NO327495B1 - Syrelabile og enzymatisk spaltbare fargestofforbindelser for diagnostikk med naerinfrarodt lys og for terapi, og optisk, diagnostisk middel. - Google Patents

Abstract

Syrelabile og enzymatisk spaltbare forbindelser for in vivo og in vivo diagnostikk ved hjelp av nærinfrarød stråling (NIR-stråling), anvendelse av disse forbindelser som optiske diagnostika og terapeutika og diagnostiske midler som inneholder disse forbindelser.

Description

Oppfinnelsen angår syrelabile og enzymatisk spaltbare forbindelser for in vivo og in vitro diagnostikk ved hjelp av nærinfrarød stråling (NIR-stråling), og optiske, diagnostiske midler til in vivo diagnostisering som inneholder disse forbindelser .

Nærinfrarød billeddannelse er en ikke invasiv diagnostisk fremgangsmåte der den høye gjennomtrengelighet for lys med bølgelengde 650-1000 nm i biologiske vev blir utnyttet. I motsetning til lys i det ultrafiolette og synlige spekterområde, som bare kan trenge igjennom de øverste millimeter av vevet, blir ved anvendelse av nærinfrarødt lys inntrengnings-dybde i vev på flere centimeter oppnådd. Årsaken til den prinsipielt dårlige inntrengingsdybde av lys er absorpsjon i kroppsegne fargestoffer, hovedsakelig hemoglobin og vann som imidlertid fremviser minimale verdier i spekterområdet for nærinfrarødt lys mellom 650 og 1000 nm. Dette spekterområde med den største optiske vevsgjennomskinnelighet blir derfor også kalt diagnostisk/terapeutisk vindu. (Boulnois, J., Lasers Med Sei 1986, 1:47-66).

Diagnostikeren står herved ved siden av de moderne billedgivende fremgangsmåter som røntgen, magnetresonanstomo-grafi eller ultralyddiagnostikk, ytterligere en fremgangsmåte for billedlig vevsfremstilling til disposisjon (Haller, E.B., Time-resolved transillumination and optical tomography. J Biomed Optics 1996, 1:7-17). Anvendelsen av NIR-stråling for stedsavhengig anvisning av blodstrøm og oksygeneringsgrad i hjernen hos pattedyr ved deteksjon av absorpsjon fra hemoglobin/deoksyhemoglobin er en kjent og anvendt fremgangsmåte (Jobsis, F.F., Science 1977, 198:1264-67; Chance, B., Leigh, J.S., Miyake, H. et al., Proe Nati Acad Sei USA 1988, 85:4971-75; Benaron D.A. et al., Science 1993, 33: 369A.).

Det vesentligste problem ved å benytte nærinfrarøde stråler er den sterke lysspredning, slik at selv ved forskjellige fotofysikalske egenskaper av et skarpt begrenset objekt og dens omgivelser avbildes dette objekt kun uskarpt. Problemet øker med den voksende fjerning av objektet fra overflaten og kan ses på som den hovedsakelige begrensende faktor så vel ved transilluminering som også ved deteksjon av fluorescensstråling. Dessuten kan fargestoffer som kontrast-middel, som preger de optiske egenskaper til vevet, føre til en høyere absorpsjon og fluorescens av vevet som skal detekteres, også muliggjøres ved dårligere stedsoppløsning av en entydig deteksjon. Dermed kan absorpsjonsforholdene til slike fargestofforbindelser benyttes som billedgivende informasjon. Innehar fargestoffene ytterligere den egenskap å emittere den absorberte energi som fluorescensstråling, så kan disse også benyttes som billedgivende informasjon. Herved blir fluor-escensstrålingen som er forskjøvet mot rødt i forhold til eksitasjonsstrålingen spesielt detektert. Fordelen består blant annet i at vevet selv i NIR-området har en svært liten egenfluorescens og dermed er bakgrunnen minimal. (S. Folli et al., Cancer Research 54, 2643-9 (1994); B. Ballou et al., cancer Immunol. Immunother. 41, 257-63 (1995); X. Li et al., SPIE vol. 2389, 789-98 (1995)).

Innen fluorescensdiagnostikk er forutsetningen derfor en tilstrekkelig, mest mulig høy forskjell i fluorescensemisjon mellom det påvisende og omliggende vev. Dette kan prinsipielt oppnås ved en forskjell i konsentrasjonen av fluorescens-fargestoff ved et bestemt tidspunkt etter substansapplikasjon. Ved diagnostikk i dypere vevssjikt spesielt er denne forskjell ofte ikke tilstrekkelig ved anvendelse av substanser med uspesifikke akkumuleringsforhold. Oppfinnelsen legger dermed den oppgave til grunn å fremstille nye forbindelser som overvinner ulempene ifølge teknikkens stand.

Oppgaven løses ifølge oppfinnelsen ved forbindelsen med den generelle formel (I)

der

F er et cyanin-, squarilium-, croconium-, merocyanin- eller oxonolfargestoffmolekyl med minst ett absorpsjonsmaksimum på mellom 600 og 1 200 nm,

L er en linkerstruktur som inneholder en enzymatisk kløyvbar binding, som blir kløyvd av kathepsiner, peptidaser, karboksypeptidaser, a- og p-glykosidaser, lipaser, fosfolipaser, fosfataser, fosfodiesteraser, proteaser, elastaser, sulfataser, reduktaser og bakterie-enzymer,

m er et tall mellom 1 og 80,

der, hvis m er et tall mellom 1 og 3,

A representerer et fargestoffmolekyl med minst ett absorpsjonsmaksimum på mellom 600 og 1 200 nm, et antibiotisk eller anticytostatisk aktivt molekyl, et biomolekyl, et ikke-biologisk makromolekyl eller en forbindelse B-(L-W)0 eller D-(L-W)o, der

D er et ikke-biologisk makromolekyl,

B er et biomolekyl,

L har betydningen ovenfor,

W representerer et antibiotisk eller anticytostatisk aktivt molekyl,

o er et tall mellom 1 og 20,

og der, hvis m er et tall mellom 4 og 80,

A representerer et biomolekyl, et ikke-biologisk makromolekyl eller en forbindelse B-(L-W)0 eller D-(L-W)0,

der

D, B, L, W og o har betydningene som er nevnt ovenfor.

De særlige egenskaper hva angår in vivo-deteksjon av nærinfrarød fluorescensemisjon ved forbindelser ifølge oppfinnelsen består i at disse viser fra en liten til slett ingen fluorescensemisjon og først etter spalting av disse konstruksjoner henholdsvis avspalting av fargestoffet fra konstruksjonen ved målstedet (f.eks. tumor, betennelse) opptrer en økning av fluorescenssignalet. Den effektive forskjell i fluorescenssignalet mellom vevet som skal påvises og omliggende vev preges derfor av a) konsentrasjonsforskjellen på grunn av farmakokinetiske mekanismer og b) forskjeller i fluorescenskvanteutbytte ved diagnostikktidspunktet.

Det ble funnet at fluorescensen til fargestoffene ble dempet når et fargestoffmolekyl koples til et ytterligere molekyl (dimer) under dannelse av forbindelsen ifølge oppfinnelsen, dvs. det forekommer en ytterst svak fluorescensemisjon til sammenligning med tilsvarende fargestoffmolekyl i ubunden tilstand. Det ble videre funnet at en sammenlignbar demping forekommer når andre molekyler med aromatiske strukturer, hvilke kan være både fargestoffer og virkestoffer (f.eks. cytostatika eller antibiotika), koples med fluores-censfargestoffet. Overraskende forekommer en slik dempning ved kopling av fargestoff til antistoffer, antistoffragmenter og proteiner.

Prinsipielt må fargestoffene som er en strukturell be-standdel av forbindelsene ifølge oppfinnelsen utmerke seg i sin monomere ukonjungerte form gjennom høye molare absorpsjonskoeffisienter og høye fluorescenskvanteutbytter. For-trinnsvis utmerker forbindelsen ifølge oppfinnelsen seg ved den generelle formel I, ved at F og/eller A betegner et

polymetinfargestoff, tetrapyrrolfargestoff, tetraaza-pyrrolfargestoff, xantinfargestoff, fenoxazinfargestoff eller fenotiazinfargestoff.

Særlig foretrukket er strukturen fra klassen polymetinfargestoff, da disse viser absorpsjonsmaksimum med svært høye molare absorpsjonskoeffisienter i det nærinfrarøde spekterområde mellom 700 og 1000 nm (s opptil 300000 1 mol-<1> cm"1) , som f.eks. cyaninfargestoff, squariliumfargestoff og croconium-fargestoff, så vel som merocyanin- og oxonolfargestoff.

Videre er slike forbindelser ifølge oppfinnelsen foretrukket med generell formel (I), der F og/eller A i generell formel (I) er et cyaninfargestoff med generell formel (II)

der

R<1> til R<4> og R<7> til R1<0>, uavhengig av hverandre, er et fluor-, klor-, brom-, jodatom eller en nitrogruppe eller et radikal -COOE<1>, -CONE^2, -NHCOE1, -NHCONHE<1>, -NE1E2, -OE1, -OSO3E<1>, -SO3E<1>, -SO2NHE<1>, -E<1>, der E1 og E<2> uavhengig av hverandre er et hydrogenatom, en mettet eller umettet, forgrenet eller rettkjedet Ci-C5o-alkylkjede, der kjeden eller deler av denne kjeden eventuelt kan danne én eller flere aromatiske eller mettede, sykliske Cs-C^-enheter eller bisykliske Cio-enheter, og der Ci-C50-alkylkjeden er avbrutt av 0 til 15 oksygenatomer og/eller 0 til 3 karbonylgrupper og/eller er substituert med 0 til 5 hydroksygrupper, 0 til 5 estergrupper, 0 til 3 karboksy-grupper eller 0 til 3 aminogrupper, og der motstående radikaler R<1> til R<4> og/eller R<7> til R1<0> i hvert tilfelle kan være koblet til hverandre med dannelsen av en seksleddet, aromatisk karbonring,

R<5> og R<6>, uavhengig av hverandre, er et radikal -E<1> med den ovenfor nevnte betydning eller en d-C4-sulfoalkylkjede, og/eller R<1> til R1<0> er en kobling med L,

Q er et fragment

der

R<11> er et hydrogen-, fluor-, klor-, brom- eller jodatom eller en nitrogruppe eller et radikal -NE<1>E<2>, -OE<1> eller -E<1>, der E<1> og E<2> har den ovenfor nevnte betydning, eller R11 er en binding med L,

R<12> er et hydrogenatom eller et radikal E<1> med den ovenfor nevnte betydning,

b er et tall 0, 2 eller 3,

X og Y representerer uavhengig av hverandre radikaler 0, S,

-CH=CH- eller et fragment

der

R<1>3 og R1<4> uavhengig av hverandre er hydrogen, en mettet eller umettet, forgrenet eller rettkjedet Ci-Cio-alkylkjede, som kan være avbrutt av opptil 5 oksygenatomer og/eller substituert med opptil 5 hydroksygrupper, og der radikalene R<13> og R<14> kan være bundet med hverandre med dannelsen av en 5- eller 6-leddet ring.

Ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen er forbindelser med generell formel (I), der fargestoffer forbindes med et terapeutisk effektivt molekyl ved en fysiologisk spaltbar binding, eller fargestoff og virkestoff koples ved fysiologisk spaltbare bindinger til biomolekyl eller ikke-biologiske bærermolekyl.

Særlig foretrukket er konstruksjoner, der fargestoffets fluorescens i koplet tilstand er dempet og den terapeutiske aktivitet til virkemolekylet maskeres ved koplingen til fargestoffet hhv. bærermolekylet (promedikamenteffekt). Spaltingen av bindingen fører til en økning av fluorescens-emisjonen ved samtidig frigivelse av virkestoffets aktivitet.

Virkestoffet W og/eller A i den generelle formel (I) ifølge oppfinnelsen er f.eks. de følgende nevnte forbindelser: Antibiotika: aclacinomycin, actinomycin Flf anthramycin, azaserin, bleomycin, cactinomycin, carubicin, carzinophilin, chromomycin, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, mtiomycin, mycofenolsyre, nogalamycin, olivomycin, peplomycin, plicamycin, porfiromycin, puromycin, streptonigrin, tubercidin, zorubicin;

Folsyre-analoger: denopterin, metotrexat, pteropterin, trimetrexat;

Pyrimidin-analoger: ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, carmofur, cytarabin, doxifluridin, enocitabin, floxuridin, 5-fluor-uracil,

Purin-analoger: fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin og derivater av de nevnte forbindelser: Alkylerte substanser: alkylsulfonat, aziridin, etylenimin, metylmelamin, nitrourinstoff, nitrogensennepsgassforbindelser, effektive hormonsubstanser som androgen, antiadrenal, anti-androgen, antiøstrogen, østrogen, LH-RH-analoger og proges-togen, så vel som ytterligere effektive cytostatikasubstanser som taxol og taxol-derivater.

Ytterligere virkestoffer er fotodynamiske aktive substanser, som bemerker seg ved muligheten til å utvikle etter eksitering en fotosensibiliserende effekt ved dannelse av cytotoksiske singlettoksygen eller av radikaler. Slike forbindelser er i første omgang tetrapyrrol eller tetraazapyrrol, f.eks. porfyrin, benzoporfyrin, klor, purpurin, ftalocyanin, naftalocyanin og derivater av de nevnte forbindelser. Ytterligere forbindelser er ekspandert porfyrin, porfycen og oxazin- eller fenoxazinfargestoff.

Den kjemiske binding som ifølge den generelle formel (I) inneholdes i koplingsstrukturen L, er strukturelt utstyrt slik at de ved bestemte fysiologiske parametrer som karakteriseres ved det syke vev (tumoren) og som er forskjellig fra det normale vevsområde, spaltes.

Det er beskrevet i litteraturen at tumorer karakteriseres ved lavere pH-verdi sammenlignet med normalvev. Mens den intracellulære pH-verdi i stor grad er identisk (ca. pH 7,4) er den ekstracellulære pH-verdi i tumoren opp til 0,5 pH-enheter lavere. Også betennelser, i særdeleshet bakterielle typer, kjennetegnes ved en lavere pH-verdi. Fremgangsmåten for bestemmelse av pH-verdien er blant annet målinger med mikro-elektroder, fluorescensmålinger med pH-sensitive fluorescens-prober og målinger med MR-sonder (R. J. Gillies et al., Am. J. Physiol. 267, pC 195-203 (1994),

G. R. Martin og R. K. Jain, Microvascular Research 46, 216-230

(1993) ,

L..E. Gerweck og K. Seetharaman, Cancer Research 56, 1194-1198

(1996)),

K. Engin et al., Int. J. Hyperthermia 11(1995) 211-216,

K. Engin et al., Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 29

(1994) 125-132,

G. Helmlinger et al., Nature Medicine 3 (1997) 177-182.

En ytterligere løsning er derfor forbindelser med kop-lingsstruktur L, som spaltes ved den lavere fysiologiske pH-verdi. Slike strukturer er f.eks. alkylhydrazon, acyl-hydrazon, arylhydrazon, sulfonylhydrazon, imin, oxim, acetal, ketal, ortoester tilsvarende fragmentene

der p er et tall mellom 2 og 4.

Spaltingen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan ved siden av å spaltes på grunn av en lavere pH-verdi også inn-treffe ved enzymer som foreligger i vevet som skal detekteres, (f.eks. tumorer, bakterielle betennelser) i høyere konsentrasjon.

Ytterligere aspekt er derfor forbindelser med koplings-struktur L, som spaltes enzymatisk. Enzymatisk spaltbare koplingsstrukturer er f.eks. slike som spaltes ved kathepsin, peptidaser, karboksypeptidaser, a- og p-glukosidaser, lipaser, oksidaser, fosfolipaser, fosfataser, fosfodiesteraser, proteaser, elastaser, sulfataser, reduktaser, transferaser og bakterielle enzymer f.eks. penicillin-amidaser som p-laktamaser (P. D. Senter et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995), 389-94).

Foretrukne enzymatisk spaltbare strukturer er kortkjedete peptidsekvenser, som f.eks. sekvenser som inneholder amino-syresekvensen Val-Leu-Lys.

Kinetikken som fører til en anriking i detekterende vev eller til en tilsvarende konsentrasjonsgradient ved et bestemt tidspunkt etter applikasjon, må korrelere så vel med kinetikken til spaltingen av forbindelsene som med kinetikken til borttransporteringen av det frigjorte fargestoffmolekyl,

og føre til en synergistisk effekt.

Ytterligere foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen med generell formel (I) utmerker seg ved at A og/eller B betegner et antistoff, deres konjugat og fragmenter, spesifikke peptider og proteiner, reseptorer, enzym, enzymsubstrat, nukleotider, naturlige og syntetiske ribonukleinsyrer eller deoksyribonukleinsyrer og deres kjemiske modifiseringer, som aptamere eller antisensoligonukleotider, lipoproteiner, lektiner, karbohydrater, mono-, di- eller trisakkarider, lineære eller forgrenede oligo- eller polysakkarider eller

-sakkaridderivater eller et dekstran.

Dessuten foretrekkes forbindelser ifølge oppfinnelsen med generell formel (I), der D betegner polyetylenglykol, polypropylenglykol, polylysin eller polylysin-dendrimer eller deres derivater.

Forbindelsen med strukturelementet A, D, B, L og W inn-treffer enten direkte eller ved vanlige funksjonelle grupper. Slike grupper er f.eks. estere, etere, sekundære og tertiære aminer, amider, tiourea-, urea-, karbamatgrupper eller male-imidstrukturer.

Et ytterligere aspekt er anvendelsen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen med generell formel I til in vivo-diagnostikk av sykt vevsområde ved hjelp av NIR-stråling så vel som for terapi av sykt vevsområde.

Ytterligere et aspekt ifølge oppfinnelsen er et optisk diagnostikum for in vivo-diagnostikk av sykt vevsområde ved hjelp av en NIR-stråling, hvilket inneholder minst én forbindelse ifølge oppfinnelsen med generell formel (I).

Dette middel blir fremstilt etter fremgangsmåter kjent for fagmannen, eventuelt ved anvendelse av vanlige hjelpe-og/eller bærerstoffer så vel som for fortynningsmidler og liknende. Til dette hører fysiologisk akseptable elektro-lytter, buffere, detergenter og substrater for justering av osmolaritet så vel som til forbedring av stabilitet og løselighet. Gjennom forholdsregler anvendt innen farmasien sørges det for sterilitet av preparatet ved fremstilling og i særdeleshet for applikasjonen.

Syntesen av fargestoffet F og A utføres etter metoder kjent i litteraturen, f.eks.

F. M. Hamer i The Cyanine Dyes and Related Compounds,

John Wiley and Sons, New York, 1964;

J. Fabian et al., Chem. Rev. 92 (1992) 1197; L. A. Ernst et al., Cytometrie 10 (1989) 3-10;

P. L. Southwick et al., Cytometrie 11 (1990) 418-430;

R. B. Mujumdar et al., Bioconjugate Chem. 4 (1993) 105-11;

E. Terpetschnig et al., Anal. Biochem. 217 (1994) 197-204;

J. S. Lindsey et al., Tetrahedron 45 (1989) 4845-66, EP-0591820 Al;

L. Strekowski et al., J. Heterocycl. Chem. 33 (1996) 1685-1688; S. R. Mujumdar et al., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 356-362; M. Lipowska et al., Synth. Commun. 23 (1993) 3087-94;

E. Terpetschnig et al., Anal. Chim. Acta 282 (1993) 633-641;

M. Matsuoka og T. Kitao, Dyes Pigm. 10 (1988) 13-22 og

N. Narayanan og G. Patronay, I. Org. Chem. 60 (1995) 2361-95.

Fargestoffene blir med støtte fra litteraturkjente metoder syntetisert med substituenter som inneholder syrelabile eller enzymatisk spaltbare bindinger eller at det oppstår slike bindinger etter kobling, f.eks. etter B. M. Mueller et al., Bioconjugate Chem. 1 (1990) 325-330;

K. Srinivasachar og D. M. Neville, Biochemistry 28 (1989) 2501-09; D. M. Neville et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 14653-61;

T. Kaneko et al., Bioconjugate Chem. 2 (1991), 133-41;

B. A. Froesch et al., Cancer Immunol. Immunother. 42 (1996), 55-63 og

J. V. Crivello et al., J. Polymer Sei: Part A: Polymer Chem. 34 (1996) 3091-3102.

De etterfølgende eksempler forklarer oppfinnelsen:

Eksempel:

1. Syntese av 5- ( 1- oksoetyl)- 1, 1'-( 4- sulfobutyl)-indotricarbocyanin- natriumsalt 1 (figur 1)

4-hydrazinofenylmetylketon blir syntetisert fra 4-aminofenylmetylketon ved diazotering og reduksjon med SnCl2 (ifølge T. Gorecki et al., J. Heterocyclic Chem. 33 (1996) 1871-76).

4,8 g (32 mmol) 4-hydrazinfenylmetylketon, 5,4 g natriumacetat og 3,9 g (45 mmol) 3-metyl-2-butanon røres i 40 ml eddiksyre i 1 time ved romtemperatur og 4 timer ved 120 °C. Reaksjonsblandingen inndampes i vakuum, oppløses i 300 ml diklormetan og den organiske fase vaskes med mettet NaCl-

løsning. Etter tørking over MgS04 oppnås 7,5 g av en brun olje. Denne oppvarmes med 6,5 g (48 mmol) 1,4-butansulton i 5 timer ved 140 °C, deretter avkjølt under omrøring med aceton og det utfellende faste stoff renset kromatografisk (RP C-18, løpe-middel metanol/vann). Utbytte: 2,5 g (23 %) 5-(1-oksoetyl)-1-4-sulfobutyl)-2,3,3-trimetyl-3H-indolenin 2.

Etter fremstilling av fargestoff 1 ble 0,5 g (1,7 mmol) l-(4-sulfobutyl)-2,3,3-trimetyl-3H-indolenin 3 omrørt med 0,47 g (1,6 mmol) glutakonaldehyddianilhydroklorid i 10 ml eddiksyreanhydrid i 30 minutter ved 120 °C. Etter avkjøling tilsettes

0,6 g (1,8 mmol) 2, 10 ml eddiksyreanhydrid, 4 ml eddiksyre og 0,5 g natriumacetat og oppvarmes i 30 minutter til 120 °C. Den dyp blå løsning avkjøles, omrøres med 200 ml eter og det bunn-felte faste stoff avfiltreres. Etter kromatografisk rensing (RP C-18, løpemiddel metanol/vann) og frysetørking oppnådde man 0,3 g (26 %) produkt 1.

Elementanalyse:

Absorpsjon: (H20) = 748 nm (e = 148000 1 mol-<1> cm-<1>)

2. Modifisering med syrelabile koblingsgrupper ( figur 2)

2.1. Omsetning av 1 med 4-karboksyfenylsulfonylhydrazin

0,2 g (0,28 mmol) 1 og 74 mg (0,34 mmol) 4-karboksyfenyl-sulf onylhydrazin ble løst i 20 ml metanol, tilsatt 5 jol trifluoreddiksyre og omrørt i 18 timer ved romtemperatur. Løs-ningsmiddelet ble fordampet i vakuum, resten ble vasket flere ganger med diklormetan og produktet ble tørket. Utbytte: 0,21 g 4.

2.2. Omsetning av 1 med 4-aminobenzosyrehydrazid

0,2 g (0,28 mmol) 1 og 51 mg (0,34 mmol) 4-aminobenzosyrehydrazid ble omsatt analogt med 2.1.

Utbytte: 0,20 g 5.

2.3. Omsetning av 1 med 4-(aminometyl)benzosyrehydrazid

0,2 g (0,28 mmol) 1 og 56 mg (0,34 mmol) 4-aminometylbenzo-syrehydrazid ble omsatt analogt med 2.1.

Utbytte: 0,22 g 6.

3. Fremstilling av reaktive funksjonelle grupper ( N-hydroksysuccinimidester og isotiocyanat) ( figur 2)

For fremstilling av N-hydroksysuccinimidylesterfor-bindelsen 7 blandes 0,1 g (0,1 mmol) 4 med 14 mg (0,12 mmol) N-hydroksysuccinimid (NHS) i 12 ml dimetylformamid (DMF) og tilsettes ved romtemperatur en løsning av 23 mg (0,11 mmol) disykloheksylkarbodiimid i 1 ml DMF. Etter omrøring i 72 timer ble produktet utfelt i dimetyleter, filtrert og felt på nytt i DMF/dietyleter. Produktet som fremkommer etter vakuumtørking (12 mg) ble anvendt uten ytterligere rensing.

For fremstilling av den syrelabile isotiocyanatforbind-elsen 8 ble 0,1 g (0,11 mmol) 5, 33 mg (0,14 mmol) N,N'-tiokarbonyldi-2(1H)-pyridon og 15 mg (0,15 mmol) trietylamin omrørt i 15 ml kloroform i 60 minutter ved romtemperatur. Produktet ble utfelt med dietyleter, filtrert og renset ved hjelp av HPLC (RP Select B, Merck, løpemiddel 10 mM fosfatbuffer pH8 /metanol). Det oppnås 40 mg (40 %) 8 etter fryse-tørking, separering av saltet med diklormetan/metanol og tørk-ing i vakuum.

4. Merking av mAK 9. 2. 27 ( antimelanomantistoff)

4.1 Merking med syrelabil NHS-ester 7

1 mg antistoff i 0,5 ml 50 mM boratbuffer (pH 9,2) ble tilsatt 33 |xl 7 (stamløsning 5 mmol/1 i DMF) og omrørt i 1 time ved romtemperatur. Ubundet fargestoff ble separert ved NAP-5-søyle (eluert med 25 mM fosfatbuffer pH 7,8 + 0,01 % NaN3) . Produktet, mAK9.2.27/4-konjugat, ble oppbevart i løsning ved 4 °C.

VIS/NIR-absorpsjonsspekter av mAK9.2.27/4-konjugat (i fosfatbuffer pH 7,8) vises i figur 5.

Fluorescenskvanteutbytte Q = 0,1 % (5 nmol/1 i fosfatbuffer pH 7,8; beregnet i forhold til indocyaningrønt som standard med Q = 13 % i DMSO ifølge R.C. Benson og H.A. Kues, J. of Chemical and Engineering Data 22 (1977) 379)

4.2. Merking med syrelabilt isotiocyanat 8

1 mg antistoff i 0,5 ml 50 mM boratbuffer (pH 9,2) ble tilsatt 6 fil 8 (stamløsning 5 mmol/1 i DMF) og omrørt i 15 minutter ved romtemperatur. Ubundet fargestoff ble separert over NAP-5-søyler (eluering med 25 mM fosfatbuffer pH 7,4 + 0,01 % NaN3) . Produktet, mAK9.2.27/5-konjugat ble oppbevart i løsning ved

4 °C.

5. Syntese av dimert indotrikarbocyaninfargestoff

5.1. Fremstilling av symmetrisk spirodimere 10

(figur 3)

0,1 g (0,47 mmol) 3,9-dietyliden-2,4,8,10-tetraoksaspiro-[5.5] undecan (syntetisert ifølge M. Crivello et al., J. Polymer Sei.: Part A: Polymer Chem. 34 (1996) 3091-3102) og 0,11 g (0,94 mmol) 6-amiho-l-heksanol ble omrørt i 15 ml dietyleter i 24 timer ved romtemperatur og løsningsmiddelet ble avdampet i vakuum. Resten ble tørket i en oljepumpe og anvendt uten videre rensing.

0,2 g (0,28 mmol) 5-karboksy-bis-l,1'-(4-sulfobutyl)-indo-trikarbocyaninnatriumsalt 9 ble omrørt i 15 ml diklormetan sammen med 0,09 g (0,28 mmol) TBTU og 30 mg trietylamin i 30 minutter og tilsatt 0,06 g (0,14 mmol) av den ovennevnte spiroforbindelse i 2 ml diklormetan. Etter omrøring i 18 timer ved romtemperatur ble produktet utfelt med dietyleter og renset kromatografisk (RP C-18, løpemiddel metanol/10 mM fosfatbuffer pH 8). Etter frysetørking ble saltet utfelt med metanol/diklormetan. Det ble oppnådd 68 mg (26 %) produkt 10.

VIS/NIR-absorpsjonsspekter av 10 (5 (omol/1 i fosfatbuffer pH 8) vises i figur 6.

Fluorescenskvanteutbytte Q = 0,2 % (5 ^mol/l i fosfatbuffer pH 8; beregnet i forhold til indocyaningrønt som standard, se eksempel 4.1.) .

5.2. Fremstilling av en fargestoffdimer (11) med syrelabile hydrazonlinkere av 6 (figur 4)

0,1 g (0,14 mmol) 5-karboksy-bis-l,1'-(4-sulfobutyl)-indotrikarbocyaninnatriumsalt 9 ble omrørt i 10 ml DMF sammen med 45 mg (0,14 mmol) TBTU og 15 mg trietylamin i 30 minutter og tilsatt 0,14 g (0,16 mmol) 6 i 2 ml DMF. Etter omrøring i 5 timer ved romtemperatur ble produktet utkrystallisert ved tilsetning av dietyleter, filtrert og renset kromatografisk (RP C-18, løpemiddel metanol / 10 mM fosfatbuffer pH 8). Etter frysetørking ble saltet utfelt med metanol/diklormetan. Det ble oppnådd 0,13 g (59 %) 11.

VIS/NIR-absorpsjonsspekter av 11 ( 4 (xmol/1) i fosfatbuffer pH 8,0 og i fosfatbuffer pH 6,0 etter 24 timer ved 37 °C : se figur 7.

6. Måling av fluorescenskvanteutbytte av 11 ved forskjellige pH- verdier i forhold til tiden

Løsninger med konsentrasjon 4 fimol/1 i 50 mM fosfatbuffer med pH-verdi 7,4; 7,0; 6,6; 6,0 og 5,0 ble inkubert ved 37 °C. Ved forskjellige tidspunkter ble aliquoter tatt ut og fluorescenskvanteutbyttet bestemt (SPEX Fluorolog Spektralfluoro-meter, 400 W Xe-lampe, PM958-detektor, kalibrert ved bølge-lengdeavhengig følsomhet av detektorene, verdiene er beregnet i forhold til indocyaningrønt, se eksempel 4.1.).

Observeringen av spaltingen av den syrelabile dimer 11 ved hjelp av stigningen i fluorescenskvanteutbyttet ved forskjellige pH-verdier i forhold til tiden vises i figur 8. 7. Syntese av en doxorubicin- indotrikarbocyaninkonjugat ( 13) med syrelabil hydrazonlinker (figur 4) 20 mg (34 ^mol) doxorubicinhydroklorid og 11 mg (68 umol) 4-(aminometyl)benzosyrehydrazid ble omrørt i 3 ml vannfri metanol etter tilsetning av 2 (il trifluoreddiksyre i 24 timer ved romtemperatur. Produktet 12 ble utkrystallisert med acetonitril, sentrifugert, vasket med acetonitril og tørket, utbytte 18 mg (24 |jmol) råprodukt. 14 mg (20 (unol) 5-karboksy-bis-l, 1'- (4-sulfobutyl)-indotrikarbocyaninnatriumsalt 9 ble omrørt i 0,5 ml DMF sammen med 7 mg (22 pmol) TBTU og 20 (J.1 trietylamin i 30 minutter. Denne reaksjonsblanding ble dråpevis tilsatt en løsning av ovennevnte forbindelse 12

(18 mg i 0,2 ml DMF) ved 0 °C og omrørt i 3 timer ved 0 °C. Produktet ble utfelt ved tilsetning av dietyleter og renset analogt med eksempel 5. Det oppnås 12 mg (47 %) 13.

Claims (9)

1. Forbindelsr, karakterisert ved at de har den generelle formel I der F er et cyanin-, squarilium-, croconium-, merocyanin- eller oxonolfargestoffmolekyl med minst ett absorpsjonsmaksimum på mellom 600 og 1 200 nm, L er en linkerstruktur som inneholder en enzymatisk kløyvbar binding, som blir kløyvd av kathepsiner, peptidaser, karboksypeptidaser, a- og p-glykosidaser, lipaser, fosfolipaser, fosfataser, fosfodiesteraser, proteaser, elastaser, sulfataser, reduktaser og bakterie-enzymer, m er et tall mellom 1 og 80, der, hvis m er et tall mellom 1 og 3, A representerer et fargestoffmolekyl med minst ett absorpsjonsmaksimum på mellom 600 og 1 200 nm, et antibiotisk eller anticytostastisk aktivt molekyl, et biomolekyl, et ikke-biologisk makromolekyl eller en forbindelse B-(L-W)C eller D-(L-W)o, der D er et ikke-biologisk makromolekyl, B er et biomolekyl, L har betydningen ovenfor, W representerer et antibiotisk eller anticytostatisk aktivt molekyl, o er ét tall mellom 1 og 20, og der, hvis m er et tall mellom 4 og 80, A representerer et biomolekyl, et ikke-biologisk makromolekyl eller en forbindelse B-(L-W)0 eller D-(L-W)0, der D, B, L, W og o har betydningene som er nevnt ovenfor.

2. Forbindelser ifølge krav 1, karakterisert ved at de har den generelle formel I der F er et cyanin-, squarilium-, croconium-, merocyanin- eller oxonolfargestoffmolekyl med minst ett absorbsjonsmaksimum på mellom 600 og 1 200 nm, L er en enzymatisk kløyvbar linkerstruktur, som består av en kortkjedet peptidsekvens, m er et tall mellom 1 og 80, der, hvis m er et tall mellom 1 og 3, A representerer et fargestoffmolekyl med minst ett absorpsjonsmaksimum på mellom 600 og 1 200 nm, et antibiotisk eller anticytostatisk aktivt molekyl, et biomolekyl, et ikke-biologisk makromolekyl eller en forbindelse B-(L-W)0 eller D-(L-W)o, der D er et ikke-biologisk makromolekyl, B er et biomolekyl, L har den ovenfor nevnte betydning, W representerer et antibiotisk eller anticytostatisk aktivt molekyl. o er et tall mellom 1 og 20, og der, hvis m er et tall mellom 4 og 80, A representerer et biomolekyl, et ikke-biologisk makromolekyl eller en forbindelse B-(L-W)0 eller D-(L-W)0, der D, B, L, W og o har betydningene som er nevnt ovenfor.

3. Forbindelser ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at Ai generell formel (I) er et polymetinfargestoff, tetrapyrrolfargestoff, tetraaza-pyrrolfargestoff, xantinfargestoff, fenoksazinfargestoff eller fenotiazinfargestoff.

4. Forbindelser ifølge minst ett av de foregående krav, karakterisert ved at Ai generell formel (I) er et cyanin-, squarilium-, croconium-, merocyanin- eller oxonolfargestoff.

5. Forbindelser ifølge minst ett av de foregående krav, karakterisert ved at F og/eller A i generell formel (I) er et cyaninfargestoff med generell formel (II) der R<1> til R<4> og R<7> til R1<0>, uavhengig av hverandre, er et fluor-, klor-, brom-, jodatom eller en nitrogruppe eller et radikal -COOE<1>, -CONE^<2>, -NHCOE<1>, -NHCONHE<1>, -NE1E2, -OE1, -OSO3E<1>, -SO3E<1>, -SO2NHE<1>, -E<1>, der E1 og E2 uavhengig av hverandre er et hydrogenatom, en mettet eller umettet, forgrenet eller rettkjedet Ci-C50-alkylkjede, der kjeden eller deler av denne kjeden eventuelt kan danne én eller flere aromatiske eller mettede, sykliske C5-C6-enheter eller bisykliske Ci0-enheter, og der Ci-Cso-alkylkjeden er avbrutt av 0 til 15 oksygenatomer og/eller 0 til 3 karbonylgrupper og/eller er substituert med 0 til 5 hydroksygrupper, 0 til 5 estergrupper, 0 til 3 karboksy-grupper eller 0 til 3 aminogrupper, og der motstående radikaler R<1> til R4 og/eller R<7> til R<10> i hvert tilfelle kan være koblet til hverandre med dannelsen av en seksleddet, aromatisk karbonring, R5 og R<6>, uavhengig av hverandre, er et radikal -E<1> med den ovenfor nevnte betydning eller en Ci-C4-sulfoalkylkjede, og/eller R<1> til R1<0> er en kobling med L, Q er et fragment der R<11> er et hydrogen-, fluor-, klor-, brom- eller jodatom eller en nitrogruppe eller et radikal -NE1E2, -OE1 eller -E<1>, der E<1 >og E<2> har den ovenfor nevnte betydning, eller R<11> er en binding med L, R<12> er et hydrogenatom eller et radikal E<1> med den ovenfor nevnte betydning, b er et tall 0, 2 eller 3, X og Y representerer uavhengig av hverandre radikaler 0, S, -CH=CH- eller et fragment der R<1>3 og R1<4> uavhengig av hverandre er hydrogen, en mettet eller umettet, forgrenet eller rettkjedet Ci-Ci0-alkylkjede, som kan være avbrutt av opptil 5 oksygenatomer og/eller substituert med opptil 5 hydroksygrupper, og der radikalene R<13> og R14 kan være bundet med hverandre med dannelsen av en 5- eller 6-leddet ring.

6. Forbindelser ifølge minst ett av de foregående krav, karakterisert ved at W eller A i generell formel (I) er et antibiotikum, en folsyreanalog, en pyrimi-dinanalog, en purinanalog, et hormonelt aktivt stoff eller et annet cytostatisk aktivt stoff.

7. Forbindelser ifølge minst ett av de foregående krav, karakterisert ved at A og/eller B er et antistoff, dets konjugater og fragmenter, spesifikke peptider og proteiner, reseptorer, enzymer, enzym-substrater, nukleotider, naturlige eller syntetiske ribonukleinsyrer eller deoksyribonukleinsyrer eller deres kjemiske modifiseringer, slik som aptamerer eller antisensoligonukleotider, lipoproteiner, lektiner, karbohydrater, mono-, di- eller trisakkarider, lineære eller forgrenede oligosakkarider eller polysakkarider eller -sakkaridderivater eller et dekstran.

8. Forbindelser ifølge minst ett av de foregående krav, karakterisert ved at Di generell formel (I), er polyetylenglykol, polypropylenglykol, polylysin eller poly-lysindendrimerer eller derivater derav.

9. Optisk, diagnostisk middel til in vivo-diagnostisering av sykdomsrammede vevsområder med anvendelse av NIR-stråling, karakterisert ved at det inneholder minst én forbindelse ifølge krav 1 i kombinasjon med vanlig benyttede adjuvanser og/eller vehikler og også fortynningsmidler.