KR20050103907A - 형광 진단을 위한 친수성의 티올-반응성 시아닌 염료 및그의 생체분자와의 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 700 내지 900 nm의 스펙트럼 범위 내에서 흡수 및 형광 최대치를 갖고, 수 용해도뿐만 아니라 염료 생산율의 증가를 위해 티올-특이성 반응기 및 3개, 바람직하게는 4개의 술포네이트기를 갖는 시아닌 염료 군, 특히 인도트리카르보시아닌으로부터의 신규한 형광 염료에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이들 염료와 생체분자의 접합체 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

형광 진단을 위한 친수성의 티올-반응성 시아닌 염료 및 그의 생체분자와의 접합체{HYDROPHILIC, THIOL-REACTIVE CYANINE DYES AND CONJUGATES THEREOF WITH BIOMOLECULES FOR FLUORESCENCE DIAGNOSIS}
본 발명은 700 내지 900 nm의 스펙트럼 범위 내에서 흡수 및 형광 최대치를 갖고, 수 용해도뿐만 아니라 염료 생산성의 증가를 위해 티올-특이성 반응기 및 3개, 바람직하게는 4개의 술포네이트기를 갖는 시아닌 염료 군, 특히 인도트리카르보시아닌으로부터의 신규한 형광 염료에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이들 염료와 생체분자의 접합체 및 그의 용도에 관한 것이다.
의학 진단에서 광선의 사용은 최근 들어 중요해졌다(예를 들어, 문헌[ Biomedical Photonics Handbook(편집자: T. Vo-Dinh), CRC Press] 참조). 매우 다양한 진단법들이 다양한 의학 분야, 예를 들어, 내시경, 유방조영술, 수술 또는 부인과학에 적용하기 위한 실험적인 시험에서 발견된다. 광-기재 방법은 높은 기기 감도를 가지고 분자 검출 및 최소량의 발색단 및/또는 형광단의 영상화를 가능하게 한다(문헌[Weissleder et al. (2001) Molecular Imaging, Radiology 219, 316-333]).
형광 진단 및 영상화를 위한 외인성 조영제로서 조직에 공급되는 염료, 및 본원에서는 특히 700 내지 900 nm의 스펙트라 범위(조직의 진단 범위) 내에서 흡수 및 형광 최대치를 갖는 형광 염료가 생체내 사용을 위해 특별한 관심을 받고 있다. 상기 파장의 광자는 조직에 의해 상대적으로 적게 흡수되므로, (주로 옥시헤모글로빈 및 데옥시헤모글로빈에 의한) 흡수 작용에 의해 광 수송이 멈추기 전에 조직 내로 몇 센티미터 통과할 수 있다. 게다가 조직 내로 도입되는 형광 염료에 의해 흡수가 일어날 수 있으나, 형광 염료는 더 긴 파동의 형광 방사선의 형태로 흡수된 에너지를 방사한다. 상기 형광 방사선은 스펙트럼 상 분리되어 검출될 수 있으며 염료의 위치 측정 및 염료가 결합된 분자 구조의 상관 관계를 가능하게 한다(또한 이와 관련하여 문헌[Licha, K. (2002) Contrast Agents for Optical Imaging (Review). In: Topics in Current Chemistry - Contrast Agents II (편집자: W. Krause), Volume 222, Springer Heidelberg, 페이지 1 내지 31.] 참조).
질병에 걸린 구조물 및 건강한 조직을 진단에 의해 유의하게 분별하기 위해서, 공급하는 염료는 조직 간에 농도 차이가 가능한 한 커야 한다. 이는 종양-생리적 특성(혈액 공급, 분포 역학, 제거 지연)에 기초로 하여 수행할 수 있다. 질병-특이성 구조물의 분자 표지를 위해, 형광 염료와 표적물-친화 생체분자, 예컨대 단백질, 펩티드, 및 항체로 구성된 접합체를 사용할 수 있다. 주입 후, 상기 접합체의 특정 부분은 분자 표적 구조물, 예컨대 수용체 또는 매트릭스 단백질에 결합하는 반면, 결합하지 않은 것들은 신체로부터 방출된다. 이 방법으로, 더 높은 농도 차이가 생기고, 이에 따라 형광 진단의 수행시 더 뛰어난 영상 대조를 이룬다.
시아닌 염료 군으로부터의 형광 염료는 대표적으로 유망한 염료의 카테고리에 속하며 매우 다양한 구조물로 합성된다. 특히, 인도카르보시아닌, 인도디카르보시아닌 및 인도트리카르보시아닌 골격을 가진 카르보시아닌은 고 흡광 계수 및 양호한 형광 양자 수율을 갖는다(문헌[Licha, K. (2002) Contrast Agents for Optical Imaging (Review). In: Topics in Current Chemistry - Contrast Agents II (편집자: W. Krause), Volume 222, Springer Heidelberg, 페이지 1 내지 31, 및 이에 인용된 참조문]).
예를 들어, WO 96/17628는 근적외선 방사선에 의한 생체내 진단법을 기재한다. 상기 경우, 특별한 광물리학적 특성, 및 약화학적 특성을 가진 수용성 염료 및 그의 생체분자 부가물이 형광 및 투시 진단을 위한 조영제이다.
인도카르보시아닌, 인도디카르보시아닌 및 인도트리카르보시아닌 골격을 가진 시아닌 염료의 합성은 종래 기술에서 잘 기재되어 있다. 이와 관련된 문헌으로는 예를 들면, 문헌[Bioconjugate Chem. 4, 105-111, 1993], [Bioconjugate Chem. 7, 356-62, 1996], [Bioconjugate Chem. 8, 751-56, 1997], [Cytometry 10, 11-19, 1989 및 11, 418-30, 1990], [J. Heterocycl. Chem. 33, 1871-6, 1996], [J. Org. Chem. 60, 2391-5, 1995], [Dyes and Pigments 17, 19-27, 1991], [Dyes and Pigments 21, 227-34, 1993], [J.Fluoresc. 3, 153-155, 1993] 및 [Anal. Biochem. 217, 197-204, 1994]가 있다. 추가적인 방법이 특허 공보 US 4,981,977, US 5,688,966, US 5,808,044, WO 97/42976, WO 97/42978, WO 98/22146, WO 98/26077, 및 EP 0 800 831에 기재되어 있다.
또한, 치환기가 변경된 인도트리카르보시아닌이 합성되고 생체분자에 커플링되었다(예를 들어, 문헌[Photochem. Photobiol. 72,234, 2000], [Bioconjugate Chem. 12,44, 2001], [Nature Biotechnol. 19,237, 2001], [J. Biomed. Optics 6,122, 2001], [J. Med. Chem. 45,2003, 2002]에 기재됨). 다른 예는 특히 공보 WO 00/61194("광학 진단을 위한 조영제로서의 단쇄 펩티드 염료 접합체(Short-Chain Peptide Dye Conjugates as Contrast Agents for Optical Diagnostics)"), WO 00/71162, WO 01/52746, WO 01/52743 및 WO 01/62156에서 발견된다.
그러나 종래 기술에서 앞서 사용되던 공지된 인도트리카르보시아닌은 여전히그들의 효과적인 사용을 방해하는 결점을 가지고 있다.
인도트리카르보시아닌은 생체분자에 커플링된 후 항상 낮은 형광 양자 수율을 나타낸다. 이에, 예를 들어 그루버(Gruber) 등은 문헌[Bioconjugate Chemn. 11, 696-704, 2000]에서 상업적으로 입수가능한 염료 Cy7의 경우 형광 효율의 손실이 생체분자로의 커플링 이후에 일어난다고 기재하고 있다. 벡커(Becker) 등은 문헌[Photochem. Photobiol. 72, 234, 2000]에서 형광 양자 수율 2.9％ 또는 2.8％ 및 생리 매질에서의 변형된 흡수 스펙트럼을 갖는 HSA 및 트랜스페린과 인도트리카르보시아닌의 접합체를 기재하고 있다.
또한, 염료 접합체는 응집되기 쉽다. HSA 및 트랜스페린과 인도트리카르보시아닌의 접합체에 관한 벡커 등의 문헌[Photochem. Photobiol. 72, 234, 2000] 및 수용체-결합 펩티드에 관한 리하(Licha) 등의 문헌[Bioconjugate Chem. 12, 44-50, 2001]에서는 상기 화합물들이 생리 매질에서 변형된 흡수 스펙트럼을 갖는 것으로 기재하고 있다. 이러한 변형은 응집체 형성 및 그 결과로서 일어나는 형광 소멸을 나타낸다. 염료의 부적합한 수 용해도의 경우에도 유사한 문제가 존재한다.
반응기에 관해서도, 항상 유도체에 대한 비효율적인 접근이 있다. 이에, 예를 들어, 그루버 등은 문헌[Bioconjugate Chem. 11, 696-704, 2000]에서 잠재적으로 생체분자 2개의 가교결합을 생성할 수 있는 2개의 반응기를 가진 Cy7-이관능성 NHS-에스테르의 용도를 기재하고 있다. 그러나 분자 내 2개의 카르복시기에 의해, 유도체로의 합성을 위한 접근은 단지 1개의 반응기에 제한되고 부산물(예를 들어, 비활성화 및 이중-활성화된 Cy7 분자의 Cy7 부분의 단일-반응성 NHS 에스테르를 함유함)을 형성한다.
따라서 상기 언급된 결점이 감소되거나 없는 형광 진단을 위한 효과적이고 제조하기에 용이한 시아닌 염료에 대한 필요성이 계속되고 있다. 또한, 상기 염료는 생체분자와의 접합체 제조에 매우 적합해야 한다.
도 1은 PBS 중의 접합체 Kl1 (A) 및 K15 (B)의 표준화시킨 흡수 및 형광 스펙트럼(표 2 참조)이다.
도 2는 하기 실시예 24[물질: 접합체 K15; 종양: 마우스의 오른쪽 옆구리 후부의 F9 기형암; 투여량: 체중 1 kg 당 50 nmol (염료에 대한 데이타); 여기(excitation): 740 nm (다이오드 레이저); 검출: 802.5±5 nm 밴드-패스 필터를 포함한 CCD-카메라(하마마츠(Hamamatsu)), 및 시간: 주입전, 주입후 1 시간, 6 시간 및 24 시간]의 본 발명에 따른 접합체의 영상화 특성의 결과를 보여준다. 종양의 위치는 화살표로 표시하였다.
본 발명의 첫번째 목적은 하기 화학식 I의 인도트리카르보시아닌 염료 및 상기 화합물의 염 및 용매화물의 제조에 의해 성취된다.
상기 식에서,
X는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 및/또는 부틸로부터 선택될 수 있는 치환기에 의해 2개 치환되는 O, S 또는 C이고,
Y는 CH2-CH2 또는 CH2-CH2-CH2이고,
Z는 C 원자가 O 또는 S에 의해 임의로 치환되는 Cl 내지 C5-알킬이거나, 또는
이고,
Rl 내지 R4는 서로 독립적으로 SO3H 또는 H이되, Rl 내지 R4 중 적어도 3개가 S03H이며,
R5는 -CO-NH-R8-R9, -NH-CS-NH-R8-R9 또는 -NH-CO-R8-R9이고, 여기서 R8은 C 원자가 O 또는 S에 의해 임의로 치환되는, 비분지쇄 C2 내지 Cl3-알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, R9는
,클로로아세틸, 브로모아세틸, 요오도아세틸, 클로로아세트아미도, 요오도아세트아미도, 클로로알킬, 브로모알킬, 요오도알킬, 피리딜 디술피드 및 비닐 술폰아미드로부터 선택되고,
R6 및 R7는 CH이거나, 또는 파라-위치에서 Cl 내지 C4-알킬 라디칼로 임의로 치환될 수 있는 C3-알킬에 의해 헥실 고리에 연결된다.
상기 식에서, Y가 CH2-CH2이고, Z가 C 원자가 O 또는 S에 의해 임의로 치환되는 Cl 내지 C5-알킬이고, R6 및 R7가 CH인 본 발명의 인도트리카르보시아닌 염료 및 상기 화합물의 염 및 용매화물이 바람직하다.
상기 식에서, Z가 Cl 내지 C5-알킬인 본 발명의 인도트리카르보시아닌 염료가 더 바람직하다.
상기 식에서, Z가 이고,
R6 및 R7이 C3-알킬을 통해 헥실 고리에 연결된 본 발명의 인도트리카르보시아닌 염료가 보다 더 바람직하다.
따라서 시아닌 염료 군으로부터의 형광 염료, 특히 700 내지 900 nm의 스펙트럼 범위 내에서 흡수 및 형광 최대치를 가지고, 티올-특이성 반응기 및 3개, 바람직하게는 4개의 술포네이트기를 갖는 인도트리카르보시아닌이 본 발명의 주제이다. 후자의 기들은 수 용해도를 증가시키기 위해 사용된다.
본 발명에 이르러, 놀랍게도, 상기 언급된 구조(술포네이토에틸 라디칼과 함께 3 내지 4개의 술포네이트기가 조밀하게 위치함)의 본 발명에 따른 인도트리카르보시아닌이 15％를 초과하는 고 형광 양자 수율을 가지며, 생체분자에 커플링 후의 형광 양자 수율이 거의 변하지 않은 채로 있다는 것(약 10％의 최대 손실)이 발견되었다. 또한 접합체의 흡수 스펙트럼은 약 750 nm의 NIR 범위 내에서 염료 흡수의 변형을 나타내지 않는다. 따라서, 특히 Cy7 및 다른 알려진 구조의 경우에서 3개 미만의 술포네이트기를 갖는 통상적인 인도트리카르보시아닌 또는 Cy7 유도체에 비해 양호한 친수성, 감소된 응집 및 증가된 형광 양자 수율을 얻는다.
본 발명에 따른 형광 진단용 시아닌 염료의 제조에서 또다른 중요한 면은 표적-특이성 생체분자에 공유 커플링되는 것을 가능케 하는 반응성 관능기를 갖는 유도체에 관한 것이다. 적합한 유도체는 예를 들면, 아미노기, 예컨대, 말레이미드와 반응하는 NHS 에스테르 및 이소티오시아네이트(문헌[Bioconjugate Chem. 4, 105-111, 1993], [Bioconjugate Chem. 8, 751-56, 1997]), 티올기와 반응하는 알파-할로케톤 또는 알파-할로아세트아미드(문헌[Bioconjugate Chem. 13, 387-391, 2002], [Bioconjugate Chem. 11, 161-166, 2000])이다. 다른 이관능성 연결기는 아릴렌디이소티오시아네이트, 알킬렌디이소티오시아네이트, 비스-N-히드록시-숙신이미딜에스테르, 헥사메틸렌디이소시아네이트 및 N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르를 포함하는 군으로부터 기원할 수 있다.
WO 01/77229는 생체분자에 결합할 수 있도록 하는 1개 이상의 반응기, 메틴쇄의 메조-위치 내 술포아릴기 및 알킬 치환기의 조합을 갖는 시아닌 염료를 기재한다. 그러나 상기 실시양태는 인도디카르보시아닌(5개의 C 원자로 구성된 폴리메틴쇄)에 관한 것이고, 상기 화합물은 메조-위치에 반응기가 없다.
WO 00/16810("근적외선 형광 조영제 및 형광 영상화(Near-Infrared Fluorescent Contrast Agent and Fluorescence Imaging)")은 C7-폴리메틴쇄의 메조-위치 내에 치환기를 갖는 인도트리카르보시아닌을 기재하고 있다. 그러나 반응기가 어떻게 도입되거나 제조되는지에 대해서는 언급되어 있지 않다.
본 발명의 또다른 면은 R5가 COOH 또는 NH2인 인도트리카르보시아닌 염료에 관한 것이다.
공개된 유도체는 Cy3-, Cy5-, Cy5.5- 및 Cy7-기본 구조(아머샴 파마샤 바이오텍(Amersham Pharmacia Biotech)으로부터 입수가능함; US 5,268,486; Cy3=인도카르보시아닌, Cy5=인도디카르보시아닌, Cy7=인도트리카르보시아닌)에 주로 기재로 한다. 티올기-반응성 유도체는 생체분자 내 특별하게 위치한 생물공학적 시스테인과 유도된 접합체를 가능하게 하기 때문에 특히 관심의 대상이다. 종래 기술은 Cy3 및 Cy5 유도체에 주로 집중한다.
본 발명에 따른 특별히 바람직한 인도트리카르보시아닌 염료는 하기 표 1에 나열된 화학식 II 내지 XX의 염료로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 인도트리카르보시아닌 염료의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 경우, 4-치환된 피리딘을 통한 단순한 접근이 발견되었다. 매우 놀랍게도, 진케(Zincke) 반응(진케-쾨니크(Zincke-Koenig) 반응, 문헌[Roempps Chemie Lexikon[Roempps Chemical Dictionary], 제10판, 페이지 5067] 참조)에 의해 고 수율의 다양한 4-치환된 피리딘이 메조-치환된 글루타콘알데히드-디아닐리드(시아닌 염료의 전구체)로 전환될 수 있다.
4-치환된 피리딘의 단순하고 효과적인 합성에 더하여, 본 발명의 염료의 대칭 구조는 분자의 대칭적인 메조-위치 내 티올기-선택성 반응기를 갖는 정의된 유도체화를 가능하게 한다.
티올기-반응성 화합물에 대한 추가적인 유도체화를 수행하였다. 티올기-반응성 관능기로는 예를 들어, 말레이니미드(말레이미드), 클로로아세틸, 브로모아세틸, 요오도아세틸, 클로로아세트아미도, 브로모아세트아미도, 요오도아세트아미도, 클로로알킬, 브로모알킬, 요오도알킬, 피리딜 디술피드 및 비닐 술폰아미드가 있다.
본 발명의 또다른 면은 본 발명의 인도트리카르보시아닌 염료와 생체분자의 커플링을 포함하는 접합체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 범위 내에서, "생체분자"는 생물학적 활성, 특히 효소 활성, 또는 합성 또는 생물학적 기원을 가진 물질, 예컨대, 제약 제제, 펩티드, 단백질, 수용체 또는 핵산의 결합을 갖는 생물학적 기원의 임의 분자로 정의된다. 따라서, 바람직한 생체분자는 단백질, 예컨대, 효소, 펩티드, 항체 및 항체 단편(예컨대, 단일 쇄, Fab, F(ab)2, 항체절편(diabody) 등), 지단백질, 핵산, 예컨대, DNA 또는 RNA로부터의 올리고뉴클레이티드 또는 폴리뉴클레이티드, 아프타머, PNA, 및 당, 예컨대, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당 및 다당류이다.
종양의 생체내 형광 진단을 위한 생체분자, 예컨대 펩티드, 항체 및 그의 단편 및 단백질을 포함한 시아닌 염료 접합체의 합성 및 생물학적 특성화는 다양한 문헌에서 종래 기술 중에 기재된다. 이 경우, 상기 언급된 Cy3, Cy5, Cy5.5 및 Cy7이 주로 사용되었다(이와 관련하여, 문헌[Nature Biotechnol. 15, 1271, 1997], [Cancer Detect. Prev. 22, 251, 1998], [J. Immunol. Meth. 231, 239, 1999], [Nature Biotechnol. 17, 375, 1999], [Nature Medicine 7, 743, 2001] 참조).
본 발명의 또다른 면은 본 발명의 방법에 따라 제조된 생체분자와 본 발명에 따른 인도트리카르보시아닌 염료의 접합체에 관한 것이다. 상기 접합체는 상기 기재된 바와 같은 생체분자를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있는데, 여기서 생체분자로서, 적어도 한개의 생체분자는 펩티드, 단백질, 지단백질, 항체 또는 항체 단편, 핵산, 예컨대, DNA 또는 RNA의 올리고뉴클레이티드 또는 폴리뉴클레이티드, 아프타머, PNA, 및 당, 예컨대, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당 및 다당류로부터 선택되는 것이 바람직하다. 따라서 커플링된 단백질은 신체의 골격 단백질 또는 가용성 단백질 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. HSA와 같은 혈청 단백질, scFv-단편 또는 F(ab)와 같은 항체/항체 단편 뿐만 아니라 펩티드, BSA, 난(egg) 알부민 또는 그로부터 유도된 과산화효소가 특히 매우 바람직하다.
따라서 예를 들어, 혈관형성이 활발한 조직 내에서 집중적으로 발현되고 인접한 조직 내에서는 매우 낮은 수준으로만 발현되는 분자로 유도(direct)되는 항체가 종래 기술로부터 알려져 있다(WO 96/01653 참조). 혈관 성장 인자에 대한 수용체에 대항하는 항체, 염증 조절 화합물이 결합하는 내피 세포를 포함하는 수용체, 및 신규 혈관의 형성시 특별하게 발현되는 매트릭스 단백질이 특별한 관심을 받는다. 매트릭스 단백질 EDB-피브로넥틴으로 유도되는 다른 항체 또는 항체 단편 및 본 발명에 따른 그로부터의 접합체가 바람직하다. 종양태아 피브로넥틴으로도 알려진 EDB-피브로넥틴은 혈관형성의 과정 중에 새롭게 형성된 혈관 근처에서 특별히 형성되는 피브로넥틴의 스플라이스(splice) 변종이다. EDB-피브로넥틴에 대항하는 항체 L19, E8, AP38 및 AP39가 특히 바람직하다(문헌[Cancer Res 1999,59, 347], [J Immunol Meth 1999, 231, 239], [Protein Expr Purif 2001, 21, 156]).
인도트리카르보시아닌 염료가 SH 기, 특히 시스테인의 SH 기를 통해 생체분자에 커플링되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 접합체가 바람직하다. C-말단 또는 N-말단(바깥쪽 1 내지 10개의 아미노산 내) 상에, 분자내 S-S-가교결합을 형성하지 않고, 그리하여 본 발명에 따른 염료에 커플링되는데 사용될 수 있는 시스테인을 함유하도록 재조합 기술에 의해 제조된 항체 및 그들의 단편들이 상기 접합체로부터 임의로 보다 더 바람직하게 제조된다.
본 발명의 다른 면은 본 발명의 인도트리카르보시아닌 염료 및/또는 본 발명의 접합체를 포함하는 진단 키트에 관한 것이다. 또한, 상기 키트는 특히 종양의 생체내 진단을 하기 위한 추가적인 아주반트(adjuvant)를 함유할 수 있다. 상기 아주반트는, 예를 들어, 적합한 완충액, 용기, 검출 시약 또는 사용 설명서이다. 상기 키트는 바람직하게 본 발명에 따른 염료의 정맥내 투여를 위한 모든 물질을 함유한다. 본 발명에 따른 이러한 키트의 특별한 실시양태는 예를 들어 하기와 같다.
첫번째 용기는 유리 SH 기를 갖는 항체(생체분자), 및 용액 또는 동결-건조된 물질로서 표준 완충액/첨가제를 함유한다. 다른 용기는 용액(일반 첨가제) 또는 동결-건조된 물질로서 본 발명에 따른 염료를 0.1 내지 1의 몰비(등몰량 중 lOx 부족량)로 함유한다. 염료-함유 용기는 완충액 또는 증류수와 임의로 혼합시키고 생체분자-함유 용기에 첨가하여, 1 내지 10 분 동안 배양하고 주입액으로서 즉시 사용된다.
다른 실시양태에서, 상기 키트는 제1 챔버가 항체 용액을 함유하고, 제2 챔버는 용액 또는 고형물로서 염료를 함유하고, 이들은 갈라질 수 있는(breachable) 벽에 의해 물리적으로 분리된 2-챔버 시스템(예를 들어, 주사기)으로 존재한다. 벽이 파괴된 후, 주입액의 혼합 및 제조가 일어난다.
이어서 본 발명의 마지막 면은 종양의 생체내 진단을 위한 형광 조영제로서의 본 발명에 따른 접합체의 용도에 관한 것이다. 이와 관련하여 Cy7의 흡수 최대치는 745 nm의 범위 내 있고, 따라서 더 깊은 조직 층으로부터의 형광 생체내 검출을 위해 특히 적합하다(상기 참조). 그러나 티올기-선택성 반응기를 갖는 Cy7 유도체는 기재되지 않았다. 또한, 종양의 경계 부분의 검출을 위한 항체 접합체의 용도는 WO 01/23005("수술 중 종양 주변을 도시하기 위한 혈관형성의 표적 구조물에 결합하는 항체 염료 접합체(Antibody Dye Conjugates for Binding to Target Structures of Angiogenesis in Order to Intraoperatively Depict Tumor Peripheries)")에 이미 기재되었으나, 본 발명에 따른 유익한 염료를 사용하는 것은 아니다.
본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가적으로 설명되나 이에 제한되지는 않는다.
실시예 1-16: 말레이미드기를 갖는 인도트리카르보시아닌 염료의 합성
실시예 1: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)에틸]카바모일}-에틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-l-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 II)
a) 1-(2-술포네이토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-술폰산, 내부염
2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-술폰산(문헌[Bioconjugate Chem 1993, 4, 105]) 10 g (0.04 mol), 2-클로로에탄술폰산 클로라이드 6.8 g (0.04 mol) 및 트리에틸아민 4.2 g (0.04 mol)을 아세토니트릴 200 ml 중에서 6 시간 동안 환류시켰다. 침전물을 흡입하여 건조시켰다. 수율 5.0 g (이론치의 35％). 문헌[Anal Biochem 1994, 217, 197].
b) 3-피리딘-4-일-프로피온산-tert-부틸 에스테르
THF 50 ml 중의 t-부틸-P,P-디메틸포스포노아세테이트 20 g (89 mmol)을 0 ℃에서 THF 250 ml 중의 수소화나트륨(미네랄 오일 중 60 ％) 3.9 g (98 mmol)의 현탁액에 적가하였다. 0 ℃에서 1 시간 교반시킨 후, 테트라히드로푸란 50 ml 중의 피리딘-4-카르브알데히드 10 g (93 mmol)의 용액을 적가하고, 반응 혼합물을 1 시간 동안 0 ℃에서, 18 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 침전된 고형물을 여과에 의해 제거하고, 용액을 증발에 의해 농축시켰다. 잔류물을 가열시키면서 이소프로판올에 용해시키고, 용해되지 않은 부분을 여과하여 제거하고, 결정화를 위해 용액을 0 ℃로 냉각시켰다. 생성된 고형물을 여과하고, 헥산으로 교반시키고, 헥산을 여과하고, 여과하고 건조시켰다. 중간 생성물(15.3 g)을 6 시간 동안 10％ 팔라듐/활성탄 0.15 g과 함께 에탄올 150 ml 중에서 수소화시켰다. 촉매를 여과하여 제거하고, 용액을 증발에 의해 농축하고, 잔류물을 실리카 겔(이동 용매 디에틸 에테르) 상에서 여과시켰다. 담황색 오일 13.0 g (이론치의 71％)을 수득하였다.
c) 3-[2-(tert-부틸옥시카르보닐)에틸]글루타콘알데히드-디아닐리드-히드로브로마이드
디에틸 에테르 150 ml 중의 3-피리딘-4-일-프로피온산-tert-부틸 에스테르 10 g (48 mmol)의 용액을 아닐린 8.9 g (96 mmol)과 혼합한 후, 0 ℃에서 디에틸 에테르 2 ml 중의 브로모시아노겐 5.4 g (48 mmol)의 용액과 혼합하였다. 0 ℃에서 3 시간 동안 교반시킨 후, 생성된 적색 고형물을 여과하고 에테르로 세척하고 진공-건조시켰다.
수율: 20.3 g (이론치의 92％)
d) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-l-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(2-카르복시에틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염
아세트산 무수물 20 ml 및 아세트산 5 ml 중의 3-[2-(tert-부틸옥시카르보닐)에틸]-글루타콘알데히드-디아닐리드-히드로브로마이드(실시예 lc) 1.0 g (2.2 mmol) 및 1-(2-술포네이토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-술폰산(실시예 la) 1.5 g (4.4 mmol)의 현탁액을 아세트산나트륨 0.75 g (9.1 mmol)과 혼합하고 1 시간 동안 120 ℃에서 교반시켰다. 냉각 후, 이를 디에틸 에테르와 혼합하고, 침전된 고형물을 여과하고 크로마토그래피(RP-C18-실리카 겔, 이동 용매 물/메탄올)에 의해 정제하고 생성물을 동결-건조시켰다(0.5 g). 중간 생성물을 디클로로메탄 4 ml/트리플루오로아세트산 l ml 중에서 1 시간 동안 교반시켜서 보호기를 절단하였다. 증발에 의한 농축 및 크로마토그래피 정제(RP-C18-실리카 겔, 이동 용매 물/메탄올) 후, 청색 동결건조물 0.45 g (이론치의 23％)을 수득하였다.
e) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카바모일}에틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염
실시예 ld)의 표제 화합물 0.4 g (0.45 mmol) 및 트리에틸아민 45 mg (0.45 mmol)을 디메틸포름아미드 10 ml에 용해시키고, 0 ℃에서 TBTU 0.15 g (0.45 mmol)과 혼합하고 10 분 동안 교반시켰다. 이어서, 디메틸포름아미드 0.5 ml 중의 트리에틸아민 68 mg (0.68 mmol) 및 N-(2-아미노에틸)말레이미드-트리플루오로아세테이트(문헌[Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445]) 0.17 g (0.68 mmol)의 용액을 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 디에틸 에테르 10 ml를 첨가한 후, 고형물을 원심분리시키고, 건조시키고 크로마토그래피(RP C-18 실리카 겔, 구배: 메탄올/물)에 의해 정제하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.30 g (이론치의 65％).
실시예 2: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(2-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)헥실]카바모일}에틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 III)
실시예 ld)의 표제 화합물 0.4 g (0.45 mmol) 및 N-(6-아미노헥실)말레이미드-트리플루오로아세테이트(문헌[Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445]) 0.21 g (0.68 mmol)로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.38 g (이론치의 81％).
실시예 3: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(2-{[13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-1-일)-4,7,10-트리옥사트리데실]카바모일}에틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 IV)
실시예 ld)의 표제 화합물 0.4 g (0.45 mmol) 및 N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실)말레이미드-트리플루오로아세테이트(문헌[Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445]) 0.28 g (0.68 mmol)로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.27 g (이론치의 51％).
실시예 4: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(4-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)에틸]카바모일}-부틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 V)
a) (3-tert-부톡시카르보닐-프로필)-트리페닐-포스포늄 브로마이드
-40 ℃에서 THF 400 ml 중에서 4-브로모부티르산 50 g (0.30 mol)을 트리플루오로아세트산 무수물 187 g (0.89 mol)과 조금씩 혼합하였다. -40 ℃에서 30 분 동안 교반시킨 후, tert-부탄올 400 ml/THF 30 ml를 1 시간 내에 적가하였다. 실온에서 16 시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 빙-냉각된 탄산나트륨 용액 상에 붓고, 수성상을 디에틸 에테르로 3번 추출하고, 유기상을 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발에 의해 농축하였다. 잔류물을 진공 하에서 증류시켰다(비점 72 ℃/0.9 mbar; 수율: 41 g). 아세토니트릴 250 ml에서 20 시간 동안 중간 생성물 41 g (0.18 mol), 트리페닐포스핀 44.6 g (0.17 mol) 및 중탄산나트륨 32.5 g (0.36 mol)을 환류-가열시켜서 포스포늄염을 형성하는 반응을 수행하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 증발에 의해 농축하고, 디에틸 에테르와 교반시켜서 잔류물을 결정화시켰다. 수율: 백색 고형물 58.5 g (이론치의 40％, 4-브로모부티르산에 대해).
b) 5-피리딘-4-일-펜탄산-t-부틸 에스테르
-40 ℃의 에어-프리 환경 중에서 20 분 이내에 무수 THF 100 ml 중의 (3-tert-부톡시카르보닐-프로필)-트리페닐-포스포늄 브로마이드(실시예 4a) 14 g (28 mmol)의 용액을 부틸리튬(헥산 중 1.6 M) 17.5 ml (28 mmol)와 합하고 1 시간 동안 -40 ℃에서 교반시켰다. THF 20 ml 중의 4-피리딘카르브알데히드 2.78 g (26 mmol)의 용액을 적가하고 16 시간 동안 실온에서 교반시킨 후, 빙수에 붓고, 수성상을 디에틸 에테르로 3번 추출하고, 유기상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 증발에 의해 농축하였다. 크로마토그래피 정제(실리카 겔, 이동 용매 헥산/에틸 아세테이트) 후, 생성물을 E,Z-혼합물('H-NMR 후 4:1; 5.0 g)로서 수득하였다. 이중결합을 수소화시키기 위해, 중간 생성물을 메탄올 200 ml에 용해시키고 실온에서 수소 상에 Pt02 촉매 100 mg과 함께 교반시켰다. 여과 및 증발에 의한 농축 후, 황색 오일을 수득하였다. 수율: 4.9 g (이론치의 74％).
c) 3-[4-(tert-부틸옥시카르보닐)부틸]글루타콘알데히드-디아닐리드-히드로브로마이드
디에틸 에테르 35 ml 중의 5-피리딘-4-일-펜탄산-t-부틸에스테르 4.0 g (17 mmol)의 용액을 아닐린 3.2 g (34 mmol)과 합한 후 0 ℃에서 디에틸 에테르 8 ml 중의 브로모시아노겐 1.9 g (17 mmol)의 용액과 합하였다. 0 ℃에서 3 시간 동안 교반시킨 후, 생성된 적색 고형물을 여과하고, 에테르로 세척하고, 진공-건조시켰다. 수율: 7.8 g (이론치의 95％).
d) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(4-카르복시부틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염
실시예 4c)의 표제 화합물(2.5 mmol) 및 1-(2-술포네이토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-술폰산(5 mmol)으로부터 실시예 ld)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.85 g (이론치의 37％).
e) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(4-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-1-일)에틸]카바모일}-부틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-술포네이트, 내부염
실시예 4d)의 표제 화합물 0.4 g (0.43 mmol)로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.31 g (이론치의 69％).
실시예 5: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(4-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)헥실]카바모일}부틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 VI)
실시예 4d)의 표제 화합물 0.4 g (0.43 mmol) 및 N-(6-아미노헥실)말레이미드트리플루오로아세테이트 0.20 g (0.66 mmol)으로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.35 g (이론치의 74％).
실시예 6: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(4-{[13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-1-일)-4,7,10-트리옥사트리데실]카바모일}부틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 VII)
실시예 ld)의 표제 화합물 0.4 g (0.43 mmol) 및 N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실)말레이미드-트리플루오르아세테이트 0.30 g (0.72 mmol)으로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.27 g (이론치의 52％).
실시예 7: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-l-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)에틸]카바모일}헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 VIII)
a) (3-tert-부톡시카르보닐-펜틸)-트리페닐-포스포늄 브로마이드
실시예 4a)에 기재된 바와 같이 제조하는데, 중간 생성물 6-브로모헥산산-tert-부틸 에스테르를 조 생성물로서 반응시켰다. 6-브로모헥산산 50 g으로부터 점성의 무색 오일로서 생성물 79 g (이론치의 69％)을 수득하였다.
b) 7-피리딘-4-일-헵탄산-t-부틸 에스테르
실시예 4b)에 기재된 바와 같이 제조하였다. (3-tert-부톡시카르보닐-펜틸)-트리페닐-포스포늄 브로마이드(실시예 7a) 25 g (48.7 mmol)으로부터 황색 오일로서 7-피리딘-4-일-헵탄산-t-부틸 에스테르 7.5 g (이론치의 65％)을 수득하였다.
c) 3-[6-(tert-부틸옥시카르보닐)헥실]글루타콘알데히드-디아닐리드-히드로브로마이드
디에틸 에테르 30 ml 중의 7-피리딘-4-일-헵탄산-t-부틸 에스테르 5.0 g (19 mmol)의 용액을 아닐린 3.6 g (38 mmol)과 혼합한 후 0 ℃에서 디에틸 에테르 5 ml 중의 브로모시아노겐 2.1 g (19 mmol)의 용액과 혼합하였다. 0 ℃에서 2.5 시간 동안 교반시킨 후, 생성된 적색 고형물을 여과하고, 에테르로 세척하고, 진공-건조시켰다. 수율: 8.9 g (이론치의 91％).
d) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-l-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-카르복시헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염
실시예 7c)(3 mmol)의 표제 화합물 및 1-(2-술포네이토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-술폰산(6 mmol)로부터 실시예 ld)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 1.5 g (이론치의 54％).
e) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)에틸]카바모일}헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염
실시예 7d)의 표제 화합물 0.4 g (0.43 mmol)로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.31 g (이론치의 69％).
실시예 8: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)헥실]카바모일}헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 IX)
실시예 7d)의 표제 화합물 0.5 g (0.53 mmol) 및 N-(6-아미노헥실)말레이미드트리플루오로아세테이트 0.23 g (0.75 mmol)으로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.42 g (이론치의 70％).
실시예 9: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-l-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-{[13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-1-일)-4,7,10-트리옥사트리데실]카바모일}헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 X)
실시예 7d)의 표제 화합물 0.5 g (0.53 mmol) 및 N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실)말레이미드-트리플루오로아세테이트 0.44 g (1.06 mmol)로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.24 g (이론치의 37％).
실시예 10: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-l-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)에틸]카바모일}-3-옥사-펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 XI)
a) 3-옥사-6-(4-피리디닐)헥산산-tert-부틸 에스테르
톨루엔 400 ml/THF 50 ml 중의 3-(4-피리디닐)-1-프로판올 75 g (0.4 mol)의 용액을 테트라부틸암모늄 술페이트 10 g 및 32％ 수산화나트륨 용액 350 ml와 혼합하였다. 이어서, 브로모아세트산-tert-부틸 에스테르 123 g (0.68 mol)을 적가하고 18 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 유기상을 분리하고, 수성상을 디에틸 에테르로 3번 추출하였다. 합해진 유기상을 NaCl 용액으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 증발에 의해 농축하였다. 크로마토그래피 정제(실리카 겔: 이동 용매 헥산:에틸 아세테이트) 후, 생성물 56 g (이론치의 41％)을 갈색 오일로서 수득하였다.
b) 3-[4-옥사-5-(tert-부틸옥시카르보닐)펜틸]글루타콘알데히드-디아닐리드-히드로브로마이드
디에틸 에테르 60 ml 중의 3-옥사-6-(4-피리디닐)헥산산-tert-부틸 에스테르 5.0 g (20 mmol)의 용액을 아닐린 3.7 g (40 mmol)과 혼합한 후 0 ℃에서 디에틸 에테르 8 ml 중의 브로모시아노겐 2.2 g (20 mmol)의 용액과 혼합하였다. 0 ℃에서 1 시간 동안 교반시킨 후, 디에틸 에테르 50 ml를 혼합하고, 생성된 적색 고형물을 여과하고, 에테르로 세척하고, 진공-건조시켰다. 수율: 청자색(violet)의 고형물 8.5 g (이론치의 85%).
c) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-카르복시-4-옥사헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염
아세트산 무수물 50 ml 및 아세트산 10 ml 중의 3-[2-(tert-부틸옥시카르보닐)에틸]-글루타곤알데히드-디아닐리드-히드로브로마이드(실시예 10b) 3.0 g (6 mmol) 및 1-(2-술포네이토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-술폰산(실시예 la) 4.2 g (12 mmol)의 현탁액을 아세트산나트륨 2.5 g (30 mmol)과 혼합하고 50 분 동안 120 ℃에서 교반시켰다. 냉각 후, 이를 디에틸 에테르와 혼합하고, 침전된 고형물을 여과하고, 아세톤에 흡수성 침전시키고, 고 진공 하에서 건조시켰다. 크로마토그래피 정제(RP-C18-실리카 겔, 이동 용매 물/메탄올), 진공 중의 메탄올 제거 및 동결-건조 후, 표제 화합물을 즉시 수득하였다. 수율: 청색 동결건조물 2.3 g (이론치의 41％).
d) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)에틸]카바모일}-3-옥사-펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염
실시예 lOc)의 표제 화합물 1.0 g (1.1 mmol)로부터 실시예 lc)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물의 0.85 g (이론치의 73％).
실시예 11: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-l-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)헥실]카바모일}-3-옥사-펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 XII)
실시예 10c)의 표제 화합물 0.5 g (0.55 mmol) 및 N-(6-아미노헥실)말레이미드-트리플루오로아세테이트 0.23 g (0.75 mmol)으로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.42 g (이론치의 68％).
실시예 12: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{[13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)-4,7,10-트리옥사트리데실]카바모일}-4-옥사펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 XIII)
실시예 10c)의 표제 화합물 0.5 g (0.55 mmol) 및 N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실)말레이미드-트리플루오로아세테이트 0.46 g (1.06 mmol)으로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.34 g (이론치의 56％).
실시예 13: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카바모일}에틸)-페녹시]시클로헥스-l-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 XIV)
a) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(l-{[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-클로로-시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-술포네이트, 내부염
1-(2-술포네이토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-술폰산(실시예 1a) 5.0 g (14.4 mmol) 및 N-[(3-(아닐리노메틸렌)-2-클로로-1-시클로헥센-1-일)메틸렌]아닐린 히드로클로라이드(알드리치 캄파니(Aldrich Company)) 2.6 g (7.2 mmol)을 1 시간 동안 메탄올 100 ml 중의 무수 아세트산나트륨 2.5 g (30 mmol)과 함께 환류시키고, 냉각시키고, 디에틸 에테르 150 ml와 혼합하고 밤새 교반시켰다. 침전물을 흡입하고, 건조시키고 크로마토그래피(실리카 겔, 구배: 디클로로메탄/메탄올)에 의해 정제하였다. 수율: 청색 고형물 3.8 g (이론치의 58％).
b) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-카르복시에틸)페녹시]시클로헥스-l-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염
디메틸포름아미드 30 ml 중의 3-(4-히드록시페닐)프로피온산 0.37 g (2.2 mmol)을 수소화나트륨(60％ 미네랄 오일 분산액) 0.18 g (4.5 mmol)과 혼합하였다. 실온에서 30 분 동안 교반시킨 후, 0 ℃로 냉각시키고, 디메틸포름아미드 100 ml 중의 실시예 12a)의 표제 화합물 2.0 g (2.2 mmol)의 용액을 적가하고 2 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 혼합물을 드라이 아이스로 켄칭시키고, 진공 중에서 용매를 제거하였다. 잔류물을 메탄올에 용해시키고, 에테르 200 ml와 교반시키고, 침전된 고형물을 여과하였다. 크로마토그래피 정제를 수행하였다(실리카 겔, 구배: 에틸 아세테이트/메탄올). 수율: 청색 고형물 1.9 g (이론치의 83％).
c) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)에틸]카바모일}에틸)-페녹시]시클로헥스-l-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염
실시예 12b)의 표제 화합물 0.1 mg (0.10 mmol)을 트리에틸아민의 존재 하에 TBTU 및 N-(2-아미노에틸)말레이미드-트리플루오로아세테이트와 함께 실시예 le)에 기재된 바와 같이 반응시키고, 수득한 생성물을 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 수율: 청색 동결건조물 93 mg (이론치의 81％).
실시예 14: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-1-일)헥실]카바모일}에틸)-페녹시]시클로헥스-l-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 XV)
실시예 14a)의 표제 화합물 0.7 g (0.68 mmol) 및 N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실)말레이미드-트리플루오르아세테이트 0.53 g (1.22 mmol)으로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.56 g (이론치의 68％).
실시예 15: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-1-일)-4,7,10-트리옥사트리데실]카바모일}에틸)페녹시]시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 XVI)
실시예 14a)의 표제 화합물 0.7 g (0.68 mmol) 및 N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실)말레이미드-트리플루오로아세테이트 0.59 g (1.36 mmol)으로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 2번의 크로마토그래피 정제를 하였다. 수율: 청색 동결건조물 0.67 g (이론치의 75％).
실시예 16: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카바모일}에틸)-페녹시]-5-tert-부틸-시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 XVII)
a) N-[(3-(아닐리노메틸렌)-2-클로로-5-tert-부틸-1-시클로헥센-1-일)메틸렌]아닐린 히드로클로라이드
옥시염화인 6.7 ml (73.4 mmol)를 0 ℃에서 디메틸포름아미드 8 ml에 적가하였다. 이어서, 디클로로메탄 30 ml 중의 4-tert-부틸시클로헥사논 5.0 g (32.4 mmol)의 용액을 적가하고, 반응 혼합물을 3 시간 동안 환류 하에서 교반시켰다. 0 ℃로 냉각시킨 후, 에탄올 5.5 ml 중의 아닐린 6 g (64.8 mmol)을 서서히 적가하고, 혼합물을 빙 200 g 상에 붓고, 진한 염산 5 ml를 교반시키면서 첨가하였다. 침전된 고형물을 여과하고, 에테르로 세척하고 건조시켰다. 수율: 적색 고형물 6.8 g (이론치의 50％).
b) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일l비닐렌}-2-클로로-5-tert-부틸시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염
1-(2-술포네이토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-술폰산(실시예 la) 5.0 g (14.4 mmol) 및 N-[(3-(아닐리노메틸렌)-2-클로로-5-tert-부틸-l-시클로헥센-l-일)메틸렌]아닐린 히드로클로라이드(실시예 16a) 3.0 g (7.2 mmol)을 1.5 시간 동안 메탄올 100 ml 중의 무수 아세트산나트륨 2.5 g (30 mmol)과 환류시키고, 냉각시키고, 디에틸 에테르 200 ml와 혼합하고 밤새 교반시켰다. 침전물을 흡입하고, 건조시키고, 크로마토그래피(실리카 겔, 구배: 디클로로메탄/메탄올)에 의해 정제하였다. 수율: 청색 고형물 4.7 g (이론치의 68％).
c) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-카르복시에틸)페녹시]-5-tert-부틸시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염
실시예 13b)에 기재된 바와 같이 실시예 16b)의 표제 화합물 2.0 g (2.1 mmol)으로부터 반응을 수행하였다. 수율: 1.5 g (이론치의 66％).
d) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-lH-피롤-l-일)에틸]카바모일}에틸)-페녹시]-5-tert-부틸-시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-술포네이트, 내부염
실시예 13c)에 기재된 바와 같이 실시예 16c)의 표제 화합물 1.0 g (0.92 mmol)으로부터 반응을 수행하였다. 크로마토그래피에 의한 정제를 RPC-18 실리카 겔(이동 용매: 아세토니트릴/물)을 사용하여 2번 수행하였다. 수율: 0.24 g (이론치의 22％).
실시예 17 내지 19: 브로모아세틸아미드 기를 포함한 인도트리카르보시아닌 염료의 합성
실시예 17: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-l-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{[6-(브로모아세틸아미노)헥실]카바모일}-4-옥사펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-l-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 XIX)
a) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{(6-아미노헥실)카바모일}-4-옥사펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-술포네이트, 내부염
실시예 10c)의 표제 화합물 0.5 g (0.55 mmol) 및 N-boc-헥산디아민(플루카(Fluka)) 0.15 g (0.70 mmol)으로부터 실시예 le)와 유사하게 합성하였다. 반응 생성물을 크로마토그래피(RP C18-크로마토그래피, 구배: 메탄올/물)에 의해 정제하고 동결-건조시킨 후, 빙 냉각시키면서 트리플루오로아세트산 2 ml/디클로로메탄 8 ml 중에서 15 분 동안 교반시켰다. 진공 하에 회전시킨 후, 잔류물을 메탄올 중에 용해시키고, 디에틸 에테르로 침전시키고 단리하였다. 수율: 청색 고형물 0.26 g (이론치의 41％).
b) 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{[6-(브로모아세틸아미노)헥실]카바모일}-4-옥사펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-술포네이트, 내부염
실시예 18a)의 표제 화합물 0.26 g (0.23 mmol)을 디메틸포름아미드 5 ml 중에서 -20 ℃로 냉각시키고, 트리에틸아민 28 mg (0.28 mmol) 및 디메틸포름아미드 0.2 ml 중의 브로모아세틸 브로마이드 0.10 g (0.46 mmol)의 용액과 혼합하였다. 최고 0 ℃에서 5 시간 동안 교반시킨 후, 디에틸 에테르를 첨가함으로써 생성물을 침전시키고 디메틸포름아미드/디에틸 에테르로부터 반복하여 재-침전시킴으로써 생성물을 수득하고 이어서 건조시켰다. 수율: 청색 고형물 0.23 g (이론치 86％).
실시예 18: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-술포네이토-l-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(3-{[3-(브로모아세틸아미노)프로필]카바모일}-에틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 XVIII)
실시예ld)의 표제 화합물(0.5 g; 0.56 mmol) 및 N-boc-프로필렌디아민으로부터 출발하여 실시예 17과 유사하게 합성하였다. 모든 단계에 걸친 수율: 0.22 g (이론치의 37％).
실시예 19: 삼나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-술포네이토-1-(2-술포네이토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[3-(브로모아세틸아미노)프로필]카바모일}에틸)-페녹시]시클로헥스-l-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-술포네이토에틸)-2,3-디히드로-lH-인돌-5-술포네이트, 내부염 (화학식 XX)
실시예 13b)의 표제 화합물(0.5 g; 0.49 mmol) 및 N-boc-프로필렌디아민으로부터 출발하여 실시예 17과 유사하게 합성하였다. 모든 단계에 걸친 수율: 0.31 g (이론치의 53％).
실시예 20 내지 23: 생체분자와 접합체의 합성 및 접합체의 광물리학적 특성
실시예 20: 실시예 1 내지 16의 표제 화합물을 사용한 BSA(소혈청 알부민)의 표지
일반적인 방법: 인산 완충액(0.1 M Na2HP04/NaH2PO4, pH 6.8) 5 ml 중의 BSA(시그마 캄파니(Sigma Company)) 5 mg (0.074 μmol)의 용액을 각각의 경우마다 실시예 1 내지 16의 표제 화합물 0.74 μmol(PBS 중 0.5 mg/ml의 모액)과 혼합하고 30 분 동안 25 ℃에서 배양하였다. 겔 크로마토그래피(칼럼: 세파덱스(Sephadex) G50, 직경 1.5 cm, 파마시아(Pharmacia), 용리액: PBS)에 의해 접합체를 정제하였다.
실시예 21: 실시예 17 내지 19의 표제 화합물을 사용한 BSA의 표지
일반적인 방법: 인산 완충액(0.1 M 붕산염 완충액, pH 8.5) 5 ml 중의 BSA(시그마 캄파니) 5 mg (0.074 μmol)의 용액을 각각의 경우마다 실시예 17 내지 19의 표제 화합물 1.10 μmol(PBS 중 0.5 mg/ml의 모액)과 혼합하고 5 시간 동안 25 ℃에서 배양하였다. 겔 크로마토그래피(칼럼: 세파덱스 G50, 직경 1.5 cm, 파마시아, 용리액: PBS)에 의해 접합체를 정제하였다.
실시예 22: 실시예 1 내지 16의 표제 화합물을 사용한 항-ED-B-피브로넥틴 scFv 항체 AP39(단일쇄 단편)의 표지
AP39는 C-말단 시스테인을 갖는 scFv이고, 약 56,000 g/mol의 몰 질량을 갖는 공유결합 S-S-이량체(문헌[Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Mar; 5 (2): 204-13])로서 존재한다. 디술피드 가교결합을 환원시킴으로써, 접근가능한 SH 기를 가진 2개의 단량체를 생성하였다(몰 질량 28,000 g/mol).
일반적인 방법: PBS 중의 AP39 용액 0.3 ml(농도: 이량체 0.93 mg/ml)를 PBS 중의 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP) 용액 60 ㎕(2.8 mg/ml)와 혼합하고 질소 하에 1 시간 동안 25 ℃에서 배양하였다. 과량의 TCEP를 NAP-5 칼럼(용리액: PBS) 상에서 겔 여과에 의해 분리하였다. 광도 측정에 의해 측정된 수득한 AP39-단량체의 양(OD280nm = 1.4)은 230 내지 250 ㎍(부피 0.5 내지 0.6 ml)였다. 용액을 실시예 1 내지 16의 표제 화합물 0.03 μmol(PBS 중 0.5 mg/ml의 모액)과 혼합하고 30 분 동안 25 ℃에서 배양하였다. 접합체를 겔 크로마토그래피에 의해 NAP-5 칼럼(용리액: PBS/10％ 글리세롤) 상에서 정제하였다. 접합체 용액의 면역 반응성을 친화성 크로마토그래피(ED-B-피브로넥틴 수지)(문헌[J Immunol Meth 1999, 231, 239])에 의해 측정하였다. 수득한 접합체의 면역 반응성은 80％ 초과하였다(접합 이전의 AP39는 95％ 초과함).
실시예 23: 실시예 17 내지 19의 표제 화합물을 사용한 항-ED-B-피브로넥틴 scFv 항체 AP39(단일쇄 단편)의 표지
일반적인 방법: PBS 중의 AP39 용액 0.3 ml(농도: 이량체 0.93 mg/ml)를 PBS 중의 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP) 용액 60 ㎕(2.8 mg/ml)와 혼합하고 질소 하에 1 시간 동안 25 ℃에서 배양하였다. 과량의 TCEP를 NAP-5 칼럼(용리액: pH 8.5 붕산염 완충액 50 mmol) 상에서 겔 여과에 의해 분리하였다. 광도 측정에 의해 측정된 수득한 AP39-단량체의 양(OD280nm = 1.4)은 230 내지 250 ㎍ (부피 0.5 내지 0.6 ml)였다. 용액을 실시예 17 내지 19의 표제 화합물 0.06 μmol(PBS 중 0.5 mg/ml의 모액)과 혼합하고 4 시간 동안 25 ℃에서 배양하였다. 접합체를 겔 크로마토그래피에 의해 NAP-5 칼럼(용리액: PBS/10％ 글리세롤) 상에서 정제하였다. 접합체 용액의 면역 반응성을 친화성 크로마토그래피(ED-B-피브로넥틴 수지)(문헌[J Immunol Meth 1999, 231, 239])에 의해 측정하였다. 수득한 접합체의 면역 반응성은 75％ 초과하였다(접합 이전의 AP39는 95％ 초과함).
실시예 21 및 22의 염료-BSA-접합체 및 실시예 23 및 24의 염료-scFv 항체 접합체의 광물리학적 특성화.
농도 수치(염료/항체 몰비)를 단파장 흡수 숄더(약 690 내지 710 nm) 내에서 75000 L mol-1cm-1의 흡광 계수에 기초하여 광도 측정에 의해 측정; 항체 흡수(AP39)를 1.4값의 OD280nm로 측정; 및/또는 단백질 흡수(BSA)는 0.58값의 OD277nm로 측정하였다. 형광 양자 수율은 인도시아닌 그린(Green)(DMSO 중 Q = 0.13, 문헌[J Chem Eng Data 1977, 22,379], [Bioconjugate Chem 2001, 12, 44])에 대한 스펙스 플루오로로그(SPEX fluorolog)(램프 및 검출기에 의해 검량된 파장-의존성 감광도)를 사용하여 측정하였다.
본 발명에 따른 접합체의 특성
물질 (생체분자/샘플 화합물) 농축 수치 흡수 최대치 (nm) 형광 최대치 (nm) 형광 양자 수율
실시예 20
K1 BSA 및 실시예 2의 표제 화합물로부터의 접합체 0.5 766 790 0.13
K2 BSA 및 실시예 4의 표제 화합물로부터의 접합체 0.6 767 792 0.16
K3 BSA 및 실시예 5의 표제 화합물로부터의 접합체 0.7 765 790 0.15
K4 BSA 및 실시예 10의 표제 화합물로부터의 접합체 0.5 766 789 측정되지 않음
K5 BSA 및 실시예 11의 표제 화합물로부터의 접합체 0.5 768 790 0.14
K6 BSA 및 실시예 13의 표제 화합물로부터의 접합체 0.4 772 793 0.11
K7 BSA 및 실시예 16의 표제 화합물로부터의 접합체 0.4 772 793 측정되지 않음
실시예 21
K8 BSA 및 실시예 17의 표제 화합물로부터의 접합체 0.3 768 790 0.15
실시예 22
K9 AP39 및 실시예 1의 표제 화합물로부터의 접합체 1.1 768 794 0.14
K10 AP39 및 실시예 2의 표제 화합물로부터의 접합체 1.0 767 793 0.12
K11 AP39 및 실시예 4의 표제 화합물로부터의 접합체 0.8 767 792 0.12
K12 AP39 및 실시예 5의 표제 화합물로부터의 접합체 0.9 768 794 0.14
K13 AP39 및 실시예 6의 표제 화합물로부터의 접합체 1.1 769 792 0.10
K14 AP39 및 실시예 7의 표제 화합물로부터의 접합체 1.0 769 792 측정되지 않음
K15 AP39 및 실시예 10의 표제 화합물로부터의 접합체 1.1 767 790 0.13
K16 AP39 및 실시예 11의 표제 화합물로부터의 접합체 1.1 767 789 0.15
K17 AP39 및 실시예 12의 표제 화합물로부터의 접합체 0.9 766 790 0.11
K18 AP39 및 실시예 13의 표제 화합물로부터의 접합체 1.2 771 795 0.10
K19 AP39 및 실시예 14의 표제 화합물로부터의 접합체 1.1 772 796 0.09
실시예 23
K20 AP39 및 실시예 17의 표제 화합물로부터의 접합체 0.7 767 790 0.18
K21 AP39 및 실시예 19의 표제 화합물로부터의 접합체 0.8 773 794 0.13
실시예 24:
본 발명에 따른 접합체의 영상화 특성을 종양-보유 무모(hairless) 마우스에 주입 후 생체내에서 검사하였다. 상기 목적을 위해, 접합체를 정맥내 투여하고, 종양 부위 내 농도를 0 내지 24 시간의 기간 동안 관찰하였다. 상기 물질의 형광은 레이저 다이오드(0.5 W 출력)로 생성된 740 nm 파장의 근적외선 광선으로 부분 조사함으로써 여기시켰다. 형광 방사선은 강화 CCD 카메라에 의해 측정하고, 형광 영상은 디지털 방식으로 저장하였다. 염료 접합체의 생체내 효율성을 실시예에 기초하여 도 2에 도시하였다.
추가적으로 정교화하지 않고, 당업자들은 상기 기재한 바를 사용하여 본 발명의 내용 전부를 이용할 수 있을 것이다. 그러므로 하기 바람직하고 특별한 실시양태들은 단지 예시로서 해석되며, 어떤 식으로든 개시문의 다른 부분을 제한하는 것이 아니다.
상기 및 하기 실시예에서 달리 언급하지 않는 한, 모든 온도는 보정하지 않고 섭씨(Celsius) 온도로 기재되고, 모든 비율 및 백분율은 중량비이다.
본원에 인용된 모든 출원, 특허 및 문헌의 개시문 전문이 본원에 참고로 포함된다.
상기 실시예에서 사용된 것들을 대신하여 일반적으로 또는 특별하게 기재된 본 발명의 실시 조건 및/또는 시약을 사용함으로써 상기 실시예를 유사한 성공률로 반복할 수 있다.
상기 설명으로부터, 당업자는 발명의 중요한 특징을 쉽게 확인하고, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 용도 및 상태에 맞추기 위해 본 발명을 다양하게 변화시키고 변형시킬 수 있다.

Claims (34)

  1. 하기 화학식 I의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 I>
    상기 식에서,
    X는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 및/또는 부틸로부터 선택될 수 있는 치환기에 의해 2개 치환되는 O, S 또는 C이고,
    Y는 CH2-CH2 또는 CH2-CH2-CH2이고,
    Z는 C 원자가 O 또는 S에 의해 임의로 치환되는 Cl 내지 C5-알킬이거나, 또는
    이고,
    Rl 내지 R4는 서로 독립적으로 SO3H 또는 H이되, Rl 내지 R4 중 적어도 3개가 S03H이며,
    R5는 -CO-NH-R8-R9, -NH-CS-NH-R8-R9 또는 -NH-CO-R8-R9이고, 여기서 R8은 C 원자가 O 또는 S에 의해 임의로 치환되는, 비분지쇄 C2 내지 Cl3-알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, R9는
    ,클로로아세틸, 브로모아세틸, 요오도아세틸, 클로로아세트아미도, 요오도아세트아미도, 클로로알킬, 브로모알킬, 요오도알킬, 피리딜 디술피드 및 비닐 술폰아미드로부터 선택되고,
    R6 및 R7는 CH이거나, 또는 파라-위치에서 Cl 내지 C4-알킬 라디칼로 임의로 치환될 수 있는 C3-알킬에 의해 헥실 고리에 연결된다.
  2. 제1항에 있어서, Y가 CH2-CH2이고, Z가 C 원자가 O 또는 S에 의해 임의로 치환되는 Cl 내지 C5-알킬이고, R6 및 R7가 CH인 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Z가 Cl 내지 C5-알킬인 인도트리카르보시아닌 염료.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, Z가
    이고,
    R6 및 R7가 C3-알킬을 통해 헥실 고리에 연결된 인도트리카르보시아닌 염료.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R5가 COOH 또는 NH2인 인도트리카르보시아닌 염료.
  6. 제3항에 있어서, 하기 화학식 II의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 II>
  7. 제3항에 있어서, 하기 화학식 III의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 III>
  8. 제3항에 있어서, 하기 화학식 IV의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 IV>
  9. 제3항에 있어서, 하기 화학식 V의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 V>
  10. 제3항에 있어서, 하기 화학식 VI의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 VI>
  11. 제3항에 있어서, 하기 화학식 VII의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 VII>
  12. 제3항에 있어서, 하기 화학식 VIII의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 VIII>
  13. 제3항에 있어서, 하기 화학식 IX의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 IX>
  14. 제3항에 있어서, 하기 화학식 X의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 X>
  15. 제2항에 있어서, 하기 화학식 XI의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 XI>
  16. 제2항에 있어서, 하기 화학식 XII의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 XII>
  17. 제2항에 있어서, 하기 화학식 XIII의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 XIII>
  18. 제4항에 있어서, 하기 화학식 XIV의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 XIV>
  19. 제4항에 있어서, 하기 화학식 XV의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 XV>
  20. 제4항에 있어서, 하기 화학식 XVI의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 XVI>
  21. 제4항에 있어서, 하기 화학식 XVII의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 XVII>
  22. 제3항에 있어서, 하기 화학식 XVIII의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 XVIII>
  23. 제2항에 있어서, 하기 화학식 XIX의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 XIX>
  24. 제4항에 있어서, 하기 화학식 XX의 인도트리카르보시아닌 염료 또는 상기 화합물의 염 및 용매화물.
    <화학식 XX>
  25. a) 하나 이상의 4-치환된 피리딘의 제조,
    b) 진케-쾨니크(Zincke-Koenig) 반응에 의해, 하나 이상의 4-치환된 피리딘을 시아닌 염료의 전구체로서 메조-치환된 글루타콘알데히드-디아닐리드로 전환, 및
    c) 시아닌 염료의 전구체로서 메조-치환된 글루타콘알데히드-디아닐리드를 수득하는 것을 포함하는 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 인도트리카르보시아닌 염료의 제조 방법.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 인도트리카르보시아닌 염료와 생체분자의 커플링을 포함하는 접합체의 제조 방법.
  27. 제26항에 따라 제조된 생체분자와 인도트리카르보시아닌 염료의 접합체.
  28. 제27항에 있어서, 생체분자로서 펩티드, 단백질, 지단백질, 항체 또는 항체 단편, 핵산, 예컨대, DNA 또는 RNA로부터의 올리고뉴클레이티드 또는 폴리뉴클레이티드, 아프타머, PNA, 및 당, 예컨대, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당 및 다당류로부터 선택된 생체분자 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  29. 제28항에 있어서, 단백질이 신체의 골격 단백질 및 가용성 단백질 군으로부터 선택된 접합체.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 가용성 단백질이 HSA와 같은 혈청 단백질, BSA, 난(egg) 알부민, 과산화효소와 같은 효소, 또는 항체, scFv 단편 또는 F(ab)인 접합체.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 단백질이 ED-B-피브로넥틴에 대한 친화성을 갖는 접합체.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인도트리카르보시아닌 염료가 SH 기, 특히 시스테인의 SH 기를 통해 생체분자와 커플링된 접합체.
  33. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 인도트리카르보시아닌 염료 및/또는 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 접합체와, 특히 종양의 생체내 진단을 위한 추가의 아주반트(adjuvant)를 포함하는 진단 키트.
  34. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 접합체의 종양의 생체내 진단을 위한 형광 조영제로서의 용도.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101228147B1 (ko) * 2010-08-13 2013-01-31 국립암센터 방사성 동위원소가 표지되고 근적외선 영역의 형광색소 및 가시광선 영역의 색소가 결합된 알부민을 포함하는 감시림프절 표지자
KR20210013558A (ko) * 2018-05-29 2021-02-04 쑤저우 바이위안 젠트 코., 엘티디. 형광 염료, 그 제조 방법 및 응용

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7597878B2 (en) * 2000-09-19 2009-10-06 Li-Cor, Inc. Optical fluorescent imaging
DE602004009169D1 (de) * 2004-07-22 2007-11-08 Bayer Schering Pharma Ag Verwendung von Cyanin-farbstoffen zur Diagnose von Krankheiten, welche mit Angiogenese assoziert sind
EP1679082A1 (en) * 2005-01-07 2006-07-12 Schering AG Use of cyanine dyes for the diagnosis of proliferative diseases
FR2889700B1 (fr) * 2005-08-11 2012-11-23 Synthinnove Lab Marqueurs, leur procede de fabrication et leurs applications
EP1760467A1 (en) * 2005-09-02 2007-03-07 Schering AG Optically fluorescent nanoparticles
US7972789B2 (en) 2005-11-28 2011-07-05 Dako Denmark A/S Dye compounds
JPWO2007091661A1 (ja) * 2006-02-08 2009-07-02 独立行政法人産業技術総合研究所 分子イメージングに適した糖鎖修飾リポソームならびにその利用および製造
JP5643514B2 (ja) * 2007-02-09 2014-12-17 ビセン メディカル， インコーポレイテッド ポリシクロ染料およびその使用
WO2009023813A1 (en) * 2007-08-15 2009-02-19 Applied Soil Water Technologies Llc Metals recovery from mining heap leach ore
US20090214436A1 (en) 2008-02-18 2009-08-27 Washington University Dichromic fluorescent compounds
KR101043407B1 (ko) * 2009-02-19 2011-06-22 한국과학기술연구원 암 표적성이 우수한 단백질 복합체 및 이의 제조방법
JP2011046663A (ja) 2009-08-28 2011-03-10 Fujifilm Corp 近赤外蛍光造影剤
WO2012054784A1 (en) 2010-10-20 2012-04-26 Li-Cor, Inc. Fluorescent imaging with substituted cyanine dyes
EP2655327B1 (en) 2010-12-21 2016-02-24 Pierce Biotechnology, Inc. Fluorescent compounds
US8889884B1 (en) 2011-07-14 2014-11-18 Pierce Biotechnology, Inc. Phosphine derivatives of fluorescent compounds
US9249307B2 (en) * 2011-08-16 2016-02-02 Pierce Biotechnology, Inc. Benzocyanine compounds
EP2771333A4 (en) * 2011-09-23 2015-05-20 Li Cor Inc APPLICATION OF REDUCED DYES IN IMAGING
WO2013112554A1 (en) 2012-01-23 2013-08-01 Washington University Goggle imaging systems and methods
US9751868B2 (en) 2012-02-28 2017-09-05 Pierce Biotechnology, Inc. Benzocyanine compounds
EP3081564B1 (en) * 2012-03-02 2019-07-10 Pierce Biotechnology, Inc. Indole derivatives as labeling dye for biomolecule
US10041950B2 (en) 2012-03-27 2018-08-07 Ventana Medical Systems, Inc. Signaling conjugates and methods of use
US9676787B2 (en) 2012-08-28 2017-06-13 Pierce Biotechnology, Inc. Benzopyrylium compounds
EA201690195A1 (ru) 2013-08-12 2016-05-31 Дженентек, Инк. Конъюгатные соединения антитело-лекарство на основе димера 1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1h-бензо[e]индола и способы применения и лечения
MX2016007578A (es) 2013-12-16 2016-10-03 Genentech Inc Compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco dimerico de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1h-benzo [e] indol, y metodos de uso y tratamiento.
TWI758784B (zh) 2014-09-12 2022-03-21 美商建南德克公司 抗her2抗體及免疫結合物
EP3001197A1 (en) * 2014-09-23 2016-03-30 Universität Heidelberg Fluorescent protein stains
US10806804B2 (en) 2015-05-06 2020-10-20 Washington University Compounds having RD targeting motifs and methods of use thereof
JP6752582B2 (ja) * 2016-02-08 2020-09-09 キヤノン株式会社 光音響イメージング用造影剤
EP3646032A1 (en) * 2017-06-27 2020-05-06 Coriolis Pharma Research GmbH Polysorbate quantification assay
CN107955392B (zh) * 2017-12-05 2019-04-16 大连理工大学 一类具有长寿命三重激发态的近红外氨基菁染料及其制备方法
WO2021119423A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Washington University Near infrared fluorescent dyes, formulations and related methods
US20230098702A1 (en) * 2020-02-10 2023-03-30 C-Biomex Co., Ltd. Amphoteric fluorescent substance capable of being attached to biomaterials
EP4168492A1 (en) 2020-06-23 2023-04-26 Bracco Imaging SPA Near-infrared cyanine dyes and conjugates thereof
WO2022265043A1 (ja) * 2021-06-18 2022-12-22 富士フイルム株式会社 化合物及びこれを用いた標識生体物質

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5242680A (en) * 1991-08-23 1993-09-07 Merck & Co., Inc. Thiol-reactive maleimido-based radiolabeling reagents
DE4445065A1 (de) * 1994-12-07 1996-06-13 Diagnostikforschung Inst Verfahren zur In-vivo-Diagnostik mittels NIR-Strahlung
DE19717904A1 (de) * 1997-04-23 1998-10-29 Diagnostikforschung Inst Säurelabile und enzymatisch spaltbare Farbstoffkonstrukte zur Diagnostik mit Nahinfrarotlicht und zur Therapie
GB9710049D0 (en) * 1997-05-19 1997-07-09 Nycomed Imaging As Method
JP2000095758A (ja) * 1998-09-18 2000-04-04 Schering Ag 近赤外蛍光造影剤および蛍光造影方法
ATE352586T2 (de) * 2000-09-29 2007-02-15 Molecular Probes Inc Modifizierte carbocyaninfarbstoffe und deren konjugate
US6733744B1 (en) * 2000-10-16 2004-05-11 Mallinckrodt Inc. Indole compounds as minimally invasive physiological function monitoring agents
WO2002038190A2 (en) * 2000-10-27 2002-05-16 Beth Israel Deaconess Medical Center Non-isotopic detection of osteoblastic activity in vivo using modified bisphosphonates
US20040022731A1 (en) * 2002-04-26 2004-02-05 Alexei Bogdanov In vivo imaging of apoptosis

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101228147B1 (ko) * 2010-08-13 2013-01-31 국립암센터 방사성 동위원소가 표지되고 근적외선 영역의 형광색소 및 가시광선 영역의 색소가 결합된 알부민을 포함하는 감시림프절 표지자
KR20210013558A (ko) * 2018-05-29 2021-02-04 쑤저우 바이위안 젠트 코., 엘티디. 형광 염료, 그 제조 방법 및 응용

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