KR100336182B1

KR100336182B1 - 하이드록시신남산 유도체 또는 이를 포함하는 당귀추출물을 함유하는 치매 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100336182B1
Application number: KR1020000019330A
Authority: KR
Inventors: 김영희; 송동근; 서홍원; 허성오
Original assignee: 이희설; 주식회사 싸이제닉; 송동근; 주식회사 바이오시너젠
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2002-05-10
Also published as: EP1175208A4; AU4147800A; EP1175208A1; ATE301460T1; CN1347316A; KR20000071673A; DE60021873T2; EP1175208B1; JP4350910B2; US20050163879A1; JP2002541194A; DE60021873D1; BR0010119A; EA005565B1; US20060159790A1; WO2000061131A1; ES2246845T3; EA200101077A1

Abstract

본 발명은 유효성분으로서 하기 화학식 1의 하이드록시신남산(hydroxycinnamic acid) 유도체, 데커시놀, 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 이들을 포함하는 당귀 추출물을 함유하는 치매 예방 및 치료용 약학 조성물 및 식품에 관한 것으로, 본 발명의 약학 조성물 및 식품은 치매의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 식에서,

R¹은 H 또는 CH₃이고,

R²는 -CH=CHCOOH 또는

Description

하이드록시신남산 유도체 또는 이를 포함하는 당귀 추출물을 함유하는 치매 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DEMENTIA COMPRISING A HYDROXYCINNAMIC ACID DERIVATIVE OR AN EXTRACT OF A PLANT OF GENUS ANGELICAE COMPRISING SAME}

최근 노령 인구의 급격한 증가로 인해 노화와 관련된 노인성 치매(senile dementia)의 발생이 심각한 사회 문제로 대두되고 있다. 이 질환은 발병율이 높은데도 불구하고 현재 뚜렷한 치료제 및 예방제가 없어 막대한 사회경제적인 손실을 유발하고 있다.

알쯔하이머 병은 노인성 치매중에서 가장 중요한 질환으로, 베타아밀로이드(Aβ_1-42)의 뇌내 축적과 그로 인한 신경독성이 발병의 매우 중요한 원인으로 알려져 있다(Selkoe,Annu. Rev. Neurosci.,17, 489-517(1994)). 지금까지, 알쯔하이머 병의 예방 및 치료를 위해 알쯔하이머 병의 원인물질로 알려진 베타아밀로이드의 독성을 차단할 수 있는 물질을 개발하려는 노력이 계속되고 있으나 아직까지는 효과적인 치료제가 개발되지 못했다.

한편, 당귀는 한방에서 심장, 간장, 비장의 치료에 사용되는 약재로, 오래 전부터 식용으로 사용되어 왔으나 치매 예방이나 치료에 대한 효과는 보고된 바 없다.

본 발명의 목적은 치매의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 치매의 예방 및 치료 효과가 있는 기능성 식품을 제공하는 것이다.

도 1a 및 1b는 참당귀 추출물 중 데커시놀과 페룰린산의 존재를 HPLC로 확인한 크로마토그램이고,

도 2a는 농도를 달리하여 당귀 추출물을 투여한 쥐에서 수동회피반응 결과를 나타내는 그래프이고, 도 2b는 투여기간을 달리하여 당귀 추출물을 투여한 쥐에서 수동회피반응 결과를 나타내는 그래프이며,

도 3a는 농도를 달리하여 페룰린산을 투여한 쥐에서 수동회피반응 결과를 나타내는 그래프이고, 도 3b는 투여기간을 달리하여 페룰린산을 투여한 쥐에서 수동회피반응 결과를 나타내는 그래프이며,

도 4a 및 4b는 투여기간을 달리하여 페룰린산을 투여한 쥐를 이용한 Y-미로 시험에서 교차활동량(%) 및 통로를 통과한 전체횟수를 각각 나타내는 그래프이고,

도 5는 페룰린산 또는 이소페룰린산을 투여한 쥐에서 수동회피반응 결과를 나타내는 그래프이고,

도 6a, 6b 및 6c는 각각 농도를 달리하여 데커시놀을 투여한 쥐에서 수동회피반응 결과, Y-미로 시험시 교차활동량(%) 및 통로를 통과한 전체횟수를 나타내는 그래프이고,

도 7a 내지 7b는 페룰린산과 데커시놀의 상승작용을 보여주는 수동회피반응 결과를 나타내는 그래프이고,

도 8a 내지 8f는 베타아밀로이드(1-42) 주사 1일 후의 생쥐의 이상피질(pyriform cortex)과 편도양핵(amygdaloid nucleus)에서 OX-42의 면역화학염색 결과를 나타낸 것이고,

도 9a 내지 9c는 베타아밀로이드(1-42) 주사 5일 후의 생쥐 중격핵에서 콜린 아세틸트랜스퍼레이즈(choline acetyltransferase; ChAT)의 면역화학염색 결과를 나타낸 것이고,

도 10은 페룰린산의 투여가 베타아밀로이드(1-42)의 투여로 인한 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase; LDH)의 농도 증가에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 유효성분으로서 하기 화학식 1의 하이드록시신남산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 치매 예방 및 치료용 약학 조성물이 제공된다.

화학식 1

상기 식에서,

R¹은 H 또는 CH₃이고,

R²는 -CH=CHCOOH 또는이다.

상기 화학식 1의 하이드록시신남산 유도체로는 페룰린산(ferulic acid), 이소페룰린산(isoferulic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid), 카페인산(caffeic acid) 등을 예로 들 수 있다.

또한, 본 발명에서는 유효성분으로서 데커시놀 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 치매 예방 및 치료용 약학 조성물이 제공된다.

상기 화학식 1의 하이드록시신남산 유도체 및 데커시놀은 문헌(전통약물로부터 신약개발연구법, 서울대학교 천연물과학연구소 발행)의 방법에 따라 당귀로부터분리하여 얻거나, 문헌(Merck Index 등)의 방법에 따라 합성하거나, 상업적으로 입수할 수도 있다.

상기 화학식 1의 하이드록시신남산 유도체 및 데커시놀은 통상적인 방법에 따라, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염 및 칼슘염과 같은 무기염, 안젤산(angelic acid), 라이신, 에탄올아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민 및 α-토코페롤과의 유기염, 및 트리테르펜 알콜(triterpene alcohol) 또는 식물 스테롤(plant sterols), 예를 들어, 사이클로아테놀(cycloartenol)과의 에스테르('오리자놀(oryzanol)') 등 당업계에 공지된 다양한 약학적으로 허용되는 염의 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 화학식 1의 하이드록시신남산 유도체 또는 데커시놀을 포함하는 당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매 예방 및 치료용 약학 조성물이 제공된다. 본 발명의 당귀의 예로서는 상기 화합물을 함유하는 참당귀(Angelica gigasNakai), 왜당귀(Angelica acutilobaKitagawa), 중국당귀(Angelica sinensisDiels) 등을 들 수 있다(생약의 품질평가, 천연약물연구회).

본 발명의 당귀 추출물은 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있으며, 예를 들어, 당귀의 근경에 메탄올, 에탄올 등의 저급 알콜, 바람직하게는 80% 메탄올을 가하고 5 내지 80℃, 바람직하게는 30 내지 55℃에서 15분 내지 48 시간, 바람직하게는 30분 내지 12 시간 동안 추출하여 얻을 수 있다. 이와 같이 얻어진 당귀 추출물은 페룰린산(ferulic acid)과 데커시놀(decursinol)을 포함하며, 이들의 함량은추출물 총 중량에 대하여 각각 0.01 내지 0.9 wt% 및 0.1 내지 10 wt%이다. 또한, 추출 용매로서 아세톤, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드 등의 유기용매를 사용할 수도 있으며, 얻어진 추출물을 감압건조시켜 분말 형태로 만들 수도 있다.

화학식 1의 하이드록시신남산 유도체, 데커시놀 또는 이들을 포함하는 당귀 추출물은 베타아밀로이드 1-42를 생쥐의 뇌실내로 직접 투여함으로써 기억력이 감소된 알쯔하이머 질환 모델에서 알쯔하이머병에 대한 예방 및 치료 효과를 나타내며, 그 효과는 투여량에 비례하여 증가한다.

상기와 같은 알쯔하이머병의 생쥐모델에서는 행동학적으로 수동회피반응 및 Y-미로 검사에서 기억감소 효과가 관찰된다. 그런데, 본 발명의 하이드록시신남산 유도체, 데커시놀 또는 이들을 포함하는 당귀 추출물을 예방적으로 투여한 쥐에서는 뇌실내 베타아밀로이드 1-42 투여에 의한 기억감소가 효과적으로 방지된다.

생쥐의 뇌실내에 베타아밀로이드 1-42를 투여함으로써 유발되는 조직학적 변화를 면역 화학염색법으로 조사하면, 소교세포(microglia)의 표지 물질인 OX-42에 대한 면역화학염색이 대뇌피질에서 일시적으로 증가하였다가 정상으로 회복됨을 확인할 수 있다. 또한, 베타아밀로이드 1-42의 투여에 의해 아세틸콜린 합성효소인 콜린아세틸트랜스퍼레이즈(cholineacetyltransferase; ChAT)의 농도가 감소한다.

그러나, 뇌실내로 베타아밀로이드 1-42를 투여하기 전에 본 발명의 하이드록시신남산 유도체, 데커시놀 또는 이들을 포함하는 당귀 추출물을 투여한 생쥐에서는, 이 물질을 투여하지 않은 경우에 비해 소교세포의 OX-42의 증가 정도가 매우 현저히 감소한다. 또한 베타아밀로이드 1-42의 투여에 의한 ChAT 농도의 감소가 방지된다.

즉, 본 발명의 하이드록시신남산 유도체, 데커시놀 또는 이들을 포함하는 당귀 추출물은 베타아밀로이드에 의한 신경독성 유발에 중요한 역할을 하는 소교세포의 활성을 억제함으로써 뇌조직을 보호할 수 있으며, 또한 베타아밀로이드에 의한 ChAT 감소를 방지하여 뇌보호작용을 나타냄으로써 치매 예방 및 치료 효과를 나타낸다.

상기와 같은 유효성에도 불구하고, 화학식 1의 하이드록시신남산 유도체, 데커시놀 및 이들을 포함하는 당귀 추출물은 랫트를 사용한 시험에서 급성 독성 등의 독성을 전혀 나타내지 않으며 간 기능에 부작용을 보이지 않는다.

화학식 1의 하이드록시신남산 유도체, 데커시놀 및 이들을 포함하는 당귀 추출물을 통상적인 방법에 따라 적절한 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 치매 치료용 약학 조성물을 제조할 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말,새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 하이드록시신남산 유도체의 통상적인 1일 투여량은 0.5 내지 50 ㎎/㎏ 체중의 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 데커시놀의 경우 통상적인 1일 투여량은 0.3 내지 30 ㎎/㎏ 체중의 범위이고, 당귀 추출물의 경우에는 5 내지 500 ㎎/㎏ 체중의 범위이다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 하이드록시신남산 유도체, 데커시놀 또는 당귀 추출물은 치매 예방 또는 치료 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 유효량의 화학식 1의 하이드록시신남산 유도체, 데커시놀 또는 당귀 추출물을 포함하는, 치매 예방 또는 치료효과를 나타내는 식품 또는 음료 조성물을 제공한다. 치매 예방 식품 개발을 위하여 본 발명의 하이드록시신남산 유도체, 데커시놀 또는 당귀 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

화학식 1의 하이드록시신남산 유도체, 데커시놀 또는 당귀 추출물을 식품 제조시 원료 물질에 첨가하거나 조리된 식품에 적절히 혼합하여 치매 예방 또는 치료효과가 있는 식품을 제조할 수 있으며, 이 경우, 최종적으로 제조된 식품 또는 음료 중에 하이드록시신남산 유도체의 함량은 0.05 내지 10 % 범위일 수 있고, 데커시놀의 함량은 0.05 내지 10 %, 당귀 추출물의 함량은 1 내지 40 %의 범위일 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

또한, 하기 실시예에서 고체와 고체 혼합물, 액체와 액체, 및 액체와 고체에 대한 하기 백분율은 각각 중량/중량, 부피/부피 및 중량/부피에 기초한 것이며 특별한 언급이 없는 한 모든 반응은 실온에서 수행하였다.

참고예 1: 뇌실 내 주사

문헌(Laursen & Belknap,J. Pharmacol. Methods,16, 355-357(1986))에 기재된 방법에 따라, 50 ㎕ 해밀턴 주사기에 26 게이지 주사바늘을 꽂고 주사끝 2.4 mm을 생쥐의 두정(bregma)에 삽입하여 1.85 ㎍/5 ㎕의 베타아밀로이드(1-42) 또는 베타아밀로이드(40-1)를 뇌실내로 투여하였다. 대조군에는 베타아밀로이드(40-1)를 동량으로 주사하였다. 뇌실 내 주사후 1-2일에 수동회피검사를 실시하고(1일: 훈련, 2일: 검사), 3-4일에는 Y-미로실험을 실시하였다(3일: 훈련, 4일: 검사).

참고예 2: 수동회피검사(passive avoidance test)

수동회피검사를 통하여 학습, 기억력을 평가하였다. 수동회피검사는문헌(Song 등,J. Neurochem., 71, 875-878(1998))에 기재된 방법에 따라 다음과 같이 실시하였다.

시험에는 밝게 조명된 방과 어두운 방으로 이루어지고 바닥에는 전기충격을 줄 수 있도록 장치된 수동회피상자를 사용하였다. 먼저 생쥐를 밝은 방에 놓고 생쥐가 어두운 방으로 들어가는 즉시 0.25 mA로 1초간 전기충격을 주었다. 훈련 후 24시간 뒤 생쥐를 밝은 방에 놓고 어두운 방으로 들어가기까지의 시간을 측정하여 수동회피반응시간으로 하였다. 최대 제한시간은 300초로 하는데, 300초가 넘도록 어두운 방으로 들어가지 않으면 수동회피반응시간을 300초로 결정하였다.

참고예 3: Y-미로

Y-미로를 통하여 자발적인 교차행동량(alternation behavior)을 평가하였다. Y-미로는 문헌(Starter 등,Psychopharmacology, 94, 491-495(1988))에 기재된 방법에 따라 다음과 같이 실시하였다.

Y-미로는 영문 Y 자 모양의 세 개의 통로로 이루어졌다. 한 통로의 끝에 생쥐의 머리부분이 향하도록 두고 8분 동안 자유로이 세 개의 통로에서 왕래시켰다. 교차횟수는 생쥐가 연속적으로 세 통로를 통과하였을 때 한번 교차한 것으로 하였다. 자발적인 교차행동량은 교차횟수와 통로를 통과한 전체횟수(number of arm entries)의 백분비로 계산하였다.

실시예 1: 당귀 추출물의 제조

잘게 썬 참당귀 근경 1 kg에 80 % 메탄올 2 L를 가하고 수용액 상에서 40℃에서 2시간 동안 추출하는 과정을 2회 반복하였다. 추출물을 모으고, 감압 환류 냉각관을 사용하여 메탄올로부터 수분을 증발시킨 후, 감압 건조기로 완전히 건조시켜 당귀 추출물 290 g을 얻었다. 본 실시예에서 얻은 당귀 추출물은 HPLC를 사용한 성분분석 결과 주요 성분으로서 데커시놀 및 페룰린산을 각각 0.5 및 0.07 중량%씩 함유하였다(도 1a 및 도 1b). 이때 HPLC 조건은 다음과 같았다:

데커시놀

컬럼: Si60(7 ㎛, 250 mm × 4 mm); 용출액: n-헥산:EtoAc=1:1; 유속: 1.0 ml/분; 검출기: UV 340 nm

페룰린산

컬럼: RP-18(7 ㎛, 250 mm × 4 mm); 용출액: MeOH:물=1:3.5; 유속: 1.0 ml/분; 검출기: UV 258 nm.

또한, 왜당귀 및 중국당귀를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 추출물을 수득하였으며, HPLC를 이용한 성분분석 결과 이 추출물들이 페룰린산과 데커시놀을 포함함을 확인하였다.

실시예 2: 당귀 추출물의 치매 예방 효과

4-5주령의 생쥐(체중 20-25 g) 40마리를 각 군별로 10마리씩 4개의 군으로 나누었다. 실시예 1에서 얻은 당귀 추출물을 각각 0.08 %(w/v), 0.1 %(w/v) 농도로 물에 녹인 후 두 군의 생쥐에게 물 대신 4주 동안 섭취시켰으며, 그 결과 마리당 매일 약 8 ㎖가 투여되었다. 다른 두 군의 생쥐들에게는 보통의 물을 4주 동안 공급하였다. 그 후, 참고예 1의 방법에 따라, 당귀 추출물을 투여하지 않은 군 중 한 군(대조군)의 생쥐들에게는 베타아밀로이드(42-1)를, 나머지 세 군의 생쥐들에게는 베타아밀로이드(1-42)(Aβ_1-42)를 각각 1.85 ㎍씩 뇌실 내에 투여하였다. 뇌실 내 주사후 참고예 2에서와 같이 수동회피실험을 실시하였다. 10마리에서 평균값을 구하였으며 결과는 도 2a에 나타나 있다.

도 2a에서 볼 수 있는 바와 같이, 베타아밀로이드(1-42)투여군은 대조군에 비해 수동회피반응시간이 유의하게 감소하였다(P<0.05). 또한, 당귀 추출물을 0.08 % 또는 0.1 % 농도로 투여한 군에서 수동회피반응은 베타아밀로이드(1-42)투여군에 비하여 유의하게 증가하였다(P<0.05).

한편, 0.1 % 농도의 당귀 추출물을 1, 2, 4주 동안 투여하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 실험을 반복하여 도 2b와 같은 결과를 얻었으며, 여기에서 수동회피반응시간은 당귀 추출물 2주 및 4주 투여군에서 베타아밀로이드(1-42)투여군에 비하여 유의하게 증가하였다(P <0.05).

실시예 3: 페룰린산의 치매 예방 효과

실시예 2에서 치매 예방 효과가 입증된 당귀 추출물 중 박막 크로마토그래피(TLC)에 의해 분리된 활성 성분인 페룰린산의 치매 예방 효과를 다음과 같이 확인하였다.

4-5주령의 생쥐(체중 20-25 g) 50마리를 각 군별로 10마리씩 5개의 군으로 나누었다. 페룰린산을 0.002 %(w/v), 0.004 %(w/v) 및 0.006 %(w/v) 농도로 각각 물에 녹인 용액을 세 군의 생쥐에게 물 대신 4주 동안 섭취시켰으며, 그 결과 마리당 매일 약 8 ㎖가 투여되었다. 다른 두 군의 생쥐들에게는 보통의 물을 4주 동안 공급하였다. 그 후, 참고예 1의 방법에 따라, 페룰린산을 투여하지 않은 군 중 한 군(대조군)의 생쥐들에게는 베타아밀로이드(42-1)를, 나머지 네 군의 생쥐들에게는 베타아밀로이드(1-42)를 각 1.85 ㎍씩 뇌실 내에 투여하였다. 뇌실 내 주사후 참고예 2에서와 같이 수동회피실험을 실시하였다. 10마리에서 평균값을 구하였으며 결과는 도 3a에 나타나 있다.

도 3a에서 보는 바와 같이, 베타아밀로이드(1-42)만을 투여한 군은 대조군에 비해 수동회피시간이 유의하게 감소하였다. 그러나 페룰린산을 예방적으로 4주동안 투여한 실험군들에서는 투여된 페룰린산에 용량의존적으로 수동회피시간의 감소가 방지되었다.

한편, 페룰린산 용액을 0.006 %(w/v) 농도로 1, 2, 3, 4주 동안 투여하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 실험을 반복하여 도 3b와 같은 결과를 얻었으며, 투여기간이 증가함에 따라 수동회피반응에 대한 페룰린산의 효과가 증가하였다.

동일한 동물들을 사용하여 참고예 3에서와 같이 Y-미로 실험을 실행한 결과, 베타아밀로이드(1-42)만 투여한 군에 비해, 페룰린산을 투여한 군에서 교차 활동량이 투여 기간에 비례하여 증가하였다(도 4a). 그러나, 이때의 자발성 운동량을 나타내는 통로통과 전체횟수는 각 군에서 거의 비슷했다(도 4b). 이러한 결과는 페룰린산 용액의 효과가 운동에 영향을 미치는 것이 아니라 기억에 영향을 미쳐서 나타나는 것임을 의미한다.

한편, 페룰린산과 그의 이성질체인 이소페룰린산을 각각 0.006 %(w/v)의 농도로 4주동안 투여한 것을 제외하고는 상기와 동일하게 실시한 결과, 이소페룰린산 투여군의 수동회피반응 시간이 페룰린산 투여군과 비슷하게 증가하였으므로 이소페룰린산이 페룰린산과 동일한 치매 예방효과를 나타냄을 확인하였다(도 5).

실시예 4: 데커시놀의 치매 예방 효과

실시예 2에서 치매 예방 효과가 입증된 당귀 추출물 중 박막 크로마토그래피(TLC)에 의해 분리된 활성 성분인 데커시놀의 치매 예방 효과를 다음과 같이 확인하였다.

4-5주령의 생쥐(체중 20-25 g) 40마리를 각 군별로 10마리씩 4개의 군으로 나누었다. 데커시놀을 생쥐가 각각 하루에 7.5 mg/kg 및 15 mg/kg 용량으로 섭취할 수 있도록, 옥수수유(corn oil)에 녹인 후 사료에 섞어서 4주 동안 두 군의 생쥐에게 각각 투여하였다. 다른 두 군의 생쥐에게는 사료에 동량의 옥수수유를 섞어서 4주 동안 투여하였다. 그 후, 참고예 1의 방법에 따라, 데커시놀을 투여하지 않은 한 군(대조군)의 생쥐들에게 베타아밀로이드(42-1)를, 나머지 세 군의 생쥐들에게는 베타아밀로이드(1-42)를 각각 1.85 ㎍씩 뇌실 내에 투여하였다. 뇌실 내 주사후 참고예 2에서와 같이 수동회피실험을 실시하였으며, 참고예 3에서와 같이Y-미로 실험을 실시하였다. 10마리에서 평균값을 구하였으며 결과는 도 6a 내지 6c에 나타나 있다.

도 6a에서 보는 바와 같이, 데커시놀을 투여한 쥐에서는 베타아밀로이드(1-42)에 의한 수동회피시간 감소가 방지되었다.

또한, Y-미로 실험에서도 데커시놀에 의해 교차활동량이 증가하였으나(도 6b) 일반적 운동량을 나타내는 통로통과 전체횟수는 전체적으로 거의 비슷하므로(도 6c), 데커시놀의 효과가 운동에 영향을 미치는 것이 아니라 기억에 영향을 미쳐서 나타나는 것임을 알 수 있다.

한편, 페룰린산과 데커시놀 사이에 상승작용이 있는지를 보기 위하여, 생쥐에게 페룰린산 0.002 %(w/v), 데커시놀 2 mg/kg 또는 이들의 혼합물을 투여하는 것을 제외하고는 상기와 동일하게 실시하였다. 또한, 페룰린산 0.003 %(w/v), 데커시놀 3 mg/kg 또는 이들의 혼합물을 투여하여 동일한 실험을 반복하였다. 두 실험에서 모두 실시예 3과 같이 0.006%의 페룰린산을 투여한 그룹을 비교군으로 사용하였다. 그 결과, 각각은 유효하지 않은 저용량의 페룰린산과 데커시놀의 혼합물을 사용한 경우 유효한 효과가 나타났다(도 7a 및 7b). 이는 두 가지 물질사이에 상승효과(synergistic effect)가 있음을 나타낸다.

실시예 5: 페룰린산의 뇌세포 보호작용 확인

(1) 베타아밀로이드 주사 1일 후의 OX-42의 면역 세포화학 염색

4-5주령의 생쥐(체중 20-25 g)들을 세 군으로 나누어 그 중 한 군에게 페룰린산을 음수에 0.006 %(w/v)의 농도로 섞어 4주 동안 투여하였다. 다른 두 군의 생쥐들에게는 보통의 물을 4주 동안 공급하였다. 그 후, 참고예 1의 방법에 따라, 페룰린산을 투여하지 않은 한 군(대조군)의 생쥐들에게는 베타아밀로이드(42-1)를, 다른 두 군의 생쥐들에게는 베타아밀로이드(1-42)를 각 1.85 ㎍씩 뇌실 내에 투여하였다.

베타아밀로이드 투여 1일 후에 생쥐를 소듐 펜토바비탈로 마취한 후 마취된 생쥐의 복부를 절제하고, 좌측 심실 내부로 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 관류하여 고정한 다음, 뇌를 절취하였다. Cho 등의 방법(Choet al.,J. Comp. Neurol., 369: 264-276(1996))에 따라 절취된 뇌로부터 박편을 제작한 후 OX-42 항체(Halan(Sera-Lab))의 1:500 희석액을 이용하여 이상피질(pyriform cortex)과 편도양핵(amygdaloid nucleus)에서 OX-42를 면역 화학염색하였다. 그 후 박편을 직립 현미경하에서 200배와 400배의 배율로 관찰하였다.

그 결과는 도 8a 내지 8f에 나타나 있으며, 도 8a 내지 8c는 200배, 도 8c 내지 8f는 400배의 배율로 각각 관찰한 것이다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 베타아밀로이드(1-42)만 주사한 군(도 8b 및 8e)에서는 OX-42가 대조군(도 8a 및 8d)에 비해 현저히 증가하였으나, 페룰린산 투여 후 베타아밀로이드(1-42)를 주사한 군(도 8c 및 8f)에서는 OX-42가 현저히 감소하였다.

(2) 베타아밀로이드 투여 5일 후 ChAT의 면역 세포화학 염색

생쥐들을 상기 (1)에서와 같이 세 군으로 나누어 페룰린산 및/또는 베타아밀로이드를 투여하고, 5일이 경과한 후 콜린-아세틸트랜스퍼레이즈(ChAT)에 대한 항체(Chemicon사)의 1:750 희석액을 사용하는 것을 제외하고는 상기 (1)의 방법과 동일하게 실시하여 아세틸콜린 신경세포가 분포하는 중격핵(septal nucleus)에서 아세틸콜린합성효소인 ChAT를 면역 세포화학 염색법에 의해 염색하였다.

그 결과, 베타아밀로이드(1-42)만 투여한 군(도 9b)에서는 ChAT가 대조군(도 9a)에 비해 감소하였으나, 페룰린산 투여 후 베타아밀로이드(1-42)를 주사한 군(도 9c)에서는 감소가 억제되었다.

실시예 6: 페룰린산의 신경세포 손상 방지 효과

위 등의 방법(Wieet al., Neurosci. Lett., 225: 93-96(1997))에 따라, 생쥐의 대뇌피질 세포로부터 신경교세포를 배양한 후 이를 기질로 하여 생쥐의 대뇌 신경세포를 배양하였다.

상기와 같이 제조된 신경세포 배양물을 세 개의 군으로 나눈 후, 한 군에는 아무런 처리를 하지 않았고(대조군), 다른 두 군에는 베타아밀로이드(1-42)를 25 μM의 농도로 처리하였으며, 이중 한 군에는 베타아밀로이드를 투여하기 30분전에 페룰린산을 100 μM의 농도로 처리하였다.

신경세포의 손상 정도는 상기 위(Wie) 등의 방법에 따라 배양세포에서 세포밖의 배양액으로 분비되는 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase; LDH)의 농도를측정함으로써 확인하였는데, 베타아밀로이드 투여 후 24 시간 및 48시간에 각각 세포배양액을 취하여 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 베타아밀로이드 투여에 의해 손상 및 파괴된 세포로부터 분비된 LDH의 농도를 측정하였다.

도 10에서와 같이, 베타아밀로이드투여군은 대조군에 비해 LDH 분비가 현저히 증가하였으나, 베타아밀로이드+페룰린산 투여군에서는 LDH 분비가 현저히 감소하였다. 이 결과로부터 페룰린산이 베타아밀로이드(1-42)에 의한 신경세포의 손상을 억제함을 확인할 수 있다.

실시예 7: 당귀 추출물의 경구독성시험

4 주령의 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 랫트 암수 각 20마리를 온도 22±3℃, 상대습도 50 ±10%, 조도 150-300 룩스(Lux)의 동물실내에서 1주일간 사육한 후 암수 각 5마리씩을 포함하는 4개의 군으로 나누었다.

실시예 1에서 얻은 참당귀의 추출물을 옥수수유에 녹인 후, 4 그룹의 랫트에게 각각 300, 1,000, 3000 및 10,000 mg/kg의 용량으로 1회 경구투여하였다. 투여 후 7일 동안 일반증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 또한, 투여 7일째에 랫트를 치사시켜 해부한 후 육안으로 내부 장기를 검사하였다. 투여당일부터 매일 체중의 변화를 측정하여 참당귀 추출물에 의한 동물의 체중 감소 현상을 관찰하였다.

그 결과, 참당귀 추출물의 LD₅₀값은 숫컷의 경우 3,722 mg/kg, 암컷의 경우2,804 mg/kg으로 나타났다. 생존동물에 대한 부검을 실시한 바, 1,000 mg/kg 이하 투여군에서는 아무런 병변 육안 소견이 없었다. 체중의 경우, 1,000 mg/kg 이하 투여군에서는 체중 감소가 일어나지 않았다.

제 제 예

실시예 1에서 얻은 참당귀 추출물 100 mg, 우유 칼슘 45 mg, 미세결정성 셀룰로스 122 mg, 이소플라본 15 mg, 은행잎 추출물 2.5 mg, 산조인 추출물 2 mg, 비타민 B₁0.25 mg, 비타민 B₂0.3 mg, 비타민 D₃0.0025 mg 및 스테아르산 마그네슘 2.5 mg을 완전히 섞고 경질 젤라틴 캡슐에 충진하여 경질 젤라틴 캡슐제를 제조하였다.

유효성분으로서 페룰린산 등의 하이드록시신남산 유도체, 데커시놀, 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 이들을 포함하는 당귀 추출물을 함유하는 본 발명의 조성물은 치매의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1의 하이드록시신남산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 치매의 예방 및 치료용 조성물:

화학식 1

상기 식에서,

R¹은 H 또는 CH₃이고,

R²는 -CH=CHCOOH 또는이다.
제 1 항에 있어서,

상기 화학식 1의 하이드록시신남산 유도체가 페룰린산 또는 이소페룰린산인 조성물.
제 1 항에 있어서,

데커시놀을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
데커시놀을 함유하는 치매의 예방 및 치료용 조성물.
화학식 1의 하이드록시신남산 유도체 또는 데커시놀을 포함하는 당귀의 추출물을 함유하는 치매의 예방 및 치료용 조성물.
제 5 항에 있어서,

상기 당귀 추출물이 당귀의 근경을 저급 알콜로 추출하여 얻은 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,

상기 당귀가 참당귀(Angelica gigasNakai), 왜당귀(Angelica acutilobaKitagawa) 또는 중국당귀(Angelica sinensisDiels)인 것을 특징으로 하는 조성물.
하기 화학식 1의 하이드록시신남산 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 함유하는 치매의 예방 및 치료용 식품:

화학식 1

상기 식에서,

R¹은 H 또는 CH₃이고,

R²는 -CH=CHCOOH 또는이다.
제 8 항에 있어서,

상기 화학식 1의 하이드록시신남산 유도체가 페룰린산 또는 이소페룰린산인 식품.
제 8 항에 있어서,

데커시놀을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 식품.
데커시놀을 함유하는 치매의 예방 및 치료용 식품.
화학식 1의 하이드록시신남산 유도체 또는 데커시놀을 포함하는 당귀 추출물을 함유하는 치매의 예방 및 치료용 식품.
제 12 항에 있어서,

상기 당귀 추출물이 당귀의 근경을 저급 알콜로 추출하여 얻은 것임을 특징으로 하는 식품.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,

상기 당귀가 참당귀(Angelica gigasNakai), 왜당귀(Angelica acutilobaKitagawa) 또는 중국당귀(Angelica sinensisDiels)인 것을 특징으로 하는 식품.