JP5022901B2 - ニコチン中毒および禁断症状を予防および治療するためのオニノダケ（Ａｎｇｅｌｉｃａｇｉｇａｓ）から単離した精製エッセンシャルオイル抽出物および低級アルコール可溶性抽出物を含む組成物 - Google Patents

Description

本発明はニコチン中毒および禁断症状の予防と治療のための、オニノダケ（Angelica gigas Nakai）から単離した精製エッセンシャルオイル抽出物と低級アルコール可溶性抽出物を含む組成物に関するものである。

毎年約２０５万人の人間が長期間の喫煙により死亡していると報告されており、喫煙習慣は精神的、身体的なニコチン依存への耽溺を引き起こす。

喫煙によりニコチンは７秒で脳に到達し、この素早い反応が喫煙行動を正に強化する。ニコチンの量および伝達速度は喫煙癖の習慣化の制御において重要な役割を果たしている。喫煙で吸入したニコチンは肺を通して動脈に吸収され、続いて脳に到達する。吸収されたニコチンの９０％が肝臓中で半減期の長いコチニン代謝産物へと代謝され、ニコチン消費の標識要素となる。ニコチンはニコチン・コリン受容体に作用し、血圧、心拍数を上昇させ、様々なホルモンの分泌を促す。中枢神経系において、ニコチン受容体は長期にわたる刺激により消極されるため代謝調整の上昇が起こり、受容体密度が上がる。ニコチンには暗い気分の緩和、精神の集中や注意力の維持、食欲の抑制といった様々な作用がある。ニコチンはその耐性獲得の早さと正の強化作用により慢性の耐性を引き起こし、これが喫煙習慣の継続への強い動機となる。

生理学的および薬物学的観点からみて多くの異なるニコチン・コリン受容体があること、また中枢神経系におけるニコチンの薬力学的反応がニコチン依存において重要な役割を担っていること（Marks, M. J. その他。J.Pharmacol. Exp.Ther., 235, pp619-628, 1985）、中脳辺縁系および黒質線条体路、主要中枢神経系ドーパミン作動系がコカイン、アンフェタミン、モルヒネ等の中毒性薬物の強化作用において重要な役割を果たすこと（Di Chiara, Imperato, A., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 8, pp5274-5278 1998）が報告されている。

ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のアルカロイド性アゴニストとしてのニコチンは腹側被蓋野（ＶＴＡ）のドーパミン神経細胞に位置するシナプス後ｎＡＣｈＲと側坐核（ＮＡｃ）のシナプス前ｎＡＣｈＲを活性化させることでドーパミンの放出を促進する（Clarke P. B., Pert A., Brain Res., 348, pp355-358, 1985; De Belleroche J.その他。Neurosci. Lett., 11, p209, 1979; Brazel M.P. その他。Neuropharmacology, 29, pp1177-1185, 1990）。ニコチンを含む全ての中毒性薬物の反復投与により、続く薬物注射に対する運動反応の亢進から明らかなように、行動感作が生じる場合がある（Robinson T. E., Becker J. B., Brain Res. Rev., 11, pp157-198, 1986; Heidbreder C. A.その他。J. Pharmacol. Exp. Ther., 275, pp150-163 (1995); Sills T. L., Fletcher P. J., Eur. J. Pharmacol., 337, 161-164 (1997)。行動感作は、強迫的な薬物探索行動等の薬物中毒のある面において極めて重要な役割を果たすと考えられている（Robinson T. E., Berridge K. C., Addiction, 96, pp103-114, 2001）。ニコチンの行動感作に関する神経生物学的基質は、なんらかの形で、薬物の正の強化作用と運動刺激物に関係する基本構造であるところのＮＡｃのドーパミン（ＤＡ）系に関連するものと信じられている（Pierce R. C., Kalivas P. W., J. Pharmacol. Exp. Ther., 275, pp1019-1029; Shim I.その他。Behav. Brain Res., 121, pp137-147 2001）。

これらの薬物はドーパミン系の標的部位であるところの側坐核と線条体からのドーパミン放出を刺激し、ドーパミン神経回路を実験的に損傷させると、中毒性薬物の強化作用は消失する。ニコチンがその他の中毒性薬物と同様の神経化学的および機能活性を有しており、ドーパミン作動系がこれらの中毒作用において重要な役割を果たしていることが、様々な実験結果により証明されている。

韓国で栽培されているオニノダケ（Angelica gigas Nakai）はデクルシン、デクルシノール、ノダケネチンその他のクマリン化合物、およびα−ピネン、リモネン、β−ユーデスモール、エレモールその他のエッセンシャルオイルを含み、更年期障害、腹痛、便秘等の様々な病気の治療に使用されてきたことが文献に記載されている（Chung B. S.その他。HyangyakDaesajeon, young-rim press, p411, 1998）。近年、オニノダケの薬理活性についてのレポートが幾つか発表されており、例えば、オニノダケのエーテル可溶性抽出物はウサギの腸と子宮への刺激作用を示すこと、オニノダケから単離したデクルシンおよびデクルシノール化合物には様々な活性、つまりカエルの単離心臓への阻害作用、ウサギにおける呼吸阻害および血流低下作用があること（Chi HJその他。Sangyakhakhoiji, 1(1) pp25-32, 1970）、オニノダケから単離したデクルシンがＰＫＣ（たんぱく質キナーゼＣ）酵素の刺激活性のみならず抗癌活性を示したこと、オニノダケから単離したangelan I と angelan IIは、現在に至るまで、強力な抗癌または免疫増強剤として有用である可能性がある（韓国特許登録番号２５２１９４号）などが挙げられる。

しかしながら、参照することにより本願に組み込まれるところの上記の引用文献のいずれにも、ニコチン中毒および禁断症状の予防および治療における、オニノダケから単離した精製エッセンシャルオイル抽出物の予防または治療活性については報告または開示されていない。

本発明の発明者は、オニノダケから単離した精製エッセンシャルオイル抽出物が、反復的なニコチン摂取によって誘発されたニコチン薬物中毒動物モデルにおける行動作用を低減するのみならず、ドーパミン放出を阻害することで長期にわたるニコチン摂取によって誘発された薬物強化作用に対する感作効果を阻害すること、また強力な禁煙薬として有用になり得ることを発見した。

従って、本発明の目的はニコチン中毒および禁断症状の予防と治療のための、オニノダケから単離した精製エッセンシャルオイル抽出物を含む医薬品組成物を提供することである。

従って、本発明はオニノダケから単離した精製エッセンシャルオイル抽出物を有効成分としてニコチン中毒と禁断症状を治療および予防するに効果的な量で含む医薬品組成物を提供するものである。

ここで開示の「精製抽出物」という用語は、ヘキサンで抽出した抽出物を含み、α−ピネン、リモネン、β−ユーデスモール、エレモール、その組み合わせから成る群から選択された豊富なエッセンシャルオイルを含む。

本発明の目的は、治療を必要とするヒトを含む哺乳類のニコチン中毒と禁断症状の治療と予防のための治療薬を調製するための、オニノダケから単離した精製エッセンシャルオイル抽出物の使用を提供するものである。

本発明の目的は、哺乳類におけるニコチン中毒と禁断症状を治療または予防するための方法を提供することであり、製剤的に許容可能な担体とともに、オニノダケから単離した有効量の精製エッセンシャルオイル抽出物を前述の哺乳類に投与することを含む。

本発明の別の目的は、ニコチン中毒および禁断症状の予防と緩和のための、オニノダケから単離した精製エッセンシャルオイル抽出物を食品学的に許容可能な添加物と共に含むヘルスケア食品または食品添加物を提供することである。

本発明の医薬品組成物は組成物全重量に対して上記抽出物を約０．０２〜９０重量％含有し得る。

本発明のヘルスケア食品は組成物の全重量に対して前記抽出物を０．０１〜８０重量％、好ましくは１〜５０重量％含有する。

上記のヘルスケア食品はヘルスケア食品、健康飲料等に含有させることができ、粉末、顆粒、錠剤、チュアブル錠、カプセル、飲料等として使用しても良い。

以下で、本発明を詳細に説明する。

オニノダケから単離した精製エッセンシャルオイル抽出物と低級アルコール可溶性抽出物を含む本発明は、以下の手順によって詳細に調製することができる。

オニノダケから単離した精製エッセンシャルオイル抽出物を含む本発明は、以下のようにして調製することができる。オニノダケの根を乾燥、切断、粉砕し、体積で２〜１５倍、好ましくは約５〜１０倍の塩化メチレン、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン、アセトン、ジクロロメタン、四塩化炭素等の無極性溶媒、好ましくはヘキサンと混合する。溶液を約１〜５日、好ましくは４７〜７２時間にわたって温水抽出、冷水抽出、還流抽出、超音波抽出等の抽出法でもって、１〜５回、好ましくは２〜３回、連続して溶媒でもって抽出する。残留物をろ過して得た上清をロータリーエバポレータで２０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃で濃縮し、続いて凍結真空乾燥、熱風乾燥、または噴霧乾燥によって乾燥させ、オニノダケから単離した目的とする精製エッセンシャルオイル抽出物を得る。

オニノダケから単離した低級アルコール可溶性抽出物を含む本発明は、以下のようにして調製することが可能である。オニノダケの根を乾燥、切断、粉砕した後、体積で２〜１５倍、好ましくは約５〜１０倍のメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の極性溶媒、好ましくはエタノールと混合する。溶液を約１〜５日、好ましくは４７〜７２時間にわたって温水抽出、冷水抽出、還流抽出、超音波抽出等の抽出法でもって、１〜５回、好ましくは２〜３回、連続して溶媒でもって抽出する。残留物をろ過して得た上清をロータリーエバポレータで２０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃で濃縮し、続いて凍結真空乾燥、熱風乾燥、または噴霧乾燥によって乾燥させ、オニノダケから単離した目的とする低級アルコール可溶性抽出物を得る。

また、上記記載の工程に改良を加えたり、当技術分野で周知の従来法、例えば文献に開示された手順を用いてより強力な成分または化合物に分別または単離する工程にさらに供してもよい（Harborne J. B. Phytochemical method: A guide to modern techniques of plant analysis, 3^rd Ed. pp6-7, 1998）。

従って、本発明は上述の手順によってオニノダケから単離した精製エッセンシャルオイル抽出物と低級アルコール可溶性抽出物を有効成分としてニコチン中毒と禁断症状を治療および予防するに効果的な量で含む医薬品組成物も提供するものである。

ニコチン中毒および禁断症状に対する本発明の独創的な抽出物の効果を研究するために、本発明の発明者は、反復的なニコチン摂取によって誘発されたニコチン薬物中毒動物モデルにおける行動作用の低下のみならず、ドーパミン放出の阻害による長期にわたるニコチン摂取によって誘発された薬物強化作用に対する感作効果の阻害作用について様々な実験を徹底的に行い、ついに強力な禁煙薬として有用に成り得ることを確認した。

本発明による抽出物は、製剤的な観点から許容範囲にある担体、アジュバントまたは希釈剤を含有する医薬品組成物として提供することができる。例えば、本発明の抽出物は注射剤を製造する際に一般的に使用されるオイル、プロピレングリコール、その他の溶媒に溶解することができる。適当な担体の例としては、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物性油、ミリスチン酸イソプロピルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。外用としては、本発明の化合物を軟膏やクリームにすることが可能である。

本発明の抽出物は強力な禁煙作用を有しているため、本発明の医薬品組成物はニコチン中毒および禁断症状の治療または予防に用いてもよい。

下文において、以下の製剤方法および賦形剤は単なる模範例に過ぎず、決して本発明を限定するものではない。

医薬品の剤形とした本発明の抽出物は、その製剤的な観点からみて許容範囲にある塩として使用してもよい。また、その他の製剤的に活性な化合物と組み合わせての使用はもちろん、単体で使用しても適当なものと組み合わせての使用であってもよい。

本発明の抽出物は、通常の生理食塩水、５％デキストロース等の水溶性溶媒や、植物性油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコール等の非水溶性溶媒に溶解、懸濁、または乳化させることで注射製剤としてもよい。製剤は可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、防腐剤等の通常の添加物を含んでいてもよい。

本発明の独創的な抽出物の望ましい投与量は、条件や対象の体重、重症度、剤形、投与経路、投与期間によって異なり、当業者が選択してもよい。しかし、望ましい効果を得るためには、本発明の独創的な抽出物を、体重/日あたり、０．０００１〜１００mg/kg、好ましくは０．００１から１００mg/kg投与することが一般的に勧められる。１日１回投与しても、何回かにわけて投与してもよい。組成に関しては、抽出物の量は組成物の総重量につき０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．０００１〜１重量％にすべきである。

本発明の医薬品組成物は様々な投与方法でもって哺乳類（ラット、マウス、家畜、ヒト）等の対象動物に投与することができる。全ての投与方式が考えられ、例えば吸入投与、経口投与、直腸投与、または静脈注射、筋内注射、皮下注射、髄腔内投与、硬膜外または脳室内注入によって投与することができる。

本発明の抽出物は様々な機能性健康食品およびヘルスケア食品の製造において主成分または添加物および補助剤として使用することもできる。

ここでいう「機能性健康食品」とは、ヒトまたは哺乳類におけるニコチン中毒または禁断症状を予防または緩和するために通常の食品に本発明の抽出物を添加することで、物理機能性または生理学的機能性等の機能性を強化した機能性食品と定義される。

本発明のもう一方の目的は、ニコチン中毒および禁断症状の予防と緩和のための、オニノダケから単離した精製エッセンシャルオイルと低級アルコール可溶性抽出物を食品学的に許容可能な添加物と共に含むヘルスケア食品を提供することである。

ここでいう「ヘルスケア食品」とは特に意図された効果はないものの、全般的な効果を添加物として少量で、もしくはカプセル・丸薬・錠剤等として全量で発揮する本発明の抽出物を含有する食品と定義される。

ここでいう「食品学的にみて許容可能な添加物」とはその用途が直接的であれ間接的であれ一成分であること自体あるいはその反対で食品の特性に影響を与えることに帰着する、または帰着することが十分に期待しえる物質と定義される。例としては、増粘剤、熟成剤、漂白剤、抑制剤、湿潤剤、固化予防剤、清澄剤、硬化剤、乳化剤、安定剤、シックナー、塩基および酸、発泡剤、栄養剤、着色剤、着香料、甘味料、防腐剤、酸化予防剤等が挙げられ、以下で詳細に説明する。

ある特定の目的をもって食品にある物質を添加する場合はそれを直接添加物と称し、梱包や貯蔵、その他の取り扱いのために食品の一部として微量添加する場合は間接食品添加物と称される。

上記記載の健康食品は、ニコチン中毒と禁断症状の予防と改善を目的として、食品、健康飲料、食餌療法等に取り入れることができ、粉末、顆粒、錠剤、チュアブル錠、カプセル、飲料等の形態で使用してもよい。

また、上記記載の抽出物を、ニコチン中毒と禁断症状の予防と改善を目的として食品または飲料に添加することもできる。機能性健康食品またはヘルスケア食品としての食品または飲料に添加する上記記載の抽出物の量は、機能性健康食品組成物としては、概して食品総重量の約０．０１〜１００w/w %である。特に、機能性健康食品、ヘルスケア食品または特殊栄養食品における本発明の抽出物の好ましい量は各食品の使用目的に応じて異なっていてもよいが、一般的には、食品組成を１００％として本発明の抽出物を麺類等の食品中に添加物として約０．０１〜５％使用するのが好ましく、ヘルスケア食品においては４０〜１００％の比率で使用するのが好ましい。

本発明の健康飲料組成物が上記記載の抽出物を主成分として記載の比率で含有しているとした場合、その他の液状成分については特に制限はなく、その他の成分としては様々な清涼剤や通常の飲料等の天然糖類が挙げられる。上記記載の天然糖類としては、グルコース、果糖等の単糖類；麦芽糖、蔗糖等の二糖類；デキストリン、シクロデキストリン等の一般的な糖；キシリトール、エリスリトール等の糖アルコールが例として挙げられる。上記記載のもの以外の清涼剤としては、ソーマチン、レバウディオサイドＡ等のステビア抽出物、グリシルリジン等の天然清涼剤、サッカリン、アスパルテーム等の合成清涼剤が好適に有用なものとして挙げられる。上記記載の天然糖類の量は、通常、本発明の飲料組成物１００あたり約１〜２０ｇ、好ましくは５〜１２ｇである。

上記記載の組成物以外の成分としては様々な栄養剤、ビタミン、ミネラルまたは電解質、合成着香料、着色料、チーズやチョコレートの場合は品質改良剤、ペクチン酸およびその塩、アルギニン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド粘着剤、ｐＨ調整剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料等で使用される炭酸化剤が挙げられる。上記記載のもの以外の成分ついては、天然フルーツジュースに使用する果汁、果汁飲料、野菜飲料が挙げられ、成分は独立して使用しても組み合わせて使用してもよい。各成分の比率はあまり重要ではないが、通常、本組成物１００ w/w%に対して約０から２０ w/w%である。こういったものを添加する、上述の抽出物を含有する食品としては様々な食品、飲料、ガム、複合ビタミン剤、健康促進食品等が挙げられる。

以下の実施例を用いて、本発明をより詳細に説明する。しかしながら、いかなる方法によっても本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

本発明で記載のように、本発明はニコチン中毒と禁断症状の予防と治療のための、オニノダケから単離した精製エッセンシャルオイル抽出物を含む医薬品組成物を提供するものである。

本発明の精神または範囲から外れることなく、本発明の組成物、その用途および製剤に様々な改良や変更を加えうることは当業者には明白である。

本発明を以下の実施例を用いてより詳細に説明するが、いかなる方法によっても本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。

以下の参考例、実施例、および実験例は本発明をより詳しく説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。

実施例１．オニノダケから単離した精製エッセンシャルオイル抽出物の調製
韓国の市場(Dae-gu Youngnam Yakup社。韓国)で購入したオニノダケ（Angelica gigas Nakai）の茎を乾燥させたもの３００ｇを切断し、ｎ−ヘキサン３００ｍｌと混合し、還流抽出器を用いて室温で７２時間抽出した。沈殿物をフィルターペーパーによるろ過で除去した後、回収した上清を減圧下５０℃で濃縮して、１０．３ｇの透明で淡い茶色の精製エッセンシャルオイル抽出物を得た（以下、ＡＧ−Ｈと称する）。得られた抽出物は以下の実験例においてテストサンプルとして使用した。

実施例２．オニノダケから単離した低級アルコール可溶性抽出物の調製
韓国の市場(Dae-gu Youngnam Yakup社・韓国)で購入したオニノダケ（Angelica gigas Nakai）の茎を乾燥させたもの３００ｇを切断し、エタノール３００ｍｌと混合し、還流抽出器を用いて室温で７２時間抽出した。沈殿物をフィルターペーパーによるろ過で除去した後、回収した上清を減圧下で濃縮して、２７．０ｇのエタノール可溶性抽出物を得た（以下、ＡＧ−Ｅと称する）。得られた抽出物は以下の実験例においてテストサンプルとして使用した。

実験例１．行動作用の測定
実施例１、２で調製した抽出物の行動作用を測定するために、以下の実験を行った。

１−１．実験動物の準備
Hyochang Science社から購入した体重２５０〜２６０ｇのオスのＳＤラットを実験動物として使用した。全てのラットを不断給餌と飲水で標準条件下で飼養した（室温：２１±２℃、相対湿度：５５−６５％、明暗サイクル：１２時間）。ラットには試験前に触れることが許されている。全実験手順はＮＩＨのアニマルケア・ガイドラインに従って行った。

１−２．自発運動の測定
ラットの自発運動を量的に求めるために、自発運動を以下の手順で測定した。

行動試験に先立って、ラットは個別に飼育された。自発運動は床中央部の頭上にビデオカメラが設置された８つの長方形の黒色アクリル製コンテナ（４３ｘ４３ｘ４５ｃｍ）内で測定した。壁部および床部は透明なプレキシグラスから形成されており、黒く着色されている。自発運動はエソビジョンプログラム（オランダ・ワーヘニンゲンのNoldus Information Technology BV社）を用いたビデオトラッキングシステムによって観察した。ラットを箱内で一時間適応させ、ベースライン１時間と薬剤処理１時間の間に移動した距離を記録した。得られた映像をコンピュータに転送し、ラットの運動を黒い背景に対照させた白い動物映像の移動を認識する方法で追跡した。

ステップ１−１で準備した実験動物を実験室に移動し、８つのコンテナに入れる前に各ラットの体重を測定した。実験は３つのステップから構成される。つまり（１）連続７日間にわたる１日２回の酒石酸水素ニコチン（０．４ｍｇ／ｋｇ、皮下注射；Sigma社・米国）の投与を行う感作相、（２）ニコチンの投与を３日間停止する離脱相、（３）離脱相終了の翌日に当量のニコチンを繰り返し投与する試験相である。

自発運動の段階的な亢進によって表される、ニコチンの反復投与による行動感作現象を裏付けるために、グループＦには７日間にわたって１日２回にわたり１ｍｌ／ｋｇの生理食塩水溶液を皮下投与し、グループＡには０．４ｍｇ／ｋｇのニコチンを投与した。ラットの行動変化は、１１日目の薬剤投与後の変化を測定することで評価した。このあと、薬剤の投与はさらに３日間継続される。実施例１で調製した精製エッセンシャルオイル抽出物の吸入を特殊ケージ（Three-Shine社。韓国・ソウル）で２４時間にわたって行い、自発的な運動の基礎レベルを測定した。薬剤投与開始の２４時間前、実施例１と２で調製した精製エッセンシャルオイル抽出物を各ケージに入れ、ニコチンまたは生理食塩水溶液処理後の各グループの行動変化を測定した。韓国の市場で購入したメンソール（Dae-gu Youngnam Yakup社。韓国）を実施例１および２で調製した精製エッセンシャルオイル抽出物の代わりに投与した（表１を参照のこと）。データの解析をＳＰＳＳ８．０およびスタットビュー５．０ソフトウェアプログラムを用いて行った。

表１
実験プロトコル

結果、ニコチン連日注射の最終日翌日の１１日目のニコチンの全身投与は、生理食塩水で前処理したラットに比較して、ニコチンで前処理したラットにおける自発運動の大幅な亢進をもたらした。ニコチン投与後の６０分の試験時間中における、距離で測定した水平方向自発運動はそれぞれグループＡで４３９９．０±４１４．０ｃｍ、グループＢ−１で２６３０．１±３８４．２ｃｍ、グループＢ−２で３２４１．７±４７５．２ｃｍ、グループＣで４８８６．８±５５７．０ｃｍ、グループＤで１９２１．７±２０９．７ｃｍ、グループＥ−１で１６８１．０±２２２．２ｃｍ、グループＥ−２で１８４２．３６±２６７．８ｃｍ、グループＦで１５９４．８±２２３．６ｃｍであった。ＡＧ−ＨおよびＡＧ−Ｅ抽出物の吸入によりニコチン誘発性運動亢進が顕著に減少した（表２を参照のこと）。

表２
自発運動

実験例２．神経化学変化の測定
実施例１で調製した抽出物の神経化学変化を測定するために、以下の実験を行った。

２−１．定位脳手術
ステップ１−１で準備した実験動物を実験環境に２または３日間にわたって順応させ、以下の実験において使用した。

５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与によりラットに麻酔をかけ、定位脳手術台に固定した（ＫＯＰＦ９５７）。PaxinosとWatsonの脳アトラス（Paxinos G., Watson C., “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates”, Academic Press, New York, 1986）に従った側坐核の被殻部の座標を用い（ＡＰ１．７、ＭＬ０．８、ＤＶ６．０）、麻酔下にあるラットに微小透析ガイドカニューレ（ＣＭＡ１１。Carnegie Medicin社。スウェーデン・ストックホルム）を定位脳インプラントした。手術を終了した実験グループに１週間の回復期間を与え、微小透析システムに接続した（Ｓ１１２１溶剤送達システム。Syknm）。

２−２．微小透析手順
回復期間後、ラットを微小透析システムに接続し、微小透析プローブ（ＣＭＡ１１、１４／０２キュプロフェン透析膜、６０００ダルトン、軸長：１４ｍｍ、寸法：０．２４ｘ２ｍｍ）をガイドカニューレを介して麻酔下のラットの脳内に挿入した。

プローブを用いてＣＳＦ（人工脳脊髄液）を速度１．５μｌ／分（ＣＭＡ１００ミクロ注入ポンプ）でかん流させた。微小透析液（ＣＳＦ）はリンガー溶液を変形したものであり、５００ｍｌの水における８．６６ｇのＮａＣｌ、０．２２４ｇのＫＣｌ、０．０２０６ｇのＣａＣｌ_２Ｈ_２Ｏ、０．１６３ｇのＭｇＣｌ_２６Ｈ_２Ｏと５００ｍｌの水における０．２１４ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４、０．００５４ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４Ｈ_２Ｏを混合した混合溶液を含有する。自由行動のラットから単離した細胞外液を微小透析システムを通して回収し、以下の分析に使用する前に７０℃で保存した。

２−３．微小透析液におけるＤＯＰＡＣ（ドーパミンＨＶＡ）のＨＰＬＣ分析
微小透析後、側坐核内の微小透析プローブの位置を組織化学的に確認するために、ホルマリン１００ｍｌ、蒸留水９００ｍｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４（二塩基）６．５ｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４Ｈ_２Ｏ（一塩基）４ｇを含有するホルマリン緩衝剤を調製し、１Ｌの蒸留水に溶解させた９ｇを含有する生理食塩水と緩衝液をそれぞれ４Ｌの蒸留浴に注いだ。浴は定位脳手術台の手術台よりも高い位置に取り付けられている。麻酔下のラットを開胸し下行大動脈を縫合し、心尖を刺した。生理食塩水溶液を流し込むことで血液を洗い流した。ホルマリン緩衝剤で十分な再かん流を行った後、ラットの脳を頭蓋から取り出し、ホルマリン緩衝剤内に保存した。幅１００ミクロンの脳切片をビブラトームミクロトーム（７５２Ｍ１６６１、Campclen Instrument社）を用いて作成しクレシルバイオレットで染色した。プローブ設置はマニュアルに開示された所定の座標に従って確認された（Pixinos and Watson atlas; George Paxinos & Charles Watson, Academic press, Inc.）。組織学的検査により微小透析プローブが側坐核被殻部に位置していないと判明した場合は、解析からそのラットを除外した。

データの解析はＳＰＳＳ１１．０１およびスタットビュー５．０ソフトウェアプログラムを用いて行った。神経化学データは反復測定ＡＮＯＶＡを用いて分析し、行動データは一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。値（ｐ＜０．０５）は有効数字で表された。

微小透析液中のＤＯＰＡＣ（３，４−酢酸ジヒドロキシフェニル）、ＤＡ（ドーパミン）、ＨＶＡ（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル酢酸）含有量を表３に開示の条件でＨＰＬＣ分析により測定した。

表３
ＨＰＬＣ条件

実験例３．ニコチン反復投与によって引き起こされた側坐核におけるＤＡレベル変化に対するオニノダケから単離した抽出物の効果
オニノダケから単離した抽出物（AG−HおよびAG−E）の、ニコチンの反復投与によって引き起こされたドーパミン放出に対する効果を測定するために、以下の実験を行った。

酒石酸ニコチン（０．４ｍｇ／ｋｇ。皮下注射。フリーベース）をステップ１−１で用意した実験動物に７日間にわたって１日２回投与し、実施例１および２で調製した精製エッセンシャルオイルとエタノール可溶性抽出物の吸入を薬物強化作用を誘発させるための離脱相後に２４時間行った。同様の方法で、対照グループとしてのラットに生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｋｇ。皮下注射）を投与し、３日間の離脱期間の翌日に実施例１および２で調製した精製エッセンシャルオイルとエタノール可溶性抽出物を２４時間にわたってラットに吸入させた。吸入終了５時間後に、３ｍMのニコチンを局所的に投与して、側坐核における放出ドーパミンレベルの変化を測定した。

結果、対照グループ（４．７４２９±０．４３ｎM、ｎ＝８）とニコチン処理グループ（ｎ＝８）のＤＡ濃度はベースラインに相対してそれぞれ１０３．３％、６９０．０％上昇した一方、AG−H処理グループおよびAG−E処理グループのＤＡ濃度はそれぞれ２５５．０％、３９７．３％上昇した。従って、ＡＧ−ＨとＡＧ−Ｅの吸入は、ニコチン前処理ラットにおいて、局所的投与によって誘発された側坐核における細胞外ＤＡ濃度の上昇を著しく阻害することが確認された（表４を参照のこと）。

表４

実験例４．ニコチンの反復投与によって引き起こされた側坐核におけるＤＯＰＡＣレベル変化に対するオニノダケから単離した抽出物の効果
オニノダケから単離した抽出物（AG−HおよびAG−E）の、ニコチンの反復投与によって引き起こされたＤＯＰＡＣ（３，４−酢酸ジヒドロキシフェニル）放出に対する効果を測定するために、以下の実験を行った。

酒石酸ニコチン（０．４ｍｇ／ｋｇ。皮下注射。フリーベース）をステップ１−１で用意した実験動物に７日間にわたって１日２回投与し、実施例１および２で調製した精製エッセンシャルオイルとエタノール可溶性抽出物の吸入を薬物強化作用を誘発するための離脱相後に２４時間行った。同様の方法で、対照グループとしてのラットに生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｋｇ。皮下注射）を投与して、３日間の離脱期間の翌日に、実施例１および２で調製した精製エッセンシャルオイルとエタノール可溶性抽出物を２４時間にわたってラットに吸入させた。吸入終了５時間後に、３ｍMのニコチンを局所的に投与して、側坐核における放出ＤＯＰＡＣレベル変化を測定した。

結果、対照グループのＤＯＰＡＣ濃度（３４９．５０ １０２．５ｎM、ｎ＝８）はベースラインに相対して３０％の低下、ニコチン処理グループ（ｎ＝８）のＤＯＰＡＣ濃度は９１０％増加した一方、AG−HおよびＡG−E処理グループのＤＯＰＡＣ濃度はそれぞれ１２８３．８％、７１６．７％上昇した（表５を参照のこと）。

表５

実験例５．ニコチン反復投与によって引き起こされた側坐核におけるＨＶＡレベル変化に対するＡＧ−Ｈの効果
ニコチンの反復投与によって引き起こされたＨＶＡ（４−ヒドロキシ−メトキシフェニル酢酸）放出に対するＡＧ−Ｈの効果を測定するために、以下の実験を行った。

酒石酸ニコチン（０．４ｍｇ／ｋｇ。皮下注射。フリーベース）をステップ１−１で用意した実験動物に７日間にわたって１日２回投与し、実施例１で調製した精製エッセンシャルオイルの吸入を薬物強化作用を誘発させるための離脱相後に２４時間行った。同様の方法で、対照グループとしてのラットに生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｋｇ。皮下注射）を投与して、３日間の離脱期間の翌日に、実施例１で調製した精製エッセンシャルオイル抽出物を２４時間にわたってラットに吸入させた。吸入終了５時間後に、３ｍMのニコチンを局所的に投与して、側坐核における放出ＨＶＡレベルの変化を測定した。

結果、対照グループのＨＶＡ濃度（６８６．０７±１６５．１２ｎM、ｎ＝８）およびニコチン処理グループ（ｎ＝８）のＨＶＡ濃度はベースラインに相対してそれぞれ１３７．１および１５６．７％上昇した一方、AG−H処理グループにおけるＨＶＡ濃度は２５８．８％上昇した（表６を参照のこと）

表６

結果から、生理食塩水前処理をしたラットと比較して、ニコチン前処理をしたラットにおけるＤＡ放出と自発運動がニコチン投与により著しく上昇したことがわかる。これらの結果はその他の研究結果と一致しており、運動反応の亢進および脳におけるＤＡ放出増加によって立証されるように、ニコチンの反復投与によりラットの側坐核における細胞外ＤＡレベルの感作と行動感作が起こることを示す。この阻害制御により、中毒性薬物の報酬効果と強化作用を緩和し得る可能性がある。

従って、ＡＧ−ＨとＡＧ−Ｅの吸入が、ニコチンの反復投与によって誘発された側坐核における細胞外ドーパミンレベルの感作と行動感作を緩和することが確認された。これらの結果は、ＡＧ−ＨとＡＧ−Ｅがおそらくは側坐核におけるＤＡ放出を変化させることにより、ニコチン中毒において有効である可能性を示唆している。

実験例６．毒性試験
６−１．方法
実施例で得た試験抽出物の急性毒性試験を以下の手順で生後６週間のＳＰＦ ＳＤラットで行った。

各２匹のラットで構成される４グループに、ＡＧ−ＨおよびＡＧ−Ｅ抽出物を１００ｍｇ／ｋｇ経口投与して、２週間観察した。

６−２．結果
いずれのグループまたは性別に関しても、死亡率、臨床的徴候、体重変化、および全体の所見に処置による効果の違いは見られなかった。経口投与における最低ＬＤ_５０値は１００ｍｇ／ｋｇより高かった。これらの結果から、本発明による試験抽出物が安全でありながらも強力であることがわかった。

以下に、製剤方法と賦形剤の種類とを説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。代表的な製剤例は以下に記載のとおりである。

粉剤の調製
ＡＧ−Ｈ ５０ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
上記成分を混合して密封容器に充填することで粉剤を調製した。

錠剤の調製
ＡＧ−Ｅ ５０ｍｇ
コーンスターチ １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
上記成分を混合、錠剤状にすることで錠剤を調製した。

カプセルの調製
ＡＧ−Ｈ ５０ｍｇ
コーンスターチ １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
錠剤は、上記成分を混合し、通常のゼラチン調製方法でゼラチンカプセルに充填することで調製した。

注射剤の調製
ＡＧ−Ｈ ５０ｍｇ
注射用蒸留水 最適量
ｐＨ調整剤 最適量
注射剤は、通常の注射剤調製法に従って有効成分を溶解し、ｐＨを約７．５に調整し、２ｍｌのアンプルに全成分を充填して殺菌することで調製した。

液剤の調製
ＡＧ−Ｅ ０．１〜８０ｇ
糖 ５〜１０ｇ
クエン酸 ０．０５〜０．３％
カラメル ０．００５〜０．０２％
ビタミンＣ ０．１〜１％
蒸留水 ７９〜９４％
ＣＯ_２ガス ０．５〜０．８２％
液剤は、通常の液剤調製法に従って有効成分を溶解し、全成分を充填・殺菌することで調製した。

ヘルスケア食品の調製
ＡＧ−Ｅ １０００ｍｇ
ビタミン混合物 最適量
酢酸ビタミンＡ ７０ｍｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ_１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ_２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ_６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ_１２ ０．２ｍｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０ｍｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０ｍｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
ミネラル混合物 最適量
硫酸鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
リン酸一カリウム １５ｍｇ
リン酸二カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
上記記載のビタミンおよびミネラル混合物には様々な変更を加えてもよく、そういった変更は本発明の精神と範囲から外れるものとはみなされない。

健康飲料の調製
ＡＧ−Ｅ １０００ｍｇ
クエン酸 １０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
アプリコット濃縮物 ２ｇ
タウリン １ｇ
蒸留水 ９００ｍｌ
健康飲料は、通常の健康飲料調製方法に従って有効成分を溶解、混合、８５℃で１時間攪拌、濾過、全成分を１０００ｍｌのアンプルに充填・殺菌することで調製した。

本発明の記載より、様々なアレンジを加えうることは明白である。そういった変更は本発明の精神と範囲から外れるものとはみなされない。また、当業者に自明なそういった改良は全て、以下に述べる請求項の範囲に含まれるものとする。

本発明で記載のように、本発明のオニノダケから単離した精製エッセンシャルオイル抽出物およびエタノール可溶性抽出物はドーパミン、ＤＯＰＡＣ、ＨＶＣの放出を用量依存的に阻害することで、薬物の強化作用の感作効果を阻害し、長期間のニコチン摂取によって引き起こされたニコチン薬物中毒における行動作用を低下させる。従って、医薬品またはヘルスケア食品として、ニコチン中毒および禁断症状を治療または予防するのに有用である。

Claims (2)

1. オニノダケ（Angelica gigas Nakai）から単離した精製エッセンシャルオイル抽出物を有効成分として効果的な量で含む、ニコチン中毒と禁断症状を治療および予防するための医薬品組成物であって；該組成物は、オニノダケの根を乾燥、切断、粉砕し、体積で５〜１０倍のヘキサンと混合し、得られる溶液を４７〜７２時間にわたって２〜３回連続して該溶媒で抽出し、得られる残留物をろ過して得た上清をロータリーエバポレータで５０〜７０℃で濃縮し、次いで乾燥させて得られる、単離精製エッセンシャルオイル抽出物を含む、組成物。
2. オニノダケの根を乾燥、切断、粉砕し、体積で５〜１０倍のヘキサンと混合し、得られる溶液を４７〜７２時間にわたって２〜３回連続して該溶媒で抽出し、得られる残留物をろ過して得た上清をロータリーエバポレータで５０〜７０℃で濃縮し、次いで乾燥させて得られる、単離精製エッセンシャルオイル抽出物からなることを特徴とする、治療を必要とするヒトを含む哺乳類のニコチン中毒と禁断症状の治療と予防のための治療薬。