KR0149477B1 - Hiv 활성의 저해제 - Google Patents

Abstract

바가스로 되어 있는 고체 배지에 표고버섯(Letinus edodes) 균류를 접종하고, 그런다음 증식된 균사체를 함유하는 고체 배지를 해속하고, 물 및 셀룰라아제, 프로테아제 및 글루코시다아제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한 효소를, 고체 배지를 30 내지 50℃에 유지하면서, 해속이 된 고체 배지에 가하고, 효소의 존재하에 고체 배지를 분쇄 분말화하여 표고버섯 균사체 추출물을 얻고, 그런다음 추출물을 95℃보다 높지 않은 온도까지 가열하여 효소를 불활성화하고 추출물을 살균하는 단계에 의해 얻어진 표고버섯 균사체추출물로 되어 있는 HIV 활성의 저해제. 이 HIV 활성의 저해제는 HIV의 비루스 활성을 저해할 수 있고, 이 비루스의 증식을 억제할 수 있으며, 부작용의 우려가 적어 안전성이 탁월하다.

Description

HIV 활성의 저해제

제1도는 본 발명의 HIV 활성 저해제의 저해 활성을 보여주는 그래프이다.

[ 발명의 분야]

본 발명은 HIV(인간 면역결핍 바이러스) 활성의 저해제, 보다 상세하게는 HIV - 감염질병에 치료적으로 유효하고 거의 부작용을 일으키지 않는 HIV활성 저해제에 관한 것이다.

[발명의 배경]

세계에서 첫번째로 HIV 감염에 의한 사망자가 1950년 아프리카에서 발견되었고 순식간에 HIV 감염자가 전세계적으로 퍼진 것으로 보고되었다. 최근에는 많은 사람들이 HIV에 감염되어 사망했다.

HIV 감염자를 위한 치료약제에는 AZT, ddI, ddC, 인터로이긴 - Ⅱ(interleuxin-Ⅱ), GLO223, DHCA, γ-베타-계(ser) 인터페론, 알파 인터페론, 감마 인터페론 등이 포함된다. 그러나, 이들 치료약제들은 심한 부작용과 효능이 열등한 문제점을 갖고 있으며, 특별한 효능을 가진 HIV 활성의 저해제(즉, HIV 활성 저해제)는 어떤 것도 아직 발견되지 않았다.

그런 이유로 본발명자는 HIV 바이러스 활성을 저해하고 그 바이러스를 파괴할 수 있고 부작용의 걱정이 거의 없는 HIV 활성 저해제를 탐구하고자 정성껏 연구를 하였다. 그 결과 특정 공정에 의해 제조된 특정한 균사체 추출물이 HIV 활성을 저해하고 그 바이러스의 증식을 억제 한다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

일본특허공고 제 23826/1985호는, 바가스를 기재로 하는 고체 배양기상에 표고버섯균을 접종하고, 다음으로 균사체를 증식하여 얻어지는 균사체를 포함하는 고체 배양기를 12메시 통과분이 30증량% 이하가 되도록 해속하고, 이 해속된 고체 배양기에 물 및 셀룰라아체 또는 프로테아제로 부터 선택되는 효소의 1종류 또는 그 이상을 상기 고체 배양기를 30 - 50℃의 온도로 유지하면서 첨가하고, 상기 고체 배양기를 효소의 존재하에서 분쇄 및 불말화하여 바가스 섬유의 적어도 70중량% 이상이 12메시 통과분이 되도록 하고, 다음으로 95℃까지의 온도로 가열함으로써 효소를 실활시키고, 또한 감균하는 동시에 얻어진 현탁상 액을 여과하는 단계로 되어 있는 건강음료 제조 방법을 기재하고 있다.

또한, 일본특허출원 제 5355/1984 호 및 제 5356/1984 호(즉 각각 일본특허공고 제 35149/1992 호 및 제 6171/1992호)는 영지버섯(Fomes japonicus)균을 사용하는 건강음료의 제조방법을 기재하고 있다.

그러나 이들 공고공보에는, 얻어진 건강음료가 HIV 활성에 대한 저해제로서 효과적이라는 어떤 기재나 시사도 없다.

표고버섯(Lentinus edodes)으로 부터 얻어진 생리학적 활성물질에 관해서는 몇가지 문헌이 보고되어 있다.

BIOTHERAPY 제2권 제3호 509-521 페이지(1988년 6월)에서, 테츠오 타구치등은 표고버섯으로 부터 얻어진 렌티난은 이것을 HIV 치료제 AZT와 병용함에 의해 HIV의 증식을 저해한다고 진술하고 있다. 그외에 Phamaceutical Magazine 제108권, 제 3 호, 171 - 186페이지(1988)에서, 상기논문의 공동저자인 쿠레오 치하라는 표고버섯으로 부터 얻어진 다당류의 주물질은 β-1,6 : β-1,3-D-글루칸이라고 보고하고 있다.

또한 BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 제160권 제1호 367 - 373페이지(1988)에서, 하루미 스즈키등은 표고버섯 균사체(LEM)의 추출물은 항 HIV효과를 갖는다고 보고하고 Agri. Biol. Chem(농생화학) 제54권 제2호 479 - 487페이지 (1990)에는 상기 추출물의 주물질은 LEM내에 함유된 수용성 리그닌이라고 기재되어 있다.

그런데, 본발명의 HIV활성의 저해제는 미정제 상태에서도 시험관내에서 125㎍/㎖의 농도에서 HIV 활성에 대한 충분한 저해 효과를 나타내며 이미 보고된 상기 물질들과는 상이하다.

[발명의 목적]

본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술에 있어서의 문제점들을 해결하려는 것이고, HIV의 바이러스 활성을 저해하고 상기 바이러스의 증식을 억제할 수 있고 부작용의 우려가 적기때문에 안전성이 탁월한 HIV 활성의 저해제를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

[발명의 요약]

본 발명에 의한 HIV 활성의 저해제는, 바가스로 되어 있는 고체 배지에 표고버섯 균을 접종하고, 그런다음 증식된 균사체를 함유하는 고체 배지를 해속하고, 셀룰라아제, 프로테아제 및 글루코시다아제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한 효소 및 물을, 고체 배지를 30내지 50℃에 유지하면서, 해속 된 고체 배지에 가하고, 효소의 존재하에 고체 배지를 분쇄 및 분말화하여 표고버섯 균사체추출물을 얻고, 그런다음 추출물을 95℃ 보다 높지 않은 온도까지 가열하여 효소를 불활성화하고 추출물을 살균하는 단계에 의해 얻어진 표고버섯 균사체 추출물로 되어 있다.

상기 공정에 의해 얻어진 표고버섯 균사체 추출물로 되어 있는 HIV 활성 저해제는 HIV의 바이러스 활성을 저해하고 상기 바이러스의 증식을 억제할 수 있으며 부작용의 우려가 적어 안전성이 탁월하다.

본 발명에 의한 HIV 활성의 저해제를 아래에 상세히 설명하겠다.

[ HIV 활성의 저해제의 제조 ]

본발명에 의한 HIV 활성의 저해제는 표고버섯 균사체의 적어도 한 추출물을 함유하고 있다. 표고버섯 균사체의 추출물을 제조하기 위해서는, 바가스로 구성된 고체 배지를 물 바람직하게는 순수(pure water)와 적당히 혼합하고 그런다음 표고버섯 균류을 고체 배지내에 접종한다. 필요에 따라 이 바가스 배지에 쌀겨, 광물질(예컨대, 인, 철, 게르마늄), 땅콩 껍질 및 현미를 첨가 보충할 수 있다.

이어서, 표고버섯 균류로 접종된 배지를 온도, 습도 및 조명이 조절된 배양실에 넣어 균사체가 증식되게 한다. 고체 배지내에 균사체가 퍼지고 자실체가 형성된다. 자실체 형성의 직전,후에 12인치 메시의 바가스양이 30중량%이하가 되도록 바가스 기질을 해속 하는 것이 바람직하다. 즉, 12메시의 체를 통과하는 해속 된 기질이 30중량%이하가 되게 한다.

바가스 기질 배지의 해속은 상기와 같이 자실체 형성의 직전 및 후에 행하는 것이 바람직하지만 자실체가 제법 성장한 후에 행할 수도 있다.

그렇게 해속 된 고체 배지에, 고체배지를 30 내지 50℃로 유지하면서, 셀룰라아제, 프로테아제 및 글루코시다아제로 구성된 군으로 부터 선택된 적어도 한 효소와 물을 보충한다. 이들 효소중 셀룰라아제(섬유분해효소)를 가하는 것이 특히 바람직하다. 첨가될 효소의 양은 고체 배지 1㎏당 0.5 내지 5g, 바람직하게는 1 내지 3g의 범위이다. 첨가되는 물은 금속이온등의 이온을 함유하지 않은 순수가 바람직하다. 순수는 해속 된 배지 1㎏당 1 내지 10㎏, 바람직하게는 2 내지 6㎏의 양을 첨가하여 바가스 함유 혼합물을 얻는다.

그런다음, 바가스 함유 혼합물로부터 표고버섯 균사체의 추출물을 취출(추출)한다. 표고버섯 균사체 추출물을 취출하기 위해서는, 예컨대 변속기어 펌프에 의해 배지 함유 혼합물을 순환시키면서, 12인치 메시의 바가스 섬유의 양이 70중량%이상이 되도록(12 메시체를 통과하는 분쇄 분말화된 고체 배지가 70중량% 이상이 되도록)고체 배지를 분쇄, 분말화하는 것이 바람직하다.

바가스 함유 혼합물의 분쇄, 분말화는 상기 혼합물의 온도를 30 내지 50℃로 유지하면서 행해질수도 있고, 또는 상기 혼합물의 온도를 상기 온도이상으로 점차 상승시키면서 행해질 수도 있다. 바람직하게는, 분쇄 및 분말화는 온도를 점차적으로 상승시키면서 행해진다.

물온도가 60℃이상이 되게, 바람직하게는 70℃이상이 될때에, 실온의 공기를 바가스함유 혼합물내에 분출하면, 기포가 갑자기 가열되고 파괴되어 바가스 섬유에 충격을 가하게 되며 그리하여 효과적인 성분의 추출이 효율적으로 행해질 수 있다.

그런다음 그렇게 처리된 바가스 함유 혼합물을 다시 95℃보다 높지 않은, 바람직하게는 약 75 내지 90℃의 온도로 가열하고 수십분간 그 온도로 유지하여 혼합물내에 있는 효소를 불활성화하고 그 혼합물을 살균한다. 그리하여 표고버섯 균사체의 추출물을 얻는다.

소망에 따라서는, 그렇게 얻어진 표고버섯 균사체의 추출물을, 50 내지 120인치 메시, 바람직하게는 60 내지 100인치 메시의 여포(필터 클로스)를 통과시킬 수도 있다.

상기와 같이 얻어진 표고버섯의 추출물은 농축물 상태로 이용될 수도 있고 또는 추출물을 냉동건조하여 얻은 분말의 형태로 이용될 수도 있다.

그런 HIV 활성저해제는 과립, 액체, 정제 및 캡슈울과 같은 여러형태로 경구투여에 의해 사용될 수 있다. HIV 감염자에 효과를 갖는 상기 저해제의 주사액을 개발할 수도 있다. 상기 균사체 추출물을 함유하는 HIV 활성저해제는 희석되지 않은채 HIV감염자에 투여될 수도 있으나, 예컨대 정제수 또는 알코올로 적절히 희석하여 투여될 수도 있다.

표고버섯 균사체의 추출물로 되어 있는 본 발명의 HIV 활성 저해제가 상기와 같이 HIV 감염환자에 투여되면, HIV 활성은 현격히 약화되고 상기 바이러스의 증식은 저해될 수도 있다. 그위에 HIV 감염에 의해 약화된 세포가 소생하여 장기간 동안 생존할 수 있다.

표고버섯 균사체의 추출물로 되어 있는 본 발명의 HIV 활성 저해제를 HIV 감염자에게 투여하면 상기와 같이 HIV 활성을 악화시킬 수 있고 상기 바이러스의 증식을 저해하여 HIV에 감염된 인간 세포를 활성화시킬 수 있는 이유는 다음과 같은 것으로 생각된다.

본 발명자의 연구에 의하면, 표고버섯 균사체의 추출물로 되어 있는 HIV 활성 저해제는, 표고버섯 균사체로 부터 추출된 또한 표고버섯 균사체가 배양된 고체 배지로 부터 추출된 많은 효과성분들을 혼합상태로 함유하고 있고 이들 효과성분들(미확인)이 항 HIV 활성을 갖고 있는 것으로 생각된다.

이것은, 단지 표고버섯 균사체만으로 부터 추출된 효과성분들은 HIV에 대해 저해 활성을 거의 나타내지 못하고, 또한 고체 배지(바가스)만으로부터 추출된 효과성분들도 HIV에 대해 거의 저해 활성을 나타내지 못한다는 사실로부터 추측될 수 있다.

[발명의 효과]

본 발명에 의해서, HIV의 바이러스 활성 또는 그 바이러스의 증식을 저해할 수 있고, HIV에 감염된 인간세포의 활성을 촉진시킬 수 있으며, 부작용의 우려가 적어 안전성이 탁월한 HIV 활성의 저해제가 얻어진다.

[ 실시예]

본 발명을 아래의 실시예를 참고하여 상세히 설명하겠으나 본발명은 이들 실시예에 의해 결코 제한되지 않는다고 생각해야 할 것이다.

[ 제조실시예 1]

[표고버섯 균사체 추출물로 되어 있는 HIV 활성 저해제의 제조]

90중량부의 바가스와 10중량부의 쌀겨로 구성된 고체 배지에 순수를 적당량 가했다. 그런다음, 그 고체 배지에 표고버섯 균류를 접종했다. 그렇게 처리한 고체 배지를 온도 및 습도가 조정된 배양실에 넣어 표고버섯 균사체가 증식되게 했다. 고체 배지내에 균사체가 증식하여 넓게 퍼진뒤에, 바가스 기질의 셀룰로오스를 해속하여 12인치 메시의 바가스 섬유의 양이 24중량%가 되게 하였다. 그렇게 해속된 배지 1.0㎏에, 고체 배지 온도를 40℃로 유지하면서, 순수 3.5리터와 정제 셀룰로오스 2.0g을 가하여 바가스 함유 혼합물을 얻었다.

이어서 혼합물을 함유한 배지를 변속기어펌프에 의해 순환시키면서 펌프의 기어부에서 약 200분동안 혼합물을 분쇄, 분말화시켜 12인치 메시의 바가스 섬유의 양이 약 80중량%가 되게 했다. 바가스함유 혼합물의 분쇄 및 분말화는 혼합물의 온도를 서서히 상승시키면서 행했다.

그런다음, 바가스함유 혼합물을 다시 90℃까지 가열하고 같은 온도에서 30분간 방치했다.

90℃까지의 가열에 의해 효소의 불활성화 및 혼합물의 살균을 행했다. 그렇게 해 얻은 배지 함유 혼합물을 60인치 여포를 통해 여과하여 미세 현탁물을 함유한 표고버섯 균사체 추출물을 얻었다.

[ 시험 실시예1 - 10]

상기한 제조실시예1에서 얻은 표고버섯 균사체 추출물로 되어 있는 HIV 활성 저해제에 관해서, Antiviral Research(항 바이러스 연구) 제20권 317 - 331페이지(1993)에 기재된 방법에 따라 항 HIV 효과를 측정했다.

상세하게는, 성인 T 세포 백혈병 바이러스로 인간 헬퍼 T 세포를 변형하여 얻은 인간 T4 임파세포 MT - 4를 표적 세포로 사용했다. MT - 4 세포(105/㎖) HIV (HIV - 1형 RF 주, 2 X 103 TCD50/㎖)로 37℃에서 1시간동안 감염시켰다.

그런뒤 그렇게 HIV로 감염시킨 MT - 4 세포( 감염다중도 : 0.02 )를 신선한 배지로 세척하여 비흡착된 바이러스를 제거했다. 그런 뒤 세포의 수를 5 X 104세포 / ㎖가 되게 조정하고 각각 100㎖씩의 양으로 세포들을 96 - 웰 미소판의 각 웰내에 갈라넣었다.

이어서 HIV - 감염 MT - 4세포를 수용하는 각 미소판 웰에, 최종 농도의 2배농도의 HIV 활성 저해제가 용해되어있는 배지 100㎖를 가하여, 37℃에서 5 내지 6일간 배양을 행했다.

배양 최종일에, 미소판의 각 웰에 MTT[3 - (4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드]를 가하고 그런다음 다시 4시간 동안 배양시켰다. 그런다음 생성된 포르마잔 염료의 밀도를, 595nm에서 흡광도를 측정함으로써, 비색 정량했다. 그 결과는 표 1에 표시되어 있다.

표 1에는, 제조실시예 1에서 얻은 HIV 활성 저해제를 HIV로 감염되지 않은 표적 세포 MT-4에 가한 것을 제외하고는 상기와 같은 방식으로 생성된 포르마잔 색소농도(흡광도)도 또한 표시되어 있다.

표1에 표시된 활성(생존도) 표시(%)는 다음과같이 구했다. 표적 세포 MT-4를 함유하는 배지 100㎕에 HIV 활성 저해제를 함유하지 않은 (HIV 활성 저해제의 농도 = 0) 배지 100㎕를 가하여 표적 세포 MT-4 배양했다. 표적 세포 MT - 4의 배양후 색농도를 595nm에서의 측색에 의해 구하고 이 경우의 흡광도를 100으로 설정했다(시험번호1). 또한 여러농도를 가진 HIV 활성 저해제를 사용하여 상기와 같은식으로 흡광도를 측정했다. 그렇게 하여 얻어진 각 흡광도 대 상기 흡광도의 비를 퍼센트(%)로 표시하고 이 값을 세포활성(세포 생존도)의 표시로 삼았다. 예컨대, 시험실시예2의 흡광도는 1.122이고 시험실시예1의 흡광도는 1.056이며 따라서 시험실시예2의 세포 생존도(%)= 1.122/1.056 ∼ 106.3%.

제1도는 표1에 표시된 결과를 도시하고 있다.

표1 또는 제1도에 표시된 결과로 부터 분명한 것 처럼, HIV 활성 저해제의 농도가 125㎍/㎖를 초과할때에는, 세포가 HIV로 감염되어 있지 않다 하더라도, MT-4의 생존도는 HIV 활성 저해제로부터 유래하는 영향 때문에 감소한다. 그러나, 상기 농도 이하의 농도에서는 HIV 활성저해제의 농도 증가와 더불어 HIV 감염 MT-4세포의 생존도는 HIV 활성 저해제의 항 AIDS 바이러스 효과로 인해 증가한다.

특히 HIV 활성 저해제의 농도가 125㎍/㎖일때 HIV 감염 MT-4 세포의 생존도는 71.5%이다.

Claims (3)

1. 바가스(bagasse)를 포함하는 고체 배지상에 표고버섯(Lentinus edodes)균을 접종하고, 다음으로 증식된 균사체를 함유하는 고체 배지를 해속하는 단계와; 상기 해속된 고체 배지 1㎏에 셀룰라아제(cellulase), 프로테아제(protease) 및 글루코시다아제(glucosidase)로 구성되는 군으로 부터 선택된 적어도 한 효소 0.5 내지 5g 및 물 1 내지 10㎏을 상기 고체 배지를 30 내지 50℃로 유지하면서 첨가하는 단계와; 표고버섯 균사체 추출물을 얻기 위하여 상기 효소의 존재하에서 상기 고체 배지를 분쇄 및 분말화 시키는 단계; 및 상기 효소를 불활성화 시키고 상기 추출물을 살균시키기 위하여 95℃보다 높지 않은 온도까지 추출물을 가열하는 단계에 의해 얻어지는 표고버섯 균사체 추출물을 포함하는 HIV 활성의 저해제.
2. 제1항에 있어서, 상기 효소가 바람직하게는 셀룰라아제인 것을 특징으로 하는 HIV 활성의 저해제.
3. 제1항에 있어서, 상기 고체배지가 바가스와 쌀겨를 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV 활성의 저해제.