CN1106695A - 人类免疫缺陷病毒活性抑制剂 - Google Patents
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Abstract
一种HIV活性抑制剂，包含用以下步骤获得的
香菇菌丝体提取物：将香菇真菌接种在包括蔗渣的固
体培养基上，然后将含增殖的菌丝体的固体培养基分
割开，在将固体培养基保持于30—50℃的条件下，向
分割开的固体培养基中加入水和选自纤维素酶、蛋白
酶和糖甙酶组成的一组中的至少一种酶，在酶的存在
下将固体培养基磨碎和研碎，得到香菇菌丝体提取
物，然后将提取物加热到不高于95℃的温度使酶失
活，并将提取物灭菌。该抑制剂抑制HIV活性，限制
病毒增殖，极少不良反应，安全性极好。
Description
本发明涉及HIV（人类免疫缺陷病毒）活性的抑制剂，更特殊地涉及对HIV感染性疾病治疗有效而几乎不引起不良反应的HIV活性抑制剂。
据报导，1950年在非洲发现世界上首例死于HIV感染的患者，HIV感染者迅即扩播到世界各地。最近报导，大量的人感染了HIV并已死亡。
HIV感染者的治疗剂包括2′，3′二脱氧核苷胸腺嘧啶叠氮钠（AZT）、2′3′二脱氧核苷次黄嘌呤（ddI）、2′3′二脱氧核苷胞嘧啶（ddC）、白细胞介素-2、GL0223、DHCA、γ-β-ser干扰素、α干扰素、γ干扰素等。
但是，这些治疗剂存在不良反应严重或疗效差的问题，至今尚未发现有特异疗效的HIV活性的抑制剂（即HIV活性抑制剂）。
因此，本发明者进行了认真的研究以寻求一种HIV活性抑制剂，它抑制HIV病毒活性，能消灭所述病毒，而且没有不良反应之虑。结果，本研究者发现用特殊方法制备的一种菌丝体提取物抑制HIV活性并限制所述病毒的增殖，从而完成了本发明。
日本专利公布No.23826/1985描述了制备一种保健饮料的方法，包括以下步骤：将香菇（Lentinus edodes）真菌接种在包括蔗渣的固体培养基上，然后将含增殖的菌丝体的固体培养基分开（分割开），使分割开的12吋筛孔的培养基不多于30%（重量），在将固体培养基保持于30-50℃的条件下，向分割开的固体培养基中加入水和选自纤维素酶、蛋白酶和糖甙酶组成的一组中的至少一种酶，在酶的存在下将固体培养基磨碎和研碎，以便使12吋筛孔的蔗渣纤维量至少为70%（重量），然后加热至不高于95℃的温度使酶失活并灭菌，将得到的悬浮液过滤。
而日本专利申请No.5355/1984和No.5356/1984（即分别为日本专利公布No.35149/1992和No.6171/1992）描述了用紫芝（Fomes japonicus）真菌制备保健饮料的方法。
但是，在这些出版物中既未描述也未提示所获得的保健饮料作为HIV活性抑制剂是有效的。
关于从香菇（日本食用蘑菇、香菇）中得到的生理活性物质，有一些文献报导。
“BIOTHERAPY”Vol.2，No.3，pp.509-521（June，1088），Tetsuo Taguchi et al.阐述了从香菇中得到的香菇糖与HIV活疗剂AZT合用抑制HIV的增殖。上述论文的合作者Kureo Chihara在“Pharmaceutical Magazine”Vol.108，No.3，pp.171-186（1988）报告了从香菇中得到的多糖类的主要物质是β-1，6：β-1，3-D-葡聚糖。
此外，“BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS”Vol.160，No.1，pp.367-373（1988），Harumi Suzuki et al.报道香菇菌丝体（LEM）的提取物具有抗HIV效应，“Agri.Biol.Chem.”Vol.54，No.2，pp.479-487（1990）描述了所述提取物的主要物质是LEM中含有的水溶性木素。
另外，本发明的HIV活性抑制剂在体外试验中即使在不纯的状态下，125μg/ml的浓度就对HIV活性显示足够的抑制效应，且不同于上述已报道的物质。
本发明旨在解决与如上所述现有技术有关的这些问题。本发明的目的是提供一种HIV活性的抑制剂，它抑制HIV的病毒活性，能限制所述病毒的增殖，由于极少不良反应之虑，因而安全性极好。
按本发明所述的HIV活性抑制剂包括用以下步骤获得的香菇菌丝体提取物：将香菇真菌接种在包括蔗渣的固体培养基上，然后将含增殖的菌丝体的固体培养基分割开，在将固体培养基保持于30-50℃的条件下，向分割开的固体培养基中加入水和选自纤维素酶、蛋白酶和糖甙酶组成的一组中的至少一种酶，在酶的存在下将固体培养基磨碎和研碎，得到香菇菌丝体提取物，然后将提取物加热到不高于95℃的温度使酶失活，并将提取物灭菌。
包含用上述方法得到的香菇菌丝体提取物的HIV活性抑制剂能抑制HIV的病毒活性，所述病毒的增殖，并且因极少不良反应之虑而安全性极好。
图1是本发明的HIV活性抑制剂抑制作用的图示。
按本发明的HIV活性抑制剂将在下文进行详述。
HIV活性抑制剂的制备
按本发明所述的HIV活性抑制剂至少含一种香菇菌丝体的提取物。
为了制备香菇菌丝体提取物，将由蔗渣组成的固体培养基与水（最好是纯水）适当混合，然后将香菇真菌接种到固体培养基中。如果需要，此蔗渣培养基可用稻糠、无机物（如磷、铁、锗）、花生壳和未碾过的米加以补充。
接着，将接种了香菇真菌的培养基放在调节好温度、湿度和照明度的培养室中以繁殖菌丝体。
菌丝体在固体培养基上广泛播散生长，形成蘑菇体。在蘑菇体体正要形成前或刚形成后，要求将蔗渣基质分割开，以使12吋筛孔的蔗渣量不多于30%（重量），即通过12号筛的分割后的蔗渣基质不多于30%（重量）。如上所述，蔗渣基质培养基的分割在蘑菇体正要形成前或刚形成后进行为好，但也可在蘑菇体长得相当程度后进行。
给这样分割开的固体培养基补充水和选自由纤维素酶、蛋白酶和糖甙酶组成的一组中的至少一种酶，并将固体培养基保持在30-50℃下。在这些酶中，加纤维素酶更好。加入的酶量为每kg固体培养基在0.5-5g的范围内，较佳为1-3g。加入的水以不含离子（如金属离子）的纯水为较好。加入的纯水量为每kg分割开的培养基1-10kg，最好为2-6kg，以得到含蔗渣的混合物。
然后，从含蔗渣的混合物中取得香菇菌丝体提取物。为了取出香菇菌丝体提取物，要求使固体培养基受到碾磨，采用例如变速齿轮泵循环含培养基的混合物时，使12吋筛孔的蔗渣纤维的量不少于70%（重量）（通过12号筛的碾碎和磨碎的固体培养基不少于70%（重量）。
含蔗渣混合物的碾磨可在保持所述混合物的温度于30-50℃的情况下进行，也可将所述混合物的温度缓慢地升至上述温度以上而进行。碾磨在缓慢升温下进行较好。当水温变为不低于60℃（较好为不低于70℃）时，如果将室温下的空气引入含蔗渣的混合物，则气泡突然受热并破裂以致对蔗渣纤维产生碰撞，由此可高效率地进行有效成分的提取。
然后，将如此处理的含蔗渣混合物进一步加热到不高于95℃的温度，较好为约75-90℃，并在此同样的温度下保持几十分钟，使混合物中的酶失活并将所述混合物灭菌，从而获得香菇菌丝体提取物。
如果需要，可将这样获得的香菇菌丝体提取物通过50-120吋筛孔（较好为60-100吋筛孔）的滤布进行过滤。
如上得到的香菇菌丝体提取物可以其浓缩物的形式使用，也可以冷冻干燥提取物所得粉剂的形式使用。
这样的HIV活性抑制剂可以诸如颗粒剂、液体剂、片剂和胶囊等不同剂型口服给药。也可开发所述抑制剂的注射液，它作用于HIV感染者。含上述菌丝体提取物的HIV活性抑制剂可不经稀释地施用于HIV感染者，但也可用诸如纯水或乙醇适当稀释后给药。
如上所述，当将含香菇菌丝体提取物的本发明的HIV活性抑制剂施用于HIV感染者时，HIV活性显著减弱，所述病毒的增殖可被抑制。此外，因HIV感染而被削弱的细胞可复活并可长期生存。
将含香菇菌丝体提取物的本发明的HIV活性抑制剂给HIV感染者投药可削弱HIV活性，抑制所述病毒的增殖并液活受HIV感染的人体细胞（如上所述）的原因设想如下：
根据本发明者的研究，认为含香菇菌丝体提取物的HIV活性抑制剂含有从香菇菌丝体和从长有香菇菌丝体的固体培养基中提取的以混合形式存在的大量有效成分，这些有效成分（未鉴定）具有抗HIV活性。
从这一事实可以设想，单从香菇菌丝体中提取的有效成分对HIV几乎不显示抑制活性，单从固体培养基（蔗渣）中提取的有效成分也对HIV几乎不显示抑制活性。
按照本发明，提供了一种HIV活性抑制剂，它能抑制HIV的病毒活性或所述病毒的增殖，能促进受HIV感染的人体细胞的激活，并因极少有不良反应之虑而安全性极佳。
下面用实施例对本发明作更详细的描述，但应当认为，本发明决不受这些实施例的限制。
制备例1
包含香菇菌丝体提取物的HIV活性抑制剂的制备
将纯水适量加入由90重量份蔗渣和10重量份稻糠组成的固体培养基中。然后，将香菇真菌接种到固体培养基中。这样处理过的固体培养基放在已调节好温度和湿度的培养室中，以繁殖香菇菌丝体。在菌丝体增殖并播散生长在固体培养基中后，将蔗渣基质的纤维素分割开，以使12吋筛孔的蔗渣纤维量为24%（重量）。向这样分割开的1.0kg培养基中加入3.51纯水和2.0g纯化过的纤维素酶，固体培养基保持在40℃，得到含蔗渣的混合物。
接着，在借助变速齿轮泵使含混合物的培养基循环的同时，在泵的齿轮部分碾碎和磨碎混合物，共约200分钟时间，使12吋筛孔的蔗渣纤维量为80%（重量）。含蔗渣的混合物的碾碎和磨碎在使混合物缓慢升温下进行。
此后，将含蔗渣的混合物进一步加热到90℃，使其在该温度下静置30分钟。
通过加热到90℃，完成了酶的失活和混合物的灭菌。
将这样得到的含培养基的混合物通过60吋筛孔的滤布过滤，得到含精细悬浮物质的香菇菌丝体提取物。
实验例1-10
对于如上所述制备例1中所得到的含香菇菌丝体提取物的HIV活性抑制剂，按“Antiviral Research”Vol.20，pp.317-331，（1993）所描述的方法测定其抗HIV效应。
详细情况如下：
用人T细胞白血病病毒修饰人辅助T细胞，将得到的人T4淋巴细胞MT-4用作靶细胞。
在37℃下，用HIV（HIV-1型RF种族，2×103TCD50/ml）将MT-4细胞（105/ml）感染1小时。
然后，用新鲜的培养基洗涤经HIV这样感染的MT-4细胞（感染倍数（infection multiplicity）：0.02）以除去未吸附的病毒。此后，将细胞数调整节到5×104细胞/ml，分别以100μl/的量分配到96孔微量板的每个孔中。
接着，在含HIV感染的MT-4细胞的微量板的每一个孔中加入100μl培养基，其中，浓度为终浓度两倍的HIV活性抑制剂被溶入，于37℃下培养5-6天。
在培养的最后一天，向微量板的每个孔中加入MTT[3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物]，再继续培养4小时。然后，通过测量595nm的吸光度对产生的甲
染料的密度进行比色测定。
结果列于表1。
在表1中，还列出了除将制备例1中得到的HIV活性抑制剂加到不用HIV感染的MT-4靶细胞中之外，以上述同样方法产生的甲
染料的密度（吸光度）。
表1中所示的活性（存活力）指标（%）是按如下方法测定的。在100μl含靶细胞MT-4的培养基中加入100μl不含HIV活性抑制剂的培养基（HIV活性抑制剂的浓度＝0），培养靶细胞MT-4。在靶细胞MT-4培养后，通过595nm处的比色测定颜色密度，在此情况下的吸光度定为100（实验号1）。再用各种浓度的HIV活性抑制剂按上述同样方法测量吸光度。这样得到的每一吸光度与上述吸光度的比用百分数（%）表示，此值作为细胞活性（细胞存活力）的指标。例如，实验例2中的吸光度为1.122，实验例1中的吸光度为1.056，因此，实验例2的细胞存活力（%）＝1.122/1.056≌106.3%。
图1以图示法表示表1中所列的结果。
从表1或图1所列结果可以看出，当HIV活性抑制剂的浓度超过125μg/ml时，由于来自HIV活性抑制剂的影响，即使不用HIV感染细胞，MT-4细胞的存活力也降低。然而，由于HIV活性抑制剂的抗AIDS病毒效应，在不高于上述浓度的浓度范围内，随着HIV活性抑制剂浓度的增加，感染HIV的MT-4细胞的存活力提高。特别是，当HIV活性抑制剂的浓度为125μg/ml时，感染HIV的MT-4细胞的存活力是71.5%。
Claims (3)
1、一种HIV活性抑制剂，其特征在于包含用以下步骤获得的香菇菌丝体提取物：将香菇真菌接种在包括蔗渣的固体培养基上，然后将含增殖的菌丝体的固体培养基分割开，在将固体培养基保持于30-50℃的条件下，向分割开的固体培养基中加入水和选自纤维素酶、蛋白酶和糖甙酶组成的一组中的至少一种酶，在酶的存在下将固体培养基磨碎和研碎，得到香菇菌丝体提取物，然后将提取物加热到不高于95℃的温度使酶失活，并将提取物灭菌。
2、如权利要求1所述的HIV活性抑制剂，其中酶是纤维素酶。
3、如权利要求1所述的HIV活性抑制剂，其中固体培养基包含蔗渣和稻糠。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20010228 Termination date: 20120315 |