JPWO2019067875A5

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Publication number: JPWO2019067875A5
Application number: JP2020517991A
Authority: JP
Publication date: 2022-07-07
Anticipated expiration: 2038-09-28

Claims

ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む、齧歯動物であって、
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が内因性Ｔｔｒプロモーターを含み、前記ヒトＴＴＲ配列が前記内因性Ｔｔｒプロモーターに作動可能に連結されており、
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座がヒトＴＴＲ３’非翻訳領域を含み、
内因性Ｔｔｒ５’非翻訳領域は欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、
（Ｉ）前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の前記Ｔｔｒコード配列全体が欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられており、かつＴｔｒ開始コドンからＴｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている；あるいは
（ＩＩ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座がシグナルペプチドを含むトランスサイレチン前駆体タンパク質をコードし、前記シグナルペプチドをコードする前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の第１のエクソンが欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、かつ第２のＴｔｒエクソンの開始からＴｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている、齧歯動物。
前記Ｔｔｒ開始コドンから前記Ｔｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列およびヒトＴＴＲ３’非翻訳領域を含むヒトＴＴＲ配列で置き換えられており、
前記内因性Ｔｔｒ５’非翻訳領域は欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、
前記内因性Ｔｔｒプロモーターは欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、
請求項１に記載の齧歯動物。
（ｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座の前記ヒトＴＴＲ配列が、配列番号１８に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか；
（ｉｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号１に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むタンパク質をコードするか；
（ｉｉｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号９０に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むコード配列を含むか；または、
（ｉｖ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号１４または１５に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、
請求項２に記載の齧歯動物。
前記第２のＴｔｒエクソンから前記Ｔｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列およびヒトＴＴＲ３’非翻訳領域を含むヒトＴＴＲ配列で置き換えられており、
前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の第１のエクソンおよび第１のイントロンが欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、
前記内因性Ｔｔｒ５’非翻訳領域が欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、
前記内因性Ｔｔｒプロモーターが欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられていない、
請求項１に記載の齧歯動物。
（ｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座の前記ヒトＴＴＲ配列が、配列番号１９に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むか；
（ｉｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号２に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むタンパク質をコードするか；
（ｉｉｉ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号９１に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含むコード配列を含むか；または
（ｉｖ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が、配列番号１６または１７に示す配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む、
請求項４に記載の齧歯動物。
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が選択カセットもレポーター遺伝子も含まない、請求項１から５のいずれか一項に記載の齧歯動物。
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座についてホモ接合性である、請求項１から６のいずれか一項に記載の齧歯動物。
ラットまたはマウスである、請求項１から７のいずれか一項に記載の齧歯動物。
前記マウスである、請求項８に記載の齧歯動物。
ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価する方法であって、
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬が投与された請求項１から９のいずれか一項に記載の齧歯動物における前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価すること
を含む方法。
前記投与が、（１）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達であって、必要に応じて、前記齧歯動物が、ＡＡＶ８媒介性送達によって前記ヒトＴＴＲ標的化試薬が投与されている、送達；（２）脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達であって、必要に応じて、前記ＬＮＰの用量が約０．１ｍｇ／ｋｇから約２ｍｇ／ｋｇの間にある、送達；または（３）流体力学的送達（ＨＤＤ）を含む、請求項１０に記載の方法。
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性が、前記齧歯動物から単離された肝臓において評価され、必要に応じて、前記方法は、前記肝臓以外の単離された臓器または組織における前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を評価することをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬がゲノム編集剤であり、前記評価することが前記遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座の改変を評価することを含み、必要に応じて、前記評価することが、前記遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
前記評価することが、前記遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座によってコードされるＴｔｒメッセンジャーＲＮＡの発現を測定することまたは前記遺伝子改変Ｔｔｒ遺伝子座によってコードされるＴＴＲタンパク質の発現を測定することを含み、必要に応じて、前記ＴＴＲタンパク質の発現を評価することが、前記齧歯動物における前記ＴＴＲタンパク質の血清レベルを測定することを含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬が、ヒトＴＴＲ遺伝子のある領域を標的にするように設計されたヌクレアーゼ剤を含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質、および前記ヒトＴＴＲ遺伝子におけるガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含み、必要に応じて、前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１５に記載の方法。
前記ヒトＴＴＲ標的化試薬が外因性ドナー核酸をさらに含み、前記外因性ドナー核酸が前記ヒトＴＴＲ遺伝子と組み換わるように設計されており、必要に応じて、前記外因性ドナー核酸が一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項１５または１６に記載の方法。
ｉｎｖｉｖｏでヒトＴＴＲ標的化試薬の活性を最適化する方法であって、
（ａ）ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む第１の齧歯動物において、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法を１回目に実行すること、
（ｂ）ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含む前記ヒトＴＴＲ配列を含む前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む第２の齧歯動物において、変数を変更し、ステップ（ａ）の方法を変更した前記変数で２回目に実行すること；および
（ｃ）ステップ（ａ）の前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性をステップ（ｂ）の前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択すること
を含む方法。
（Ｉ）ステップ（ｂ）の変更した前記変数が、前記ヒトＴＴＲ標的化試薬を前記齧歯動物に導入する送達方法または投与経路であり、必要に応じて、前記投与することがＬＮＰ媒介性送達を含み、ステップ（ｂ）の変更した前記変数がＬＮＰ製剤である；
（ＩＩ）ステップ（ｂ）の変更した前記変数が、前記齧歯動物に導入される前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の濃度または量である；
（ＩＩＩ）ステップ（ｂ）の変更した前記変数が、前記齧歯動物に導入される前記ヒトＴＴＲ標的化試薬の形態である；
（ＩＶ）ステップ（ｂ）の変更した前記変数が、前記齧歯動物に導入される前記ヒトＴＴＲ標的化試薬である；あるいは
（Ｖ）前記ヒトＴＴＲ標的化試薬が、Ｃａｓタンパク質、およびヒトＴＴＲ遺伝子におけるガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計されたガイドＲＮＡを含み、
（１）ステップ（ｂ）の変更した前記変数が、ガイドＲＮＡ配列または前記ガイドＲＮＡ標的配列である、
（２）前記Ｃａｓタンパク質および前記ガイドＲＮＡの各々がＲＮＡの形態で投与され、ステップ（ｂ）の変更した前記変数がＣａｓｍＲＮＡのガイドＲＮＡに対する比である、または
（３）ステップ（ｂ）の変更した前記変数がガイドＲＮＡの改変である、請求項１８に記載の方法。
ＴＴＲコード配列と非コード配列の両方を含むヒトＴＴＲ配列を含む遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座をそのゲノムに含む、齧歯動物細胞であって、
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座が内因性Ｔｔｒプロモーターを含み、前記ヒトＴＴＲ配列が前記内因性Ｔｔｒプロモーターに作動可能に連結されており、
前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座がヒトＴＴＲ３’非翻訳領域を含み、
内因性Ｔｔｒ５’非翻訳領域は欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、
（Ｉ）前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の前記Ｔｔｒコード配列全体が欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられており、かつＴｔｒ開始コドンからＴｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている；あるいは
（ＩＩ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座がシグナルペプチドを含むトランスサイレチン前駆体タンパク質をコードし、前記シグナルペプチドをコードする前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の第１のエクソンが欠失しておらず、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられておらず、かつ第２のＴｔｒエクソンの開始からＴｔｒ停止コドンまでの前記内因性Ｔｔｒ遺伝子座の領域が欠失し、対応するヒトＴＴＲ配列で置き換えられている、齧歯動物細胞。
請求項１から９のいずれか一項に記載の齧歯動物を作製するための方法であって、
（Ｉ）
（ａ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座を含むように多能性齧歯動物細胞のゲノムを改変するステップと；
（ｂ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座を含む遺伝子改変多能性齧歯動物細胞を同定または選択するステップと；
（ｃ）前記遺伝子改変多能性齧歯動物細胞を齧歯動物宿主の胚に導入するステップと；
（ｄ）前記齧歯動物宿主の胚を代理齧歯動物母に埋め込み、懐胎させるステップと
を含む、あるいは
（ＩＩ）
（ａ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座を含むように齧歯動物の１細胞期胚のゲノムを改変するステップと；
（ｂ）前記遺伝子改変内因性Ｔｔｒ遺伝子座を含む遺伝子改変齧歯動物１細胞期胚を選択するステップと；
（ｃ）前記遺伝子改変齧歯動物１細胞期胚を代理齧歯動物母に埋め込み、懐胎させるステップと
を含む方法。