TWI792124B - 肝癌動物模式及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種肝癌動物模式及其用途，其基因組中包含一B型肝炎病毒基因組及一被部分剔除之單套內生性miR-122。由於其發生自發性肝癌的時間早且發生率高，及其脂肪代謝異常，其可用於篩選預防或治療B型肝炎病毒與肝癌或其他疾病之候選試劑或發展診斷與預測肝癌進行的用途。
Description
本發明有關於一種肝癌動物模式，尤其是一種B型肝炎引發的肝癌動物模式。
肝癌高居台灣癌症之次位，每年有超過七千人以上因此而死亡，在世界上也佔癌症死亡率第三位，每年因肝癌死亡的病人約五十萬人以上。而Ｂ型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)則是引起肝癌的主要病因，慢性肝炎可能進而導致肝硬化或肝癌。
目前對於HBV的研究缺乏適當的動物模式，黑猩猩雖然可以被Ｂ型肝炎病毒感染，但是黑猩猩屬於於法律保護的動物物種與費用非常昂貴，無法被廣泛應用。土撥鼠與北京鴨雖然可以感染類似Ｂ型肝炎病毒的woodchuck hepatitis virus (WHV)與duck hepatitis B virus (DHBV)，因為這些肝炎病毒感染的特質和病程還是和人類的Ｂ型肝炎病毒感染有些不同，還有不易繁殖與照顧及價格昂貴，並不是理想的Ｂ型肝炎病毒感染與肝癌研究模式。
目前除了黑猩猩以外，最貼近真正人體的動物模式為人肝移植小鼠，不過技術門檻極高，且小鼠體質脆弱難照顧，只有特定大型實驗室的專門人員能製造，數量有限也難以推廣，價格昂貴，難以大量繁殖用於全面性的肝炎與肝癌研究。再者，此種小鼠通常用於短期的病毒感染研究或抗病毒藥物評估，極少用於肝癌發生的研究。而且人肝來源稀少且昂貴，每隻小鼠因移植的成效不一，個體變異較大。而HBV基因轉殖小鼠可以大量表現HBV病毒，並且用做抗病毒藥物試驗平台，雖部分表現高病毒量的小鼠品系有機會產生肝癌，一般的B型肝炎病毒轉殖基因鼠致癌率低，除非加入化學致癌物，然而如此又和人類慢性B型肝炎病毒感染所致的肝癌機制不同，無法做為臨床與轉譯研究用。
miR-122是抑癌基因，主要存於肝臟，在人類的B型肝炎病毒感染期間，隨著感染時間逐漸減少，和肝細胞癌的發生有密切關係，隨著肝癌的分期日益嚴重(Tsai WC et al. Hepatology 2009, 565 citations)[1]，miR-122更進一步減少，也影響了肝癌的進行。先前研究顯示miR-122 剔除小鼠，全部發生肝癌(Tsai WC et al. MicroRNA-122. J Clin Invest 2012;122(8):2884–2897. With an editorial and 583 citations) [2]，然而人類的肝癌miR-122只是減少，並非雙套基因均剔除，miR-122 剔除小鼠肝癌機轉和人類肝癌不一樣。亟需建立更近似人類的由B型肝炎轉為肝癌的模式。
人類肝臟粒線體功能的改變，和miR-122降調均可影響脂肪的代謝，造成脂肪肝。非酒精性脂肪肝也可引發肝癌，是影響全球人類健康的重要問題，慢性B型肝炎病毒感染合併脂肪肝與代謝症候群顯著的增加肝硬化與肝癌的機會。目前尚無動物模式同時研究肝臟粒線體功能的改變，和miR-122降調和慢性B型肝炎關係與如何增加肝癌的機轉。
有鑒於現有技術缺乏一理想之B型肝炎引發肝癌的動物模式，本發明提供一種產生肝癌模式之非人類基因轉殖動物的方法。
一方面，本發明提供一種產生肝癌模式之非人類基因轉殖動物的方法，其包含：a)提供一編碼選自由B型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）基因組包含5′端強化子I/II（enhancer I/II）、X、C、PS及S等基因的開放閱讀框（open reading frame）至3′端多腺苷酸化位置（polyadenylation site）之聚核苷酸序列表現載體；b)將該聚核苷酸序列表現載體引入來自與該非人類基因轉殖動物相同之動物物種之基因組基因座中，以產生含有編碼該HBV基因組之非人類基因轉殖動物；c)提供內生性miR-122剔除之與前述相同之動物物種；及d)將該含有編碼該HBV基因組之非人類基因轉殖動物及該內生性miR-122剔除之動物進行雜交以產生其基因組編碼該HBV基因組及內生性miR-122剔除之非人類基因轉殖動物。應用基因重組技術建立肝臟專一表現的HBV轉殖基因。
於本發明之一實施例，其中該非人類基因轉殖動物為嚙齒動物，較佳為小鼠或大鼠。
於本發明之一實施例，其中該HBV基因組包含基因型A、野生型的基因型B、基因型C、基因型D、基因型E、基因型F、基因型G、基因型H、基因型I及基因型J。基因型B東亞較常見的基因型，也是台灣主要分布的基因型，另一組實施例同時包括具有易致癌的BCP突變與有抗藥性常見的反轉錄酶活化位基因突變之野生型與抗藥性HBV基因組。野生型小鼠可用以篩檢新型抗病毒藥物的藥效，抗藥性小鼠可用以篩檢可能產生抗藥性的新藥標的，提早於以剔除，合併兩種篩檢可以快速篩選出既能高效率清除病毒又不易產生抗藥性的新藥標的。同時易致癌的特性，又可以做為肝癌動物模式，做為篩選抗癌藥物的平台，也可做為癌症研究的動物模式。
根據本發明，該具抗藥性之HBV基因組係對類核苷抗病毒藥物具抗藥性，例如阿德福韋（adefovir）或 拉米夫定（lamivudine）。本發明的動物模式經藥物試驗後發現，野生型的HBV基因組小鼠施用阿德福韋（adefovir）或 拉米夫定（lamivudine）等抗病毒藥物後，血清病毒量減少超過千倍，而抗藥性的HBV基因組小鼠施用抗病毒藥物後，病毒量減少程度明顯低於野生型小鼠，呈現抗藥性。
於本發明之一實施例，其中該具抗藥性之HBV基因組具有至少一胺基酸變異，其中該胺基酸變異係選自由存在於HBV基因組逆轉錄酶（reverse transcriptase）區域rtA181V、rtN236T、rtL180M、rtM204V及其任一組合所組成的群組，其中數字係變異之胺基酸位點，其後之英文字母係變異之胺基酸。該胺基酸變異係選自由rtL180M、rtM204V及其組合所組成的群組。
於本發明之一實施例，其中該內生性miR-122為單套剔除或雙套剔除，較佳為單套剔除，可用以減少miR-122表現量，如同一般B型肝炎病人miR-122表現量可能減少。
另 一方面，本發明提供一種使用如本發明之方法篩選具預防或治療肝癌或其他疾病功效候選試劑的方法，其包含：a)提供一種如請求項1-12之方法產生肝癌模式之非人類基因轉殖動物；b)給予該非人類基因轉殖動物服用一種候選試劑；及c)比較給予服用候選試劑與未給予服用的非人類基因轉殖動物組之表現，其中該候選試劑若能減緩症狀，則篩選出為具有預防或治療肝癌或其他疾病功效之試劑。
於本發明之一實施例，其中該試劑為預防或治療肝癌、肝炎、或脂肪肝。
又一方面，本發明提供一種非人類基因轉殖動物，係發生自發性肝癌的時間早且發生率高，及其脂肪代謝異常。其特徵具有內生性miR-122剔除之與前述相同之動物物種，及含有編碼該HBV基因組之非人類基因轉殖動物及該內生性miR-122剔除之動物進行雜交以產生其基因組編碼該HBV基因組及內生性miR-122剔除。
因此，該非人類基因轉殖動物可做為新穎抗病毒藥物及抗肝癌藥物篩選平台。
本發明進一步提供一種使用該非人類基因轉殖動物於篩選預防或治療肝癌或其他疾病之候選試劑的用途，其包含：a)一種如前述之非人類基因轉殖動物；b)提供給該非人類基因轉殖動物一種候選試劑；及c)比較已提供受試藥物及未提供候選試劑的非人類基因轉殖動物，其中該候選試劑若能減緩症狀，則可被篩選出為預防或治療肝癌或其他疾病之有效試劑。
由於前述之基因組編碼該HBV基因組及內生性miR-122剔除之非人類基因轉殖動物發生自發性肝癌的時間早且發生率高，及其脂肪代謝異常，因此，本發明亦提供一種miR-122用於製備預防或治療肝癌的藥物的用途，其中該藥物可有效提高有需要個體之內生性miR-122。
除非另外定義，本文所用之所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬領域之技術者普遍了解之相同意義。應理解本文所使用的術語僅具有針對描述具體實施例之目的，而意不在於限制。
如本文所用，單數形式「一」（a、an）及「該」包括複數參照，除非另外明確指示內容。因此，例如，對「一樣本」之參照包括複數個此等樣本及熟習本技術者已知之其等同物。
如本文所用，「基因」係指真核或原核細胞基因組的任一和所有分離編碼區，以及相關的非編碼和調節區。術語「基因」還意指編碼特定多胜肽、內含子和參與表現調節的相鄰5'和3'端非編碼核苷酸序列的開放閱讀框。在這方面，該基因可進一步包含控制信號，例如與特定基因天然相關的啟動子、增強子、終止及/或多腺苷酸化信號，或異源控制信號。該DNA序列可以是cDNA或基因組DNA或其片段。基因可導入合適的載體中，用於染色體外維持，或整合到宿主中。
如本文所用，「基因轉殖」係指將新的遺傳物質利用基因工程添加至生物體的基因組中，該基因組與外來DNA的結合造成一種永久或者暫時性的基因型(genetic)變化。
如本文所用，「非人類基因轉殖動物」包括除人類之外的任何可轉型物種，尤其是非人類哺乳類動物，其包括創始非人類基因轉殖動物及創始者之子代，及由該等動物所取得之細胞與組織等。 舉例而言，非人類哺乳類動物包括靈長類動物、有蹄類動物、犬類動物、齧齒動物或貓類動物。在一具體實施例中，基因轉殖動物為小鼠。
如本文所用，「微核糖核酸（microRNA，miRNA）」，為真核生物中廣泛存在的一種長約21到23個核苷酸的RNA分子，可調節其他基因的表現。其由DNA轉錄而來，但無法進一步轉譯成蛋白質的RNA，故為非編碼RNA。在調控基因表現、細胞周期、生物體發育時序等方面具有重要作用。
產生轉殖基因動物之方法為熟習此項技術者已知。該等方法包括嵌入、基因剔除、CRISPR、TALENs及其類似方法。
在本發明一特定具體實施例中，提供一種表現B型肝炎病毒的非人類基因轉殖動物，其編碼HBV基因組包含5′端強化子I/II（enhancer I/II）、開放區（open reading frame）X、C、PS及S至3′端多腺苷酸化位置（polyadenylation site）。
在另一方面，本發明提供一種產生表現B型肝炎病毒基因轉殖非人類動物之方法，其包含：a)提供編碼選自由HBV基因組包含5′端強化子I/II（enhancer I/II）、開放區（open reading frame）X、C、PS及S至3′端多腺苷酸化位置（polyadenylation site）之聚核苷酸序列；b)在一定條件下將該聚核苷酸序列引入來自與該非人類動物相同之動物物種之胚胎幹細胞中，該條件使得該聚核苷酸序列同源性重組至該胚胎幹細胞之基因組基因座中，以產生含有編碼選自由HBV基因組包含5′端強化子I/II（enhancer I/II）、開放區（open reading frame）X、C、PS及S至3′端多腺苷酸化位置（polyadenylation site）的聚核苷酸之胚胎幹細胞；c)將經同源性重組之胚胎幹細胞注射至非人類動物之囊胚中；d)將經注射之囊胚引入假孕雌性非人類動物中；e)允許假孕雌性動物分娩一或多個含有同源性重組DNA序列之非人類基因轉殖動物；及f)將帶有轉殖基因的初代非人類基因轉殖動物持續回交數代產生穩定的非人類基因轉殖動物品系。
在一具體實施例中，該HBV基因組係包含基因型A、基因型B、基因型C、基因型D、基因型E、基因型F、基因型G、基因型H、基因型I及基因型J。較佳地，該HBV基因組係為基因型B。
在另一具體實施例中，該HBV基因組係自長期使用類核苷抗病毒藥物阿德福韋（ adefovir）或 拉米夫定（lamivudine）的慢性 B 型肝炎病人血液樣本單離，係為具抗藥性之HBV基因組。
該具抗藥性之HBV基因組之胺基酸變異係選自由存在於HBV基因組逆轉錄酶（reverse transcriptase）區域rtA181V、rtN236T、rtL180M、rtM204V及其任一組合所組成的群組，其中數字係變異之胺基酸位點，其後之英文字母係變異之胺基酸。較佳地，該具抗藥性之HBV基因組之胺基酸變異係選自rtL180M及rtM204V之組合。
在本發明一特定具體實施例中，提供一種miR-122基因剔除動物，其基因組中內生性的miR-122被剔除， 其製備方法請參見J Clin Invest. 2012;122(8):2884–2897。
本發明所提供之miR-122基因剔除動物在其中一個或兩個對偶基因(allele)上有部分或完整表現喪失。
在基因剔除的過程中，可能使目標基因的表現量降低至無法偵測或是無顯著意義。miR-122的剔除代表miR-122的表現量已經被實質上減少。此目的可由多種途徑達到，包括加入一破壞性的序列至目標基因，例如：插入一個或多個的終止碼(stop codon)、插入一DNA片段、刪除部分的目標基因序列或是利用終止碼代替目標基因的一般密碼子等等。另外，還有許多不同的方法可以用來達到”基因剔除”的效果，例如一原基因所在之染色體部分或全部的刪除，包括非密碼(non-coding)區域的刪除，尤其是啟動子(promotor)區域、3端調節(regulatory)序列、增強子(enhancer)或是刪除某些能夠活化標的表現的基因。此外，基因剔除也可以給予一反義(anti-sense)人造核苷酸來阻止標的的表現。
此外，基因剔除也包括條件式基因剔除(conditional knock-out)，例如將一動物暴露於可以促使目標基因變異的物質而發生目標基因變異、加入一可以促使目標基因重組的酶(例如Cre-lox系統中的Cre) 以達成組織或時間專一性的基因剔除方法等。
在一具體實施例中，該內生性miR-122為單套或雙套剔除。較佳地，該內生性miR-122為單套剔除。
在本發明一特定具體實施例中，提供一種非人類基因轉殖動物，其基因組中同時具有HBV基因組及內生性miR-122剔除。該非人類基因轉殖動物係由前述表現B型肝炎病毒的非人類基因轉殖動物及miR-122基因剔除動物經雜交而產生。
本發明之非人類基因轉殖動物可以作為肝癌的動物模式。特別是，此些動物可作為鑑定對於治療或預防肝癌有效的化合物或組合物。鑑定化合物或組合物係經由施與一試驗化合物或組合物於本發明之非人類基因轉殖動物，或是將試驗化合物或組合物接觸源自基因轉殖、非人類動物的器官、組織(如肝臟)、或細胞(如肝細胞)。再評估試驗化合物或組合物對於非人類基因轉殖動物其器官、組織或細胞的肝癌治療效果。例如，臨床病理學上癌症大小的鑑定可用以評估非人類基因轉殖動物。可減緩癌症症狀的試驗化合物或組合物可能有效於治療或預防肝癌。
本發明之特徵亦包括適於產生本發明之非人類基因轉殖動物的表現載體。上述表現載體包括一啟動子，其係操作性地連結至一編碼B型肝炎病毒之核酸以便媒介其在肝臟或其他器官或組織之表現。
此外，由於前述之基因組編碼該HBV基因組及內生性miR-122剔除之非人類基因轉殖動物發生自發性肝癌的時間早且發生率高，及其脂肪代謝異常，因此，本發明亦提供一種miR-122用於製備預防或治療肝癌的藥物的用途，其中該藥物可有效提高有需要個體之內生性miR-122。
實施例
實施例 1 模擬人類肝癌具高的 B 型肝炎病毒量和降調的 miR-122 ，不需加化學治癌物，即有高的肝癌發生率
基於對人類與動物肝癌模式的了解，本發明從血液中分離的HBV病毒顆粒抽取HBV DNA(表一：D14及D23，核啟動子突變株常見於HCC，B基因型是台灣主要的B型肝炎病毒基因型)［A19、A33及A45品系小鼠含對Adefovir具抗藥性HBV DNA（SEQ ID NO 1）；B00及B13品系小鼠含lamivudine抗藥性HBV DNA（SEQ ID NO 2）；C13、C20及C30品系小鼠含對Adefovir為野生型HBV DNA（SEQ ID NO 3）；D11、D14及D23品系小鼠含對lamivudine為野生型HBV DNA（SEQ ID NO 4）］，建立1.46倍長度的HBV基因組，包含5′端Enhancer I、Enhancer II到3′端的Polyadenylation site (Poly A)，可以完整轉錄出pregenomic/precore、large/middle/small HBs與HBx等HBV mRNA。1.46倍長度的HBV基因組的5′端再接上小鼠的albumin promoter，3′端接上Chicken HS4 Insulators（SEQ ID NO 5），構成全長10.4 Kb的HBV轉殖基因（圖1），並建立B型肝炎病毒轉殖基因鼠，之後與miR-122剔除鼠雜交，建立近似人類B型肝炎與肝癌的混種小鼠，混種小鼠的miR-122表現量，因只有單套，較正常小鼠來的低，並且可以大量表現HBV病毒，隨著年齡，miR-122進一步降低，相較一般的HBV基因轉殖鼠，其自發性肝癌的發生時間較早且發生率較高，而雄鼠的肝癌發生率更高達60~90%，更適合用做肝癌預防或治療等研究(圖3及表2)。表2清楚顯示混種小鼠結合高B型肝炎病毒量和單套miR-122顯著增加肝癌發生率：B6野生種小鼠不會發生肝癌，單套miR-122小鼠也很少發生肝癌，單純的B型肝炎病毒轉殖基因鼠肝癌發生率也不高，尤其是D23品系和雌鼠，但是混種鼠結合高B型肝炎病毒量和單套miR-122則不須加入任何化學致癌物，就顯著增加肝癌發生率。高肝癌發生率的特點在本發明建立的混種小鼠可重複地在八年的時間觀察了四代小鼠，證明這株小鼠是穩定的肝癌模式，很適合做肝癌的基礎和轉譯研究，繁殖成本也較低，更適合用做肝癌動物模式。表 1 、從病人血液分離 HBV 病毒株用以建立 HBV 基因轉殖小鼠 
附註：4個B型肝炎病毒株(M8817、P3257、M1840、P3358)分別來自兩個病人，其中病毒株M8817與P3257來自肝癌病人(HCC-B)使用抗病藥物Adeforvir (ADV)前與產生抗藥性後的血清樣品。病毒株M1840與P3358來自慢性B型肝炎病人(CHB)使用抗病毒藥物lamivudine (LAM, 3TC)前與產生抗病毒藥物後的血清樣品。肝癌病人常見的B型肝炎病毒basal core promoter (BCP) 基因突變，與長期使用抗病毒藥物ADV與LAM產生抗藥性後B型肝炎病毒常見的反轉錄酶reverse transcriptase (RT)基因突變部位分析於表中。表 2 、肝癌發生率（ 18 月齡後） 
實施例
2 B
型肝炎病毒轉殖基因鼠與混種小鼠肝組織中的粒線體外形和功能的改變
B型肝炎病毒可以引起慢性B型肝炎病人肝臟粒線體外形和功能的改變，而miR-122也可被B型肝炎病毒降調。以B型肝炎病毒表現質體轉染肝癌細胞株，也發現細胞中的粒腺體外型與功能產生如慢性B型肝炎病人肝臟粒線體的變化(圖4)。本發明所建立的B型肝炎病毒轉殖基因鼠與混種小鼠肝組織中的肝臟粒線體外形改變，較多碎裂成小球的粒線體、溶酶體（lysosomes）、自噬溶酶體（autophagolysosomes）、自噬囊泡（autophagic vacuoles） (圖5、圖6及圖7)。混種小鼠肝組織更有脂肪堆積的油滴(圖7及圖8)。
實施例3 B型肝炎病毒轉殖基因鼠與混種小鼠肝組織的基因表現特徵
以系統性探討B型肝炎病毒基因轉殖小鼠腫瘤與B6小鼠正常肝臟組織的基因差異表現。通過微陣列分析B型肝炎病毒基因轉殖小鼠腫瘤與B6小鼠正常肝臟組織的差異表現基因（differentially expressed genes，DEG）。使用Bioconductor R的Limma分析肝癌組織與正常肝臟組織的DEGs，在p值＜0.01的閾值下，過濾到1003個探針組（756個基因）有顯著改變，其中483個上調，對應於364個基因，而520個探針組被下調，相應到395個基因。在表現量下調基因所對應差異最顯著的前十個途徑中，脂肪酸beta oxidation、膽酸合成、retinoic acid合成、雄激素與雌激素合成等相關基因表現顯著下降。Integrin signaling、14-3-3相關的signaling等訊號傳遞相關基因表現上升。對11個HBV基因轉殖小鼠的肝癌組織（LT）和11個B6小鼠的正常肝組織（Liv）抽取RNA並反轉錄成cDNA，利用Real-Time PCR (qPCR)分析基因表現，也證實脂肪酸beta-氧化、三酸甘油酯裂解、自噬作用（autophagy）、磷脂類合成等相關基因表現下降。而脂肪酸合成、脂肪酸攝取、EMT相關基因表現增加(圖9A)。利用Western Bolting觀察相關基因在蛋白質層次的表現，也發現肪酸beta-氧化相關基因Acaa2、Acsl1表現下降，自噬作用相關的Atg7表現下降，脂肪酸攝取相關的Fabp4表現增加(圖9B)。
實施例
4 B
型肝炎病毒轉殖基因鼠與混種小鼠肝組織的脂肪代謝異常
進一步比較不同腫瘤發生率的小鼠品系之早期肝臟脂肪酸組成，6個月大B6小鼠（公鼠3隻、母鼠3隻）、miR-122+/-小鼠（公鼠4隻、母鼠4隻）、HBV基因轉殖小鼠（D14公鼠3隻、母鼠3隻；D23公鼠3隻、母鼠3隻）、Hybrid小鼠（D14122公鼠3隻、母鼠3隻；D23122公鼠4隻、母鼠3隻）的肝臟組織萃取物以GC-MS定量分析脂肪酸含量（microgram脂肪酸/miligram肝臟組織）。結果顯示HBV轉基因小鼠與混種小鼠的早期肝臟中，飽和脂肪酸的組成增加而不飽和脂肪酸減少(圖10)。顯示出因B型肝炎病毒引起的粒線體異常和miR-122降調造成的脂肪代謝異常，和肝癌的發生有密切的關係。
圖11A-C顯示罹患肝癌腫(Hybrid)小鼠之肝癌組織與非癌組織代謝體的NMR分析比較。利用偏最小平方判別分析圖（PLS-DA score plot）顯示肝癌組織與非癌組織的脂溶性代謝物明顯分群(圖11A)。 圖11B顯示肝癌組織在5.6-6.8 ppm之間的區域的化學位移是共軛多烯（conjugated polyenes）的烯屬質子（b-carotene, vitamin A, and retinoic acid）的減少。比較肝癌組織(ML-D14122-LT-182-FC)與非癌組織(D14122-LN-182-FC)，三酸甘油酯與膽固醇在肝癌組織含量較高，多元不飽和脂肪酸在肝癌組織含量較低，可能是肝癌組織的脂質重新合成（de novo synthesis）減少所致(圖11C)。腫瘤抑制分子b-carotene, vitamin A, retinoic acid和miR-122的減少可能和肝癌的生成密切相關。臨床上有文獻顯示慢性B型肝炎帶原合併糖尿病、脂肪肝或代謝症候群增加肝硬化和肝細胞癌的危險，但原因未明，本發明提供之B型肝炎病毒轉殖基因鼠和其混種提供了絕佳模式做機轉和轉譯研究，以發展有效的對策和治療方法。
實施例
5 B
型肝炎病毒轉殖基因鼠與混種鼠
miR-122
降調用於肝癌生物標記的研發
混種小鼠出生僅具單套miR-122，隨著年齡漸長B型肝炎病毒進一步降調miR-122，形成肝癌後，癌組織中的miR-122更進一步降低。粒線體和miR-122都在脂肪的代謝平衡上扮演關鍵的角色，兩者功能的異常都會導致肝臟脂肪的堆積，而形成非常普遍影響世人健康的非酒精性脂肪肝病。本發明建立的混種小鼠在5-6個月大時，肝臟即有脂肪堆積，肝組織有許多自噬現像。微陣列分析顯示脂肪合成增加、代謝與分解減少、肝癌組織的表皮細胞間質化增加、脂肪的β氧化降低、癌組織的維他命A和retinoic acid減少。因此，本發明提供之混種小鼠可做為早期肝癌診斷生物標記的開發工具。
本發明在此提供一例示。首先，測得肝臟miR-122表現量在B型肝炎病毒基因轉殖小鼠肝癌組織（LT, N=11）較B6小鼠正常肝臟組織（Liv, N=11）來的低(圖12A)。以「病例對照研究法」（case-control study），從大於18個月大以上混種小鼠中，區分罹患肝癌（43隻，25公18母）與未罹癌（32隻，11公21母）兩組，比較這些小鼠早期（4~8個月大）血液樣本，檢視9個可能的miR-122標的基因，發現CDC25A在罹癌小組的表現量顯著高於未罹癌小組(圖12B)。比較肝臟組織CDC25基因表現量，發現在肝癌組織（LT，來自11隻HBV基因轉殖小鼠）的表現量較正常肝臟組織（Liv，來自11隻B6小鼠）來的高(圖12C)。進一步由人類肝癌手術標本中偵測CDC25A的基因表現。從公共域Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫中的數據集GSE45267中提取基因表現水平，包含48個肝癌組織和39個非腫瘤肝組織的RNA表現譜，使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0基因表達微陣列檢測，提取與兩個CDC25A RNA檢測探針組（1555772_a_at和204695_at）相關的數據，並使用廣義關聯圖軟件作為熱圖顯示。CDC25A的表現在肝癌組織顯著高於非癌組織(圖12D)。因此miR-122的降低和CDC25A的上升可做為診斷肝癌的標記。
實施例
6 B
型肝炎病毒轉殖基因鼠與混種鼠用於抗
B
型病毒與抗肝癌藥物的研究
臨床上，以健保資料庫分析顯示使用核苷類似物(nucleos(t)ide)的確可以有意義的降低肝癌的發生率，尤其是在小於四十歲非肝硬化的慢性B型肝炎病人預防的療效尤佳。(Wu & Wu et al. Gastroenterology 2014)。目前臨床較常使用的核苷類似物是惠立妥（tenofovir，TDF）與貝樂克（entecavir，ETV），有較強的抗病毒療效，而且很少有抗藥性。惠立妥停藥後，病毒的再活化和肝炎的復發較使用貝樂克者較常也較早發生，有時甚至引發肝衰竭，原因仍然不明。比較HBV抗病毒藥物TDF與ETV長期使用與停藥對病毒量的影響。6個月大的混種小鼠分別餵食不同劑量TDF（135或50 mg/kg）與ETV（5或1 mg/kg）。TDF與ETV皆能在用藥1個月後（M1）使病毒量降到最低，但TDF停藥一個月後（M2）病毒量迅速回升到用藥前（M0）水準，而ETV停藥一個月後（M2）病毒量依舊停留在低點，停藥3個月後（M4）緩步從1.0E+5回升到1.0E+6，停藥6個月後（M7）回升到用藥前（M0）水準(圖13)。長期使用惠立妥tenofovir或貝樂克對降低肝炎的療效比較與是否有副作用，目前正使用混種小鼠實驗治療中，將提供臨床寶貴的資料。
綜上，本發明建立的混種小鼠在肝炎與肝癌研究上有下列優勢：（1）B型肝炎病毒基因轉殖小鼠和miR-122基因剔除小鼠混種具有高濃度B型肝炎病毒DNA和降調的miR-122，和人類的B型肝炎病毒感染很近似，又有極高(＞90%)自發性肝癌發生率，小鼠肝癌的病理特徵和人類肝癌近似，可做為人類B型肝炎病毒相關肝癌的理想動物模式。極高(＞90%)自發性肝癌發生率，做為實驗性預防或治療肝癌時，只需要較少數目的小鼠，就可得到足夠的肝癌小鼠分配到治療與對照組，觀察到可能的防治效果，較符合成本效益。（2）混種B型肝炎病毒轉殖基因鼠五個月大時，肝組織中的粒腺體的外型就有改變，miR-122有降調的現象，因此很適合做為研究粒線體功能異常和miR-122有降調對脂肪代謝的影響，並發展新穎的治療策略。（3）混種小鼠肝癌組織的脂肪代謝異常、β氧化降低、癌組織的維他命A和retinoic acid減少，因而提供以校正脂肪代謝異常，和補充維他命A和retinoic acid，做為新穎的肝癌預防方法。（4）肝炎生物標記的研發平台。（5）理想的篩檢新穎抗B型病毒與抗肝癌藥物的研究平台。
本領域中的通常知識者將理解，可以對上述具體實施例進行改變而不脫離其廣泛的發明構思。因此，應當理解，本發明不限於所揭露的特定具體實施例，而是旨在涵蓋由所附的申請專利範圍所界定的本發明的精神及範圍內的修改。
無
當結合附圖閱讀時，將更好地理解前述發明內容以及本發明的以下實施方式。在圖式中：
圖1顯示應用基因重組技術建立肝臟專一表現的HBV轉殖基因。
圖2顯示3-4個月大，能夠表現lamividine (LAM)抗藥性的B型肝炎病毒之HBV基因轉殖小鼠品系（品系B00 小鼠6隻；品系B13 小鼠5隻）與表現野生型B型肝炎病毒的HBV基因轉殖小鼠品系（D11小鼠3隻；D14小鼠5隻），以餵食管給予口服LAM（餵食濃度為100 mg/Kg 體重），測量餵藥前與餵藥14天後血清中的病毒量。圖檔中的矩形上下限為四分位數，矩形內水平線標示中位數，以Mann–Whitney U test統計分析 p = 0.0093，呈現顯著差異。相較於餵藥後的病毒量下降程度，抗藥性組的病毒下降幅度少於野生型組，在此動物模式展現類似慢性B型 肝炎病人長期服用LAM等抗病毒藥物後產生的抗藥性。
圖3顯示各品系HBV基因轉殖小鼠中，3個月大的小鼠的血清中測得HBV病毒量，其中adefovir野生型/抗藥性品系（C13, C20, C30 / A19, A33, A45）病毒量介於10E+2~10E+5，與lamivudine野生型/抗藥性品系（D11, D14, D23 / B00, B13）病毒量介於10E+5~10E+8。
圖4顯示以B型肝炎病毒表現質體轉染肝癌細胞株，也發現細胞中的粒腺體外型與功能產生變化。Vector，人類細胞株Huh-7轉染空白載體；WT，人類細胞株Huh-7轉染野生型B型肝炎病毒；MT Proline，人類細胞株Huh-7轉染preS2剔除突變B型肝炎病毒。
圖5顯示B型肝炎病毒轉殖基因鼠粒線體在五個月即有變化，較多碎裂成小球的粒線體、溶酶體（lysosomes）、自噬溶酶體（autophagolysosomes）、自噬囊泡（autophagic vacuoles）。黃色箭號標示自噬溶酶體（autophagolysosomes），黃色箭頭標示溶酶體（lysosomes），紅色箭號標示粒線體。
圖6顯示B型肝炎病毒轉殖基因鼠與miR-122剔除鼠雜交的混種小鼠粒線體在五個月即有變化，較多碎裂成小球的粒線體、溶酶體（lysosomes）、自噬溶酶體（autophagolysosomes）、自噬囊泡（autophagic vacuoles）。混種小鼠在5-6個月大時，肝組織即有許多自噬現象。黃色箭號標示自噬溶酶體（autophagolysosomes），黃色箭頭標示溶酶體（lysosomes），紅色箭號標示粒線，藍色箭頭標示次級溶酶體（secondary lysosomes）。
圖7顯示以穿透式電子顯微鏡觀察B型肝炎病毒轉殖基因鼠與miR-122剔除鼠雜交的混種小鼠的肝臟組織，發現肝臟細胞內粒線體在小鼠五個月大時即有變化，較多碎裂成小球的粒線體、溶酶體lysosomes、自噬溶酶體autophagolysosomes、自噬囊泡autophagic vacuoles、脂肪油滴。混種小鼠在5-6個月大時，肝臟即有脂肪堆積，肝組織有許多自噬現象。黃色箭號標示自噬溶酶體（autophagolysosomes），黃色箭頭標示溶酶體（lysosomes），紅色箭號標示粒線體，藍色箭號標示次級溶酶體（secondary lysosomes）。
圖8顯示混種小鼠的肝臟有較多中性脂肪堆積。Oil Red可以將油滴中的中性脂肪酸染成紅色，小鼠肝臟組織以OCT包埋，冷凍切片後以Oil Red染色，以光學顯微鏡觀察照相，相片圖檔利用影像分析軟體Image J 分析，單位面積組織中Oil Red的染色比例予以量化。分別比較6個月大的HBV基因轉殖小鼠D14、D23與混種小鼠D14122、D23122的公鼠與母鼠之肝臟組織的中性脂肪分布，發現兩個品系混種小鼠（D14122, D23122）的脂肪分布顯著高於HBV基因轉殖小鼠（D14, D23），呈現類似慢性B型肝炎感染病人產生脂肪肝現象。
圖9A 顯示對11個HBV轉基因小鼠的肝癌組織（LT）和11個B6小鼠的正常肝組織（Liv）抽取RNA並反轉錄成cDNA，利用Real-Time PCR (qPCR)分析基因表現，也證實脂肪酸beta-氧化、三酸甘油酯裂解、自噬作用（autophagy）、磷脂類合成等相關基因表現下降。而脂肪酸合成、脂肪酸攝取、EMT相關基因表現增加。
圖9B顯是利用Western Bolting觀察相關基因在蛋白質層次的表現，也發現肪酸beta-氧化相關基因Acaa2、Acsl1表現下降，自噬作用相關的Atg7表現下降，脂肪酸攝取相關的Fabp4表現增加。
圖10顯示HBV轉基因小鼠與混種小鼠的早期肝臟中，飽和脂肪酸的組成增加而不飽和脂肪酸減少。為了比較不同腫瘤發生率的小鼠品系之早期肝臟脂肪酸組成， 6個月大B6小鼠（公鼠3隻、母鼠3隻）、miR-122+/-小鼠（公鼠4隻、母鼠4隻）、HBV基因轉殖小鼠（D14公鼠3隻、母鼠3隻；D23公鼠3隻、母鼠3隻）、Hybrid小鼠（D14122公鼠3隻、母鼠3隻；D23122公鼠4隻、母鼠3隻）的肝臟組織萃取物以GC-MS定量分析脂肪酸含量（microgram脂肪酸/miligram肝臟組織）。變異數分析（ONE way ANOVA test）的Tukey多重比較測定之顯著差異* P＜0.05 、** P＜0.01、***P＜0.001。
圖11A-11C顯示罹患肝癌混種小鼠之肝癌組織與非癌組織代謝體的NMR 分析比較。圖11A為偏最小平方判別分析圖（PLS-DA score plot）顯示肝癌組織與非癌組織的脂溶性代謝物明顯分群。圖11B在5.6-6.8 ppm之間的區域的化學位移是共軛多烯（conjugated polyenes）的烯屬質子（b-carotene, vitamin A, and retinoic acid）。圖11C為比較肝癌組織(ML-D14122-LT-182-FC)與非癌組織(D14122-LN-182-FC)，三酸甘油酯與膽固醇在肝癌組織含量較高，多元不飽和脂肪酸在肝癌組織含量較低，可能是肝癌組織的脂質重新合成（de novo synthesis）減少所致。
圖12A-D顯示混種小鼠做為早期肝癌診斷biomarker開發工具。圖12A顯示肝臟miR-122表現量在HBV基因轉殖小鼠肝癌組織（LT, N=11）較B6小鼠正常肝臟組織（Liv, N=11）來的低。圖12B揭示以「病例對照研究法」（case-control study），從大於18個月大以上hybrid小鼠中，區分罹患肝癌（43隻，25公18母）與未罹癌（32隻，11公21母）兩組，比較這些小鼠早期（4~8個月大）血液樣本，檢視9個可能的miR-122標的基因，發現CDC25A在罹癌小組的表現量顯著高於未罹癌小組。圖12C比較肝臟組織CDC25A基因表現量，發現在肝癌組織（LT，來自11隻HBV基因轉殖小鼠）的表現量較正常肝臟組織（Liv，來自11隻B6小鼠）來的高。圖12D顯示人類HCC手術標本中CDC25A的基因表現。從公共域Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫中的數據集GSE45267中提取基因表現水平，包含48個HCC組織和39個非腫瘤肝組織的RNA表現譜，使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0基因表達微陣列檢測，提取與兩個CDC25A RNA檢測探針組（1555772_a_at和204695_at）相關的數據，並使用廣義關聯圖軟件作為熱圖顯示。CDC25A的表現在肝癌組織顯著高於非癌組織（t test* P＜0.05 、** P＜0.01、***P＜0.001）。
圖13 比較HBV抗病毒藥物惠立妥（tenofovir，TDF）與貝樂克（entecavir，ETV）長期使用與停藥對病毒量的影響。6個月大的hybrid小鼠分別餵食不同劑量TDF（135或50 mg/kg-day）與TEV（5或1 mg/kg-day）。TDF與ETV皆能在用藥1個月後（M1）使病毒量降到最低，但TDF停藥一個月後（M2）病毒量迅速回升到用藥前（M0）水準，而ETV停藥一個月後（M2）病毒量依舊停留在低點，停藥3個月後（M4）緩步從1.0E+5回升到1.0E+6，停藥6個月後（M7）回升到用藥前（M0）水準。
無
Claims (7)
- 一種篩選具預防或治療肝癌、肝炎、或脂肪肝功效之候選試劑的方法，其包含：a)提供一種可自發性產生肝癌模式之基因轉殖囓齒動物；b)給予該可自發性產生肝癌模式之基因轉殖囓齒動物服用一種候選試劑；及c)比較給予服用候選試劑與未給予服用的囓齒動物組之表現，其中該候選試劑若能減緩症狀，則篩選出為具有預防或治療肝癌、肝炎、或脂肪肝功效之試劑；其中該可自發性產生肝癌模式之基因轉殖囓齒動物之基因組包含一編碼B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)之基因組，其包含5'端強化子I/II(enhancer I/II)、開放區(open reading frame)X、C、PS及S至3'端多腺苷酸化位置(polyadenylation site)之聚核苷酸序列，及一被單套剔除之內生性miR-122。
- 如請求項1之方法，其中該可自發性產生肝癌模式之基因轉殖囓齒動物係由下列方法步驟製得：(1)提供一編碼選自由B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因組，其包含5’端強化子I/II(enhancer I/II)、開放區(open reading frame)X、C、PS及S至3’端多腺苷酸化位置(polyadenylation site)之聚核苷酸序列表現載體；(2)將該聚核苷酸序列表現載體引入嚙齒動物之基因組基因座中，以產生含有編碼該HBV基因組之囓齒動物；(3)提供內生性miR-122剔除之與前述相同之囓齒動物；及(4)將該含有編碼該HBV基因組之基因轉殖嚙齒動物及該內生性miR-122剔除之嚙齒動物進行雜交以產生其基因組編碼該HBV基因組及內生性miR-122單套剔除之囓齒動物。
- 一種使用一可自發性產生肝癌模式之基因轉殖囓齒動物於篩選預防或治療肝癌、肝炎或脂肪肝之候選試劑的用途，其中該可自發性產生肝癌 模式之基因轉殖囓齒動物包含一編碼B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)之基因組，其包含5′端強化子I/II(enhancer I/II)、開放區(open reading frame)X、C、PS及S至3′端多腺苷酸化位置(polyadenylation site)之聚核苷酸序列，及一被單套剔除之內生性miR-122。
- 如請求項3之用途，其中該可自發性產生肝癌模式之基因轉殖囓齒動物係由下列方法步驟製得：(1)提供一編碼選自由B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因組，其包含5’端強化子I/II(enhancer I/II)、開放區(open reading frame)X、C、PS及S至3’端多腺苷酸化位置(polyadenylation site)之聚核苷酸序列表現載體；(2)將該聚核苷酸序列表現載體引入嚙齒動物之基因組基因座中，以產生含有編碼該HBV基因組之囓齒動物；(3)提供內生性miR-122剔除之與前述相同之囓齒動物；及(4)將該含有編碼該HBV基因組之基因轉殖嚙齒動物及該內生性miR-122剔除之嚙齒動物進行雜交以產生其基因組編碼該HBV基因組及內生性miR-122單套剔除之囓齒動物。
- 一種用於篩選具預防或治療肝癌、肝炎、或脂肪肝功效之候選試劑之可自發性產生肝癌模式之非人類基因轉殖動物的製備方法，其包含：(1)提供一編碼選自由B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因組包含5'端強化子I/II(enhancer I/II)、開放區(open reading frame)X、C、PS及S至3'端多腺苷酸化位置(polyadenylation site)之聚核苷酸序列表現載體；(2)將該聚核苷酸序列表現載體引入動物之基因組基因座中，以產生含有編碼該HBV基因組之非人類基因轉殖動物；(3)提供內生性miR-122剔除之與前述相同之動物物種；及(4)將該含有編碼該HBV基因組之非人類基因轉殖動物及該內生性miR-122剔除之 動物進行雜交以產生其基因組編碼該HBV基因組及內生性miR-122單套剔除之非人類基因轉殖動物。
- 如請求項5之製備方法，其中該可自發性產生肝癌模式之非人類基因轉殖動物之基因組包含一編碼B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)之基因組，其包含5'端強化子I/II(enhancer I/II)、開放區(open reading frame)X、C、PS及S至3'端多腺苷酸化位置(polyadenylation site)之聚核苷酸序列，及一被單套剔除之內生性miR-122。
- 如請求項5之製備方法，其中該非人類基因轉殖動物為基因轉殖囓齒動物。
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|---|---|---|---|
| US201962949658P | 2019-12-18 | 2019-12-18 | |
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|---|---|---|---|---|
| CN103088061A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-05-08 | 中国科学院微生物研究所 | 一种rna及载体在制备预防和/或治疗肝癌产品中的应用 |
-
2020
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103088061A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-05-08 | 中国科学院微生物研究所 | 一种rna及载体在制备预防和/或治疗肝癌产品中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 期刊 L G Guidotti et al. High-level hepatitis B virus replication in transgenic mice. J Virol. 69(10). 1995 Oct. 6158-69.;期刊 Shu-Hao Hsu et al. Essential metabolic, anti-inflammatory, and anti-tumorigenic functions of miR-122 in liver. J Clin Invest. 122(8). 2012 Aug. 2871-83. * |
| 期刊 Shu-Hao Hsu et al. Essential metabolic, anti-inflammatory, and anti-tumorigenic functions of miR-122 in liver. J Clin Invest. 122(8). 2012 Aug. 2871-83. |
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