WO2020174539A1 - 細胞増殖モニター用非ヒト哺乳動物 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a non-human mammal for cell growth monitoring, which is preferably used in the fields of medicine and drug discovery.
- Monitoring cell growth is useful for assessing the state of cells and tissues and for assessing the effects of drugs and the like.
- Evaluation of cell proliferation using cells in vitro is generally performed using reagents such as 3 H-thymidine, BrdU, MTT and the like.
- Non-Patent Documents 2 and 3 disclose that a secretory luciferase, Gaussia luciferase, can be used to evaluate in vivo biological processes by measuring the fluorescence of luciferase secreted in blood.
- a secretory luciferase Gaussia luciferase
- some previous reports disclose that the growth of tumor cells and cell lines prepared from tumor cells was monitored using a reporter as an index, but in this case, due to mutations in oncogenes and tumor suppressor genes, etc. It is a report made by the expression and detection of a reporter expression that depends on the growth number of cells or cell lines in which the cell growth activity exceeds that of normal cells. Can the growth of cells with normal growth ability or growth activity be evaluated? I was not sure.
- the object of the present invention is to develop a system capable of easily measuring in vivo physiological cell proliferation in real time.
- the present inventors have conducted extensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, (i) a promoter sequence of a cell proliferation-related gene, (ii) a sequence encoding a secretory reporter protein, and (iii) the promoter sequence A gene containing a sequence (reporter protein transcription inhibitory sequence) which is sandwiched between two lox sequences and is located between the secretory reporter protein coding sequence and which inhibits transcription of the sequence coding for the secretory reporter protein.
- a non-human mammal that retains the construct on the chromosome By crossing a non-human mammal that retains the construct on the chromosome with a non-human mammal that expresses Cre recombinase in a tissue-specific manner, a non-human mammal that expresses the secreted reporter protein in a specific tissue in a cell growth-dependent manner. It was found that a human mammal can be obtained, and that by using this, physiological cell growth in vivo in a target tissue can be easily measured in real time, and the present invention has been completed.
- the gist of the present invention is as follows. [1] (i) a promoter sequence of a cell proliferation-related gene, (Ii) a sequence encoding a secretory reporter protein, (Iii) disposed between the promoter sequence and the secretory reporter protein coding sequence, A sequence sandwiched between two lox sequences, which inhibits transcription of the sequence encoding the secretory reporter protein (reporter protein transcription inhibitory sequence), and A genetic construct comprising: A gene construct capable of expressing the secreted reporter protein in a cell growth-dependent manner by excising the reporter protein transcription inhibitory sequence together with two lox sequences by Cre recombinase. [2] The gene construct according to [1], wherein the cell growth-related gene is Ki67.
- the non-human mammal expressing Cre recombinase is a non-human mammal that expresses Cre recombinase in a tissue-specific manner, and produces the secretory reporter protein in a tissue-specific manner in response to cell proliferation, [7] Alternatively, the non-human mammal described in [8]. [10] The non-human mammal according to [9], wherein the tissue is liver or pancreas. [11] The non-human mammal according to any of [5] to [10], which is a mouse. [12] A cell obtained from the non-human mammal according to any of [5] to [11]. [13] A method for evaluating cell proliferation, which comprises a step of quantifying the secretory reporter protein using the non-human mammal according to any one of [5] to [11] or the cell according to [12].
- physiological cell proliferation in vivo can be measured in real time with high sensitivity by collecting a small amount of blood. Moreover, since a fluorescence imaging device or the like is not required, simple measurement is possible.
- tissue-specific cell growth can be monitored by expressing Cre recombinase in a tissue-specific manner, and cell growth in small tissues such as pancreatic islets can also be measured with high sensitivity.
- the non-human mammal of the present invention can be suitably used for disease state analysis, drug evaluation and the like.
- FIG. 1 Diagram showing the gene construct of the real-time cell proliferation reporter.
- a CAT/polyA element (LSL cassette) flanked by loxP sites was placed downstream of the human Ki67 promoter (Ki67p) in the GLuc Basic-1 vector to construct a Ki67p-LSL-Gluc construct.
- the CAT/polyA element was excised and Gluc was expressed under Ki67p control.
- Graph showing luciferase activity in medium of Cre-adenovirus infected Hepa1-6 cells or MIN6-K8 cells. Luciferase activity in the medium of LacZ-adenovirus infected cells was used as a control. Data are expressed as mean ⁇ standard error.
- N 4-6 in each group.
- Graph showing luciferase activity in the medium of LacZ-adenovirus-infected or Cre-adenovirus-infected Hepa1-6 cells after treatment with mitomycin C (MitC), rapamycin, or roscovitine. Luciferase activity in the medium of solvent-treated LacZ-adenovirus infected cells was used as a control. Data are expressed as mean ⁇ standard error. ##P ⁇ 0.01 as assessed by one-way analysis of variance (ANOVA). N 4-5 in each group. 3 is a graph showing the expression of CAT gene or Gluc gene in MIN6-K8 cells infected with Cre-adenovirus.
- FIG. 3 is a graph showing the time course of plasma luciferase activity of i ⁇ Ki67p-Gluc mice (Ki67p-LSL-Gluc; Cre(+)) during pregnancy (relative value to day 0).
- Pregnancy (+) represents pregnant mice as determined from subsequent birth.
- Luciferase activity in the medium of isolated islets cultured at low glucose concentration (LG) or gene expression in these islets was used as a control.
- GLP-1 glucagon-like peptide-1
- the gene construct of the present invention is (I) a promoter sequence of a cell growth-related gene, (Ii) a sequence encoding a secretory reporter protein, (Iii) disposed between the promoter sequence and the secretory reporter protein coding sequence, A sequence sandwiched between two lox sequences, which inhibits transcription of the sequence encoding the secretory reporter protein (reporter protein transcription inhibitory sequence), and including.
- the secretory reporter protein gene can be expressed in a cell growth-dependent manner from the promoter sequence of the cell growth-related gene.
- the cell growth-related gene is a gene that is specifically expressed when cell growth is performed, that is, a gene that is not expressed in the G0 phase of the cell cycle and is expressed particularly in the M phase.
- Examples include Ki67 gene, PCNA gene, CyclinD1 gene, cdk2 gene, farnesyl transferase gene, and EGF receptor gene. Of these, Ki67 is preferably used.
- the promoter of the Ki67 gene includes a sequence containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto as long as it has a cell growth-dependent transcription promoting activity, and is a complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1. It may be a DNA that hybridizes under stringent conditions.
- the stringent conditions include, for example, the conditions of washing with 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS and 65° C. after the hybridization.
- Secretary reporter protein means a reporter protein that is expressed in cells and secreted in the body fluids of non-human mammals.
- the body fluid includes blood, lymph, sweat, urine, saliva and the like, but blood is preferable.
- the reporter protein is not particularly limited as long as it can be detected by an immunological method, colorimetric reaction, fluorescence emission, chemiluminescence, etc., and examples thereof include luciferase, green fluorescent protein (GFP), alkaline phosphatase, peroxidase and the like.
- GFP green fluorescent protein
- a secretory signal may be added to the reporter protein.
- secretory reporter proteins include secretory luciferases such as Gaussia luciferase, Cypridina luciferase, Metridia luciferase, Vargula luciferase, Oplophorus luciferase, Pleuromamma luciferase, and secretory placental alkaline phosphatase (SEAP).
- secretory luciferases such as Gaussia luciferase, Cypridina luciferase, Metridia luciferase, Vargula luciferase, Oplophorus luciferase, Pleuromamma luciferase, and secretory placental alkaline phosphatase (SEAP).
- the nucleotide sequence encoding Gaussia luciferase is shown in SEQ ID NO: 2, for example, and the amino acid sequence of Gaussia luciferase is shown in SEQ ID NO: 3, for
- the lox sequence may be any sequence recognized by Cre recombinase, but examples include loxP, lox71, lox66, lox511, lox2272, Vlox (VCre), Slox (SCre).
- the reporter protein transcription inhibitory sequence is also called a stuffer sequence, but it is a sequence provided to inhibit the transcription of the gene coding for the secretory reporter protein linked to the 3'side thereof, and the sequence is site-specific. By excision with the lox sequence by a selective recombinase, the secretory reporter protein gene is located immediately below the cell growth-related gene promoter, and transcription of the secretory reporter protein gene occurs under the control of the promoter.
- the reporter protein transcription inhibitory sequence is not particularly limited as long as it has a length sufficient to inhibit transcription, but it is a marker gene for distinguishing the presence of the sequence (different from the secretory reporter protein).
- a gene encoding a reporter protein or a drug resistance gene such as LacZ, CAT, GFP, Neo, Hyg
- the reporter protein transcription inhibiting sequence may have a poly A sequence added to its 3'end.
- Non-human mammal carrying the gene construct of the present invention on the chromosome has the above-mentioned gene construct on the chromosome.
- the non-human mammal of the present invention may be, for example, any non-human mammal such as mouse, rat, rabbit, goat, pig, dog, cat, guinea pig, hamster, sheep, cow, marmoset, etc., but preferably mouse Is.
- the non-human mammal (transgenic non-human mammal) of the present invention can be obtained by integrating the gene construct on the chromosome of the non-human mammal.
- the gene construct further contains a sequence homologous to the target site on the chromosome.
- the Rosa26 gene locus is preferable as the target site on the chromosome.
- the mouse ROSA26 locus was discovered by Friedrich and Soriano in 1991 by a gene trap experiment using retrovirus-infected embryonic stem (ES) cells (Genes & Development, 1991, 5, 5, 1513-1523). Targeting the ROSA26 locus in mouse ES cells has been widely used to construct transgenic mouse models (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 5037-5042, etc.).
- the transgenic non-human mammal of the present invention can be obtained, for example, by a method including the following steps (a) to (g).
- E breeding the non-human mammal and selecting a germline chimera from the offspring,
- non-human mammal that retains the gene construct of the present invention obtained on the chromosome as described above, by expressing Cre recombinase, a non-human expressing the secretory reporter protein in a cell growth-dependent manner.
- a mammal can be obtained.
- a non-human mammal retaining the gene construct of the present invention on the chromosome a non-human mammal expressing the secretory reporter protein in a cell growth-dependent manner by crossing with a non-human mammal expressing Cre recombinase. Can be obtained.
- the Cre recombinase gene is not particularly limited as long as it is a gene encoding a protein capable of recognizing the lox sequence and removing the sequence sandwiched by it.
- the Cre recombinase gene can be mentioned.
- Cre Crecombinase is preferably a drug-induced nuclear translocation type because it controls the timing of its expression.
- Cre recombinase is expressed as a fusion protein with a protein that promotes nuclear translocation in a drug-dependent manner in order to translocate to the nucleus in a drug-dependent manner and excise the reporter protein transcriptional inhibitory sequence flanked by lox sequences. It is preferable. Examples of such a protein include a nuclear hormone receptor, and an estrogen receptor can be preferably used. Mice expressing a fusion protein of Cre recombinase and estrogen receptor are described in Genesis 39, 167-172. (2004) and the like. When expressed as such a fusion protein, Cre functions and cell proliferation-dependent secretion of a reporter protein can be observed only when a ligand such as tamoxifen is administered.
- Cre recombinase In order to evaluate target tissue-specific cell proliferation, it is preferable to express Cre recombinase only in the target tissue and express the secretory reporter protein specifically in the target tissue. In order to express Cre recombinase only in the target tissue, it is preferable that the gene encoding Cre recombinase is linked to the 3'side of the tissue-specific promoter and expressed under the control of the promoter.
- the tissue-specific promoter can be appropriately selected according to the target tissue.
- liver-specific promoters include liver albumin promoter, ApoAI promoter, ⁇ -fetoprotein promoter, ⁇ 1-antitrypsin promoter, transferrin transthyretin promoter, serum amyloid A promoter, transthyretin promoter, HNF-6 promoter and the like.
- pancreatic ⁇ cell-specific promoter include insulin promoter, glucagon promoter, PDX-1 promoter and the like.
- Examples of skeletal muscle-specific promoters include myosin H chain promoter, muscle creatine kinase promoter, dystrophin promoter, calpain promoter, alpha-actin promoter, fast muscle troponin 1 promoter, and the like.
- Examples of the skin-specific promoter include a keratin promoter.
- Examples of lung-specific promoters include cytokeratin 18 promoter, CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) promoter, lung surfactant protein A and B promoter, and the like.
- Examples of adipose tissue-specific promoters include lipoprotein lipase promoter, adipsin promoter, adiponectin promoter, aP2 promoter and the like.
- nerve-specific promoters include choline acetyltransferase promoter, c-Fos promoter, Arc promoter, synapsin I promoter, neuron-specific enolase promoter, neurofilament-L promoter, neuropeptide Y promoter, tyrosine hydroxylase gene promoter, dopamine- b-hydroxylase gene promoter, L7 Purkinje cell protein promoter, D1A dopamine receptor gene promoter, glutamate decarboxylase 65 gene promoter, neuronal nicotinic acetylcholine receptor beta 3 gene promoter, GABA(A) receptor delta subunit gene promoter, etc. Is mentioned.
- Examples of blood cell-specific promoters include f4/80 promoter, lysozyme 2 promoter, chemokine (C-X3-C motif) receptor 1 promoter, colony stimulating factor 1 receptor promoter and the like.
- the intestine-specific promoter includes the villin promoter.
- the non-human mammal having the Cre recombinase gene linked to the downstream of the appropriate promoter on the chromosome can be obtained by the same procedure as described above.
- Non-human mammal that produces a secretory reporter protein in a cell growth-dependent manner A non-human mammal retaining the gene construct of the present invention and a Cre recombinase expressing non-human mammal are bred, and from the progeny that are born, a gene encoding a secretory reporter protein and a gene encoding Cre recombinase are homozygous or An animal having a heterogeneous gene, in which the reporter protein transcription inhibitory sequence is removed in the target tissue and a gene encoding a secretory reporter protein is expressed under the control of a cell growth-related gene promoter, is subjected to gene analysis such as Southern blot or PCR or Screen by phenotypic analysis. By such a procedure, a non-human mammal producing a secretory reporter protein in a cell growth-dependent manner can be obtained.
- the non-human mammal or cells obtained therefrom can be used for evaluation and analysis of cell proliferation. That is, since the non-human mammal or cells thereof secrete a reporter protein in response to cell proliferation, cell proliferation can be evaluated, analyzed or monitored by quantifying the secreted reporter protein. For example, cell proliferation can be monitored by periodically collecting a body fluid such as blood and measuring the amount of the reporter protein contained therein. For the measurement, an appropriate method can be selected depending on the type of reporter protein. In the case of luciferase, the activity can be measured using a luciferase substrate. Further, by expressing Cre recombinase in a tissue-specific manner, tissue-specific cell proliferation can be evaluated, analyzed or monitored. Furthermore, by making the Cre recombinase drug-inducible, the reporter protein can be secreted only at the time of analysis.
- the non-human animal of the present invention that produces a secretory reporter protein in a cell growth-dependent manner can be used to monitor changes in cell growth due to external stimuli and changes in cell growth due to internal factors such as pathological conditions. It can also be used to assess the effect of drugs on cell proliferation. That is, a test substance can be administered to the transgenic non-human animal of the present invention to evaluate the effect of the test substance on cell proliferation.
- a body fluid (for example, blood) sample is collected from a transgenic non-human animal before and after administration of the test substance, and the effect of the test substance can be evaluated using the increase or decrease of the reporter protein contained in the body fluid as an index.
- the amount of the reporter protein contained in the body fluid when the amount of the reporter protein contained in the body fluid is reduced by administration of the test substance, it can be determined that the test substance has an effect of suppressing cell proliferation, and conversely, it is contained in the body fluid.
- the amount of the reported reporter protein increases, it can be judged that the test substance has an effect of promoting cell growth.
- the cancer progression can be monitored by inducing cancer in the target tissue and measuring the cell proliferation thereof, and the anticancer effect of the drug can be evaluated by adding the drug.
- This Ki67p-LSL-Gluc construct was transfected into mouse hepatocyte cell line Hepa1-6 or mouse ⁇ cell line MIN6-K8 [J Diabetes Investig 1, 137-142. (2010)]. After confirming that the construct functions in these cells, Ki67p-LSL-Gluc was electroporated into the Rosa26 gene locus of C57BL/6N mouse-derived ES cells by electroporation.
- Homologous recombinant ES cell clones were identified using the neo probe in PCR and Southern blot analysis. Chimeric mice were generated from these established homologous recombinant ES cells. A heterozygous mouse was obtained by mating this chimeric mouse with a wild-type mouse.
- Recombinant Adenovirus (Cre-adenovirus) encoding a Cre recombinase gene under the control of the CAG promoter was previously reported [Gastroenterology 152, 1521-1535 e1528.(2017), Am J Physiol Endocrinol Metab 290, E308-316. (2006)].
- Recombinant adenovirus encoding the LacZ gene (LacZ-adenovirus) was used as a control.
- Hepa1-6 cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle medium (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass.) supplemented with 10% fetal bovine serum and penicillin (100 U/mL) and streptomycin (100 mg/mL).
- MIN6-K8 cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle medium containing 25 mM glucose supplemented with 10% fetal bovine serum and penicillin (100 U/mL) and streptomycin (100 mg/mL).
- adenovirus infection cells were incubated for 48 hours in medium containing 2.2 ⁇ 10 5 PFU of Cre-adenovirus or LacZ-adenovirus.
- Hepa1-6 cells were incubated for 5 hours in medium containing mitomycin (30 ⁇ g/mL), roscovitine (500 ⁇ g/mL), or rapamycin (50 ⁇ M), then medium without these agents. Incubated for 20 hours. Water was used as the solvent.
- Gaussia Luciferase Assay A small incision was made in the tail of mice and blood samples were taken. 50 ⁇ L of blood was added to 1 ⁇ L of 0.5 M EDTA and centrifuged for 10 minutes or more to separate plasma. 1 ⁇ L of 0.5 M EDTA was added to 50 ⁇ L of blood and then centrifuged for 10 minutes or more to separate plasma. 100 ⁇ L of 10 ⁇ g/mL coelenterazine (Nanolight Technologies) diluted in phosphate buffered saline (PBS) was then added to 20 ⁇ L of sample (medium or plasma) in 96-well plates. Gluc activity was measured using a plate luminometer (Fluoroscan Ascent FL, Thermo Fisher Scientific) set to inject coelenterazine and perform photon counting for 10 seconds [Nat Methods 5, 171-173. (2008)].
- the primer sequences were as follows: mouse Ki67 (5′-AGTCTCTGGAGAGTCTGATTGTA-3′ (SEQ ID NO:4) [forward primer], 5′-ACTTCTTGGTGCATACAATGTC-3′ (SEQ ID NO:5) [reverse primer]), mouse Actb.
- mice Male albumin-CreER; Ki67p-LSL-Gluc mice were treated with corn oil (Sigma) at 80 ⁇ g/g body weight tamoxifen (Sigma, St. Louis, Mo., USA) every 24 hours for 5 hours. Intraperitoneal injections were given for consecutive days. Ten days after the last injection, 70% PHx was given to these mice according to the published protocol [Nature protocols 3, 1167-1170. (2008)]. This protocol is for ligating and removing the left and middle lobes of the liver. In sham surgery, only midline laparotomy was performed.
- Ki67p-Gluc mice Tamoxifen-induced ⁇ cell-specific Ki67p-Gluc mice (i ⁇ Ki67p-Gluc mice), RIP-CreER mice and Ki67p-LSL-Gluc mice were crossed. At 8 weeks of age, RIP-CreER; Ki67p-LSL-Gluc mice were given an intraperitoneal injection of tamoxifen (Sigma) as described above.
- mice were crossed with male C57BL/6N mice.
- Male C57BL/6N mice were purchased from Japan SLC (Shizuoka, Japan). Mating was confirmed by the presence of a vaginal plug the next morning after placing the mice in the same cage overnight.
- mice were kept in a 12-hour light-dark cycle in an air-conditioned environment. Mice were fed standard laboratory chow (65% carbohydrate, 4% milk fat, 24% protein; provided by Oriental Yeast Co., Ltd. (Tokyo, Japan)). Littermate mice without the CreER allele were used as a control.
- Islet Islet Analysis Ten days after the last injection, islets were isolated as described [Diabetes 60(2):537-47. (2011)]. Pancreatic islets were isolated by retrograde injection of 1.0 mL Hank's solution containing 1.0 mg/mL collagenase V (Sigma) into the pancreatic duct. The pancreas was digested in a 37°C constant temperature chamber. Purification of islets from mice was accomplished by hand selection under light microscopy. The isolated islets were treated with RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum, 25 mM glucose, 100 U/mL penicillin, 100 ⁇ g/mL streptomycin, and 50 ⁇ g/mL gentamicin at 37° C.
- the islets were treated with 1.0 mg/mL collagenase for 10 minutes at 37° C. to ensure that the peptide reached the inside of the islets [J Mol Endocrinol 38, 127-136. (2007)]. Then, it wash
- islets were treated with 5.5 mM glucose, and 1 mM dipeptidyl peptidase-4 inhibitor diprotin A (Peptide Institute, Osaka, Japan), and 100 nM GLP-1 (Aviva Systems Biology, Incubated in RPMI 1640 medium with Bachem, USA). Water was used as the solvent.
- Ki67p was inserted into pGLuc Basic-1 vector (NanoLight Technologies, Arizona, USA) to monitor real-time cell proliferation by utilizing Gluc activity in blood. Then, the loxP-chloramphenicol acetyltransferase (CAT)-polyA-loxP (LSL) cassette was inserted downstream of Ki67p. This CAT-polyA cassette functions as a termination sequence. This is expected to promote Gluc expression only in proliferating Cre-activated cells (Ki67p-LSL-Gluc construct) (FIG. 1).
- the Ki67p-LSL-Gluc construct was added to mouse hepatocyte cell line Hepa1-6 and mouse ⁇ cell line. It was transfected into MIN6 and then infected with adenovirus containing Cre (Cre-adenovirus). Gluc activity in the medium of Hepa1-6 and MIN6 cells was significantly increased (FIG. 2), indicating that Gluc produced in these cells was secreted into the medium. Furthermore, the elevated Gluc activity in the medium was significantly reduced by treating Hepa1-6 cells with antitumor agents such as mitomycin C and rapamycin, or with the CDK inhibitor roscovitine (FIG.
- PHx is a commonly used technique for inducing hepatocyte proliferation [Science 276, 60-66. (1997)].
- the inventors sought to monitor hepatocyte proliferation in vivo in iLKi67p-Gluc mice after PHx in vivo. 20 ⁇ L of plasma obtained from the tail vein was used to analyze luciferase activity at each time point. The luciferase activity in plasma started to increase on the second day after 70% PHx, and the maximum increase was observed on the third day after this operation (FIG. 5).
- luciferase activity was continuously measured in plasma samples derived from pregnant i ⁇ Ki67p-Gluc mice. For each genotype, the female mice that gave birth were defined as previously pregnant and unbred mice were used as controls. Luciferase activity in plasma from pregnant i ⁇ Ki67p-Gluc mice started to increase 3 days after mating and continued to increase until 12th day of pregnancy (P12). After that, the number gradually decreased until delivery (Fig. 7). Again, luciferase activity in i ⁇ Ki67p-Gluc mice during pregnancy was similar to the previously reported time course of ⁇ -cell proliferation during pregnancy [TEM 21, 151-158. (2010)].
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Abstract
（i）細胞増殖関連遺伝子のプロモーター配列と、 （ii）分泌型レポータータンパク質をコードする配列と、 （iii）前記プロモーター配列と前記分泌型レポータータンパク質コード配列との間に配置された、 2つのlox配列に挟まれ、前記分泌型レポータータンパク質をコードする配列の転写を阻害する配列（レポータータンパク質転写阻害配列）と、 を含む遺伝子構築物を染色体上に保持する非ヒト哺乳動物であって、Creリコンビナーゼを機能させることによって、細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を発現することができる、非ヒト哺乳動物。
Description
本発明は医療や創薬分野で好適に使用される細胞増殖モニター用非ヒト哺乳動物に関する。
細胞増殖をモニターすることは細胞や組織の状態を評価したり薬剤などの効果を評価したりするために有用である。インビトロの細胞を用いた細胞増殖の評価は一般的には3H-チミジン、BrdU、MTTなどの試薬を用いて行われる。
また、近年では、細胞増殖関連分子であるKi67のプロモーターの制御下でGFPを発現させ、細胞増殖をGFPの蛍光でモニターすることが報告されている（非特許文献１）。
一方、インビボの生体における細胞増殖をモニターできる方法の開発が求められており、例えば、GFPなどの蛍光レポータータンパク質を組織や腫瘍部位特異的に発現させた実験動物が開発されている。しかしながら、これまでの方法では生理的な細胞増殖をインビボでモニターするには感度が低く、また、蛍光を測定するためのイメージング装置が必要であり、より簡便なシステムの開発が求められていた。
非特許文献２および３には分泌型ルシフェラーゼであるGaussiaルシフェラーゼを用いることでインビボの生体プロセスを血中に分泌されたルシフェラーゼの蛍光を測定することにより評価できることが開示されている。しかしながら、このような分泌型レポーターを細胞増殖の評価に使用できるかどうかは不明であった。
また、いくつかの先行報告では腫瘍細胞や腫瘍細胞から作成した細胞株の増殖についてレポーターを指標にモニターしたことを開示しているが、この場合、がん遺伝子やがん抑制遺伝子の変異等により細胞増殖活性が正常細胞を上回る状態となった細胞または細胞株の増殖数に依存したレポーター発現とその検知によってなされた報告であり、通常の増殖能または増殖活性を有する細胞の増殖を評価できるかどうかは不明であった。
また、いくつかの先行報告では腫瘍細胞や腫瘍細胞から作成した細胞株の増殖についてレポーターを指標にモニターしたことを開示しているが、この場合、がん遺伝子やがん抑制遺伝子の変異等により細胞増殖活性が正常細胞を上回る状態となった細胞または細胞株の増殖数に依存したレポーター発現とその検知によってなされた報告であり、通常の増殖能または増殖活性を有する細胞の増殖を評価できるかどうかは不明であった。
Cytometry A 77, 564-570. (2010)
Nat Methods 5, 171-173.2008
Nat Protoc 4, 582-591.2009
本発明は、インビボの生理的な細胞増殖をリアルタイムで簡便に測定できるシステムを開発することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、（i）細胞増殖関連遺伝子のプロモーター配列と、（ii）分泌型レポータータンパク質をコードする配列と、（iii）前記プロモーター配列と前記分泌型レポータータンパク質コード配列との間に配置された、2つのlox配列に挟まれ、前記分泌型レポータータンパク質をコードする配列の転写を阻害する配列（レポータータンパク質転写阻害配列）とを含む遺伝子構築物を染色体上に保持する非ヒト哺乳動物を、組織特異的にCreリコンビナーゼを発現する非ヒト哺乳動物と交配させることによって、特定の組織において細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を発現する非ヒト哺乳動物が得られることを見出し、これを用いることにより、目的組織におけるインビボの生理的な細胞増殖をリアルタイムで簡便に測定できることを見出し、本発明の完成に至った。
本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］（i）細胞増殖関連遺伝子のプロモーター配列と、
（ii）分泌型レポータータンパク質をコードする配列と、
（iii）前記プロモーター配列と前記分泌型レポータータンパク質コード配列との間に配置された、
2つのlox配列に挟まれ、前記分泌型レポータータンパク質をコードする配列の転写を阻害する配列（レポータータンパク質転写阻害配列）と、
を含む遺伝子構築物であって、
前記レポータータンパク質転写阻害配列が2つのlox配列とともにCreリコンビナーゼによって切除されることにより、細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を発現させることができる、遺伝子構築物。
[２]細胞増殖関連遺伝子がKi67である、［１］に記載の遺伝子構築物。
[３]分泌型レポータータンパク質がGaussiaルシフェラーゼである、[１]または[２]の遺伝子構築物。
[４]前記レポータータンパク質転写阻害配列がマーカー遺伝子とその転写を終結させるポリA配列である、[１]～[３]のいずれかに記載の遺伝子構築物。
[５][１]～[４]のいずれかに記載の遺伝子構築物を染色体上に保持する非ヒト哺乳動物であって、Creリコンビナーゼを機能させることによって、細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を産生することができる、非ヒト哺乳動物。
[６]前記遺伝子構築物は染色体上のROSA26部位に導入された、[５]に記載の非ヒト哺乳動物。
[７][５]または[６]に記載の非ヒト哺乳動物をCreリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物と掛け合わせることによって得られた、細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を産生する、非ヒト哺乳動物。
[８]前記Creリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物が薬剤誘導性核移行型Creリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物である、[７]に記載の非ヒト哺乳動物。
[９]前記Creリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物が組織特異的にCreリコンビナーゼを発現する非ヒト哺乳動物であり、組織特異的に、細胞増殖に応じて前記分泌型レポータータンパク質を産生する、[７]または[８]に記載の非ヒト哺乳動物。
[１０]前記組織が肝臓または膵臓である、[９]に記載の非ヒト哺乳動物。
[１１]マウスである、[５]～[１０]のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
[１２][５]～[１１]のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物から得られた細胞。
[１３][５]～[１１]のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物または[１２]に記載の細胞を用いて前記分泌型レポータータンパク質を定量する工程を含む、細胞増殖の評価方法。
［１］（i）細胞増殖関連遺伝子のプロモーター配列と、
（ii）分泌型レポータータンパク質をコードする配列と、
（iii）前記プロモーター配列と前記分泌型レポータータンパク質コード配列との間に配置された、
2つのlox配列に挟まれ、前記分泌型レポータータンパク質をコードする配列の転写を阻害する配列（レポータータンパク質転写阻害配列）と、
を含む遺伝子構築物であって、
前記レポータータンパク質転写阻害配列が2つのlox配列とともにCreリコンビナーゼによって切除されることにより、細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を発現させることができる、遺伝子構築物。
[２]細胞増殖関連遺伝子がKi67である、［１］に記載の遺伝子構築物。
[３]分泌型レポータータンパク質がGaussiaルシフェラーゼである、[１]または[２]の遺伝子構築物。
[４]前記レポータータンパク質転写阻害配列がマーカー遺伝子とその転写を終結させるポリA配列である、[１]～[３]のいずれかに記載の遺伝子構築物。
[５][１]～[４]のいずれかに記載の遺伝子構築物を染色体上に保持する非ヒト哺乳動物であって、Creリコンビナーゼを機能させることによって、細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を産生することができる、非ヒト哺乳動物。
[６]前記遺伝子構築物は染色体上のROSA26部位に導入された、[５]に記載の非ヒト哺乳動物。
[７][５]または[６]に記載の非ヒト哺乳動物をCreリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物と掛け合わせることによって得られた、細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を産生する、非ヒト哺乳動物。
[８]前記Creリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物が薬剤誘導性核移行型Creリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物である、[７]に記載の非ヒト哺乳動物。
[９]前記Creリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物が組織特異的にCreリコンビナーゼを発現する非ヒト哺乳動物であり、組織特異的に、細胞増殖に応じて前記分泌型レポータータンパク質を産生する、[７]または[８]に記載の非ヒト哺乳動物。
[１０]前記組織が肝臓または膵臓である、[９]に記載の非ヒト哺乳動物。
[１１]マウスである、[５]～[１０]のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物。
[１２][５]～[１１]のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物から得られた細胞。
[１３][５]～[１１]のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物または[１２]に記載の細胞を用いて前記分泌型レポータータンパク質を定量する工程を含む、細胞増殖の評価方法。
本発明によれば、インビボの生理的細胞増殖をわずかな血液の採取によってリアルタイムで高感度に測定できる。また、蛍光イメージング装置などを必要としないため、簡便な測定が可能である。また、組織特異的にCreリコンビナーゼを発現させることで組織特異的な細胞増殖をモニタリングすることができ、膵島のような小さな組織における細胞増殖も高感度で測定可能である。本発明の非ヒト哺乳動物は病態解析、薬剤評価などに好適に使用できる。
＜遺伝子構築物＞
本発明の遺伝子構築物は、
（i）細胞増殖関連遺伝子のプロモーター配列と、
（ii）分泌型レポータータンパク質をコードする配列と、
（iii）前記プロモーター配列と前記分泌型レポータータンパク質コード配列との間に配置された、
2つのlox配列に挟まれ、前記分泌型レポータータンパク質をコードする配列の転写を阻害する配列（レポータータンパク質転写阻害配列）と、
を含む。
前記レポータータンパク質転写阻害配列が2つのlox配列とともにCreリコンビナーゼによって切除されることにより、細胞増殖関連遺伝子のプロモーター配列から細胞増殖依存的に分泌型レポータータンパク質遺伝子を発現させることができる。
本発明の遺伝子構築物は、
（i）細胞増殖関連遺伝子のプロモーター配列と、
（ii）分泌型レポータータンパク質をコードする配列と、
（iii）前記プロモーター配列と前記分泌型レポータータンパク質コード配列との間に配置された、
2つのlox配列に挟まれ、前記分泌型レポータータンパク質をコードする配列の転写を阻害する配列（レポータータンパク質転写阻害配列）と、
を含む。
前記レポータータンパク質転写阻害配列が2つのlox配列とともにCreリコンビナーゼによって切除されることにより、細胞増殖関連遺伝子のプロモーター配列から細胞増殖依存的に分泌型レポータータンパク質遺伝子を発現させることができる。
細胞増殖関連遺伝子とは、細胞増殖が行われるときに特異的に発現する遺伝子、すなわち、細胞周期のG0期には発現せず、それ以外、特にM期において発現する遺伝子が挙げられ、具体的には、Ki67遺伝子、PCNA遺伝子、CyclinD1遺伝子、cdk2遺伝子、ファルネシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びEGFレセプター遺伝子などが挙げられる。この中では、Ki67が好ましく用いられる。
Ki67遺伝子のプロモーターとしては配列番号１に記載の塩基配列を含む配列が挙げられるが、細胞増殖依存的な転写促進活性を有する限り、これには限定されず、配列番号１の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。ストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイゼーションの後、0.1×SSC、0.1％SDS、６５℃で洗浄する条件が挙げられる。
分泌型レポータータンパク質とは、細胞内で発現され、非ヒト哺乳動物の体液中に分泌されるレポータータンパク質を意味する。ここで、体液は、血液、リンパ液、汗、尿、唾液などが挙げられるが、好ましくは血液である。レポータータンパク質は、免疫学的手法、比色反応、蛍光発光、化学発光などにより検出可能なものであれば特に制限されないが、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。レポータータンパク質は分泌シグナルが付加されてもよい。分泌型のレポータータンパク質として具体的には、例えば、Gaussiaルシフェラーゼ、Cypridinaルシフェラーゼ、Metridiaルシフェラーゼ、Vargulaルシフェラーゼ、Oplophorusルシフェラーゼ、Pleuromammaルシフェラーゼなどの分泌型ルシフェラーゼや分泌性胎盤アルカリホスファターゼ（SEAP）などが挙げられる。Gaussiaルシフェラーゼをコードする塩基配列は例えば配列番号２に示され、Gaussiaルシフェラーゼのアミノ酸配列は例えば配列番号３で示される。ただし、分泌型ルシフェラーゼとして機能するタンパク質およびそれをコードする限りこれらのものには限定されない。
lox配列はCreリコンビナーゼによって認識される配列であればよいが、例えば、loxP, lox71, lox66, lox511, lox2272, Vlox (VCre), Slox (SCre)などが例示される。
レポータータンパク質転写阻害配列はスタッファー配列と呼ぶこともあるが、その3’側に連結された分泌型レポータータンパク質をコードする遺伝子の転写を阻害するために設けられた配列であり、当該配列が部位特異的組換え酵素によってlox配列とともに切り出されることによって、細胞増殖関連遺伝子プロモーターの直下に分泌型レポータータンパク質遺伝子が配置され、当該プロモーターの制御下に分泌型レポータータンパク質遺伝子の転写が起こるようになる。レポータータンパク質転写阻害配列は転写を阻害するのに十分な長さを有していれば特に限定されないが、当該配列が存在することを識別しやすくするためのマーカー遺伝子（分泌型レポータータンパク質とは異なるレポータータンパク質をコードする遺伝子や薬剤耐性遺伝子など、例えば、LacZ、CAT、GFP、Neo、Hygなど）が使用できる。レポータータンパク質転写阻害配列はその3’末端にポリＡ配列が付加されてもよい。
＜本発明の遺伝子構築物を染色体上に保持する非ヒト哺乳動物＞
本発明の非ヒト哺乳動物は、前記の遺伝子構築物を染色体上に保持する。
本発明の非ヒト哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ウシ、マーモセットなどの任意の非ヒト哺乳動物であり得るが、好ましくはマウスである。
本発明の非ヒト哺乳動物は、前記の遺伝子構築物を染色体上に保持する。
本発明の非ヒト哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ウシ、マーモセットなどの任意の非ヒト哺乳動物であり得るが、好ましくはマウスである。
本発明の非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物）は、前記遺伝子構築物を非ヒト哺乳動物の染色体上に組み込むことで得ることができる。相同組換えによって染色体上の特定の位置に組み込むために、前記遺伝子構築物は染色体上の目的部位と相同な配列をさらに含むことが好ましい。ここで、染色体上の目的部位としては、Rosa26遺伝子座が好ましい。マウスROSA26遺伝子座は、Friedrich及びSorianoにより1991年に、レトロウイルスを感染させた胚性幹(ES)細胞を用いるジーントラップ実験により発見された(Genes & Development, 1991, 5, 1513～1523)。ROSA26遺伝子座をマウスES細胞でターゲティングすることは、トランスジェニックマウスモデルを構築するために広く用いられている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 5037-5042など)。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、例えば、以下の（ａ）～（ｇ）の工程を含む方法により得ることができる。
（ａ）前記遺伝子構築物を含むターゲッティングベクターを非ヒト哺乳動物の胚性幹（ES）細胞に導入する工程、
（ｂ）前記遺伝子構築物が挿入された染色体を有するES細胞を選択する工程、
（ｃ）選択したES細胞を受精卵に導入する工程、
（ｄ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程、
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、生殖系列キメラを選択する工程、
（ｆ）該生殖系列キメラを交配させ、産まれた仔から、前記遺伝子構築物が挿入された染色体を有する個体を選択する工程、および
（ｇ）（ｆ）で得られた個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、前記遺伝子構築物が挿入されたホモ接合体を選択する工程。
（ａ）前記遺伝子構築物を含むターゲッティングベクターを非ヒト哺乳動物の胚性幹（ES）細胞に導入する工程、
（ｂ）前記遺伝子構築物が挿入された染色体を有するES細胞を選択する工程、
（ｃ）選択したES細胞を受精卵に導入する工程、
（ｄ）該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物の卵管あるいは子宮に移植する工程、
（ｅ）該非ヒト哺乳動物を飼育し、産まれた仔から、生殖系列キメラを選択する工程、
（ｆ）該生殖系列キメラを交配させ、産まれた仔から、前記遺伝子構築物が挿入された染色体を有する個体を選択する工程、および
（ｇ）（ｆ）で得られた個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、前記遺伝子構築物が挿入されたホモ接合体を選択する工程。
このような方法は、例えば、Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo： A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory（1986）や、米国特許第5,616,491号および5,750,826号などに記載されている。
上記のようにして得られた本発明の遺伝子構築物を染色体上に保持する非ヒト哺乳動物の体内において、Creリコンビナーゼを発現させることにより、細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を発現する非ヒト哺乳動物を得ることができる。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物を染色体上に保持する非ヒト哺乳動物を、Creリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物と掛け合わせることによって、細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を発現する非ヒト哺乳動物を得ることができる。
＜Creリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物＞
Cre recombinase遺伝子としては、lox配列を認識してそれに挟まれる配列を除去しうるタンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限されないが、例えば、GenBankに Accession No. X03453で登録されているバクテリオファージＰ１のCre recombinase遺伝子を挙げることができる。
Cre recombinase遺伝子としては、lox配列を認識してそれに挟まれる配列を除去しうるタンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限されないが、例えば、GenBankに Accession No. X03453で登録されているバクテリオファージＰ１のCre recombinase遺伝子を挙げることができる。
Creリコンビナーゼはその発現のタイミングを制御するため、薬剤誘導性核移行型であることが好ましい。例えば、薬剤依存的に核に移行し、lox配列で挟まれたレポータータンパク質転写阻害配列を切除するようにするため、Creリコンビナーゼを、薬剤依存的に核移行を促すタンパク質との融合タンパク質として発現させることが好ましい。このようなタンパク質としては核内ホルモン受容体が挙げられ、エストロゲン受容体が好ましく使用できる。Creリコンビナーゼとエストロゲン受容体の融合タンパク質を発現するマウスはGenesis 39, 167-172.(2004)などに記載されている。このような融合タンパク質として発現させることで、タモキシフェンなどのリガンドを投与した時にのみCreが機能して細胞増殖依存的なレポータータンパク質の分泌を観察することができる。
目的組織特異的な細胞増殖を評価するため、Creリコンビナーゼを目的組織のみで発現させて、目的組織特異的に分泌型レポータータンパク質を発現させることが好ましい。Creリコンビナーゼを目的組織のみで発現させるためには、Creリコンビナーゼをコードする遺伝子を組織特異的プロモーターの３’側に連結して、当該プロモーターの制御下で発現させることが好ましい。
組織特異的プロモーターは、目的組織に応じて適宜選択できる。
肝臓特異的プロモーターとしては、肝臓アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡＩプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、α１－アンチトリプシンプロモーター、トランスフェリントランスサイレチンプロモーター、血清アミロイドＡプロモーター、トランスサイレチンプロモーター、ＨＮＦ－６プロモーターなどが挙げられる。
膵臓β細胞特異的プロモーターとしては、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ＰＤＸ－１プロモーターなどが挙げられる。
骨格筋特異的プロモーターとしては、ミオシンH鎖プロモーター、筋クレアチンキナーゼプロモーター、ジストロフィンプロモーター、カルパインプロモーター、アルファ-アクチンプロモーター、速筋型トロポニン1プロモーター、などが挙げられる。
皮膚特異的プロモーターとしてはケラチンプロモーターなどが挙げられる。
肺特異的プロモーターとしてはサイトケラチン18プロモーター、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）プロモーター、肺サーファクタントタンパク質A、Bプロモーターなどが挙げられる。
脂肪組織特異的プロモーターとしてはリポタンパク質リパーゼプロモーター、アジプシンプロモーター、アディポネクチンプロモーター、aＰ２プロモーターなどが挙げられる。
神経特異的プロモーターとしては、コリンアセチルトランスフェラーゼプロモーター、ｃ-Ｆｏｓプロモーター、Ａｒｃプロモーター、シナプシンＩプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、ニューロフィラメント－Ｌプロモーター、ニューロペプチドＹプロモーター、チロシン水酸化酵素遺伝子プロモーター、ドーパミン－ｂ－ヒドロキシラーゼ遺伝子プロモーター、Ｌ７プルキンエ細胞タンパク質プロモーター、Ｄ１Ａドーパミン受容体遺伝子プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５遺伝子プロモーター、神経ニコチン性アセチルコリン受容体ベータ３遺伝子プロモーター、ＧＡＢＡ（Ａ）受容体デルタサブユニット遺伝子プロモーターなどが挙げられる。
血球特異的プロモーターとしてはｆ４/８０プロモーター、ライソザイム２プロモーター、ケモカイン(Ｃ-Ｘ３-Ｃモチーフ)受容体１プロモーター、コロニー刺激因子1受容体プロモーターなどが挙げられる。
腸管特異的プロモーターとしてはヴィリンプロモーターが挙げられる。
上記のような適当なプロモーターの下流に連結されたCreリコンビナーゼ遺伝子を染色体上に保持する非ヒト哺乳動物は上記と同様の手順で得ることができる。
肝臓特異的プロモーターとしては、肝臓アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡＩプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、α１－アンチトリプシンプロモーター、トランスフェリントランスサイレチンプロモーター、血清アミロイドＡプロモーター、トランスサイレチンプロモーター、ＨＮＦ－６プロモーターなどが挙げられる。
膵臓β細胞特異的プロモーターとしては、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ＰＤＸ－１プロモーターなどが挙げられる。
骨格筋特異的プロモーターとしては、ミオシンH鎖プロモーター、筋クレアチンキナーゼプロモーター、ジストロフィンプロモーター、カルパインプロモーター、アルファ-アクチンプロモーター、速筋型トロポニン1プロモーター、などが挙げられる。
皮膚特異的プロモーターとしてはケラチンプロモーターなどが挙げられる。
肺特異的プロモーターとしてはサイトケラチン18プロモーター、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）プロモーター、肺サーファクタントタンパク質A、Bプロモーターなどが挙げられる。
脂肪組織特異的プロモーターとしてはリポタンパク質リパーゼプロモーター、アジプシンプロモーター、アディポネクチンプロモーター、aＰ２プロモーターなどが挙げられる。
神経特異的プロモーターとしては、コリンアセチルトランスフェラーゼプロモーター、ｃ-Ｆｏｓプロモーター、Ａｒｃプロモーター、シナプシンＩプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、ニューロフィラメント－Ｌプロモーター、ニューロペプチドＹプロモーター、チロシン水酸化酵素遺伝子プロモーター、ドーパミン－ｂ－ヒドロキシラーゼ遺伝子プロモーター、Ｌ７プルキンエ細胞タンパク質プロモーター、Ｄ１Ａドーパミン受容体遺伝子プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５遺伝子プロモーター、神経ニコチン性アセチルコリン受容体ベータ３遺伝子プロモーター、ＧＡＢＡ（Ａ）受容体デルタサブユニット遺伝子プロモーターなどが挙げられる。
血球特異的プロモーターとしてはｆ４/８０プロモーター、ライソザイム２プロモーター、ケモカイン(Ｃ-Ｘ３-Ｃモチーフ)受容体１プロモーター、コロニー刺激因子1受容体プロモーターなどが挙げられる。
腸管特異的プロモーターとしてはヴィリンプロモーターが挙げられる。
上記のような適当なプロモーターの下流に連結されたCreリコンビナーゼ遺伝子を染色体上に保持する非ヒト哺乳動物は上記と同様の手順で得ることができる。
＜細胞増殖依存的に分泌型レポータータンパク質を産生する非ヒト哺乳動物＞
本発明の遺伝子構築物を保持する非ヒト哺乳動物およびCreリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物を交配させ、生まれてくる子孫の中から、分泌型レポータータンパク質をコードする遺伝子およびCreリコンビナーゼをコードする遺伝子をホモまたはヘテロに有し、目的組織において、レポータータンパク質転写阻害配列が除去され、細胞増殖関連遺伝子プロモーターの制御下で分泌型レポータータンパク質をコードする遺伝子が発現する動物を、サザンブロットやPCRなどの遺伝子解析または表現型解析によりスクリーニングする。このような手順により、細胞増殖依存的に分泌型レポータータンパク質を産生する非ヒト哺乳動物が得られる。
本発明の遺伝子構築物を保持する非ヒト哺乳動物およびCreリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物を交配させ、生まれてくる子孫の中から、分泌型レポータータンパク質をコードする遺伝子およびCreリコンビナーゼをコードする遺伝子をホモまたはヘテロに有し、目的組織において、レポータータンパク質転写阻害配列が除去され、細胞増殖関連遺伝子プロモーターの制御下で分泌型レポータータンパク質をコードする遺伝子が発現する動物を、サザンブロットやPCRなどの遺伝子解析または表現型解析によりスクリーニングする。このような手順により、細胞増殖依存的に分泌型レポータータンパク質を産生する非ヒト哺乳動物が得られる。
上記非ヒト哺乳動物またはそれから得られた細胞は細胞増殖の評価および解析に使用できる。すなわち、上記非ヒト哺乳動物またはその細胞は細胞増殖に応じてレポータータンパク質を分泌するため、分泌されたレポータータンパク質を定量することで、細胞増殖の評価、解析又はモニターすることができる。例えば、血液などの体液を定期的に採取し、そこに含まれるレポータータンパク質の量を測定することで、細胞増殖をモニターすることができる。測定はレポータータンパク質の種類によって適当な方法を選択できる。ルシフェラーゼの場合、ルシフェラーゼの基質を用いて活性を測定することができる。
また、組織特異的にCreリコンビナーゼを発現させることで、組織特異的な細胞増殖を評価、解析又はモニターすることができる。さらに、Creリコンビナーゼを薬剤誘導型とすることにより、解析するときにのみレポータータンパク質を分泌させることができる。
また、組織特異的にCreリコンビナーゼを発現させることで、組織特異的な細胞増殖を評価、解析又はモニターすることができる。さらに、Creリコンビナーゼを薬剤誘導型とすることにより、解析するときにのみレポータータンパク質を分泌させることができる。
本発明の細胞増殖依存的に分泌型レポータータンパク質を産生する非ヒト動物は、外部刺激に対する細胞増殖の変化や病態などの内部要因に対する細胞増殖の変化をモニターするために使用することができる。また、薬剤の細胞増殖に対する影響を評価するために使用することができる。すなわち、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与し、被験物質が細胞増殖に与える影響を評価することができる。被験物質投与前後のトランスジェニック非ヒト動物より体液（例えば、血液）サンプルを採取して、体液中に含まれるレポータータンパク質の増減を指標として、当該被験物質の効果を評価することができる。例えば、被験物質の投与により、体液中に含まれるレポータータンパク質の量が低減した場合には、当該被験物質は細胞増殖を抑制する効果を有すると判断することができ、逆に、体液中に含まれるレポータータンパク質の量が増大した場合には、当該被験物質は細胞増殖を促進する効果を有すると判断することができる。例えば、目的組織にがんを誘発し、その細胞増殖を測定することにより、癌の進行をモニターできるし、薬剤を添加することで薬剤の抗がん効果を評価することもできる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の態様は以下の実施例には限定されない。
材料および方法
ＥＳ細胞における遺伝子ターゲティング、およびノックインマウスの生成
ｐＧＬｕｃ Ｂａｓｉｃ－１ベクターをＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国アリゾナ州）より購入した。このベクターは、プロモーターを含まないレポーター遺伝子Ｇｌｕｃ（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ分泌ルシフェラーゼのヒト化コード配列）（配列番号２）を含む［Mol Ther 11, 435-443.(2005)］。図１に示すように、リアルタイム細胞増殖のモニタリングのためのコンストラクトを構築するため、ヒトＫｉ６７プロモーター配列（配列番号１）をｐＧＬｕｃ Ｂａｓｉｃ－１のＥｃｏＲＶ部位に、ｌｏｘＰ－クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）－ｐｏｌｙＡ－ｌｏｘＰ（ＬＳＬ）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 160-164.(1995)]カセットをｐＧＬｕｃ Ｂａｓｉｃ－１のＳａｃＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に、それぞれ挿入した（Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃコンストラクト）。このＫｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃコンストラクトを、マウス肝細胞株Ｈｅｐａ１－６またはマウスβ細胞株ＭＩＮ６－Ｋ８［J Diabetes Investig 1, 137-142.(2010)］にトランスフェクトした。これらの細胞でコンストラクトが機能するのを確認した後、Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来ＥＳ細胞のＲｏｓａ２６遺伝子座にエレクトロポレーションでノックインした。相同組換え体のＥＳ細胞クローンを、ＰＣＲおよびサザンブロット分析でｎｅｏプローブを用いて識別した。樹立されたこれらの相同組換え体ＥＳ細胞から、キメラマウスを生成した。このキメラマウスを野生型マウスと交配することで、ヘテロ接合体マウスを得た。
ＥＳ細胞における遺伝子ターゲティング、およびノックインマウスの生成
ｐＧＬｕｃ Ｂａｓｉｃ－１ベクターをＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国アリゾナ州）より購入した。このベクターは、プロモーターを含まないレポーター遺伝子Ｇｌｕｃ（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ分泌ルシフェラーゼのヒト化コード配列）（配列番号２）を含む［Mol Ther 11, 435-443.(2005)］。図１に示すように、リアルタイム細胞増殖のモニタリングのためのコンストラクトを構築するため、ヒトＫｉ６７プロモーター配列（配列番号１）をｐＧＬｕｃ Ｂａｓｉｃ－１のＥｃｏＲＶ部位に、ｌｏｘＰ－クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）－ｐｏｌｙＡ－ｌｏｘＰ（ＬＳＬ）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 160-164.(1995)]カセットをｐＧＬｕｃ Ｂａｓｉｃ－１のＳａｃＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に、それぞれ挿入した（Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃコンストラクト）。このＫｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃコンストラクトを、マウス肝細胞株Ｈｅｐａ１－６またはマウスβ細胞株ＭＩＮ６－Ｋ８［J Diabetes Investig 1, 137-142.(2010)］にトランスフェクトした。これらの細胞でコンストラクトが機能するのを確認した後、Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来ＥＳ細胞のＲｏｓａ２６遺伝子座にエレクトロポレーションでノックインした。相同組換え体のＥＳ細胞クローンを、ＰＣＲおよびサザンブロット分析でｎｅｏプローブを用いて識別した。樹立されたこれらの相同組換え体ＥＳ細胞から、キメラマウスを生成した。このキメラマウスを野生型マウスと交配することで、ヘテロ接合体マウスを得た。
組換えアデノウイルス
ＣＡＧプロモーター制御下のＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子をコードする組換えアデノウイルス（Ｃｒｅ－アデノウイルス）を、先の報告［Gastroenterology 152, 1521-1535 e1528.(2017)，Am J Physiol Endocrinol Metab 290, E308-316.(2006)］に記載のように用いた。
ＬａｃＺ遺伝子をコードする組換えアデノウイルス（ＬａｃＺ－アデノウイルス）を対照として使用した。
ＣＡＧプロモーター制御下のＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子をコードする組換えアデノウイルス（Ｃｒｅ－アデノウイルス）を、先の報告［Gastroenterology 152, 1521-1535 e1528.(2017)，Am J Physiol Endocrinol Metab 290, E308-316.(2006)］に記載のように用いた。
ＬａｃＺ遺伝子をコードする組換えアデノウイルス（ＬａｃＺ－アデノウイルス）を対照として使用した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
Ｈｅｐａ１－６細胞は、１０％ウシ胎児血清ならびにペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）中で維持した。ＭＩＮ６－Ｋ８細胞は、１０％ウシ胎児血清ならびにペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した、２５ｍＭグルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。アデノウイルス感染のため、細胞を、２．２×１０5ＰＦＵ のＣｒｅ－アデノウイルスまたはＬａｃＺ－アデノウイルスを含む培地中で４８時間インキュベートした。細胞増殖を抑制するため、Ｈｅｐａ１－６細胞を、マイトマイシン（３０μｇ／ｍＬ）、ロスコビチン（５００μｇ／ｍＬ）、またはラパマイシン（５０μＭ）を含む培地中で５時間インキュベートし、その後これらの薬剤を含まない培地中で２０時間インキュベートした。溶媒として水を用いた。
Ｈｅｐａ１－６細胞は、１０％ウシ胎児血清ならびにペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）中で維持した。ＭＩＮ６－Ｋ８細胞は、１０％ウシ胎児血清ならびにペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した、２５ｍＭグルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。アデノウイルス感染のため、細胞を、２．２×１０5ＰＦＵ のＣｒｅ－アデノウイルスまたはＬａｃＺ－アデノウイルスを含む培地中で４８時間インキュベートした。細胞増殖を抑制するため、Ｈｅｐａ１－６細胞を、マイトマイシン（３０μｇ／ｍＬ）、ロスコビチン（５００μｇ／ｍＬ）、またはラパマイシン（５０μＭ）を含む培地中で５時間インキュベートし、その後これらの薬剤を含まない培地中で２０時間インキュベートした。溶媒として水を用いた。
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイ
マウスの尾部を小切開し、血液試料を採取した。５０μＬの血液を１μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡに加え、１０分間以上遠心して血漿を分離した。１μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを５０μＬの血液に加え、その後１０分間以上遠心して血漿を分離した。次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した１００μＬの１０μｇ／ｍＬセレンテラジン（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、９６穴プレート中の２０μＬの試料（培地または血漿）に加えた。Ｇｌｕｃ活性を、セレンテラジンを注入し、光子計数を１０秒間行うように設定したプレートルミノメーター（Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した［Nat Methods 5, 171-173.(2008)］。
マウスの尾部を小切開し、血液試料を採取した。５０μＬの血液を１μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡに加え、１０分間以上遠心して血漿を分離した。１μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを５０μＬの血液に加え、その後１０分間以上遠心して血漿を分離した。次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した１００μＬの１０μｇ／ｍＬセレンテラジン（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、９６穴プレート中の２０μＬの試料（培地または血漿）に加えた。Ｇｌｕｃ活性を、セレンテラジンを注入し、光子計数を１０秒間行うように設定したプレートルミノメーター（Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した［Nat Methods 5, 171-173.(2008)］。
定量ＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現量の評価
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，東京，日本）を用いて、膵島または細胞溶解物から全ＲＮＡを抽出した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて１００ｎｇの全ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲ定量システム（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒソフトウェア；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，マンハイム，ドイツ）により評価した。ｍＲＮＡの相対量を、インバリアントな対照（ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ）としてＡｃｔｂ ｍＲＮＡを用いて算出した。プライマー配列は次の通りであった：マウスＫｉ６７（５’－ＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＡＧＴＣＴＧＡＴＧＴＴＡ－３’（配列番号４）［フォワードプライマー］、５’－ＡＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＡＴＡＣＡＡＴＧＴＣ－３’（配列番号５）［リバースプライマー］）、マウスＡｃｔｂ（５’－ＧＡＴＧＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＴＴ－３’（配列番号６）［フォワードプライマー］、５’－ＴＧＴＧＴＴＧＧＣＡＴＡＧＡＧＧＴＣＴＴＴＡＣ－３’（配列番号７）［リバースプライマー］）、ＣＡＴ遺伝子（５’－ＣＡＡＣＣＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧ－３’（配列番号８）［フォワードプライマー］、５’－ＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣ－３’（配列番号９）［リバースプライマー］）、Ｇｌｕｃ遺伝子（５’－ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＡＴＴＣ－３’（配列番号１０）［フォワードプライマー］、５’－ＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＴＧＣＡＣＧＴＴＧ－３’（配列番号１１）［リバースプライマー］）。
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，東京，日本）を用いて、膵島または細胞溶解物から全ＲＮＡを抽出した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて１００ｎｇの全ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲ定量システム（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒソフトウェア；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，マンハイム，ドイツ）により評価した。ｍＲＮＡの相対量を、インバリアントな対照（ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌ）としてＡｃｔｂ ｍＲＮＡを用いて算出した。プライマー配列は次の通りであった：マウスＫｉ６７（５’－ＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＡＧＴＣＴＧＡＴＧＴＴＡ－３’（配列番号４）［フォワードプライマー］、５’－ＡＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＡＴＡＣＡＡＴＧＴＣ－３’（配列番号５）［リバースプライマー］）、マウスＡｃｔｂ（５’－ＧＡＴＧＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＴＴ－３’（配列番号６）［フォワードプライマー］、５’－ＴＧＴＧＴＴＧＧＣＡＴＡＧＡＧＧＴＣＴＴＴＡＣ－３’（配列番号７）［リバースプライマー］）、ＣＡＴ遺伝子（５’－ＣＡＡＣＣＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧ－３’（配列番号８）［フォワードプライマー］、５’－ＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＴＣ－３’（配列番号９）［リバースプライマー］）、Ｇｌｕｃ遺伝子（５’－ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＡＴＴＣ－３’（配列番号１０）［フォワードプライマー］、５’－ＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＴＧＣＡＣＧＴＴＧ－３’（配列番号１１）［リバースプライマー］）。
動物
動物実験は、東北大学の研究機関ガイドラインに従って行った。東北大学環境・安全委員会動物実験専門委員会より倫理認定を得た。
アルブミンプロモーター－ＣｒｅＥＲトランスジェニックマウス［Genesis 39, 167-172.(2004)］は、Ｐｉｅｒｒｅ Ｃｈａｍｂｏｎ氏およびＤａｎｉｅｌ Ｍｅｔｚｇｅｒ教授（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ－Ｃｅｄｅｘ，フランス）の協力により提供された。ラットインシュリン２プロモーター－ＣｒｅＥＲ（ＲＩＰ－ＣｒｅＥＲ）マウス［Nature 429, 41-46.(2004)］は、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，米国メイン州）より購入した。
動物実験は、東北大学の研究機関ガイドラインに従って行った。東北大学環境・安全委員会動物実験専門委員会より倫理認定を得た。
アルブミンプロモーター－ＣｒｅＥＲトランスジェニックマウス［Genesis 39, 167-172.(2004)］は、Ｐｉｅｒｒｅ Ｃｈａｍｂｏｎ氏およびＤａｎｉｅｌ Ｍｅｔｚｇｅｒ教授（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ－Ｃｅｄｅｘ，フランス）の協力により提供された。ラットインシュリン２プロモーター－ＣｒｅＥＲ（ＲＩＰ－ＣｒｅＥＲ）マウス［Nature 429, 41-46.(2004)］は、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，米国メイン州）より購入した。
タモキシフェン誘導性肝臓特異的Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス（ｉＬＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス）を得るため、アルブミン－ＣｒｅＥＲマウスとＫｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃの交配を行った。
８週齢の時点で、雄のアルブミン－ＣｒｅＥＲ；Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃマウスに、コーンオイル（Ｓｉｇｍａ）に溶かした８０μｇ／ｇ体重のタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ，セントルイス，米国ミズーリ州）を２４時間ごとに５日間連続で腹腔内注射した。最後の注射から１０日後、これらのマウスに、公開されているプロトコル［Nature protocols 3, 1167-1170.(2008)］に従って７０％ＰＨｘを行った。このプロトコルは肝臓の左葉および中葉を結紮および摘出するためのものである。偽手術では正中開腹のみを行った。
タモキシフェン誘導性β細胞特異的Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス（ｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス）を得るため、ＲＩＰ－ＣｒｅＥＲマウスとＫｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃマウスの交配を行った。８週齢の時点で、ＲＩＰ－ＣｒｅＥＲ；Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃマウスに、上記のようにタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射を行った。
妊娠モデルについては、最後のタモキシフェン注射から１ヶ月後、雌のｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスを雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスと交配した。雄のＣ５７ＢＬ／６ＮマウスはＪａｐａｎ ＳＬＣ（静岡，日本）より購入した。それらマウスを同一のケージ内に一晩置いた翌朝、膣栓の存在によって交配を確認した。
これらの動物は、空調環境下、１２時間明暗サイクルで飼育を行った。マウスには、標準的な実験用飼料（６５％炭水化物，４％乳脂肪，２４％タンパク質；オリエンタル酵母工業株式会社（東京，日本）による提供）が自由に与えられた。ＣｒｅＥＲ対立遺伝子を持たない同腹子マウスを対照として用いた。
ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光イメージング
マウスを麻酔し、ＰＢＳで希釈したセレンテラジン（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を４ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈注射した。注射から１分後、Ｇｌｕｃイメージングを行い、照明無しで冷却ＣＣＤカメラ（ＩＶＩＳ ＳＰＥＣＴＲＵＭ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，米国マサチューセッツ州）を用いて、光子数を１分間にわたり記録した［Nat Methods 5, 171-173.(2008)］。
マウスを麻酔し、ＰＢＳで希釈したセレンテラジン（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を４ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈注射した。注射から１分後、Ｇｌｕｃイメージングを行い、照明無しで冷却ＣＣＤカメラ（ＩＶＩＳ ＳＰＥＣＴＲＵＭ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，米国マサチューセッツ州）を用いて、光子数を１分間にわたり記録した［Nat Methods 5, 171-173.(2008)］。
膵島解析
最後の注射から１０日後、先の記述のように［Diabetes 60(2):537-47.(2011)］、膵島の単離を行った。膵島は１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＶ（Ｓｉｇｍａ）を含む１．０ｍＬのハンクス液を膵管に逆行注入することにより単離した。膵臓を３７℃の恒温チャンバー内で消化した。マウスからの膵島の精製を、光学顕微鏡観察下で手選により達成した。単離した膵島を、１０％ウシ胎児血清、２５ｍＭグルコース、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃にて、５％ＣＯ２および９５％空気中で一晩維持した。翌日、単離膵島を１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼで１０分間、３７℃にて処理し、ペプチドが確実に膵島内部に到達するようにした［J Mol Endocrinol 38, 127-136.(2007)］。その後、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、膵島をマイトジェン刺激とともに４８時間インキュベートした。高グルコース濃度による刺激のため、膵島を２５ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩ１６４０培地中でインキュベートした。低グルコース濃度実験は５．５ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて行った。ＧＬＰ－１による刺激のため、膵島を、５．５ｍＭグルコース、および１ｍＭのジペプチジルペプチダーゼ－４阻害剤であるジプロチンＡ（ペプチド研究所，大阪，日本）、ならびに１００ｎＭ ＧＬＰ－１（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｃｈｅｍ，米国）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中でインキュベートした。溶媒として水を用いた。
最後の注射から１０日後、先の記述のように［Diabetes 60(2):537-47.(2011)］、膵島の単離を行った。膵島は１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＶ（Ｓｉｇｍａ）を含む１．０ｍＬのハンクス液を膵管に逆行注入することにより単離した。膵臓を３７℃の恒温チャンバー内で消化した。マウスからの膵島の精製を、光学顕微鏡観察下で手選により達成した。単離した膵島を、１０％ウシ胎児血清、２５ｍＭグルコース、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃にて、５％ＣＯ２および９５％空気中で一晩維持した。翌日、単離膵島を１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼで１０分間、３７℃にて処理し、ペプチドが確実に膵島内部に到達するようにした［J Mol Endocrinol 38, 127-136.(2007)］。その後、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、膵島をマイトジェン刺激とともに４８時間インキュベートした。高グルコース濃度による刺激のため、膵島を２５ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩ１６４０培地中でインキュベートした。低グルコース濃度実験は５．５ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて行った。ＧＬＰ－１による刺激のため、膵島を、５．５ｍＭグルコース、および１ｍＭのジペプチジルペプチダーゼ－４阻害剤であるジプロチンＡ（ペプチド研究所，大阪，日本）、ならびに１００ｎＭ ＧＬＰ－１（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｃｈｅｍ，米国）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中でインキュベートした。溶媒として水を用いた。
統計解析
全てのデータを平均値±標準誤差で表した。２群間の相違の統計的有意性はスチューデントｔ検定を用いて評価した。３群以上を対象とする実験では一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた後、ボンフェローニの事後検定を行った。
全てのデータを平均値±標準誤差で表した。２群間の相違の統計的有意性はスチューデントｔ検定を用いて評価した。３群以上を対象とする実験では一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた後、ボンフェローニの事後検定を行った。
結果
リアルタイム細胞増殖レポーター系の生成
血中Ｇｌｕｃ活性を利用してリアルタイムな細胞増殖をモニタリングするため、ｐＧＬｕｃ Ｂａｓｉｃ－１ベクター（ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国アリゾナ州）にＫｉ６７ｐを挿入した。その後、ｌｏｘＰ－クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）－ｐｏｌｙＡ－ｌｏｘＰ（ＬＳＬ）カセットをＫｉ６７ｐの下流に挿入した。このＣＡＴ－ｐｏｌｙＡカセットは終止配列として機能する。これにより、Ｇｌｕｃ発現は増殖中のＣｒｅ活性化細胞（Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃコンストラクト）においてのみ促進されると期待される（図１）。
リアルタイム細胞増殖レポーター系の生成
血中Ｇｌｕｃ活性を利用してリアルタイムな細胞増殖をモニタリングするため、ｐＧＬｕｃ Ｂａｓｉｃ－１ベクター（ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国アリゾナ州）にＫｉ６７ｐを挿入した。その後、ｌｏｘＰ－クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）－ｐｏｌｙＡ－ｌｏｘＰ（ＬＳＬ）カセットをＫｉ６７ｐの下流に挿入した。このＣＡＴ－ｐｏｌｙＡカセットは終止配列として機能する。これにより、Ｇｌｕｃ発現は増殖中のＣｒｅ活性化細胞（Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃコンストラクト）においてのみ促進されると期待される（図１）。
Ｃｒｅ組換え後に増殖中の細胞が実際にＧｌｕｃを発現し、培地中にそれを分泌するかどうか調べるため、まず、前記Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃコンストラクトをマウス肝細胞株Ｈｅｐａ１－６およびマウスβ細胞株ＭＩＮ６にトランスフェクトし、次いでＣｒｅを含むアデノウイルス（Ｃｒｅ－アデノウイルス）を感染させた。Ｈｅｐａ１－６およびＭＩＮ６細胞の培地中のＧｌｕｃ活性は著しく上昇し（図２）、これらの細胞中で産生されたＧｌｕｃが培地中に分泌されたことが示された。さらに、培地中の上昇したＧｌｕｃ活性は、マイトマイシンＣおよびラパマイシン等の抗腫瘍剤、または、ＣＤＫ阻害剤であるロスコビチンでＨｅｐａ１－６細胞を処理することによって有意に減少した（図３）。これらの発見は、培地中のＧｌｕｃ活性がこれらの細胞の細胞増殖状態を反映するということを示している。定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）法によると、ｌｏｘＰ隣接ＣＡＴ遺伝子およびＧｌｕｃ遺伝子の遺伝子発現は、それぞれ有意にダウンレギュレートおよびアップレギュレートされていた（図４）。このように、Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃ系において、培地中に分泌されるルシフェラーゼの活性を測定することにより、Ｃｒｅ組換え後の培養細胞株における細胞増殖状態をモニタリングすることが可能となる。
部分的肝切除後の肝細胞増殖のｉｎ ｖｉｖｏリアルタイムモニタリング
次に、Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－ＧｌｕｃコンストラクトをＣ５７ＢＬ／６ＮマウスのＲｏｓａ２６遺伝子座にノックインした（Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃマウス）。これらのマウスでは、ＧｌｕｃはＣｒｅが機能している細胞においてのみＫｉ６７プロモーターの制御下で発現し、循環中へ分泌されると考えられた。肝臓は高度な増殖能を有する大型臓器であるため、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞増殖をモニタリングするための本系の利用可能性を評価するのに理想的な臓器であると考えた。そのため、まず、アルブミン－ＣｒｅＥＲマウス［Genesis 39, 167-172.(2004)］をＫｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃマウスと交配することにより、タモキシフェン誘導性肝臓特異的Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス（ｉＬＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス）を生成した。ＰＨｘは肝細胞増殖を誘導するために一般的に用いられる手法である［Science 276, 60-66.(1997)］。発明者らは、ＰＨｘ後のｉＬＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでリアルタイムな肝細胞増殖のモニタリングを試みた。尾静脈から得た血漿２０μＬを用いて、各時点でのルシフェラーゼ活性を分析した。血漿中のルシフェラーゼ活性は７０％ＰＨｘ後２日目に上昇を始め、この手術後３日目に最大の上昇が見られた（図５）。上昇したルシフェラーゼ活性は、５日目までに、偽手術（ＳＯ）を行ったｉＬＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスと比較してごくわずかに高いだけの活性にまで低下し、このわずかに高い水準がその後も維持された。重要なことには、ＰＨｘ後のｉＬＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスにおけるルシフェラーゼ活性の経時変化は、以前に報告されたＰＨｘ後の肝再生の経時変化と類似したものであった［Science 276, 60-66.(1997)］。ＳＯ後のｉＬＫｉ６７ｐ－ＧｌｕｃマウスおよびＣｒｅ陰性対照マウスの血漿におけるルシフェラーゼ活性は、実験期間全体を通して低いままであった（図５）。
次に、Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－ＧｌｕｃコンストラクトをＣ５７ＢＬ／６ＮマウスのＲｏｓａ２６遺伝子座にノックインした（Ｋｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃマウス）。これらのマウスでは、ＧｌｕｃはＣｒｅが機能している細胞においてのみＫｉ６７プロモーターの制御下で発現し、循環中へ分泌されると考えられた。肝臓は高度な増殖能を有する大型臓器であるため、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞増殖をモニタリングするための本系の利用可能性を評価するのに理想的な臓器であると考えた。そのため、まず、アルブミン－ＣｒｅＥＲマウス［Genesis 39, 167-172.(2004)］をＫｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃマウスと交配することにより、タモキシフェン誘導性肝臓特異的Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス（ｉＬＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス）を生成した。ＰＨｘは肝細胞増殖を誘導するために一般的に用いられる手法である［Science 276, 60-66.(1997)］。発明者らは、ＰＨｘ後のｉＬＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでリアルタイムな肝細胞増殖のモニタリングを試みた。尾静脈から得た血漿２０μＬを用いて、各時点でのルシフェラーゼ活性を分析した。血漿中のルシフェラーゼ活性は７０％ＰＨｘ後２日目に上昇を始め、この手術後３日目に最大の上昇が見られた（図５）。上昇したルシフェラーゼ活性は、５日目までに、偽手術（ＳＯ）を行ったｉＬＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスと比較してごくわずかに高いだけの活性にまで低下し、このわずかに高い水準がその後も維持された。重要なことには、ＰＨｘ後のｉＬＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスにおけるルシフェラーゼ活性の経時変化は、以前に報告されたＰＨｘ後の肝再生の経時変化と類似したものであった［Science 276, 60-66.(1997)］。ＳＯ後のｉＬＫｉ６７ｐ－ＧｌｕｃマウスおよびＣｒｅ陰性対照マウスの血漿におけるルシフェラーゼ活性は、実験期間全体を通して低いままであった（図５）。
次に、生物発光解析を行った。ルシフェラーゼの基質であるセレンテラジン（ＣＴＺ）の静脈注射後、ＰＨｘを行ったｉＬＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスにおいてのみ、その存在が推定される肝臓の部分で強い発光シグナルが検出された（図６）。ＳＯを行ったｉＬＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスにおいては発光が検出されなかった。従って、血漿中ルシフェラーゼ活性の上昇は、肝臓においてＧｌｕｃの産生が強化されたことに起因すると思われる。発光は、鼻部無毛部および四肢遠位部にも検出された。これはおそらく、これらの部位で毛細血管が緻密に表在するためと考えられる。このように、Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃ系を使用することにより、ＰＨｘ後の肝細胞増殖を極めて少量の血液のサンプリングでモニタリングすることができる。まとめると、これらの結果は、選択された細胞型の増殖状態の定量リアルタイムｉｎ ｖｉｖｏモニタリングに対してＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃ系が利用できることを示している。
妊娠中のβ細胞増殖のｉｎ ｖｉｖｏリアルタイムモニタリング
次に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける膵臓β細胞の増殖をＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃ系を用いてモニタリングできるかどうか調べた。ＲＩＰ－ＣｒｅＥＲマウス［Nature 429, 41-46.(2004)］をＫｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃマウスと交配し、それによりタモキシフェン誘導性β細胞特異的Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス（ｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス）を作製した。
生理的条件下での本系の利用可能性を評価するため、妊娠中のβ細胞増殖のｉｎ ｖｉｖｏでのモニタリングを試みた。妊娠中は膵臓β細胞が増殖し、膵臓におけるその量が増加することがよく知られている。そこで、妊娠中のｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス由来の血漿試料におけるルシフェラーゼ活性を継続的に測定した。各遺伝子型について、出産した雌マウスはそれまで妊娠中であったと定義し、未交配のマウスを対照として用いた。妊娠中のｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス由来の血漿におけるルシフェラーゼ活性は交配後３日目に上昇を始め、妊娠１２日目（Ｐ１２）まで上昇を続けた。その後、出産まで徐々に減少した（図７）。この場合もやはり、妊娠中のｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスにおけるルシフェラーゼ活性は、以前報告された妊娠中のβ細胞増殖の経時変化と類似するものであった［TEM 21, 151-158.(2010)］。これらの結果は、Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃ系を用いることによって、非常に小さな細胞集団であるβ細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおけるリアルタイムな増殖をも検出できることをはっきりと示した。このように、本系によって、非常に小さな細胞集団の増殖をｉｎ ｖｉｖｏで継続的に検出することが可能であり、それは恐らくＧｌｕｃの高い感度と、Ｋｉ６７ｐの高い選択性および低いバックグラウンドによるものと考えられる。
次に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける膵臓β細胞の増殖をＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃ系を用いてモニタリングできるかどうか調べた。ＲＩＰ－ＣｒｅＥＲマウス［Nature 429, 41-46.(2004)］をＫｉ６７ｐ－ＬＳＬ－Ｇｌｕｃマウスと交配し、それによりタモキシフェン誘導性β細胞特異的Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス（ｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス）を作製した。
生理的条件下での本系の利用可能性を評価するため、妊娠中のβ細胞増殖のｉｎ ｖｉｖｏでのモニタリングを試みた。妊娠中は膵臓β細胞が増殖し、膵臓におけるその量が増加することがよく知られている。そこで、妊娠中のｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス由来の血漿試料におけるルシフェラーゼ活性を継続的に測定した。各遺伝子型について、出産した雌マウスはそれまで妊娠中であったと定義し、未交配のマウスを対照として用いた。妊娠中のｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウス由来の血漿におけるルシフェラーゼ活性は交配後３日目に上昇を始め、妊娠１２日目（Ｐ１２）まで上昇を続けた。その後、出産まで徐々に減少した（図７）。この場合もやはり、妊娠中のｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスにおけるルシフェラーゼ活性は、以前報告された妊娠中のβ細胞増殖の経時変化と類似するものであった［TEM 21, 151-158.(2010)］。これらの結果は、Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃ系を用いることによって、非常に小さな細胞集団であるβ細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおけるリアルタイムな増殖をも検出できることをはっきりと示した。このように、本系によって、非常に小さな細胞集団の増殖をｉｎ ｖｉｖｏで継続的に検出することが可能であり、それは恐らくＧｌｕｃの高い感度と、Ｋｉ６７ｐの高い選択性および低いバックグラウンドによるものと考えられる。
ｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスから単離された膵島を用いたβ細胞増殖のｅｘ ｖｉｖｏモニタリング
β細胞の量はグルコース恒常性の重要な決定因子であり、β細胞量を増加させることは糖尿病の治療に対して長い間待ち望まれてきた治療法である。しかし、今までのところβ細胞量を増加させるための、臨床的に利用できる方法は無い。
Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃ系がβ細胞栄養因子の探索に利用できるかどうか調べるため、ｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスから単離した膵島の培養を、高濃度のグルコース（ＨＧ）およびグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）等のいくつかのβ細胞増殖刺激［３３－３５］とともに行い、培地中のルシフェラーゼ活性を測定した。
４８時間のＨＧ刺激後、培地中のルシフェラーゼ活性は有意に増加した（図８）。一方、同一の実験条件下で膵島のＫｉ６７の遺伝子発現は僅かに増加したのみであり、その差異は低グルコース条件下で培養した単離膵島におけるものと比較して統計的な有意性にまで到達しなかった（図８）。また、ＧＬＰ－１による４８時間の刺激では、培地中のルシフェラーゼ活性が増加する傾向が見られた。一方で同様に、膵島におけるＫｉ６７遺伝子発現については、いずれの同一刺激条件下でも増加が観察されなかった（図９）。これらの結果は、ｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスから単離した膵島を用いたｅｘ ｖｉｖｏ Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃ系が、遺伝子発現分析よりも高感度にβ細胞増殖促進因子の探索に利用可能であることを示している。Ｇｌｕｃは培地中で安定なことから、本手法によって刺激期間中の増殖状態の評価を累積的に行うことができると考えられる。刺激期間の終わりの時点の状態を反映する遺伝子発現分析とは異なり、Ｇｌｕｃのこのような特徴によって、極めて高い感度が達成できると考えられる。
β細胞の量はグルコース恒常性の重要な決定因子であり、β細胞量を増加させることは糖尿病の治療に対して長い間待ち望まれてきた治療法である。しかし、今までのところβ細胞量を増加させるための、臨床的に利用できる方法は無い。
Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃ系がβ細胞栄養因子の探索に利用できるかどうか調べるため、ｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスから単離した膵島の培養を、高濃度のグルコース（ＨＧ）およびグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）等のいくつかのβ細胞増殖刺激［３３－３５］とともに行い、培地中のルシフェラーゼ活性を測定した。
４８時間のＨＧ刺激後、培地中のルシフェラーゼ活性は有意に増加した（図８）。一方、同一の実験条件下で膵島のＫｉ６７の遺伝子発現は僅かに増加したのみであり、その差異は低グルコース条件下で培養した単離膵島におけるものと比較して統計的な有意性にまで到達しなかった（図８）。また、ＧＬＰ－１による４８時間の刺激では、培地中のルシフェラーゼ活性が増加する傾向が見られた。一方で同様に、膵島におけるＫｉ６７遺伝子発現については、いずれの同一刺激条件下でも増加が観察されなかった（図９）。これらの結果は、ｉβＫｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃマウスから単離した膵島を用いたｅｘ ｖｉｖｏ Ｋｉ６７ｐ－Ｇｌｕｃ系が、遺伝子発現分析よりも高感度にβ細胞増殖促進因子の探索に利用可能であることを示している。Ｇｌｕｃは培地中で安定なことから、本手法によって刺激期間中の増殖状態の評価を累積的に行うことができると考えられる。刺激期間の終わりの時点の状態を反映する遺伝子発現分析とは異なり、Ｇｌｕｃのこのような特徴によって、極めて高い感度が達成できると考えられる。
Claims (13)
- （i）細胞増殖関連遺伝子のプロモーター配列と、
（ii）分泌型レポータータンパク質をコードする配列と、
（iii）前記プロモーター配列と前記分泌型レポータータンパク質コード配列との間に配置された、
2つのlox配列に挟まれ、前記分泌型レポータータンパク質をコードする配列の転写を阻害する配列（レポータータンパク質転写阻害配列）と、
を含む遺伝子構築物であって、
前記レポータータンパク質転写阻害配列が2つのlox配列とともにCreリコンビナーゼによって切除されることにより、細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を発現させることができる、遺伝子構築物。 - 細胞増殖関連遺伝子がKi67である、請求項１に記載の遺伝子構築物。
- 分泌型レポータータンパク質がGaussiaルシフェラーゼである、請求項１または２に記載の遺伝子構築物。
- 前記レポータータンパク質転写阻害配列がマーカー遺伝子とその転写を終結させるポリA配列である、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を染色体上に保持する非ヒト哺乳動物であって、Creリコンビナーゼを機能させることによって、細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を産生することができる、非ヒト哺乳動物。
- 前記遺伝子構築物は染色体上のROSA26部位に導入された、請求項５に記載の非ヒト哺乳動物。
- 請求項５または６に記載の非ヒト哺乳動物をCreリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物と掛け合わせることによって得られた、細胞増殖依存的に前記分泌型レポータータンパク質を産生する、非ヒト哺乳動物。
- 前記Creリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物が薬剤誘導性核移行型Creリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物である、請求項７に記載の非ヒト哺乳動物。
- 前記Creリコンビナーゼ発現非ヒト哺乳動物が組織特異的にCreリコンビナーゼを発現する非ヒト哺乳動物であり、組織特異的に、細胞増殖に応じて前記分泌型レポータータンパク質を産生する、請求項７または８に記載の非ヒト哺乳動物。
- 前記組織が肝臓または膵臓である、請求項９に記載の非ヒト哺乳動物。
- マウスである、請求項５～１０のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
- 請求項５～１１のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物から得られた細胞。
- 請求項５～１１のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物または請求項１２に記載の細胞を用いて前記分泌型レポータータンパク質を定量する工程を含む、細胞増殖の評価方法。
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|---|---|---|---|
| PCT/JP2019/007082 WO2020174539A1 (ja) | 2019-02-25 | 2019-02-25 | 細胞増殖モニター用非ヒト哺乳動物 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2020174539A1 true WO2020174539A1 (ja) | 2020-09-03 |
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ID=72238836
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|---|---|
| WO (1) | WO2020174539A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112921053A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-06-08 | 汕头大学 | 一种可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统及其建立与应用 |
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| CN101319215A (zh) * | 2008-07-01 | 2008-12-10 | 郑骏年 | 人肿瘤特异性Ki67基因启动子 |
| WO2011006962A1 (en) * | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Nucleic acid expression construct and its use as a cell proliferation marker |
-
2019
- 2019-02-25 WO PCT/JP2019/007082 patent/WO2020174539A1/ja active Application Filing
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| CN112921053A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-06-08 | 汕头大学 | 一种可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统及其建立与应用 |
| CN112921053B (zh) * | 2021-02-02 | 2023-04-14 | 汕头大学 | 一种可追踪细胞分化发育的双重诱导mCreER系统及其建立与应用 |
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