CN101319215A - 人肿瘤特异性Ki67基因启动子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人肿瘤细胞增殖抗原Ki67蛋白编码基因的启动子，具体包括该启动子的克隆、序列、功能及其用途。本发明公布了位于Ki67基因5′侧翼－820～+771位置，包含Ki67基因启动子的1591bp的序列。使用缺失分析法分别从Ki67基因5′侧翼的5′端和3′端逐段缺失，得到不同长度的DNA截短片段，这些片段被插入萤火虫荧光素酶报告基因上游，构建一系列表达质粒。将这些质粒转染四种肿瘤细胞和正常细胞瞬时表达，确定了Ki67基因核心启动子位于Ki67基因－223～+30。Ki67基因核心启动子在肿瘤细胞内具有高转录活性和肿瘤特异性，是非常有用的肿瘤特异性启动子。该启动子可用于调控治疗基因表达，或用于构建条件增殖病毒，从而实现选择性杀伤肿瘤细胞，广泛用于肿瘤靶向治疗。

Description

人肿瘤特异性Ki67基因启动子

技术领域

本发明属于医学基因工程技术领域，涉及细胞生物学、分子生物学、癌症生物学等。具体是人肿瘤特异性Ki67启动子的克隆及功能鉴定，该启动子在肿瘤细胞或组织中有较高的转录活性，从而使外源基因在肿瘤细胞或组织中特异性表达，因此可以广泛用于肿瘤靶向基因治疗。

背景技术

肿瘤严重危害人类健康。虽然化疗、放疗和手术技术的改进使肿瘤治疗效果取得很大改观，但效果仍不理想，而且肿瘤常常最终对化疗、放疗耐受。近年来肿瘤基因治疗研究取得较大进展，给人类战胜肿瘤带来希望。临床上基因治疗包括多种，如肿瘤自杀基因、抑癌基因、细胞凋亡基因、细胞因子、反义核苷酸、小干扰RNA等，虽然已经取得了一定的疗效^[1]，但单纯上述基因的应用缺乏肿瘤特异性，限制了基因治疗在临床上的应用范围及治疗效果。为了将治疗基因产物限制在肿瘤细胞中，可以通过肿瘤特异性启动子控制治疗基因表达，使其局限在肿瘤细胞内，而不在正常细胞中表达，实现治疗基因靶向转录，此即为肿瘤的靶向基因治疗^[2-4]。

肿瘤特异性启动子的活力和特异性决定肿瘤靶向基因治疗的效果和安全性^[5]。很多实验室已经通过组织特异性启动子实现肿瘤靶向基因治疗，如AFP是原发性肝癌的特异性标志物，其表达受AFP启动子调控，在腺病毒中插入该启动子，可使病毒仅在表达AFP的肝癌细胞内增殖^[6]。这类启动子尚有前列腺癌PSA启动子、黑色素瘤Tyr酶启动子^[7]、消化道肿瘤CEA启动子，乳腺癌MUC1启动子。1997年Rodriguez等^[8]构建了以PSA启动子调控腺病毒E1A区基因的增殖腺病毒CV706。实验发现CV706对PSA阳性LNCaP细胞的杀伤能力比PSA阴性DU15细胞增强400倍。5×10⁸pfu的CV706注入小鼠LNCaP种植瘤内，2周后肿瘤体积明显下降，同时PSA水平显著下降，6周后，10只鼠中有5只肿瘤完全消失。但这些启动子具有肿瘤类型局限性，只能在该种组织来源的肿瘤中起作用，使其应用受到限制^[5]。为此人们开始寄希望于针对所有肿瘤特征的启动子，如hTERT启动子^{[9，10，11]}、Survivin启动子^[12]、环氧化酶(cyclooxygenase-2，COX-2)启动子^[13]等。此类启动子可以使外源基因在多种肿瘤中特异性的表达，体内外研究取得了肯定的治疗效果，但是其活性较低，不能令人满意^[14]。因此寻找启动能力更强、特异性更高的肿瘤启动子意义重大。

Ki67蛋白是一种与肿瘤细胞增殖相关的核抗原，1983年被Gerdes^[15]发现后，经多家研究证实其与肿瘤细胞增殖密切相关。几乎所有的肿瘤细胞都表达Ki67蛋白，而正常组织和细胞不表达。Ki67在肿瘤组织中表达越高，预后越差。复发和进展期肿瘤Ki67表达高于原发性肿瘤^[16]。Ki67蛋白已成为临床判断肿瘤恶性度及预后最常用的细胞增殖标志。近年研究表明，Ki67基因是一细胞增殖基因，编码分子量为345kD和395kD的肿瘤细胞增殖必需的DNA结合蛋白。Ki67蛋白在G1中晚期出现，经S、G2期在M期达到高峰，M期后即快速降解。Ki67蛋白磷酸化与染色体的浓缩及染色单体的分离有关^[17]。越来越多的研究表明Ki67与肿瘤的形成密切相关，是调节细胞周期必不可少的组成部分。

1991年Ki67基因被定位在10号染色体^[18]，但由于其初级结构独特，在生物数据库中尚未发现与之同源的序列^[19]，也使其生物功能至今仍不清楚，对于Ki67基因功能以及基因表达调控机制等方面的研究甚少。启动子是基因组中最重要的调控元件，基因表达调控主要发生在转录水平调控，而启动子决定着转录的起始和转录的频率，是阐明基因转录调控机制和表达模式的关键。启动子区域内存在诸多的顺式作用元件，更能提供研究基因间相互作用、相互调节的线索。Ki67基因上游转录表达调控机制尚不清楚，因此我们克隆并鉴定该基因启动子，通过分析、鉴定维持该启动子转录活性的必需区域及该区域内的潜在转录因子，筛选出该启动子的核心启动子。不仅有帮于我们认识Ki67基因表达调控，更为重要的是由于Ki67基因在几乎所有的肿瘤细胞中都有很高的表达，该启动子会为我们提供一种应用范围极广的肿瘤靶向基因治疗工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的肿瘤特异性Ki67启动子的克隆，确定该启动子核心功能区域的核苷酸序列，以及核心启动子的核苷酸序列。为肿瘤的靶向基因治疗提供一个新的调控元件，为肿瘤治疗提供新的技术。

本发明的技术方案如下：通过逆转录PCR技术扩增出长度为1591bp含有人肿瘤细胞Ki67基因启动子的Ki67基因5′侧翼序列，该序列包括从转录起始位点上游-820至转录起始位点下游起始密码子ATG之后的+771，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该段GC含量高达61.47％，转录起始点前200bp范围内的GC含量更高，达67.71％。并且在-195、-189、-167、-156起始位置存在潜在转录因子Sp1一致性序列(CCCGCC)，在-53、-6、+3起始位置存在多个转录因子Sp1一致性序列(GGGCGG)，-80起始位置存在一个CHR(cell-cycle geneshomology region，细胞周期调控基因的同源区)一致性序列(ATTTGAA)，-48起始位置存在一个ZF5(human zinc finger 5 protein，人类锌指蛋白5)一致性序列(GGCGCG)，但没有典型的TATA盒和CAAT盒。提示Ki67基因表达调控存在多种因素，从中找出关键转录调控区域或调控元件，对阐明Ki67基因表达调控具有重要意义。

为寻找Ki67基因启动子的关键转录调控区域，我们使用缺失分析法分别从Ki67基因5′侧翼的5′端逐段缺失，得到9个不同长度的截短片段，利用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定截短片段在Hela细胞、BIU-87细胞、Ketr-3细胞、A549细胞四种人肿瘤细胞和人脐静脉内皮细胞株Huvec中的启动子活性。结果显示，-223～+771截短片段活性最强。然后对-223～+771片段自3′端缺失，形成的截短片段表现出较缺失前更强的启动子活性，-223～+30片段的活性在Hela细胞、BIU-87细胞、Ketr-3细胞、A549细胞内分别为-223～+771片段活性的2.9倍、2.6倍、2.4倍、2.7倍。我们将长度为253bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，位于Ki67基因5′端上游-223～+30的片断命名为Ki67核心启动子(Ki67-promoter)。Ki67-promoter在Hela细胞、BIU-87细胞、Ketr-3细胞、A549细胞四种肿瘤细胞中的活性均较hTERT启动子、Survivin启动子的活性为强。

本发明还提供了一种含有Ki67核心启动子的载体，该载体能在Ki67基因阳性的肿瘤细胞中启动荧光素酶基因的表达。本发明还提供了一种以Ki67核心启动子取代腺病毒E1A启动子调控的条件增殖型腺病毒穿梭质粒。

本发明首次鉴定了人Ki67基因启动子位于Ki67基因-820～+771位置，并鉴定出-223～+30区域为Ki67基因核心启动子，证明其在多种肿瘤细胞中的强大活性及很高的肿瘤特异性。本发明不仅对研究人Ki67基因在肿瘤细胞中的表达调控机制具有重要意义，更为重要的是因其具有肿瘤特异性和高启动子活性，这些Ki67基因启动子片段是非常有用的肿瘤特异性启动子。此类启动子可以定向插入新的基因治疗用载体，在其调控下，外源治疗基因或病毒增殖相关基因(如腺病毒E1A或E1B)只在肿瘤细胞中定位表达，从而在肿瘤的靶向治疗中具有较好的应用价值。

本文下列实例仅是用作举例说明，但应注意的是并不构成对本发明范围的限制。本发明范围内的其他方面、优点和改进对本发明所属技术领域的技术人员来说是显而易见的。

附图说明

图1Ki67基因5′侧翼序列(-820～+771)正向测序报告；

图2Ki67基因5′侧翼序列(-820～+771)反向测序报告；

图35′端启动子区域截短片段示意图；

图43’端启动子区域截短片段示意图；

图5真核表达质粒构建流程图；

图6Ki67核心启动子克隆载体pGLBK2+(-223～+30)正向测序报告；

图7pGLBK800在各细胞系中相对荧光强度；

图8自5’端缺失的各重组载体在肿瘤细胞内的相对荧光强度；

图9自5’端缺失的各重组载体在正常细胞内的相对荧光强度；

图10自3’端缺失的各重组载体在肿瘤细胞内的相对荧光强度；

图11自3’端缺失的各重组载体在正常细胞内的相对荧光强度；

图12Ki67核心启动子与hTERT、Survivin启动子在肿瘤细胞的活性比较；

图13Ki67核心启动子与hTERT、Survivin启动子在正常细胞的活性比较；

图14Ki67核心启动子取代腺病毒E1A启动子的条件增殖型腺病毒穿梭质粒的PCR鉴定示意图。图中A：Ki67启动子片段M：D2000marker。

具体实施方式

实施例1含有人Ki67基因启动子的真核表达质粒的构建

1.人Ki67基因5′侧翼序列(-820～+771)的克隆及序列鉴定

在Genbank中查找Ki67基因转录起始点5′侧翼序列，设计并合成扩增Ki67基因起始密码子上游1591大小片段的一对引物。在-820～-805区域设计上游引物，并引入Xho I酶切位点，在+758～+771区域设计下游引物，并引入Hind III酶切位点。其中上游引物命名为KU800，序列为：5′-ttgt ctcgagtttttctgtgcttttg-3′，下游引物命名为KD1，序列为：5′-tgtg aagctttcgaccccgctcct-3′。

应用此对引物，以人肾癌Ketr-3细胞基因组DNA为模板，PCR扩增出约1.6kb的DNA片段，回收目的片段，Xho I/Hind III双酶切后，与经同样酶切的载体pGL3-Basic(购自美国Promega公司)连接，pGL3-Basic为萤火虫荧光素酶报告基因前不含启动子的表达载体。连接产物转化大肠杆菌JM109，抗性筛选，测序。

测序结果证明我们克隆出的Ki67基因5′侧翼序列已定向克隆至pGL3-Basic载体萤火虫荧光素酶报告基因上游(测序图谱见图1、图2)，该重组质粒命名为pGLBK800，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，包含了长度为1591bp的Ki67基因5′侧翼序列，包括从转录起始位点上游-820至转录起始位点下游起始密码子ATG之后的+771的序列。该段序列GC含量高达61.47％，其特性为富含GC，无TATA盒和CAAT盒。

2.Ki67基因启动子核心功能区域克隆

为了鉴定Ki67基因启动子的核心功能区域，对Ki67基因5′侧翼序列进行缺失分析，由PCR方法获得启动子区域截短片段，所用的上游引物如表1所示，下游引物为KD1：5′-tgtg aagctt tcgaccccgctcct-3′。所有上游引物均含Xho I酶切位点，下游引物含Hind III酶切位点。上游引物分别与下游引物KD1组成一对引物，以质粒pGLBK800为模板进行PCR扩增，得到8段长度不同的片段。将这些片段分别与载体pGL3-Basic相连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，进行抗性筛选及测序，即得到一系列真核表达质粒pGLBK600、pGLBK400、pGLBK300、pGLBK200、pGLBK100、pGLBK50、pGLBK10、pGLBKN。自5′端逐段缺失所成的截短片段示意图见图3。

表1自5′端对Ki67基因5′侧翼行PCR逐段缺失所用上游引物

3.Ki67基因核心启动子片段克隆

Ki67基因启动子核心功能区域在转录起始点和翻译起始点之间(+1～+772)存在着700多个碱基，即5′非翻译区(5′-UTR)。通常情况下，长的5′-UTR对翻译起始有阻碍作用^[20]。为进一步检测该部分对Ki67基因启动子活性的影响，将pGLBK200质粒中的Ki67基因启动子片段自3′端逐段缺失翻译起始点至转录起始点间的碱基，构建三个重组载体pGLBK2-、pGLBK2+0、pGLBK2+。质粒构建上游引物KU200含Xho I酶切位点，序列为：5′-ttgt ctcgagatgcgtgagtggctcgcc-3′。下游引物含Hind III酶切位点，序列见表2。具体方法同5′端逐段缺失载体的构建，其示意图见图4。

以上所有真核表达质粒的构建流程图见图5。

表2自3′端对Ki67基因启动子核心功能区域行PCR缺失所用下游引物

实施例2细胞培养、质粒转染和人Ki67基因启动子活性分析

各实验质粒(Ki67启动子片段的真核表达质粒)构建成功后，用PureYieldPlasmid Midiprep System试剂盒进行质粒中量提取，同时提取阳性对照质粒pGL3-Control(含SV40启动子/增强子)、阴性对照质粒pGL3-Basic(不含SV40启动子/增强子)以及内参照质粒pRL-TK(HSV-TK启动子控制下表达海肾素荧光素酶)。实验质粒、对照质粒分别稀释至100ng/μl，内参照质粒pRL-TK稀释至20ng/μl。

本发明将各实验质粒、对照质粒分别转染人宫颈癌细胞(Hela)、膀胱癌细胞(BIU-87)、肾癌细胞(Ketr-3)、肺癌细胞(A549)及人脐静脉内皮细胞(Huvec)，检测其启动子活性。转染方法如下：①脂质体准备：将脂质体(TranfastReageat)加入400μl Nuclease-Free Water，稀释至1μg/μl，剧烈振荡10秒钟，37℃水浴中完全溶解，-30℃过夜；②质粒准备：将各实验质粒、或阳性对照质粒pGL3-Basic、或阴性对照质粒pGL3-Control与phRL-TK内参照质粒按50∶1浓度混合(0.5μg∶10ng)；③脂质体质粒混合：5μl混合质粒，用无血清无双抗培养基稀释后加入3μl脂质体，终体积为200μl。室温孵育10分钟；④细胞转染：24孔板内每孔放置1×10⁵个细胞，在含10％FCS的培养基中常规培养24h；移除培养基，使用无血清无双抗培养基洗涤1遍，每孔加入200μl质粒脂质体混合液，37℃下孵育1小时；⑤每孔加入含10％FCS无双抗培养基800μl，继续培养48小时，收获细胞，进行双荧光素酶活性分析。每组样品4复孔，进行2次重复实验。

双荧光素酶报告基因检测采用美国Promega公司生产的Dual-LuciferaseReporter Assay System试剂盒分析。将转染质粒的贴壁细胞用1×PBS洗涤一次，去尽残液，加入100μl新鲜配置的PLB，室温下振荡15min以裂解细胞。将细胞裂解液移至1.5ml EP管中，室温下13000×g离心1min，留取上清。取20μl上清加入含100μl LARII溶液的1.5ml离心管中，测定萤火虫荧光素酶活性，再向同一离心管中加入100μl新鲜配制的STOP液，测定海肾荧光素酶活性(内参照)，计算出两种荧光素酶活性的比值，即相对荧光素酶活性。相对荧光素酶活性代表启动子的转录活性。

Ki67基因5′侧翼序列启动子转录活性分析：Ki67基因5′侧翼序列的真核表达质粒pGLBK800的转录活性在Hela细胞、BIU-87细胞、Ketr-3细胞、A549细胞四种人肿瘤细胞内分别达到SV40启动子/增强子活性的21.0％、31.1％、23.9％和7.2％；在人Huvec细胞没有表现出明显活性(表3、图7)。说明我们克隆出的Ki67基因5′侧翼序列包含Ki67基因启动子，且具有较高的启动子活性和肿瘤特异性。

表3Ki67基因5′侧翼序列在不同细胞中的相对荧光素酶活性

^b与pGL3-Control质粒相对荧光素酶活性的比值

Ki67基因启动子核心功能区域截短片段转录活性分析：我们检测了pGLBK800、pGLBK600、pGLBK400、pGLBK300、pGLBK200、pGLBK100、pGLBK50、pGLBK10和pGLBKN9个重组载体在四种不同来源的人肿瘤细胞和一种人正常细胞中的启动子活性，对Ki67基因启动子核心功能区域的转录活性进行研究。在所有肿瘤细胞中均表现出以下趋势：pGLBK800、pGLBK600、pGLBK400的启动子活性逐渐增强，说明这一段含有沉默子序列；pGLBK400、pGLBK300、pGLBK200的活性变化不大，均处于峰值，其中pGLBK200活性最高，在肿瘤BIU87细胞、Ketr3细胞、Hela细胞和A549细胞中，pGLBK200活性分别达到SV40启动子/增强子活性的58.0％、44.1％、22.7％和13.2％，说明在这一段没有明显影响转录活性的调控元件；自pGLBK200缩短到pGLBK50时，转录活性显著下降，表明在这一区段存在重要的转录调控元件；pGLBK10、pGLBKN不表现启动子活性。在正常细胞中所有重组载体均无启动子活性，显示出Ki67启动子良好的肿瘤特异性(表4，图8，9)。

表4Ki67启动子核心功能区域片段在各细胞中的相对荧光素酶活性

^b与pGL3-Control质粒相对荧光素酶活性的比值.

Ki67基因核心启动子转录活性分析：为检测Ki67启动子转录起始点至翻译起始点间调控元件对启动子活性的影响，我们自3′端逐段缺失翻译起始点至转录起始点间的碱基，构建了三个重组载体pGLBK2+、pGLBK2+0、pGLBK2-，并检测在四种不同来源的人肿瘤细胞和一种人正常细胞中的启动子活性。结果显示，在所有的肿瘤细胞中三个重组载体启动子活性均较截短片段pGLBK200有很大程度的提高；而在正常细胞中与pGLBK200一样转录活性均较低。由于pGLBK2+(测序图谱见图6)质粒包含了完整的转录起始点，因此我们把-223～+30位置序列确定为Ki67基因核心启动子，命名为Ki67-promoter(见表5、图10、11)。

表5Ki67基因核心启动子片段在各细胞中的相对荧光素酶活性

^b与pGL3-Control质粒相对荧光素酶活性的比值

实施例3Ki67-promoter、hTERT启动子、Survivin启动子活性比较

为进一步验证Ki67-promoter转录活性的大小，我们将其与目前研究较多的两种肿瘤特异性启动子hTERT、Survivin启动子相比较。实验方法及步骤同实施例2。结果显示，在所有肿瘤细胞中，Ki67-promoter的活性均比hTERT和Survivin启动子的活性强，在正常细胞中，三种启动子均无活性(见表6、图12、13)。Ki67-promoter显示出更好的启动子活性。

表6Ki67核心启动子、hTERT启动子、Survivin启动子在各细胞中的活性比较

^b与pGL3-Control质粒相对荧光素酶活性的比值

实施例4Ki67启动子调控的条件增殖型腺病毒穿梭质粒的构建

肿瘤基因治疗至今没有突破的最主要原因是目前所用病毒载体存在两大缺陷：(1)无增殖能力，导致抗癌基因表达不足。(2)无靶向性，导致抗癌基因不能靶向进入肿瘤细胞。近年来条件增殖型腺病毒(Conditionally replicativeadenovirus，CRAds)治疗肿瘤研究取得重大进展。CRAds是指只在肿瘤细胞内增殖并将其裂解，而对正常细胞无影响的腺病毒。利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制的必需基因具有特异性强、安全性高和易操作等优点而成为CRAds构建最常用的一种方法。

腺病毒感染细胞首先表达E1A基因然后才能复制。因此利用肿瘤特异启动子控制E1A基因的表达，就能控制病毒只在具有该启动子活性的肿瘤细胞内增殖，同时其选择性增殖能力可使治疗基因在肿瘤细胞内大量扩增，从而显著增强杀伤肿瘤作用。Ki67启动子在不同组织来源的肿瘤细胞中活性都很高，而在正常细胞中几乎没有活性，因此它可以用于提高基因、病毒治疗的安全性和有效性。Ki67-promoter活性强、长度短，适用于病毒载体基因表达的特异性调控。

我们将Ki67-promoter插入腺病毒复制必需基因E1A前面，构建Ki67-promoter调控的条件增殖型腺病毒。为了能够方便的将该启动子插入包装病毒用穿梭质粒载体中，我们通过设计引物引入合适的酶切位点，上游引物序列为5′-ttgt ctcgag atgcgtgagtggctcgcc-3′，包含Xho I酶切位点。下游引物序列为5′-tgtg tacgta ccaccgagtcgagtcctcc-3′，包含SnaB I酶切位点。利用此对引物以pGLBK2+为模板，PCR拉出Ki67-promoter，将该片段纯化、酶切后克隆进经Xho I/SnaB I酶切过的pZXC2质粒(E1A启动子被缺失)，命名为pZKi67。平板初步筛选鉴定具有该重组子的菌落，小量培养后，PCR鉴定并送测序。PCR电泳结果可见一大小为273bp的清晰条带(图14)，测序结果证明Ki67-promoter已定向克隆至pZXC2质粒中。若将pZKi67质粒与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3同源重组，即可包装成条件增殖型腺病毒。

Claims (8)

1.一种人肿瘤特异性Ki67基因启动子，其核苷酸序列选自下组：

(1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或

(2)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的互补序列，或

(3)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中任一部分，或发生一处或多处缺失突变或替换突变，并具有与所述的碱基序列相似的启动子功能的等价物，即相似的肿瘤特异性和相似程度的启动子活性；

其核心启动子存在于SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列中。

2.根据权利要求1所述的人肿瘤特异性Ki67基因启动子，其特征在于SEQID NO：1所示的核苷酸序列中含有至少一个控制Ki67基因表达的调控元件。

3.权利要求1中的肿瘤特异性Ki67基因启动子的用途，其通过控制治疗基因表达，用于肿瘤基因治疗与预防复发。

4.根据权利要求4所述的肿瘤特异性Ki67基因启动子的用途，其特征在于治疗基因是血管抑制基因、肿瘤坏死因子基因、肿瘤自杀基因、促细胞凋亡基因、抑癌基因、细胞因子基因、反义核苷酸、或小干扰RNA。

5.权利要求1中的肿瘤特异性Ki67启动子的用途，用于增殖病毒介导的肿瘤治疗，利用权利要求1中的任一项肿瘤特异性Ki67启动子调控病毒增殖相关基因：如腺病毒E1A或E1B，使病毒仅在肿瘤细胞或组织中特异性的增殖并杀伤肿瘤。

6.一种含有Ki67核心启动子的载体，其特征在于它含有权利要求1所述的肿瘤特异性Ki67启动子。

7.根据权利要求7所述的含有Ki67核心启动子的载体，其特征在于，它含有所述的启动子调控的外源基因。

8.根据权利要求8所述的含有Ki67核心启动子的载体，其特征在于所述外源基因是报告基因。

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