CN113750256A - 一种肿瘤靶向抑制试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肿瘤靶向抑制试剂及其制备方法和应用，属于基因治疗技术领域。本发明利用KRT19在乳腺癌细胞、宫颈癌细胞以及人舌鳞状细胞癌中显著过表达，而在正常细胞中的表达水平则较低的性质，KRT19启动子调控PE38KDEL毒素的表达用于乳腺癌、宫颈癌以及人舌鳞状细胞癌的靶向基因治疗是可行的。构建了含有KRT19启动子和毒素的重组质粒，并以乳腺癌细胞MCF‑7为模型研究了pKRT19‑PE38KDEL对其蛋白合成、侵袭和迁移的抑制作用以及对细胞周期和凋亡的影响，结果显示含有KRT19启动子和毒素的重组质粒具有较好的肿瘤靶向抑制作用，有望应用于肿瘤的靶向基因治疗。

Description

一种肿瘤靶向抑制试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一种肿瘤靶向抑制试剂及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤已成为威胁人类健康的主要因素，目前针对肿瘤的治疗手段仍然主要以手术、放疗和化疗为主。这些治疗手段对于早期肿瘤患者具有较好的治疗效果，但往往存在较大的毒副作用。同时，由于肿瘤发生的隐蔽性，相当一部分肿瘤患者在发现时已处于中晚期阶段。而这些常规的治疗手段对于此阶段的肿瘤治疗效果并不理想。因此，开发新型肿瘤靶向治疗手段成为当前研究的热点问题。作为一项新型的治疗手段，基因治疗近年来越来越多地受到研究者的重视和青睐，在肿瘤的靶向基因治疗方面展示出了独特的优势。
KRT19是分子量最小的酸性角蛋白，在正常的上皮或者多种原发性/转移性上皮肿瘤中均有表达。癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡等行为会受到KRT19表达水平的调控，不同类型的癌症细胞中的KRT19表达模式有一定的差异。最近有研究表明，在乳腺癌细胞中，KRT19的表达水平显著高于正常组织细胞，特别在浸润性乳腺癌中具有特异性的高表达。KRT19可上调Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin/RAC1的核转移水平，因此，受β-catenin介导的Numb表达水平也会有所提高。高度保守的Notch信号通路是决定发育中乳腺细胞命运和细胞分化的关键调节因子之一，作为Notch信号通路的关键抑制蛋白，Numb的表达水平上调会使Notch信号通路受抑制从而失控，这对乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移等行为有影响，甚至有可能使乳腺癌细胞对临床治疗产生耐药性。KRT19在头颈部鳞状细胞癌中也表现出过度的表达。在253名头颈部鳞状细胞癌患者中，HPV阳性的患者KRT19的表达量明显高于HPV阴性患者，同时在转移部位也观察到了更高的KRT19的表达。而与头颈部鳞状细胞癌相比，KRT19则作为宫颈癌的分化基因在宫颈癌的发生和进展中起着重要的作用。
目前有已经有批准上市的肿瘤靶向药物的报道，但这些药物都是针对某一种肿瘤的治疗，缺乏肿瘤治疗的通用性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肿瘤靶向抑制试剂及其制备方法和应用，可同时针对乳腺癌、宫颈癌和头颈部鳞状细胞癌三种肿瘤的基因治疗。
本发明提供了一种肿瘤靶向抑制试剂，包括含外源基因的重组载体；所述外源基因是由KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因形成的融合基因。
优选的，所述KRT19的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述具有杀伤肿瘤作用的蛋白包括毒素；所述毒素优选包括PE38KDEL。
优选的，所述毒素PE38KDEL的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选的，所述重组载体的骨架载体包括pGL3-Basic载体。
优选的，所述pGL3-Basic载体的克隆位点为NcoI和XbaI。
本发明提供了所述肿瘤靶向抑制试剂的制备方法，包括以下步骤：
1)分别对KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因进行PCR扩增，得到带有不同酶切位点的KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段；
2)将步骤1)得到的带有酶切位点的KRT19的启动子片段克隆至骨架载体上，得到含KRT19的启动子的重组载体；
3)将所述含KRT19的启动子的重组载体和带有酶切位点的具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段分别进行双酶切，连接，得到含KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段的重组载体。
本发明提供了所述肿瘤靶向抑制试剂在制备基因治疗肿瘤的药物中的应用。
优选的，所述肿瘤包括以下癌症中的一种或几种：乳腺癌、宫颈癌和人舌鳞状细胞癌。
本发明提供了一种用于靶向抗癌的药物，包括所述肿瘤靶向抑制试剂和药学上可接受的辅料。
本发明提供的肿瘤靶向抑制试剂，包括含外源基因的重组载体；所述外源基因是由KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因形成的融合基因。本发明基于KRT19基因在特定肿瘤中高表达的特性，将KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因形成融合基因片段，利用KRT19的启动子介导毒素片段PE38KDEL的高表达，从而抑制乳腺癌、宫颈癌和头颈部鳞状细胞癌相关细胞中蛋白合成、发生周期阻滞、凋亡，从而实现靶向肿瘤的基因治疗目的。
附图说明
图1为本发明涉及的两种重组质粒构建流程图；
图2为pKRT19-Luc质粒和pKRT19-PE38KDEL质粒的酶切鉴定电泳图，M:Trans2KPlus II DNA Marker；a：pKRT19-Luc质粒双酶切产物；b：pKRT19-PE38KDEL质粒双酶切产物；
图3为质粒中的KRT19启动子基因测序序列的BLAST比对结果；
图4为在不同细胞系TCA8113(人舌鳞状细胞癌)、HeLa(人宫颈癌)、MCF7(人乳腺癌)、Mia Paca-2(人胰腺导管癌)、A549(人肺癌)和L02(人正常肝脏细胞)中pKRT19-Luc质粒转染48h后KRT19启动子的表达活性；*P<0.05、**P<0.01；
图5为各组细胞中蛋白合成的抑制情况；
图6为流式细胞术检测细胞凋亡情况，其中A.L02细胞转染48h后细胞凋亡散点图；B.MiaPaca-2细胞转染48h后细胞散点图；C.MCF7细胞转染48h后细胞散点图；D.L02、MiaPaca-2、MCF7细胞用不同质粒转染48h后的各组细胞凋亡百分比；数据使用Graph PadPrism 8.0.1软件处理，并用平均值±标准差表示，n＝3，和对照组相比(**P<0.01)；
图7为流式细胞术检测细胞周期阻滞情况；
图8为用Tranwell检测pKRT19-PE38KDEL毒素质粒对癌症细胞迁移能力的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种肿瘤靶向抑制试剂，包括含外源基因的重组载体；所述外源基因是由KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因形成的融合基因。
在本发明中，所述KRT19的启动子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1(5’-GCGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCCGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGATGGAGGCTGCAGTGGGCCGAGATCACACCACTGCACTCCAGTCTGGGCGACAGAGACTCGTCTCCAAAAAAACAAAAACAAAATCACTGGGTCAGGGGTGTGTAGGAATATGACCCCAGAGGGACTGTAATTCCCAGTGGTGTCAAACTCTGGGTGATCTTAAAGGGTGAGGCTCAGAATGTGGCTTCCAGGGACAGGGGTGTCCAGGTATGTCCCTGACGGGGGAAAGGCCAGAACAGGGTCTGCAGAGAGAGAGTGGGGGAGTGCGGGTCGGAGCTTCTGCGCGGACCGGGGCGGGGCACCTCTGGAGGGCAGGGGCCTCTGGTCTCTGGGAGGGGAGGGAATTGACCAATGGGGAGAGAGCCCATATTTGCTCTCAGGAGCCTGCAAATTCCTCAGGGCTCAGATATCCGCCCCTGACACCATTCCTCCCTTCCCCCCTCCACCGGCCGCGGGCATAAAAGGCGCCAGGTGAGGGCCTCGCCGCTCCTCCCGCGAATCGCAGCTTCTGAGACCAGGGTTGCTCCGTCCGTGCTCCGCCTCGCC-3’)所示。在本发明实施例中，KRT19启动子在不同细胞系中的表达活性的测定结果表明，与人正常肝脏细胞相比，KRT19启动子在不同细胞系中的表达活性的测定结果表明，与人正常肝脏细胞相比，人舌鳞状细胞癌细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、人胰腺导管癌细胞和人肺癌细胞中KRT19启动子转染48h后KRT19启动子的表达活性呈显著性差异，并且表达活性按上述顺序依次降低。
本发明对所述具有杀伤肿瘤作用的蛋白的种类没有特殊限制，采用本领域公知的具有直接杀伤肿瘤作用的蛋白或可以使无毒性的前体药物转化为细胞毒性代谢产物的酶类即可，例如细菌类毒素、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、P53等。所述细菌毒素优选包括PE38KDEL、白喉毒素(DT)或链球菌溶血素(streptolysin O)等。在本发明实施例中，为了举例说明所述KRT19启动子能够介导毒素表达，从而抑制乳腺癌细胞蛋白合成、发生周期阻滞、凋亡，本发明以毒素PE38KDEL为例加以说明，但这并不能理解为对发明保护范围的限制。所述毒素PE38KDEL的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2(5’-CCGGAAGGTGGCTCCCTGGCAGCTCTGACCGCACATCAGGCATGCCACCTGCCGCTGGAAACCTTCACGCGTCATCGTCAGCCGCGCGGCTGGGAACAGCTGGAACAATGTGGTTATCCGGTTCAGCGCCTGGTCGCCCTGTACCTGGCAGCACGTCTGAGCTGGAACCAGGTCGATCAAGTGATTCGTAATGCACTGGCATCACCGGGTTCGGGTGGCGACCTGGGTGAAGCAATCCGCGAACAGCCGGAACAAGCTCGTCTGGCACTGACCCTGGCAGCTGCAGAAAGTGAACGCTTTGTGCGTCAGGGTACGGGTAACGATGAAGCAGGTGCAGCAAATGGTCCGGCAGATTCCGGTGACGCACTGCTGGAACGCAACTATCCGACCGGCGCCGAATTTCTGGGTGATGGTGGCGACGTGTCGTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAATTGGACCGTTGAACGTCTGCTGCAGGCGCATCGCCAACTGGAAGAACGTGGTTATGTTTTTGTCGGCTACCACGGTACCTTCCTGGAAGCTGCGCAGAGCATTGTGTTTGGTGGCGTTCGTGCCCGCTCTCAAGATCTGGACGCAATTTGGCGCGGCTTCTATATCGCAGGTGATCCGGCTCTGGCGTATGGCTACGCTCAGGATCAAGAACCGGACGCGCGTGGCCGTATCCGTAACGGTGCACTGCTGCGTGTGTATGTTCCGCGTTCCTCACTGCCGGGTTTTTACCGTACCTCTCTGACGCTGGCAGCACCGGAAGCTGCAGGCGAAGTGGAACGCCTGATTGGTCACCCGCTGCCGCTGCGTCTGGATGCAATCACCGGTCCGGAAGAAGAAGGCGGCCGTCTGGAAACGATTCTGGGTTGGCCGCTGGCTGAACGTACCGTGGTTATTCCGAGCGCGATCCCGACGGATCCGCGCAATGTTGGTGGCGATCTGGACCCGTCGAGCATTCCGGATAAAGAACAGGCCATCTCAGCACTGCCGGACTATGCGTCGCAACCGGGTAAACCGCCGAAGGACGAGCTGTAA-3’)所示。
本发明对所述重组载体的骨架载体没有特殊限制，采用本领域所熟知的真核表达载体即可。为了举例说明所述重组载体的靶向肿瘤抑制作用，本发明实施例中以pGL3-Basic载体为例加以说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制。所述pGL3-Basic载体的克隆位点优选为NcoI和XbaI。
本发明提供了所述肿瘤靶向抑制试剂的制备方法，包括以下步骤：
1)分别对KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因进行PCR扩增，得到带有不同酶切位点的KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段；
2)将步骤1)得到的带有酶切位点的KRT19的启动子片段克隆至骨架载体上，得到含KRT19的启动子的重组载体；
3)将所述含KRT19的启动子的重组载体和带有酶切位点的具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段分别进行双酶切，得到含KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段的重组载体。
本发明分别对KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因进行PCR扩增，得到带有不同酶切位点的KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段。
在本发明中，KRT19的启动子的PCR扩增方法优选采用巢式PCR法进行。所述巢式PCR法包括两对引物，分别为Sense KRT19-Primer1(5’﹣GCGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCC﹣3’，SEQ ID NO:3)和Anti-sense KRT19-Primer2(5’﹣AGTCGCGGATCTTCACCTCTAGCTC﹣3’，SEQ IDNO:4)引物对和Sense KRT19-Primer3(5’﹣gtaccgagctcttacgcgtgctagcGCGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCC﹣3’，SEQ ID NO:5)和Anti-sense KRT19-Primer4(5’﹣ctttatgtttttggcgtcttccatGGCGAGGCGGAGCACGGACG﹣3’，SEQ ID NO:6)引物对。其中Sense KRT19-Primer3和Anti-sense KRT19-Primer4中分别被引入NheI酶切位点及NcoI酶切位点，同时5’端分别加入相应的保护碱基。所述巢式PCR的扩增程序优选如下：95℃预变性5min；40个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s；72℃最后延伸5min。
在本发明中，所述具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因的PCR扩增引物包括Sense:CATGCCATGGCACCGGAAGGTGGCTCCC(SEQ ID NO:7)；Anti-sense：CTAGTCTAGATTACAGCTCGTCCTTCGGCGGTTTACCCGGTTG(SEQ ID NO:8)。所述引物分别引入NcoI和XbaI酶切位点，同时5’端分别加入相应的保护碱基。述PCR扩增的反应程序优选如下：95℃预变性5min；40个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s，40个循环；72℃最后延伸5min。
在本发明中，所述PCR扩增后，优选将PCR扩增产物进行纯化。本发明对所述纯化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的纯化方案即可，例如采用纯化试剂盒进行纯化。
得到带有酶切位点的KRT19的启动子片段后，本发明将步骤1)得到的带有酶切位点的KRT19的启动子片段克隆至骨架载体上，得到含KRT19的启动子的重组载体。
在本发明中，所述克隆的方法优选双酶切和连接。所述双酶切用酶包括NheI酶和NcoI酶。本发明对所述双酶切的条件不做特殊限制，采用本领域所熟知的双酶切的方法即可。所述连接优选采用T4连接酶。本发明对所述连接的条件不做特殊限制，采用本领域所熟知的连接的方法即可。所得连接产物优选进行验证。所述验证包括双酶切鉴定和测序鉴定。经双酶切鉴定和测序鉴定确定成功构建了含KRT19的启动子的重组载体。
得到含KRT19的启动子的重组载体后，本发明将所述含KRT19的启动子的重组载体和带有酶切位点的具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段分别进行双酶切和连接，得到含KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段的重组载体。
在本发明中，所述双酶切优选利用NcoI和XbaI进行双酶切。所述连接用酶优选为T4 DNA连接酶。本发明对所述双酶切和连接的条件不做特殊限制，采用本领域所熟知的双酶切和连接条件即可。所得连接产物转化大肠杆菌感受态，经培养，质粒提取，PCR扩增，得到带有目标片段的质粒为本发明保护的重组载体。
所述重组载体能在肿瘤细胞中上调表达，通过KRT19的启动子介导毒素等对肿瘤有杀伤作用的蛋白高效表达从而抑制肿瘤细胞中总蛋白含量、促进肿瘤细胞凋亡和使细胞周期停滞以及抑制肿瘤细胞转移。因此，所述重组载体作为新型药物用于肿瘤的基因治疗中。
本发明提供了所述肿瘤靶向抑制试剂在制备基因治疗肿瘤的药物中的应用。
在本发明中，所述肿瘤优选包括以下癌症中的一种或几种：乳腺癌、宫颈癌和人舌鳞状细胞癌。KRT19启动子在不同细胞系中的表达活性的测定结果表明，与人正常肝脏细胞相比，KRT19启动子在不同细胞系中的表达活性的测定结果表明，与人正常肝脏细胞相比，人舌鳞状细胞癌细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、人胰腺导管癌细胞和人肺癌细胞中KRT19启动子转染48h后KRT19启动子的表达活性呈显著性差异，并且人舌鳞状细胞癌细胞、中表达活性最高，人宫颈癌细胞其次，人乳腺癌细胞次之。本发明实施例以人乳腺癌细胞为例说明，通过KRT19的启动子介导毒素等对肿瘤有杀伤作用的蛋白高效表达从而抑制肿瘤细胞中总蛋白含量、促进肿瘤细胞凋亡和使细胞周期停滞以及抑制肿瘤细胞转移。
本发明提供了一种用于靶向抗癌的药物，包括所述肿瘤靶向抑制试剂和药学上可接受的辅料。
本发明对所述药物的剂型不做特殊限制，采用本领域所熟知的基因治疗，例如注射剂。本发明对所述药物的辅料不做特殊限制，采用本领域所熟知的辅料即可。本发明对所述药物的制备方法不做特殊限制，采用本领域所熟知的药物的制备方法即可。本发明对所述药物的用法及用量也没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因递送方法及用量即可。
在本发明中的实施例中，利用的是阳离子聚合物PEI25K(分支状PEI，其分子量为25kDa)进行递送的，其中重组载体DNA与PEI的质量比为1:1.33，六孔板每孔DNA用量为2μg。即将2μg(每孔的用量)与2.7μg的PEI进行混合并孵育，形成DNA与PEI的复合物(在具体的实施过程中包含了分别将DNA及PEI利用无血清培养基进行稀释的过程，并在稀释后分别平衡5min，之后进行二者的混合及再次孵育，这一步之后便形成了二者的复合物)，然后加入细胞进行转染(此时细胞培养基需为无血清培养基，目的是避免血清对转染效率的影响)。需要注意的是：目前基因递送的方法包括病毒转染和非病毒转染。本发明实施例中所构建的质粒为非病毒质粒，因此只能应用非病毒转染的方法(若将KRT19启动子及PE38KDEL毒素克隆到病毒载体便可以用病毒转染的方法)。对于非病毒转染，目前可以应用的转染试剂种类繁多，具体转染的方法和用量可以根据转染试剂的要求，只需实现对细胞的高效转染同时尽量减少转染过程中的毒性既可以。此外，由KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因形成的融合基因还可以克隆至病毒载体中，通过病毒转染导入肿瘤细胞中。本发明对病毒转染过程中需要的用量及方法不做特殊限制，采用本领域所熟知的病毒载体构建方法和用量即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种肿瘤靶向抑制试剂及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
pKRT19-PE38KDEL重组质粒的构建
pKRT19-Luc质粒和pKRT19-PE38KDEL质粒构建的主要流程如图1所示。
1.TCA8113细胞基因组的提取
利用OMEGA的组织DNA提取试剂盒(产品编号：D3396-01)提取TCA8113细胞的基因组DNA，具体步骤如下：
(1)吸去原有的培养基，用3mLPBS溶液冲洗2次，加入2mL胰蛋白酶使其完全浸润细胞后弃掉胰酶，消化大约2min 30s，每个培养皿中加入2mL 4℃预冷的PBS溶液，清洗细胞2次，再将细胞重悬于200μL PBS溶液中，转移至1.5mL EP管内；
(2)加入25μL OB蛋白酶溶液，涡旋混匀；
(3)加入220μLBL缓冲液；
(4)在70℃下孵化10分钟，孵化期间轻轻震荡管身一次；
(5)加入220μL 100％的乙醇(根据需要调整乙醇的体积)，涡旋混匀；
(6)将一个
Figure BDA0003270217390000071
DNAMini Column插入到2mL的收集管中；
(7)将步骤(5)中的全部样品加入到转移到柱子中，10000×g离心1min；
(8)弃去滤液，保留收集管，加入500μL的混有异丙醇的HBC缓冲液，10000×g离心30s；
(9)弃去滤液，保留收集管，加入700μL混有乙醇的DNA清洗缓冲液，10000×g离心30s；
(10)弃去滤液，保留收集管；
(11)重复步骤(9)-(10)，进行第二次清洗，10000×g离心2min以除去柱子上残留的乙醇；
(12)将柱子插入到一个无核酸酶的1.5mL微离心管中；
(13)加入100～200μL预热到70℃的洗脱缓冲液，在室温下放置2分钟，10000×g离心1min；
(14)将收集到的洗脱液重新加入到柱子中，进行第二次洗脱；
(15)在﹣20℃条件下储存所得的DNA。
2.KRT 19引物的设计
利用Ensembl数据库(http://grch37.ensembl.org/index.html)获取KRT19的基因序列并通过EPD数据库(The Eukaryotic Promoter Database：https://epd.epfl.ch//index.php)确定KRT19基因的转录起始位点(TSS)。截取TSS上游547bp以及下游的61bp作为KRT19的启动子序列。利用Primer Premier 5.0设计克隆启动子所需的引物。为了便于克隆所需的KRT19启动子片段，本研究采用巢式PCR的办法进行克隆。所的引物如下所示：
第一对：
Sense KRT19-Primer1：
5’﹣GCGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCC﹣3’(SEQ ID NO:3)；
Anti-sense KRT19-Primer2：
5’﹣AGTCGCGGATCTTCACCTCTAGCTC﹣3’(SEQ ID NO:4)；
第二对：
Sense KRT19-Primer3:
5’﹣gtaccgagctcttacgcgtgctagcGCGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCC﹣3’(SEQ ID NO:5)；
Anti-sense KRT19-Primer4:
5’﹣ctttatgtttttggcgtcttccatGGCGAGGCGGAGCACGGACG﹣3’(SEQ ID NO:6)；
其中Sense KRT19-Primer3和Anti-sense KRT19-Primer4中分别被引入NheI酶切位点及NcoI酶切位点，同时5’端分别加入相应的保护碱基。
3.PCR扩增KRT19启动子片段
利用
Figure BDA0003270217390000081
FastPfu DNAPolymerase(北京全式金生物技术有限公司，产品目录号：AP221-01)将所提取基因组中的目标片段用PCR进行扩增，具体反应体系如表1所示。
表1 KRT19基因PCR扩增反应体系
Figure BDA0003270217390000082
Figure BDA0003270217390000091
(1)PCR扩增程序：95℃预变性5min；40个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s；72℃最后延伸5min；
(2)将所得的PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化；
(3)以(2)所得产物为模板，按照表2反应体系配制反应液，并按照95℃预变性5min；40个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s；72℃最后延伸5min的程序进行再次扩增。
表2 KRT19基因第二次PCR扩增反应体系
Figure BDA0003270217390000092
(4)将得到的第二次PCR产物取利用琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化。
4.PCR扩增PE38KDEL毒素基因片段
以实验室现有的包含PE38毒素基因的质粒为模板，利用引物：Sense:CATGCCATGGCACCGGAAGGTGGCTCCC(SEQ ID NO:7)；Anti-sense：CTAGTCTAGATTACAGCTCGTCCTTCGGCGGTTTACCCGGTTG(SEQ ID NO:8)扩增PE38KDEL毒素基因片段。Sense中引入NcoI酶切位点，Anti-sense中引入XbaI酶切位点，同时5’端分别加入相应的保护碱基。具体反应体系如下：
表3 PE38KDEL基因PCR扩增反应体系
Figure BDA0003270217390000093
Figure BDA0003270217390000101
PCR扩增程序：95℃预变性5min；40个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s，40个循环；72℃最后延伸5min。扩增完成后，利用琼脂糖凝胶电泳对所得目的基因进行分离纯化。
5.琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物
(1)在PCR的产物中加入适量的6×DNA Loading Buffer(北京全式金生物技术有限公司，产品目录号：GH101-01)，用移液枪吹打混匀；
(5)琼脂糖凝固后，拔出样梳，将胶板置于电泳槽中，加入1×TAE Buffer使之刚好超出胶面1mm；
(6)在上样孔中加入Trans2Kplus II DNAMarker(全式金，产品目录号：BM121-01)和PCR产物；
(7)连接电源，调整参数为120V、300mA、45min，开始电泳；
(8)电泳结束后，利用紫外可见透射反射仪上观察结果并切下目标条带。
(9)用刀片小心地切下目标DNA片段，尽量减小凝胶快的大小，去除多余的琼脂糖；
(10)将切下的凝胶块置于1.5mL EP管中，用电子天平上称重以确定凝胶块的体积。(设定凝胶密度为1g/mL)，之后利用OMEGA凝胶回收试剂盒回收DNA产物(货号：D2500)
(11)在EP管中加入与凝胶块同等体积的binding Buffer(XP2)；
(12)在50～60℃孵育，每2～3分钟将EP管取出轻微震荡直至凝胶完全融化；
(13)将一个
Figure BDA0003270217390000102
DNA Mini Column插入到一个2mL的收集管中；
(14)将EP管中的DNA溶液加入到柱子中，所加的量不得超过700μL；
(15)室温下10000×g离心1min，去除滤液，保留收集管；
(16)重复步骤(6)～(8)使全部样品都转移到柱子上；
(17)在柱子上加入300μLBinding Buffer(XP2)，室温下13000×g离心1min；
(18)去除滤液，保留收集管，在柱子中加入700μL用乙醇稀释过的SPWWash Buffer
(19)室温下10000×g离心1min，取出滤液，保留收集管；
(20)重复步骤(13)～(15)进行第二次清洗，将柱子上残留的盐尽量除尽；
(21)室温下将柱子在10000×g离心2min，使其干燥；
(22)将柱子插入到一个干净的1.5mL微离心管中；
(23)在柱子表面加入15～30μL洗脱缓冲液或pH在8.5左右的去离子水；
(24)室温下放置2min后室温10000×g离心1min；
(25)将滤液重新加入到柱子表面；室温下放置2min，室温10000×g离心1min。
(26)将滤液置于﹣20℃的冰箱中储存。
6.pKRT19-Luc质粒的构建
(1)将上述回收所得的KRT19启动子片段以及pGL3-Basic载体(Promega)分别用Nhe I限制性内切酶(NEB，货号：R0131V)和Nco I﹣HF限制性内切酶(NEB，货号：R3193V)进行酶切处理。表4和表5为反应体系。
表4 KRT19基因双酶切体系
Figure BDA0003270217390000111
表5 pGL3-Basic质粒双酶切体系
Figure BDA0003270217390000112
将上述反应物混合均匀，37℃条件下反应4h。
(2)酶切产物的回收
将酶切后的DNA片段按照上述5中方法进行回收(将其中PCR产物替换为酶切DNA产物)并利用NanoDrop(Thermo)测定浓度，﹣20℃保存，备用。
(3)将KRT19基因片段和上述pGL3-Basic酶切片段利用T4 DNA Ligase(北京全式金生物技术有限公司，货号：FL101-01)进行连接即得pKRT19-Luc质粒，具体反应体系如下(10μL体系)。
表6酶切片段连接体系
Figure BDA0003270217390000121
将反应体系在25℃水浴连接1h。即得pKRT19-Luc质粒
7.pKRT19-PE38KDEL质粒的构建
(1)将回收的PE38KDEL基因片段和pKRT19-Luc质粒分别利用NcoI和XbaI(NEB，货号：R0145V)进行双酶切，反应体系如下：
表7 PE38KDEL片段和pKRT19-Luc质粒双酶切体系
Figure BDA0003270217390000122
(2)按照6中(2)所述方法进行双酶切片段的回收及浓度检测和保存；
(3)将PE38KDEL和pKRT19-Luc质粒的双酶切片段在如下体系中进行连接：
表8酶切片段连接体系
Figure BDA0003270217390000123
将反应体系在25℃水浴连接1h。即得pKRT19-PE38KDEL质粒。
8.大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化
(1)取100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，产品目录号：CD201-01)，常温放置使其完全溶解后置于冰盒上；
(2)加入10μL连接好的质粒片段轻轻混匀，冰上放置30min；
(3)42℃热激90s后，冰上放置2min；
(4)加入400μL的LB液体培养基，37℃，120rpm振荡培养1h；
(5)将振荡培养物(100μL感受态大肠杆菌，10μL连接液，400μL LB培养基)在室温下4000g离心5min，吸掉400μL上清液，用剩余液体将细胞悬浮；
(6)将(5)的所得菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基中，37℃倒置培养12～16h后挑取单克隆。
9.从培养的大肠杆菌中提取质粒
挑取上述所得的单克隆菌落,用含有氨苄青霉素的LB液体培养基在37℃中培养12h。用OMEGA质粒小量提取试剂盒(产品编号：D6950-02)提取质粒，具体操作按说明书进行：
(1)将菌液在10000×g下离心1min，弃上清；
(2)加入250μL含有RNaseA的Solution I，震荡或移液枪轻轻吹打，使菌体充分重悬；
(3)加入250μL Solution II，温和颠倒混匀数次直到菌液变得澄清，然后室温静置2﹣3min；
(4)加入350μL Solution III，立即温和颠倒混匀数次直到白色沉淀不再增加，然后13,000×g离心10min；
(5)将
Figure BDA0003270217390000131
DNA Mini Column装在收集管中，加入100μL 3MNaOH，13,000×g离心60s，弃滤液；
(6)将(4)中所得上清小心加到柱子中，同时避免吸入沉淀，13,000×g离心1min；
(7)弃滤液，加入500μL HBC Buffer，13,000×g离心1min；
(8)弃滤液，加入700μL DNAWashing Buffer，13,000×g离心1min；
(9)重复步骤(8)一次。
(10)弃滤液，13,000×g离心2min，以尽可能地除尽吸附柱上残留的液体；
(11)将柱子装在新的1.5mL EP管中，加入100μL 70℃预热的Eluttion Buffer，室温静置1min，13,000×g离心1min，收集滤液；
(12)将所得pKRT19-Luc质粒和pKRT19-PE38KDEL质粒利用Nano Drop测定浓度后，保存于﹣20℃中，备用。
10.质粒的酶切鉴定
将提取出的质粒分别用Nhe I限制性内切酶和Xba I限制性内切酶进行酶切处理。表9为具体反应体系。
表9质粒酶切鉴定反应体系
Figure BDA0003270217390000141
将上述反应物混合均匀，37℃条件下反应4h，得到酶切DNA片段。将酶切产物于120V、300mA条件下用1％琼脂糖凝胶电泳45min，用紫外透射仪观察并对酶切产物进行鉴定。
pKRT19-Luc质粒和pKRT19-PE38KDEL质粒的酶切鉴定电泳图见图2。由图2可知，pKRT19-Luc质粒和pKRT19-PE38KDEL质粒酶切获得目标片段的酶切产物。
11.质粒的测序鉴定
将提取的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序的结果通过NCBI Blast进行比对，分析所提取pKRT19-Luc质粒和pKRT19-PE38KDEL毒素质粒中连接的KRT19启动子的基因序列是否正确。
质粒中的KRT19启动子基因测序序列的BLAST比对结果见图3。结果表明，本发明成功构建含KRT19启动子的pKRT19-PE38KDEL毒素重组载体。
实施例2
探究KRT19启动子在不同细胞系中的表达活性
1.细胞转染
(1)细胞铺板：转染前一天，在6孔板中每孔加入密度约为2.0×105的细胞培养12～16h使转染时细胞汇合度尽可能达到60％～80％；
(2)在100μL无血清培养基中加入2μg实施例1制备的DNA质粒(pKRT19-Luc质粒)，轻轻混匀，静置孵育5min；
(3)在100μL无血清培养基中加入2.7μL PEI溶液(1μg/μL，DNA质粒与PEI的质量比约为1:1.33，PEI为PEI25K(分支状PEI，其分子量为25kDa)，轻轻混匀，室温静置5min；
(4)将稀释后的PEI溶液缓缓加入质粒溶液中，并边加变轻轻混匀，然后37℃孵育30min；
(5)将铺好的细胞板取出，用1mL PBS将各孔中的细胞清洗一次；
(6)将200μL(4)中所得PEI与质粒形成的复合物缓慢均匀加入到相应的实验组中，用无血清培养基补至2mL，轻轻混匀，37℃、5％CO2浓度条件下孵育4h；
(7)将孵育了4h的细胞培养液更换为含10％FBS的DMEM培养基，继续在37℃、5％CO2浓度条件下培养48h后检测启动子的表达活性。
2.KRT19启动子在不同细胞系中的表达活性的测定
对所选细胞系进行铺板并转染，在37℃、5％CO2浓度条件下孵育48h。
(1)在孵育了48h的6孔板中各加入500μL 1×GIo Lysis Buffer(Promega，货号：E2661)，充分裂解细胞，将裂解液从六孔板转移到1.5mL EP管中并于12,000×g离心5min；
(2)在酶标板中加入100μL细胞上清液以及100μL荧光素酶底物(Promega，货号：E6110)，充分混匀后利用多功能酶标仪中检测荧光素酶活性，根据荧光素酶的活性评估KRT19启动子在不同细胞中的转录活性。
在不同细胞系TCA8113(人舌鳞状细胞癌)、HeLa(人宫颈癌)、MCF7(人乳腺癌)、MiaPaca-2(人胰腺导管癌)、A549(人肺癌)和L02(人正常肝脏细胞)中pKRT19-Luc质粒转染48h后KRT19启动子的表达活性结果见图4。与人正常肝脏细胞相比，KRT19启动子在癌细胞中表达活性显著提高，并且人舌鳞状细胞癌表达量最高，人宫颈癌细胞表达量次之，人乳腺癌细胞表达量排第三。
实施例3
检测pKRT19-PE38KDEL毒素质粒抑制不同癌细胞系的蛋白合成情况PE38KDEL毒素可以通过催化细胞翻译延长因子eEF-2失活，从而导致细胞蛋白合成受阻并诱导细胞凋亡。因此，本实施例利用可以恒定在不同细胞中高表达萤火虫荧光素酶的pGL3-Control质粒(Promega，在该质粒中，萤火虫荧光素酶的表达受到猴空泡病毒40-SV40启动子的控制)分别与不同浓度(0、0.025μg、0.05μg、0.1μg)的pKRT19-PE38KDEL质粒对细胞进行共转染，通过测定pKRT19-PE38KDEL对细胞荧光素酶合成的抑制，间接反应毒素质粒对细胞蛋白合成的抑制作用。具体转染步骤如实施例2所述。转染后的细胞在37℃、5％CO2浓度条件下孵育48h后，按照实施例2中方法检测荧光素酶活性。
各组细胞中蛋白合成的抑制情况结果见图5。如图5所示，pKRT19-PE38KDEL质粒的加入使MCF7的荧光素酶表达量被显著降低，当毒素质粒浓度为0.025μg时，其荧光素酶合成量仅接近对照组的10％。随着浓度的增大，其荧光素酶合成量进一步被降低。与此同时，L02细胞的荧光素酶合成量则几乎未被减弱，而MiaPaca-2细胞中的荧光素酶合成量在毒素质粒浓度大于0.05μg后虽然也有一定程度的降低，但抑制程度不如MCF7明显。这一结果与KRT19启动子在不同细胞中的表达活性的强弱有着明显的正相关关系。KRT19启动子在MCF7细胞中的高表达活性使毒素基因能够在其细胞中具有较高的表达量，从而对蛋白的合成产生强烈的抑制作用。这一结果表明pKRT19-PE38KDEL能够对KRT19高表达的细胞产生特异性的细胞毒性。
实施例4
流式细胞仪检测细胞凋亡
按照2.2.10的步骤对所选细胞系进行铺板并转染，在37℃、5％CO2浓度条件下孵育48h。之后利用AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(贝博，货号：BB4101)检测细胞的凋亡情况。
(1)将6孔板每个孔中的培养基分别转移到一个4mL的EP管中；
(2)在6孔板中每孔加入1mL PBS溶液，清洗后，将PBS溶液加入上述相应的4mL EP管中；
(3)在6孔板中每孔加入1mL胰酶，轻轻摇晃使其充分浸润细胞后将其抽出，用残留的胰酶将细胞消化3min；
(4)在6孔板中每孔加入1mL(1)中EP管中的培养基，终止消化。
(5)用移液枪轻轻吹打贴壁细胞使其脱落，混匀细胞悬液并将其转移回(1)的EP管中，1500×g离心3min；
(6)吸去上清液，保留细胞沉淀；
(7)往细胞沉淀中加入300μLPBS缓冲液，将细胞重悬并转移至1.5mL EP管中，1500rpm离心3min；
(8)吸去上清液，保留细胞沉淀；
(9)在细胞沉淀中加入结合液并混匀，结合液与染料总体积为50μL，具体如下表10所示：
表10流式细胞术测细胞凋亡分组
Figure BDA0003270217390000161
(10)将细胞转移到黑暗处静置30min；
(11)取出细胞混合液，再加400μL结合液；
(12)将细胞混合液用100目尼龙网过滤后加入流式管中，避光放置；
(13)按仪器操作说明利用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。其中，凋亡率为早期凋亡细胞比例及晚期凋亡细胞比例之和。在该实施例中，同时设置Control组(细胞不做任何处理)、PEI组(细胞只利用等量的转染试剂进行处理)及pGL3-Basic组(细胞利用等量的pGL3-Basic质粒进行处理)进行对照。
流式细胞术检测细胞凋亡情况结果见图6。如图6所示，MCF7在转染pKRT19-PE38KDEL 48h后，发生了明显的凋亡现象，凋亡率为15.49％。与此同时，L02以及MiaPaca-2细胞则并未出现过多的凋亡细胞，凋亡率分别为6.12％以及8.6％。三种细胞在单独利用PEI处理或pGL3-Basic处理后并未发生明显的凋亡现象。这进一步表明pKRT19-PE38KDEl可以特异性地诱导KRT19高表达的细胞发生细胞凋亡。
实施例5
流式细胞仪检测细胞周期分布
对所选细胞系进行铺板并转染，在37℃、5％CO2浓度条件下孵育48h，之后利用细胞周期检测试剂盒(贝博，货号：BB4104)对细胞的周期分布进行检测。
(1)将6孔板每个孔中的培养基分别转移到一个4mL的EP管中；
(2)在6孔板中每孔加入1mL PBS溶液，清洗后，将PBS溶液加入上述相应的4mL EP管中；
(3)在6孔板中每孔加入1mL胰酶，轻轻摇晃使其充分浸润细胞后将其抽出，用残留的胰酶将细胞消化4min；
(4)在6孔板中每孔加入1mL(1)中EP管中的培养基，终止消化。
(5)用移液枪轻轻吹打贴壁细胞使其脱落，混匀细胞悬液并将其转移回(1)的EP管中，1500×g离心3min；
(6)吸去上清液，保留细胞沉淀；
(7)往细胞沉淀中加入300μLPBS缓冲液，将细胞重悬并转移至1.5mL EP管中，1500×g离心3min；
(8)吸去上清液，保留细胞沉淀；
(9)用100μL预冷的PBS溶液将细胞重悬后，在细胞悬液中加入300μL预冷的无水乙醇溶液中，在﹣20℃固定1h；
(10)2000rpm，离心5min，弃上清；
(11)加100μL预冷的PBS溶液以及20μL RNaseA，37℃水浴30min；
(12)加入300μLPI溶液，轻轻混匀，室温下避光孵育30～60min；
(13)按仪器操作说明利用流式细胞仪检测细胞周期分布。
流式细胞术检测细胞周期阻滞情况结果见图7。如图7所示，在转染48h后，MCF7在S期的分布(68.29％)明显比对照组(44.7％)增多，甚至出现G2/M期的消失，这表明pKRT19-PE38KDEL可以诱导MCF7发生S期阻滞。在L02以及Mi Paca-2细胞中，这种趋势则被显著的减弱。Mia Paca-2细胞虽然出现一定程度上的S期增多，但其程度并不明显，这可能与KRT19启动子在MiaPaca-2中具有相对于L02较高的表达活性所造成的，但由于在Mia Paca-2细胞中KRT19启动子的活性仍然处于较低的水平，所以并未引起明显的S期阻滞。总的来说，pKRT19-PE38KDEL的处理可以特异性地诱导KRT19高表达的细胞发生周期阻滞，同时对正常细胞则不会造成显著影响。
实施例6
Transwell实验
对所选细胞系进行铺板并转染，在37℃、5％CO2浓度条件下孵育24h。
(1)在6孔板中吸去每孔的培养基，再把每个孔用1mL PBS轻轻洗一次，清洗后吸去PBS。
(2)在6孔板中每孔加入1mL胰酶，轻轻摇晃使其充分浸润细胞后将其抽出，用残留的胰酶将细胞消化3min；
(3)在6孔板中每孔加入1mL含10％FBS的DMEM培养基终止消化，加入含1％BSA的DMEM培养基并将贴壁细胞吹打下来，按需稀释适当的倍数后用细胞计数板计数，加入到Transwell小室中，使每个小室约有4×104个细胞；
(4)将Transwell小室在37℃、5％CO2浓度条件下孵育24h。
(5)将小室取出，用棉签轻轻刮去小室聚碳酸酯膜上方的细胞，小心操作避免使膜破裂；
(6)将小室依次放入含PBS溶液的24孔板中清洗，重复操作三次；
(7)将小室放在75％的乙醇中，使细胞固定15min；
(8)将小室依次放入含PBS溶液的24孔板中以除去残留的乙醇，重复操作三次；
(9)将小室放入1％结晶紫溶液中在室温下染色15min；
(10)将小室依次放入含PBS溶液的24孔板中以除去残留的结晶紫染液，重复操作三次；
(11)将小室置于荧光显微镜下，观察比较细胞迁移的情况并采集图像。
用Tranwell检测pKRT19-PE38KDEL毒素质粒对癌症细胞迁移能力的影响结果见图8所示。如图8所示，转染pKRT19-PE38KDEL质粒后，MCF7穿过膜的数量明显减少，而Miapaca-2虽然出现少量减少，但整体穿过膜的比例仍然明显高于MCF7。由于Transwell嵌套上下层营养成分的不同，上层细胞趋向于向下迁移，因此可以根据穿过膜的细胞数量多少判断细胞迁移能力的改变。本实施例中的结果表明，pKRT19-PE38KDEL能够显著抑制KRT19高表达的细胞的迁移能力，而对KRT19低表达的细胞及正常细胞则影响较小。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种肿瘤靶向抑制试剂及其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 608
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgtgcctgt aatcccagct actccggagg ctgaggcagg agaatcgctt gaacccggga 60
gatggaggct gcagtgggcc gagatcacac cactgcactc cagtctgggc gacagagact 120
cgtctccaaa aaaacaaaaa caaaatcact gggtcagggg tgtgtaggaa tatgacccca 180
gagggactgt aattcccagt ggtgtcaaac tctgggtgat cttaaagggt gaggctcaga 240
atgtggcttc cagggacagg ggtgtccagg tatgtccctg acgggggaaa ggccagaaca 300
gggtctgcag agagagagtg ggggagtgcg ggtcggagct tctgcgcgga ccggggcggg 360
gcacctctgg agggcagggg cctctggtct ctgggagggg agggaattga ccaatgggga 420
gagagcccat atttgctctc aggagcctgc aaattcctca gggctcagat atccgcccct 480
gacaccattc ctcccttccc ccctccaccg gccgcgggca taaaaggcgc caggtgaggg 540
cctcgccgct cctcccgcga atcgcagctt ctgagaccag ggttgctccg tccgtgctcc 600
gcctcgcc 608
<210> 2
<211> 1041
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccggaaggtg gctccctggc agctctgacc gcacatcagg catgccacct gccgctggaa 60
accttcacgc gtcatcgtca gccgcgcggc tgggaacagc tggaacaatg tggttatccg 120
gttcagcgcc tggtcgccct gtacctggca gcacgtctga gctggaacca ggtcgatcaa 180
gtgattcgta atgcactggc atcaccgggt tcgggtggcg acctgggtga agcaatccgc 240
gaacagccgg aacaagctcg tctggcactg accctggcag ctgcagaaag tgaacgcttt 300
gtgcgtcagg gtacgggtaa cgatgaagca ggtgcagcaa atggtccggc agattccggt 360
gacgcactgc tggaacgcaa ctatccgacc ggcgccgaat ttctgggtga tggtggcgac 420
gtgtcgttca gcacccgcgg cacgcagaat tggaccgttg aacgtctgct gcaggcgcat 480
cgccaactgg aagaacgtgg ttatgttttt gtcggctacc acggtacctt cctggaagct 540
gcgcagagca ttgtgtttgg tggcgttcgt gcccgctctc aagatctgga cgcaatttgg 600
cgcggcttct atatcgcagg tgatccggct ctggcgtatg gctacgctca ggatcaagaa 660
ccggacgcgc gtggccgtat ccgtaacggt gcactgctgc gtgtgtatgt tccgcgttcc 720
tcactgccgg gtttttaccg tacctctctg acgctggcag caccggaagc tgcaggcgaa 780
gtggaacgcc tgattggtca cccgctgccg ctgcgtctgg atgcaatcac cggtccggaa 840
gaagaaggcg gccgtctgga aacgattctg ggttggccgc tggctgaacg taccgtggtt 900
attccgagcg cgatcccgac ggatccgcgc aatgttggtg gcgatctgga cccgtcgagc 960
attccggata aagaacaggc catctcagca ctgccggact atgcgtcgca accgggtaaa 1020
ccgccgaagg acgagctgta a 1041
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgtgcctgt aatcccagct actcc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtcgcggat cttcacctct agctc 25
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtaccgagct cttacgcgtg ctagcgcgtg cctgtaatcc cagctactcc 50
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctttatgttt ttggcgtctt ccatggcgag gcggagcacg gacg 44
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catgccatgg caccggaagg tggctccc 28
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctagtctaga ttacagctcg tccttcggcg gtttacccgg ttg 43

Claims (10)

1.一种肿瘤靶向抑制试剂，其特征在于，包括含外源基因的重组载体；所述外源基因是由KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因形成的融合基因。
2.根据权利要求1所述肿瘤靶向抑制试剂，其特征在于，所述KRT19的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述肿瘤靶向抑制试剂，其特征在于，所述具有杀伤肿瘤作用的蛋白包括毒素；
优选的，所述毒素包括PE38KDEL。
4.根据权利要求3所述肿瘤靶向抑制试剂，其特征在于，所述毒素PE38KDEL的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求1所述肿瘤靶向抑制试剂，其特征在于，所述重组载体的骨架载体包括pGL3-Basic载体。
6.根据权利要求5所述肿瘤靶向抑制试剂，其特征在于，所述pGL3-Basic载体的克隆位点为NcoI和XbaI。
7.权利要求1～6任意一项所述肿瘤靶向抑制试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分别对KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因进行PCR扩增，得到带有不同酶切位点的KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段；
2)将步骤1)得到的带有酶切位点的KRT19的启动子片段克隆至骨架载体上，得到含KRT19的启动子的重组载体；
3)将所述含KRT19的启动子的重组载体和带有酶切位点的具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段分别进行双酶切，连接，得到含KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段的重组载体。
8.权利要求1～7任意一项所述肿瘤靶向抑制试剂在制备基因治疗肿瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述肿瘤包括以下癌症中的一种或几种：乳腺癌、宫颈癌和人舌鳞状细胞癌。
10.一种用于靶向抗癌的药物，其特征在于，包括权利要求1～7任意一项所述肿瘤靶向抑制试剂和药学上可接受的辅料。
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