CN111647574A - 苦荞来源的鼠李糖基转移酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了苦荞来源的鼠李糖基转移酶及其编码基因和应用。本发明通过差异RNA‑Seq筛选从苦荞中获得了鼠李糖基转移酶及其编码基因(FtRT1基因)。GUS染色结果发现，本发明所获得的FtRT1基因启动子具有启动子的活性，能够启动GUS报告基因的表达，且其表达受MeJA的诱导。本发明进一步构建农杆菌介导的苦荞毛状根遗传转化体系，FtRT1转基因毛状根总黄酮含量的测定结果表明，过表达苦荞株系中黄酮含量明显比对照组要高，证明FtRT1基因参与调控黄酮类物质的合成。本发明为生产具有重要临床需要的苦荞次生黄酮类物质提供了一种新的途径或方法。

Description

苦荞来源的鼠李糖基转移酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及鼠李糖基转移酶及其编码基因，尤其涉及从苦荞中分离得到的鼠李糖基转移酶及其编码基因，本发明进一步涉及它们在调控荞麦中黄酮类物质的合成中的应用，属于苦荞鼠李糖基转移酶及其编码基因和应用领域。

背景技术

现代临床医学观察表明苦荞制品具有降血糖、降血脂、冠心病、抗癌、抗衰老等药用疗效，这些生物活性与苦荞中生物类黄酮抗氧化能力密切相关。作为一类常见的植物次生代谢物质，黄酮类化合物目前在自然界已发现约8000多种，主要包括查尔酮、黄酮、黄烷醇、原花青素、异黄酮和花青素六类。苦荞作为唯一一种富含生物活性黄酮的谷类作物，其广泛地应用于医疗制品和食品行业中。

苦荞中生物黄酮类物质芦丁含量极高且远高于甜荞。但是，目前在苦荞中各黄酮类化合物的代谢机理尚不清晰，尤其是关于芦丁、槲皮素和其他物质之间的糖基化反应仍属空白。迄今为止，还没有关于荞麦糖基转移酶基因克隆及其功能应用的报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种苦荞来源的鼠李糖基转移酶及其编码基因；

本发明所要解决的第二个技术问题将所述苦荞来源的鼠李糖基转移酶或编码基因应用于调控苦荞中黄酮类物质的合成。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种苦荞来源的鼠李糖基转移酶，其氨基酸序列为SEQ IDNo.1所示。

本发明分别以川荞1号的cDNA和DNA为模板，克隆得到FtRT1基因的CDS序列和启动子序列；该基因的CDS长度为1401bp，编码蛋白分子量51.84KDa的466个氨基酸，所编码蛋白的等电点(pI)为6.5。

本发明进一步公开了所述苦荞来源的鼠李糖基转移酶的编码基因，其多核苷酸序列为(a)或(b)或(c)所示：

(a)、SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID No.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有鼠李糖基转移酶的功能或活性；或

(c)、与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有鼠李糖基转移酶的功能或活性；优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有鼠李糖基转移酶的功能或活性；更优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有鼠李糖基转移酶的功能或活性。

本发明还提供了所述鼠李糖基转移酶的编码基因的启动子，其多核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

本发明还公开了含有所述鼠李糖基转移酶的编码基因的重组载体。所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

本发明还公开了含有所述鼠李糖基转移酶编码基因的重组宿主细胞或重组菌；其中，所述重组菌包括但不限于重组大肠杆菌。

为进一步研究FtRT1基因在苦荞中的功能，本发明对苦荞不同时期的不同组织中FtRT1基因表达进行分析，qRT-PCR分析结果发现，FtRT1基因表达表现明显的组织差异和一定的生长发育时间差异。FtRT1基因在苦荞的各个组织中均有表达，且在茎中的表达量最高，约是根中的表达量的70倍；在叶、花、不成熟的种子和成熟的种子中的表达量也高；但在根中表达量最低。

本发明进一步对FtRT1基因的启动子进行分析，发现其启动子上有响应外源激素MeJA和ABA的作用元件，为了探索外源激素MeJA和ABA激素是否影响FtRT1基因的表达，本发明利用qRT-PCR技术分析了用50μM MeJA(茉莉酸甲酯)处理七天的无菌苗，分析探索了FtRT1基因在茉莉酸(MeJA)胁迫处理下表达模式；结果发现FtRT1基因的表达量与转录组数据基本一致，随着MeJA处理时间的增加而逐渐增高，且在4h达到最高，随后下降；通过GUS染色试验结果发现，FtRT1基因启动子具有启动子的活性，能够启动GUS报告基因的表达，且其表达受MeJA的诱导。

本发明进一步通过发根农杆菌侵染法得到五株转基因毛状根，选取长势较为一致的三个株系开展后续试验。提取部分转基因毛状根进行室温摇瓶30d，随后进行转基因毛状根总黄酮的检测。FtRT1转基因毛状根总黄酮含量的测定结果表明，过表达株系中黄酮含量明显比对照组要高，证明FtRT1参与调控黄酮类物质的合成。

因此，本发明所分离的FtRT1基因能够应用于调控植物中黄酮类物质的合成，譬如将本发明FtRT1基因可操作的与植物表达载体连接构建得到重组植物表达载体，将所构建的重组植物表达载体转化到荞麦中得到过表达植物，所得到的转基因荞麦的器官或组织中的黄酮类物质的含量显著提升。

在本发明中，可以采用任何植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体引入到目标植物的细胞、组织或器官中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等。

将本发明的SEQ ID No.2所示的基因与其他基因相嵌合或连接得到的嵌合基因或表达盒均属于本发明的保护范畴；含有所述的嵌合基因或表达盒的重组表达载体同样也属于本发明的保护范围之内。

通过本发明所披露的方法获得的转基因植物细胞和植物也可以进一步用于后续的转化程序中，例如用来引入其它的嵌合基因。

本发明通过差异RNA-Seq筛选获得了一个重要的FtRT1基因，进一步对芦丁生物合成过程中所涉及的糖基化酶的功能进行了初步探究，为深入研究鼠李糖基转移酶调控黄酮类化合物代谢机制奠定了理论基础。本发明进一步通过构建农杆菌介导的苦荞毛状根遗传转化体系，转FtRT1基因提高了荞麦毛状根黄酮含量，进而在短时间内可以获得大量的苦荞黄酮，显著提高苦荞毛状根中总黄酮有效成分含量；本发明为生产具有重要临床需要的苦荞次生黄酮提供了一种新型的优质药源，生产芦丁等生物黄酮类物质的成本低；生产过程高效、绿色、安全、无环境污染。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“同源性”，指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地85％或更高，更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。

术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。

术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“可操作地连接”指两个或更多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区可以相对于编码感兴趣表达产物的核酸序列如此安置，从而所述核酸序列的转录由该启动子区指导。因此，启动子区“与该核酸序列可操作地连接”。

术语“转化”在此指的是用于将异源DNA引入到植物细胞、植物组织、或植物中的过程。转化植物细胞、植物组织、或植物被理解为不仅包括转化过程的终末产物，也包括其子代。

术语“转化”、“转基因”、和“重组体”在此指的是其中已经被引入异源核酸分子的宿主细胞或生物体例如细菌或植物细胞(例如植物)。核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者核酸分子也可以以染色体外分子的形式存在。这样一种染色体外分子可以是自我复制的。转化细胞、组织或植物被理解为不仅包括转化过程的终末产物，还包括其转基因子代。“未转化”、“未转基因”、或“未重组的”宿主指的是野生型生物体例如细菌或植物，它不包含异源核酸分子。

术语“启动子”指下述的任何核酸序列(如DNA序列)：这种序列在转录起始期间被DNA依赖性RNA聚合酶识别并(直接或间接)结合，导致生成与转录的DNA互补的RNA分子；这种区域也可以称作“5'调节区”。启动子通常位于在待转录的编码序列前方存在的5'非翻译区(UTR)的上游并且具有多个区域，这些区域充当RNA聚合酶II和其他蛋白质如转录因子的结合位点以引发可操作地连接的基因的转录。启动子本身可以含有调节可操作地连接的基因的转录的子元件(即启动子基序)如顺式元件或增强子结构域。该启动子和连接的5'UTR也称作“启动子区”。

附图说明

图1 FtRT1 CDS和启动子的克隆的电泳结果；A:FtRT1 CDS扩增产物(2000DNAmarker)；B:FtRT1启动子的扩增产物(2000DNA marker)。

图2 FtRT1与其他植物GTs蛋白序列多重比对结果。

图3 FtRT1基因的组织特异性表达；FtH3作为内参基因，每组数据代表三次重复实验的平均值±SD；星号表示t检验有显著性差异(*P<0.05)。

图4 MeJA诱导下FtRT1基因的表达情况。

图5 pCAMBIA3301载体图谱。

图6转基因根系的鉴定以及GUS染色结果；

A:pCAMBIA3301:FtRT1pro::GUS转基因毛状根鉴定图(DL2000 DNA marker)，1：pCAMBIA3301:FtRT1pro::GUS质粒；2-4：转A4根系DNA；5-7:转pCAMBIA3301-35S::GUS根系DNA；

8-11：转pCAMBIA3301:FtRT1pro::GUS根系DNA；

B:MeJA处理pCAMBIA3301:FtRT1::GUS毛状根的GUS染色情况。

图7苦荞毛状根的诱导过程和转基因根系的鉴定；A:苦荞毛状根的诱导过程；B:转基因根系的鉴定。

图8 A4以及pCAMBIA1307-FtRT1过表达苦荞根系中总黄酮的测定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1 FtRT1 CDS和启动子的克隆以及序列分析

1FtRT1 CDS和启动子的克隆

用1％次氯酸钠溶液消毒苦荞种子6min；然后用75％乙醇灭菌2min；再用无菌水清洗直至水呈澄清为止；将消毒后的苦荞种子放在灭菌的滤纸上吸干水分，种植在MS培养基上；培养条件是温度为22-25℃，光周期为16h/8h，湿度为75-80％，培养2-4周得到无菌苗。

从苦荞中克隆获得鼠李糖基转移酶FtRT1基因：

选取两周龄幼苗，取幼苗50-100mg，加液氮充分研磨后，使用Trizol法提取总RNA。以此RNA为模板，使用

III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒(南京诺唯赞生物技术有限公司)进行反转录获得幼苗的cDNA。

根据FtRT1的ORF设计特异性引物

F：5’-ATGGGAACCCAATCAAGC-3’；

R：5’-CTACTGCTTACCAACCAAAC-3’；

以川荞1号cDNA为模板，以1.2所述DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因的CDS序列。PCR程序为95℃ 3min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s，35个循环。PCR纯化产物连接到pTOPO-Blunt Simple平末端克隆载体上，获得FtRT1-T载体质粒。送经测序、分析、拼接，克隆得到FtRT1基因的CDS序列(核苷酸序列为SEQ ID No.2所示)和启动子序列(核苷酸序列为SEQ ID No.3所示)(图1)，通过DNAMAN软件进行比对，所获得的CDS序列、启动子序列与转录组测序筛选到的序列基本一致。

2FtRT1氨基酸序列分析

该基因的CDS长度为1401bp，编码蛋白分子量51.84KDa的466个氨基酸，所编码蛋白的等电点(pI)为6.5。在NCBI数据库中用Blast比对发现，该蛋白与甜荞麦(Fagopyrumesculentum)中的鼠李糖基转移酶FeF3G6″RhaT同源性最高(96.17％)，但目前没有对其功能进行深入研究，本发明人实验室将其命名为FtRT1基因。

用NCBI的CD-search在线分析FtRT1氨基酸的保守域，发现所编码的蛋白属于GT-B型糖基转移酶，序列比对发现(图2)：FtRT1与其他GTs一样，在C端有一段高度保守氨基酸序列HCGWNS，由此证明FtRT1是一个典型的糖基转移酶。

试验例1FtRT1基因的组织特异性表达试验

为进一步研究FtRT1基因在苦荞中的功能，对苦荞不同时期的不同组织中FtRT1基因表达进行分析。

提取苦荞灌浆时期的根、茎、叶、成熟的种子和未成熟的种子总RNA。并以此RNA为模板，使用

III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒进行反转录成cDNA。以荞麦组成型表达的FeH3F基因为内参，引物序列为：

F：GAAATTCGCAAGTACCAGAAGAG；

R:CCAACAAGGTATGCCTCAGC。

同时设计基因特异引物：

FtRT1-Q-F：TCAAATAAGCTCGCCTCCCA；

FtRT1-Q-R：GCTGCATTTTGTCAAGAGCG；

并做3次生物学重复试验，利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)在BAI 7500实时荧光定量PCR仪上检测FtRT1表达量。本试验中用RQ(相对表达量)＝2-ΔΔCT的算法，计算目标基因的相对表达量；设置诱导表达0h 2-ΔΔCT值为1，计算出control以及MeJA(50μM)分别处理1、4和12h的表达倍数。

qRT-PCR分析结果发现(图3)，FtRT1基因表达表现明显的组织差异和一定的生长发育时间差异。FtRT1基因在苦荞的各个组织中均有表达，且在茎中的表达量最高，约是根中的表达量的70倍；在叶、花、不成熟的种子和成熟的种子中的表达量也高，但在根中表达量最低。

试验例2不同激素处理下FtRT1基因表达分析试验

对FtRT1基因的启动子进行分析，发现其启动子上有响应外源激素MeJA和ABA的作用元件，为了探索外源激素MeJA和ABA激素是否影响FtRT1基因的表达，利用qRT-PCR技术分析了用50μM MeJA(茉莉酸甲酯)处理七天的无菌苗，分析探索了FtRT1基因在茉莉酸(MeJA)胁迫处理下表达模式。

利用川荞1号无菌苗在组培室光照培养2-4周左右，待其长出真叶后用，取3株长势一致的川荞1号无菌苗于液体MS中，室温震荡(120r/min)处理一天后用MeJA(50μM)处理1h、4h、和12h时后取样(作为样品)。处理其他条件和培养均保持一致，对照组添加同体积的二甲基亚砜(DMSO)。取样之后用滤纸快速吸干水分后并置于液氮中速冻，接着保存于–80℃冰箱备用。

qRT-PCR分析试验结果发现，FtRT1基因的表达量与转录组数据基本一致，随着MeJA处理时间的增加而逐渐增高，且在4h达到最高，随后下降(图4)。

试验例3转基因根系的鉴定以及GUS染色试验

1.试验方法

1.1pCAMBIA 1307-FtRT1过表达载体的构建和pCAMBIA 3301:FtRT1::GUS表达载体的构建：

pCAMBIA 1307-FtRT1过表达载体的构建：设计含XbaI和KpnI酶切位点的同源重组引物，以FtRT1-T载体为模板，OE-FtRT1-F/R为引物，PCR扩增FtRT1的全长序列。

上游引物：

OE-FtRT1-F:

5’-GGGGGCGGCCGCTCTAGAATGGGAACCCAATCAAGC-3’

下游引物：

OE-FtRT1-R：

5-AAGCTTGATATCGAATTCCTACTGCTTACCAACCAAAC-3’。

随后经酶切、回收和连接转化后，将FtRT1基因全长序列正向插入pCAMBIA-1307载体的CaMV35S启动子后，经测序完全后得到过表达载体pCAMBIA1307-FtRT1。

pCAMBIA 3301:FtRT1::GUS表达载体的构建：为了进一步探究MeJA对FtRT1表达的影响，根据FtRT1的启动子序列，设计含XbaI和EcoR I酶切位点的特异引物，以川荞1号的DNA为模板，3301-FtRT1-F/R为引物，克隆了FtRT1上游1200bp的启动子序列，并连接到pTOPO-Blunt Simple平末端克隆载体上，经测序后得到3301-FtRT1-T载体质粒。

上游引物：

3301-FtRT1-F:5’-GAATCCTTAAATGGTTCATATTACTATGCAATTAG；

下游引物：

3301-FtRT1-R:5’-TCTAGATTTGTAAAATGCTTGATTTGTTTCTTG。

随后经酶切、回收、和连接转化后，将FtRT1启动子序列连接到pCAMBIA3301表达载体上。经公司测序完全后得到表达载体pCAMBIA 3301:FtRT1pro::GUS。

1.2.将测序验证正确的pCAMBIA 1307-FtRT1重组质粒、pCAMBIA3301:FtRT1pro::GUS重组质粒以及pCAMBIA1307-空载体质粒、pCAMBIA3301-空载体质粒用热激法分别转化发根农杆菌A4感受态细胞。

1.3.经菌落PCR鉴定后，将得到pCAMBIA 1307-FtRT1重组质粒阳性菌，pCAMBIA1307-空载体阳性菌、pCAMBIA3301:FtRT1pro::GUS重组质粒阳性菌，pCAMBIA3301-空载体阳性菌以及A4菌分别侵染苦荞的毛状根。

用取5瓶2-4周龄的的苦荞无菌苗；A组加入到50毫升侵染液A“50ml OD值-600-0.6的pCAMBIA 1307-FtRT1重组质粒阳性菌”；B组加入到50毫升侵染液B“50ml OD值-600-0.6pCAMBIA1307-空载体阳性菌”中；C组加入到50毫升侵染液C“pCAMBIA3301:FtRT1pro::GUS重组质粒阳性菌”中；D组加入到50毫升侵染液D“pCAMBIA3301-空载体阳性菌”中；E组加入到50毫升侵染液E“A4菌”中，使下胚轴和子叶均完全浸泡在液体中，侵染10分钟。

剪切6-8cm左右的pCAMBIA3301:FtRT1pro::GUS阳性毛状根于MS固体培养基上，待毛状根的量足够后，取适量于MS液体培养基中，室温震荡(120r/min)处理(与此同时，转pCAMBIA3301-空载体阳性毛状根作为阳性对照，转A4毛状根作为阴性对照)。第二天用MeJA(50μM)分别处理1、4、和12h时后取样，其他条件和培养均保持一致。取样之后用GUS缓冲液冲洗两遍，再用(GUS缓冲液+50mg/ml X-Gluc)37度染色过夜，待肉眼看得到明显的蓝色后，用75％乙醇脱色完全后拍照。

GUS缓冲液染色：(1)用预冷的90％丙酮固定10min，4℃保存，待用；用未添加X-Gluc的染色缓冲液润洗；(2)用预冷的染色缓冲液浸泡，抽真空10min，37℃温育；(3)先后用50％、70％和100％的乙醇漂洗样品，每次浸泡5min；(4)加入100％乙醇浸泡直至完全脱色；(5)体视显微镜照相记录。

2.试验结果

试验结果(图6)发现，pCAMBIA3301-35S::GUS毛状根染色最深，GUS活性最强，而pCAMBIA3301:FtRT1pro::GUS染色程度和GUS和活性其次，且WT毛状根中没有发现有GUS活性。同时，随着MeJA处理时间的增长pCAMBIA3301:FtRT1pro::GUS毛状根中GUS活性逐渐增强，由此证明获得的FtRT1基因的启动子具有启动子的活性，能够启动GUS报告基因的表达且其表达受MeJA的诱导。

试验例4FtRT1转基因毛状根总黄酮含量的测定试验

将试验例3构建的重组植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化苦荞的含FtRT1基因植物表达载体的发根农杆菌菌株；用构建的发根农杆菌菌株遗传转化苦荞组织；GUS染色验证FtRT1基因表达情况，获得经PCR检测为阳性的苦荞转基因毛状根克隆；转基因毛状根的扩大培养和利用三氯化铝法测定转基因毛状根的总黄酮含量。

通过发根农杆菌侵染法得到五株转基因毛状根(图7)，选取长势较为一致的三个株系开展后续试验。提取部分转基因毛状根进行室温(120r/min)摇瓶30d，随后进行转基因毛状根总黄酮的检测。

按照三氯化铝比色法具体步骤绘制芦丁标准曲线。

总黄酮标准曲线的绘制：称取芦丁标准品1.8mg，于容量瓶中加入80％甲醇定容至10mL即得芦丁标准溶液。分别吸取芦丁标准溶液2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.075、0.0375、0.01875ml置于10mL容量瓶中，加入0.1mol/L的三氯化铝溶液2mL、1mol/L的乙酸钾溶液3mL，用80％甲醇溶液定容至10mL，摇匀后室温下放置30min，同时以80％甲醇溶液作为空白对照。苦荞毛状根样品以同样的测定方法，在波长为420nm处测定吸光度。以吸光度值A为纵坐标，芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，并用芦丁标准曲线方程考察线性结果和总黄酮含量差异。

总黄酮质量浓度X和吸光值Y关系为：y＝11.777x+0.0139，R2＝0.9908，表明该标准曲线线性良好。按此方法测定转基因毛状根总黄酮含量，利用测得吸光值，根据标准曲线线性方程计算总黄酮含量。

检测结果表明，过表达转FtRT1基因株系中黄酮含量明显比对照组要高，证明FtRT1基因参与调控黄酮类物质的合成(图8)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 苦荞来源的鼠李糖基转移酶及其编码基因和应用

<130> BJ-2011-200306A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 466

<212> PRT

<213> Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn

<400> 1

Met Gly Thr Gln Ser Ser Ser Thr Asp Leu His Ile Ala Val Phe Pro

1 5 10 15

Tyr Phe Ala Phe Gly His Ile Asn Pro Phe Val His Ile Ser Asn Lys

20 25 30

Leu Ala Ser His Gly Ile Lys Ile Ser Phe Phe Ser Ala Pro Gly Asn

35 40 45

Ile Pro Arg Ile Lys Ala Ser Leu Ser Pro Ser Pro Leu Ile Ser Ile

50 55 60

Val Pro Leu Thr Phe Pro His Val Asp Gly Leu Pro Val Gly Phe Glu

65 70 75 80

Ser Thr Ala Asp Ile Thr Pro Ala Ile Ala Glu Leu Leu Lys Val Ala

85 90 95

Leu Asp Lys Met Gln Pro Gln Ile Arg Ser Leu Leu Thr Glu Leu Lys

100 105 110

Pro Asp Val Val Phe Phe Asp Phe Ala Gln Asn Trp Ile Pro Ala Leu

115 120 125

Ala Ser Glu Leu Gly Ile Lys Thr Val Met Phe Ser Val Phe Ser Leu

130 135 140

Ile Ser Asn Ser Tyr Leu Met Thr Pro Ala Arg Leu Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ile Pro Thr Ile Glu Glu Leu Lys Lys Pro Pro Gln Gly Tyr Pro Asn

165 170 175

Pro Asn Leu Ser Leu Lys Thr Phe Gln Ala Lys Asp Leu Leu Tyr Pro

180 185 190

Phe Arg Arg Phe Asn Gly Ser Pro Ser Ala Leu Glu Arg Asn Tyr Ala

195 200 205

Gly Ile Gln Gly Cys Asp Ala Ile Ala Tyr Lys Ser Cys His Glu Met

210 215 220

Glu Gly Pro Tyr Trp Ser Tyr Phe Lys Lys Val Ile Gly Lys Pro Ile

225 230 235 240

Ile Met Ala Gly Ile Pro Ile Pro Glu Thr Ser Ser Ser Gly Asp Leu

245 250 255

Asp Thr Asn Trp Ala Thr Trp Leu Ala Lys Phe Pro Pro Lys Ser Val

260 265 270

Thr Leu Cys Ser Phe Gly Ser Glu Thr Phe Leu Thr Asp Val Gln Val

275 280 285

Gln Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Thr Lys Leu Pro Phe Leu Met

290 295 300

Val Leu Ser Ser Asn Gly Phe Asp Gln Glu Arg Leu Asn Lys Ile Leu

305 310 315 320

Pro Glu Gly Phe Leu Glu Arg Val Lys Asp Arg Gly Leu Ile His Ile

325 330 335

Gly Trp Val Pro Gln Gln Lys Ile Met Ala His Glu Asn Val Gly Cys

340 345 350

Tyr Val Asn His Ala Gly Phe Gly Ser Val Ile Glu Ala Ile Val Thr

355 360 365

Asp Cys Gln Leu Val Leu Leu Pro Phe Lys Gly Asp Gln Phe Leu Asn

370 375 380

Ser Lys Leu Leu Ser Leu Asp Met Lys Val Gly Val Glu Val Asn Arg

385 390 395 400

Arg Asp Glu Asp Gly His Phe Gly Lys Glu Asp Ile Phe Glu Ala Val

405 410 415

Arg Ile Val Thr Leu Asp Gly Asp Lys Glu Pro Gly Lys Asn Ile Arg

420 425 430

Ser Asn Leu Val Lys Trp Lys Glu Met Leu Met Asn Lys Glu Phe Glu

435 440 445

Glu Lys Tyr Val Leu Glu Leu Val Lys Glu Val Lys Gly Leu Val Gly

450 455 460

Lys Gln

465

<210> 2

<211> 1401

<212> DNA

<213> Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn

<400> 2

atgggaaccc aatcaagctc aactgatctt cacatagccg tatttccgta cttcgctttc 60

ggccacatca acccattcgt tcacatctca aataagctcg cctcccatgg aatcaagatc 120

tccttcttct cagctccagg gaacattccg agaatcaaag catcactttc cccctcacct 180

ttgatttcaa tcgtaccgct cacgttcccc cacgtcgatg gccttcctgt cggcttcgaa 240

agcactgctg acatcactcc cgccattgct gagcttctca aggtcgctct tgacaaaatg 300

cagccgcaaa ttcgttcttt gctcacggaa ctcaaacccg acgtcgtttt cttcgacttt 360

gctcagaatt ggatccctgc tcttgcctcc gagcttggga ttaagactgt tatgttctct 420

gtcttctcgc ttatttctaa ctcttattta atgacgccgg cgagactttc ctccgacgat 480

attccgacca ttgaagagct caagaaacct ccacaaggtt atcccaaccc caacctctcc 540

ctgaagacat tccaggcaaa ggacttgttg tatccgttcc gacggttcaa cggcagtcca 600

tcggcgctgg agcgaaacta cgccggaatc caaggatgcg acgcaatcgc ctacaagtct 660

tgccacgaga tggaaggtcc atactggagc tacttcaaga aagtaatcgg aaagcccatc 720

atcatggccg gaattcccat accggaaaca tcatcctccg gcgacctcga caccaactgg 780

gcaacatggc tagctaaatt cccgccaaaa tcagtaactc tctgctcctt cggatccgaa 840

acgtttctca ccgacgttca agtccaagag cttgctcttg gacttgaact cacaaagctt 900

ccatttctaa tggtactgag ctccaatgga ttcgatcaag aaaggctgaa caaaatcctc 960

ccagagggat tcttggaaag agttaaagat cgaggcttga ttcatattgg ttgggtccca 1020

caacagaaga ttatggctca tgagaatgtg ggttgttatg ttaatcatgc tgggtttgga 1080

tctgtgatcg aagccattgt tactgattgt cagctggttt tgttgccttt taaaggtgat 1140

cagttcttga actcaaagct gttgagtttg gatatgaagg ttggggtgga agtaaatagg 1200

agagatgaag atgggcattt tgggaaagag gatatatttg aggctgtgag gattgttact 1260

ttggatggtg ataaagagcc tgggaagaac attagaagta accttgtgaa gtggaaggag 1320

atgctgatga acaaagagtt tgaagagaag tatgttcttg agttggttaa ggaagttaag 1380

ggtttggttg gtaagcagta g 1401

<210> 3

<211> 1200

<212> DNA

<213> Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn

<400> 3

ttaaatggtt catattacta tgcaattagt tcaaactgtt tgttgtcgta gtttttttta 60

acacttagtt caaactgttt ataatattag ttcaaaattt tttttaatta cagttttccc 120

cttttattct tttagttcaa actagttgtt ctaatagttc atatttttgt tcaattagtt 180

caaacttttt gtactaatag ttcttatttt ttgttcaatt agttcaaact gtttgttcta 240

atagttatta ttttttgttc aattcaaacc gtctatagta ttagttcaaa gttttggtat 300

cattaatttg aaaattgaat attgttggtt caaacattgt tttttttatc ggttcaaaca 360

attataagta acaaagtgca taaaaacgta actacaaaat taacaaagta atatgtgaac 420

taattatgaa aaatatcaga attaatagtg tatactttta aacgaaataa actaaaatta 480

tgaactatta taatattagt ttaaatttag gtattattaa tttgaatatt atgtaatgtt 540

agtttaaaca ttatatttta ttaattcaaa catgtataag taacaaaatg catataaaca 600

tatatatcaa attaataaat aatacgtgaa tcaactacat aaaatattag aactaatagt 660

gtatactttt gaatgaattg aacaaaactc ataaattgag ataataactt ttaatttttt 720

tctcataaaa attacgaatt atcaccgcgt ctacatcttt taaaaaataa atcattaaaa 780

gaaactacgt ctatatttta ttttcttcgc tttaaacgtt ttcatttcgt tttcattgaa 840

tgctatctaa tcaatatgac acttaattca aaaaaaagat gaatcatgtg tcgtgtcaaa 900

cgatccctaa accggtgcca cctgctaaaa gcctaaaacc atttgtcgta tcaaagagag 960

gggtccaagt ctctcgtgag ctttcttttg gggagcaatg caggatcctc attcattgat 1020

caccctccat tcttgactac ctcaaccaat tccttcatac ttcatttgcc tagctacccc 1080

caaagattga ctagccgcta cctctgtaac ctctgttact ctgtttctgc tgctttcaca 1140

tatatacata gagacacttt actcatcttc atccaagaaa caaatcaagc attttacaaa 1200

Claims (10)

1.一种苦荞来源的鼠李糖基转移酶，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述鼠李糖基转移酶的基因。

3.按照权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的多核苷酸序列为(a)或(b)或(c)所示：

(a)、SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID No.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有鼠李糖基转移酶的功能或活性；或

(c)、与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有鼠李糖基转移酶的功能或活性；优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有鼠李糖基转移酶的功能或活性；更优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有鼠李糖基转移酶的功能或活性。

4.含有权利要求3所述基因的嵌合基因或表达盒。

5.权利要求2或3所述鼠李糖基转移酶的基因的启动子，其特征在于，其多核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

6.含有权利要求3所述的基因或含有权利要求4所述嵌合基因或表达盒的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为重组植物表达载体。

7.权利要求1所述的鼠李糖基转移酶或权利要求2所述的基因在调控植物黄酮类物质的合成中的应用。

8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的植物是荞麦。

9.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的调控黄酮类物质的合成是增加黄酮类物质在植物器官或组织中的含量。

10.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，包括：将所述基因可操作的连接到植物表达载体得到重组植物表达载体；将重组植物表达载体转化到植物细胞或组织中。

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