CN113881653A

CN113881653A - 苦荞糖苷水解酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN113881653A
Application number: CN202111233872.9A
Authority: CN
Inventors: 周美亮; 张凯旋; 赵辉; 范昱; 丁梦琦; 胡永平
Original assignee: Guizhou Province Weining County Dongfangshengu Co ltd; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Guizhou Province Weining County Dongfangshengu Co ltd; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-10-22
Filing date: 2021-10-22
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2041-10-22
Also published as: CN113881653B

Abstract

本发明公开了苦荞糖苷水解酶及其编码基因和应用。本发明克隆了苦荞水杨酸类糖苷代谢途径中的新的葡萄糖水解酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。进一步利用基因工程手段，将该糖苷水解酶编码基因序列遗传转化荞麦外植体获得过表达的转基因荞麦毛状根；此外，将该糖苷水解酶进行原核表达获得重组蛋白，通过体外酶活检测和体外催化验证表明该酶可在体外高效将水杨酸‑2‑O‑葡萄糖苷水解成水杨酸。应用本发明可以通过体外生物工程方法将水杨酸类糖苷水解生成水杨酸，为商业化生成水杨酸提供了新的方法，该方法效果可靠、成本低廉，生产过程高效、绿色、安全、无环境污染。

Description

苦荞糖苷水解酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及糖苷水解酶及其编码基因，尤其涉及从苦荞中分离得到的糖苷水解酶及其编码基因，本发明进一步涉及它们在催化水杨酸-2-O-葡萄糖苷水解生成水杨酸中的应用，属于糖苷水解酶及其编码基因和应用领域。

背景技术

荞麦为蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)的双子叶植物，富含黄酮类和多酚类物质。其中，水杨酸(salicylic acid，SA)是一类广泛存在于植物体内的酚类植物激素，对植物的生长发育和抗性具有显著调控作用。不仅如此，SA为一种脂溶性有机酸，也是医学上著名的解热镇痛、抗肿瘤、抗菌类药物。目前，植物体内的水杨酸(SA)的合成途径主要是莽草酸途径。其中莽草酸的转化物苯丙氨酸首先在苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase，PAL)的作用下生成反式肉桂酸(trans-cinnamic acid，trans-CA)，然后再转化为邻香豆酸(o-coumaric acid，o-CA)或苯甲醛。其中，邻香豆酸可直接转化为SA，而苯甲醛需要先转化为苯甲酸，再在苯甲酸羟化酶(benzoic acid 2-hydroxylase，BA2H)的作用下转化为SA。酚类基团在植物分子合成糖苷是对体内天然化合物常见的一类修饰反应，会形成结构更加稳定的天然糖苷化合物，其糖苷在水解酶的作用下进一步形成单一的酚、醇、酮基团，可以更高效的调控植物体内的生理活动，是前者的逆向反应。

目前，在植物体内的水杨酸类糖苷与水杨酸的生物合成或水解反应研究仍然很少，特别是荞麦中水杨酸类糖苷在水解酶的催化下直接形成水杨酸(SA)的生物代谢过程几乎仍是空白。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种苦荞来源的糖苷水解酶及其编码基因；

本发明的目的之二将所述苦荞来源的糖苷水解酶及其编码基因应用于催化水杨酸类糖苷化合物进行水解反应生成对应产物。

为实现上述目的，本发明所采取的主要技术方案包括：

本发明一方面公开了一种苦荞来源的糖苷水解酶，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明另一方面进公开了所述苦荞来源的糖苷水解酶的编码基因(FtSAGH1)，该基因的CDS的多核苷酸序列为(a)、(b)或(c)所示：

(a)SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；或

(b)与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有糖苷水解酶的功能或活性；或

(c)与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有糖苷水解酶的功能或活性；优选的，与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有糖苷水解酶的功能或活性；更优选的，与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有糖苷水解酶的功能或活性。

本发明进一步提供了将糖苷水解酶及其编码基因应用于催化水杨酸类糖苷化合物进行2-OH位的特异性水解反应生成对应产物。

作为本发明的一种优选的具体实施方案，所述的应用包括：催化水杨酸-2-O-葡萄糖苷进行2-OH位的特异性水解反应生成水杨酸。

由此，本发明提供了一种体外将水杨酸类糖苷化合物进行2-OH位的特异性水解反应生成对应的产物转化为对应的产物的方法，包括：以所述糖苷水解酶为催化酶，催化水杨酸类糖苷化合物进行2-OH位的特异性水解反应生成对应的产物。

此外，本发明所分离的糖苷水解酶编码基因FtSAGH1也能应用于促进植物中水杨酸类糖苷化合物进行2-OH位的特异性水解反应，譬如，将葡萄糖苷水解酶编码基因FtSAGH1可操作的与植物表达载体连接构建得到重组植物表达载体，将所构建的重组植物表达载体转化到植物中得到过表达植物。

可以采用本领域的常规技术手段，将糖苷水解酶编码基因FtSAGH1通过常规的原核表达或真核表达的方法获得重组糖苷水解酶，采用该重组糖苷水解酶就可通过体外或体内的转化或催化的方法，催化水杨酸类糖苷化合物进行2-OH位的特异性水解反应生成对应的产物。

本发明还公开了含有所述糖苷水解酶编码基因FtSAGH1的重组表达载体；优选的，所述重组表达载体可以为重组植物表达载体或重组原核表达载体。

本发明进一步公开了含有所述糖苷水解酶编码基因FtSAGH1的重组宿主细胞或重组菌；其中，所述重组菌包括但不限于重组大肠杆菌或重组植物细胞。

在本发明中，可以采用任何植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体引入到目标植物的细胞、组织或器官中得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等。

将本发明的SEQ ID No.1所示的基因与其他基因相嵌合或连接得到的嵌合基因或表达盒均属于本发明的保护范畴；含有所述的嵌合基因或表达盒的重组表达载体同样也属于本发明的保护范围之内。

通过本发明所披露的方法获得的转基因植物细胞和植物也可以进一步用于后续的转化程序中，例如用来引入其它的嵌合基因。

本发明克隆了一个苦荞水杨酸类糖苷(水杨酸-2-O-葡萄糖苷)代谢途径中的新的葡萄糖水解酶基因，命名为FtSAGH1，探究了其在水杨酸-2-O-葡萄糖苷生物代谢途径中的作用；并且利用基因工程手段，将糖苷水解酶FtSAGH1基因遗传转化荞麦外植体获得过表达的转基因荞麦毛状根；将FtSAGH1基因通过原核诱导表达载体，转化至宿主菌进行表达以快速获得重组MBP-FtSAGH1蛋白，并完成了重组蛋白的体外酶活检测，并通过体外反应验证重组MBP-FtSAGH1蛋白对荞麦的水杨酸类糖苷(以水杨酸-2-O-葡萄糖苷为例)进行2-OH位的特异性水解反应(UDP-葡萄糖)生成对应的产物(水杨酸)，并以高效液相色谱法进行检测验证；结果证明，该酶可在体外高效地水杨酸-2-O-葡萄糖苷水解成水杨酸，即将水杨酸-2-O-葡萄糖苷的2-OH位的葡萄糖水解生成水杨酸。

本发明明确了荞麦水杨酸类糖苷生物代谢过程中所涉及的水解酶的功能，为后续深入研究糖苷水解酶调控水杨酸类糖苷的代谢机制奠定了理论基础。本发明还表明了可以通过体外生物工程方法大量形成水杨酸，为商业化生产利用水杨酸及其糖苷类化合物提供了参考。本发明效果可靠、成本低廉低；生产过程高效、绿色、安全、无环境污染。

本发明所涉及到的术语及定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“同源性”，指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地85％或更高，更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。

术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。

术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“可操作地连接”指两个或更多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区可以相对于编码感兴趣表达产物的核酸序列如此安置，从而所述核酸序列的转录由该启动子区指导。因此，启动子区“与该核酸序列可操作地连接”。

术语“转化”在此指的是用于将异源DNA引入到植物细胞、植物组织、或植物中的过程。转化植物细胞、植物组织、或植物被理解为不仅包括转化过程的终末产物，也包括其子代。

术语“转化”、“转基因”、和“重组体”在此指的是其中已经被引入异源核酸分子的宿主细胞或生物体例如细菌或植物细胞(例如植物)。核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者核酸分子也可以以染色体外分子的形式存在。这样一种染色体外分子可以是自我复制的。转化细胞、组织或植物被理解为不仅包括转化过程的终末产物，还包括其转基因子代。“未转化”、“未转基因”、或“未重组的”宿主指的是野生型生物体例如细菌或植物，它不包含异源核酸分子。

术语“启动子”指下述的任何核酸序列(如DNA序列)：这种序列在转录起始期间被DNA依赖性RNA聚合酶识别并(直接或间接)结合，导致生成与转录的DNA互补的RNA分子；这种区域也可以称作“5'调节区”。启动子通常位于在待转录的编码序列前方存在的5'非翻译区(UTR)的上游并且具有多个区域，这些区域充当RNA聚合酶II和其他蛋白质如转录因子的结合位点以引发可操作地连接的基因的转录。启动子本身可以含有调节可操作地连接的基因的转录的子元件(即启动子基序)如顺式元件或增强子结构域。该启动子和连接的5'UTR也称作“启动子区”。

附图说明

图1 FtSAGH1 CDS的克隆。

图2转基因毛状根和空载体毛状根中FtSAGH1的qPCR检测相对表达量。

图3 FtSAGH1糖苷水解酶的疏水性分析和三级结构预测；(a)FtSAGH1亲疏水性分析；(b)FtSAGH1蛋白质三级结构预测。

图4原核诱导表达重组FtSAGH1糖苷水解酶蛋白的western鉴定结果。

图5 FtSAGH1糖苷水解酶的水解反应。

图6水杨酸-2-O-葡萄糖苷在FtSAGH1糖苷水解酶催化下形成水杨酸的高效液相色谱法谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1 FtSAGH1基因CDS的克隆

选取2周龄～6周龄苗，取植株50-100mg，加液氮充分研磨后，使用Trizol法提取总RNA。以此RNA为模板，使用

III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)试剂盒(南京诺唯赞生物技术有限公司)进行反转录获得幼苗的cDNA。

根据FtSAGH1的ORF设计特异引物：

FtSAGH1-F：5'-ATGGCTTTCAATGGCAATCA-3'，

FtSAGH1-R：5'-TTAACCTACATGAGCTGTGTTCATA-3'；

以品苦(Pinku)1号cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因的CDS序列。PCR程序为95℃3min；95℃30s，57℃60s，72℃90s，31个循环。PCR纯化产物连接到pTOPO-Blunt Simple平末端克隆载体上，获得FtSAGH1-T载体质粒。

送经测序、分析、拼接后得到FtSAGH1全长序列。所述FtSAGH1基因的CDS的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

实施例2 FtSAGH1基因在苦荞毛状根中表达以及表达量的检测

1.pCAMBIA 1302-FtSAGH1过表达载体的构建

设计同源重组引物，以FtSAGH1-T载体为模板，OE-FtSAGH1-F/R为引物，PCR扩增FtSAGH1的全长序列。

上游引物：

pMal-FtSAGH1-NdeIF：

5'-gaaggatttcacatatgATGGCTTTCAATGGCAATCA-3'

下游引物：

pMal-FtSAGH1-BamHIR：

5'-gcagggaattcggatccTTAACCTACATGAGCTGTGTTCATA-3'。

随后经酶切、回收、和连接转化后，将FtSAGH1全长序列正向插入pCAMBIA-1302载体的CaMV35S启动子下游，经测序完全后得到过表达载体pCAMBIA1302-FtSAGH1。

2.植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化苦荞的含FtSAGH1基因植物表达载体的发根农杆菌菌株：

测序验证正确的pCAMBIA 1302-FtSAGH1重组质粒以及pCAMBIA1302空载体质粒用热激法分别转化发根农杆菌A4感受态细胞。经菌落PCR鉴定后，将得到pCAMBIA 1302-FtSAGH1重组质粒阳性菌，pCAMBIA1302空载体阳性菌。

3.经PCR检测为阳性的苦荞转基因毛状根克隆，并PCR检测表达

将侵染后的苦荞下胚轴和子叶于MS固体培养基上，待毛状根的量足够后，取适量于MS液体培养基中，室温震荡(120r/min)处理(与此同时，转pCAMBIA1302-FtSAGH1基因毛状根作为阳性对照，转pCAMBIA1302-空载体毛状根作为阴性对照)。利用FtSAGH1-F/R检测基因表达，PCR程序与上文所述一致。经PCR检测阳性结果如图1所示(引物为FtSAGH1-F/R)。挑选6个苦荞毛状根进行PCR检测。其中，编号1，2，3，4，5，6呈现阳性结果。

选取长势较为一致的三个株系(1,2,5)开展后续试验。提取部分转基因毛状根进行室温(120r/min)摇瓶14d，随后进行转基因毛状根表达量的检测。结果显示(图2)，过表达的FtSAGH1-OE毛状根中的该基因的表达量比pCAMBIA-1302空载转化毛状根中更高。

实施例3苦荞葡萄糖苷水解酶的氨基酸序列分析及比对

将FtSAGH1基因氨基酸序列在NCBI数据库中Blast比对。并利用expasy在线数据工作网站https://web.expasy.org/compute_pi/和https://web.expasy.org/protscale/预测该蛋白的等电点和亲疏水性。

该基因的CDS长度为1608bp，编码蛋白分子量约59.9kDa的535个氨基酸，所编码蛋白的等电点(pI)为5.04。该蛋白为疏水蛋白。利用https://swissmodel.expasy.org/interactive预测了该蛋白的3级结构(图3)。

实施例4重组苦荞葡萄糖苷水解酶的原核诱导表达以及鉴定

将FtSAGH1基因通过表达载体，转化至宿主菌进行表达以快速获得重组MBP-FtSAGH1蛋白：将PCR产物用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 4.0进行切胶回收纯化后,连接到MBP(麦芽糖结合蛋白)标签载体，获得MBP-FtSAGH1重组质粒。纯化方法采用NEB公司的amylase resin(E8021S)产品说明书上的方法，具体操作如下：

取含目的载体的单克隆在5mL液体LB(含50μg/mL氨苄青霉素)培养基中，37℃，220rpm培养8-12h；将1中菌液全部转入250mL无抗LB液体培养基中，37℃，220rpm培养1-3h使OD600达到0.8左右；将摇床温度调至20℃，转速调至150rpm，待培养基的温度降低至20℃后加入IPTG至终浓度为0.2mM，诱导培养8h；4℃，5000rpm离心15min收集菌体；加入平衡缓冲液，重悬菌体，超声破碎菌体，至菌液澄清；4℃，12000rpm离心15min，将上清用0.4μm滤膜过滤后，加入预先用平衡缓冲液平衡的amylase resin柱子中，使蛋白与填料结合；用5-10倍柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱，以除去没有结合的杂蛋白；用5mL的洗脱缓冲液(含10mM麦芽糖)洗脱，收集流出液；SDS-PAGE、Western blot检测纯化的蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(康为世纪)测定蛋白浓度。在蛋白样品中加入5×Loading Buffer使其终浓度为1×，沸水浴煮10min，12000rpm离心10min后吸取适量的上清加入点样孔中，80V恒压电泳，待溴酚蓝进入分离胶后将电压设置为120V继续电泳直至完成；电泳结束后小心剥取凝胶放入考马斯亮蓝R-250染液中，在水平摇床上缓慢摇动室温染色3h以上；染色结束后，将凝胶转移至考马斯亮蓝染色脱色液中，在水平摇床上缓慢摇动4-8h脱色，期间更换脱色液2-3次。SDS-PAGE电泳结束后，小心取出凝胶并放入预冷的转膜缓冲液中浸泡；夹好凝胶，冰浴中转膜90min；转膜完成后，小心剥取PVDF膜，放入TBST中漂洗3次，每次5min，然后在膜正面均匀滴加TBST稀释好的丽春红染色，观察转膜效果；将膜先在TBST中漂洗3-5次，每次5-10min，然后转入5％(W/V)脱脂奶粉的TBST溶液中，室温平缓摇动2-3h或4℃过夜；加一抗孵育：用TBST稀释一抗(1:3,000)，然后将封闭好的PVDF膜放入稀释好的一抗中，室温下在摇床上缓慢摇动孵育3h左右或4℃过夜；加二抗孵育：在TBST中漂洗3-5次，每次5-10min,用TBST按照1:8,000比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，然后将一抗孵育完的PVDF膜放入稀释好的二抗中，室温下在摇床上缓慢摇动孵育30-60min；TBST中漂洗3-5次，每次5-10min将膜平铺于透明塑料膜上，滴加ECL显色反应液至覆盖膜表面，然后盖上透明塑料膜，用化学发光成像仪检测。根据图4可看出，重组质粒转化到表达宿主大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导后，有重组MBP-蛋白的表达，上清蛋白经Ni-NTA柱纯化后得到了较纯的重组蛋白，且该蛋白的条带大小与预测的一致，加上重组标签后在103kDa左右有明显的重组蛋白条带。

根据图4可看出，MBP蛋白为45KD左右，构建的MBP-FtSAGH1重组质粒转化到表达宿主大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导后，有重组蛋白的表达，上清蛋白经Ni-NTA柱纯化后得到了较纯的重组蛋白，且该蛋白的条带大小与预测的一致，加上重组标签后在103kDa左右有明显的重组蛋白条带。纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。

实施例5水杨酸-2-O-葡萄糖苷和水杨酸在FtSAGH1糖苷水解酶催化下的反应模式

以UDP-葡萄糖为底物，苦荞中的水杨酸-2-O-葡萄糖苷在FtSAGH1葡萄糖苷水解酶的水解下，在2-OH位失去一分子的葡萄糖基，生成水杨酸(图5)。

实施例6重组MBP-FtSAGH1蛋白体外酶活的检测

将2μg纯化的MBP-FtSAGH1重组蛋白添加到200μL糖苷水解反应缓冲液(100mMTris HCl(pH 8.0)、14mMβ-巯基乙醇、1mM水杨酸-2-O-葡萄糖苷(ZC-25543,SHANGHAIZZBIO),1mM ATP)，37℃反应30min。。加入800μL乙酸乙酯终止反应，冷冻干燥。干燥后的反应产物用1mL 80％甲醇中重新溶解。溶解液利用高效液相色谱-质谱联用法测定产物。用水杨酸-2-O-葡萄糖苷、水杨酸标准品的保留时间值来鉴别反应产物。

高效液相色谱-质谱联用法测定产物：甲醇溶液浓度为55-85％，温度为25-60℃、超声时间为15-40min、超声频率为30-60kHz。固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；流动相0.1％甲酸/乙腈水溶液；流速：0.5mL/min；检测波长：210-280nm；进样量：5-20μL；柱温33-45℃。提取程序：0.1g冻干粉中加入20毫升甲醇，超声提取3次，提取物通过0.22μm的过滤膜。色谱条件：C18柱(2.1mm×75mm,2.7μm)。SAG(水杨酸-2-O-葡萄糖苷)和SA(水杨酸)的流动相梯度洗脱程序为0～7min，10％～40％A；7.5min，60％A；10min，60％A；10.1min，10％A；13.1min，10％A。用水杨酸-2-O-葡萄糖苷和水杨酸的峰面积定量反应产物。每个样本有三个重复。

HPLC色谱图(图6)显示，水杨酸-2-O-葡萄糖苷标准品不受MBP蛋白的影响，但是水杨酸-2-O-葡萄糖苷标准品在MBP-FtSAGH1催化下高效水解生成水杨酸。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 苦荞糖苷水解酶及其编码基因和应用

<130> BJ-2011-210703A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1608

<212> DNA

<213> Fagopyrum tataricum

<400> 1

atggctttca atggcaatca accttacaga actgcttacc attttcaacc cctaaggaat 60

tggattaacg ggccaatgct tcacaaggga atatatcatc tattctacca atacaatcca 120

aacgacgccg tttggggcaa cattgcgtgg ggccactcca cgtcagacga tctagtcaac 180

tggaccccac aaccaattgc catctcacct tcaatcccat cggacatcac aggttgttgg 240

tcaggctcag tcacacacct ttccggcgaa aaccccgcca ttttatacac cggagaatta 300

cacaaccaac aagtccaaaa cctagcctta ccggaggatc catccgaccc atatctcaaa 360

aaatggatca aacaccccaa taatcctatc atagttccaa ctccggcaga caacatcgaa 420

gcagccgagt ttcgagaccc cagcacagcg tggatcttgc cggacggact ttggagaatg 480

gttgtaggaa gcaaattagg tgagcgtgga atcgcagctt tgttcacaag ccgagatttc 540

atcaactgga gcacagctaa gcaaccgtta tactctgttg aggattcggg tatgtgggag 600

tgtccggatt tctttccggt ttatccgaac aagttggttg caccggagac gtcggatgtc 660

ggatcggatg ttaagcatgt ctttaaggcg agcatggtta gaacagggcg tgattgttac 720

atgatcggta catatgacac cgctaatgat gtttttgttc cggacgatga tcaggttttg 780

ttgggtttag aatcgacttt aaggtacgat tacggcaagt tttacgcgtc taagtcgttt 840

tatgatgttg ataagaagag gagggttttg tgggcttggg ttagtgaatc tagtaccagg 900

gaagaggacg tcgtaaaggg ctggtcaggg atccaggcgt ttccaagaag tgttttgctc 960

gatgaatccg gaaagcaatt ggtgcaatgg ccgatagaag agatcgaaaa tctacgagcg 1020

aaacgagttg atctacctag ccaagtgatc accaaaggtt cagtagttga agttgttggt 1080

gttaccgcag cacaagcaga cgtagaggtc gtgttcagca taagtgattt aagcaaagct 1140

gagaaattcg acccggcttg gaccgatcca caactacttt ggagccaaaa gggagcatca 1200

aacgaaggag gaatcggacc ctttgggctg ctaatcttgg cttccaagga cttacaagag 1260

tatacatcag tctctttccg gatcttcaag agcgaagaga aaggatttgt ggtgctaatg 1320

tgtagtgatc aaagcaggtc ttcgttaaac ccaacaactg acaaggcgag ttattgtact 1380

tttttaaatg tggatccttc tcaagaggat atctcgctaa ggacattgat tgatcactcg 1440

gtaatagaga gctttggagc gaaggggaag agttgcatca catctagggt ttatccaacc 1500

atagccatta acgacgatgc tcatctgtac gtatttaact atggatccga gtcgattcat 1560

atcaaagagc ttcaagcctg gaatatgaac acagctcatg taggttaa 1608

<210> 2

<211> 535

<212> PRT

<213> Fagopyrum tataricum

<400> 2

Met Ala Phe Asn Gly Asn Gln Pro Tyr Arg Thr Ala Tyr His Phe Gln

1 5 10 15

Pro Leu Arg Asn Trp Ile Asn Gly Pro Met Leu His Lys Gly Ile Tyr

20 25 30

His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Asn Asp Ala Val Trp Gly Asn Ile

35 40 45

Ala Trp Gly His Ser Thr Ser Asp Asp Leu Val Asn Trp Thr Pro Gln

50 55 60

Pro Ile Ala Ile Ser Pro Ser Ile Pro Ser Asp Ile Thr Gly Cys Trp

65 70 75 80

Ser Gly Ser Val Thr His Leu Ser Gly Glu Asn Pro Ala Ile Leu Tyr

85 90 95

Thr Gly Glu Leu His Asn Gln Gln Val Gln Asn Leu Ala Leu Pro Glu

100 105 110

Asp Pro Ser Asp Pro Tyr Leu Lys Lys Trp Ile Lys His Pro Asn Asn

115 120 125

Pro Ile Ile Val Pro Thr Pro Ala Asp Asn Ile Glu Ala Ala Glu Phe

130 135 140

Arg Asp Pro Ser Thr Ala Trp Ile Leu Pro Asp Gly Leu Trp Arg Met

145 150 155 160

Val Val Gly Ser Lys Leu Gly Glu Arg Gly Ile Ala Ala Leu Phe Thr

165 170 175

Ser Arg Asp Phe Ile Asn Trp Ser Thr Ala Lys Gln Pro Leu Tyr Ser

180 185 190

Val Glu Asp Ser Gly Met Trp Glu Cys Pro Asp Phe Phe Pro Val Tyr

195 200 205

Pro Asn Lys Leu Val Ala Pro Glu Thr Ser Asp Val Gly Ser Asp Val

210 215 220

Lys His Val Phe Lys Ala Ser Met Val Arg Thr Gly Arg Asp Cys Tyr

225 230 235 240

Met Ile Gly Thr Tyr Asp Thr Ala Asn Asp Val Phe Val Pro Asp Asp

245 250 255

Asp Gln Val Leu Leu Gly Leu Glu Ser Thr Leu Arg Tyr Asp Tyr Gly

260 265 270

Lys Phe Tyr Ala Ser Lys Ser Phe Tyr Asp Val Asp Lys Lys Arg Arg

275 280 285

Val Leu Trp Ala Trp Val Ser Glu Ser Ser Thr Arg Glu Glu Asp Val

290 295 300

Val Lys Gly Trp Ser Gly Ile Gln Ala Phe Pro Arg Ser Val Leu Leu

305 310 315 320

Asp Glu Ser Gly Lys Gln Leu Val Gln Trp Pro Ile Glu Glu Ile Glu

325 330 335

Asn Leu Arg Ala Lys Arg Val Asp Leu Pro Ser Gln Val Ile Thr Lys

340 345 350

Gly Ser Val Val Glu Val Val Gly Val Thr Ala Ala Gln Ala Asp Val

355 360 365

Glu Val Val Phe Ser Ile Ser Asp Leu Ser Lys Ala Glu Lys Phe Asp

370 375 380

Pro Ala Trp Thr Asp Pro Gln Leu Leu Trp Ser Gln Lys Gly Ala Ser

385 390 395 400

Asn Glu Gly Gly Ile Gly Pro Phe Gly Leu Leu Ile Leu Ala Ser Lys

405 410 415

Asp Leu Gln Glu Tyr Thr Ser Val Ser Phe Arg Ile Phe Lys Ser Glu

420 425 430

Glu Lys Gly Phe Val Val Leu Met Cys Ser Asp Gln Ser Arg Ser Ser

435 440 445

Leu Asn Pro Thr Thr Asp Lys Ala Ser Tyr Cys Thr Phe Leu Asn Val

450 455 460

Asp Pro Ser Gln Glu Asp Ile Ser Leu Arg Thr Leu Ile Asp His Ser

465 470 475 480

Val Ile Glu Ser Phe Gly Ala Lys Gly Lys Ser Cys Ile Thr Ser Arg

485 490 495

Val Tyr Pro Thr Ile Ala Ile Asn Asp Asp Ala His Leu Tyr Val Phe

500 505 510

Asn Tyr Gly Ser Glu Ser Ile His Ile Lys Glu Leu Gln Ala Trp Asn

515 520 525

Met Asn Thr Ala His Val Gly

530 535

Claims

1.一种苦荞(Fagopyrum tataricum)来源的糖苷水解酶，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

2.编码权利要求1所述糖苷水解酶的基因。

3.按照权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的CDS的多核苷酸序列为(a)、(b)或(c)所示：

(a)SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；或

4.含有权利要求2或3所述基因的嵌合基因或表达盒。

5.含有权利要求2或3所述的基因的重组表达载体。

6.含有权利要求4所述嵌合基因或表达盒的重组表达载体。

7.按照权利要求5或6所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为重组植物表达载体。

8.权利要求1所述的糖苷水解酶在催化水杨酸类糖苷化合物进行水解反应生成对应产物中的应用。

9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的水杨酸类糖苷化合物是水杨酸-2-O-葡萄糖苷。

10.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用是催化水杨酸-2-O-葡萄糖苷的2-OH位的葡萄糖水解生成水杨酸。