ES2385489T3 - CCaMK quinasas implicadas en la nodulación y la endomicorrización - Google Patents
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Abstract
Método para regular la nodulación y/o la endomicorrización en una planta, comprendiendo dicho métodomodular la expresión o la actividad en dicha planta de una proteína quinasa dependiente del Ca2+- calmodulina(CCaMK).
Description
CCAMK quinasas implicadas en la nodulación y la endomicorrización
La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos que están implicados en la nodulación y la micorrización en plantas.
Una amplia variedad de plantas terrestres son capaces de asociarse, a través de su sistema radicular, con simbiontes microbianos.
Los más conocidos de estos sistemas endosimbióticos son aquellos que se producen entre las bacterias del suelo denominadas colectivamente como rhizobia y las raíces de muchas especies de legumbres (familia Leguminosae). La simbiosis legumbre-rizhobia fija tanto el nitrógeno existente como el procedente de la industria de los abonos químicos, gracias a la capacidad de las bacterias rizhobia de inducir la morfogénesis de nuevos órganos en la planta, nódulos en la raíz de las legumbres, con el que fijan nitrógeno.
Otro tipo importante de relaciones simbióticas entre plantas y microorganismos es la simbiosis de micorrizas arbusculares (MA), que se da no sólo en las legumbres, sino también en la mayoría de las plantas terrestres (una excepción notable es la familia Brassicaceae, que incluye la Arabidopsis thaliana), e implica hongos del orden Glomales (GIANINAZZI-PEARSON, Plant Cell, vol. 8, pág. 1871, 1996; HARRISON, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., vol. 50, pág. 361, 1999; BRUNDRETT, New phytologist, vol. 154, pág. 275, 2002).
Aunque a primera vista pueda parecer que la simbiosis legumbre-rhizobia y la simbiosis MA no tienen mucho en común, tanto las parejas fúngicas como las bacterianas tienen una capacidad sumamente restringida para desencadenar un programa genético en una planta hospedadora que permita una infección controlada y localizada.
Los estudios sobre la simbiosis legumbre-rhizobia han llevado a identificar la estructura e importancia de las señales rizobianas, los factores Nod lipo-quito-oligosacáridos, que inician respuestas simbióticas en las raíces de las legumbres hospedadoras y son necesarias para el reconocimiento, la infección controlada y la formación de nódulos (DÉNARIÉ, y col., Annu Rev Biochem, vol. 65, pág. 503, 1996; LEROUGE y col., Nature, vol. 344, pág. 781, 1990; GEURTS and BISSELING, Plant Cell, vol. 14, Suppl, S239, 2002). A concentraciones pico-nano molares, estas moléculas inducen diversas respuestas, incluyendo la afluencia rápida y el pulso del calcio, inducción génica específica, alteraciones en la morfología celular epidérmica y mitosis celular cortical (GEURTS and BISSELING, 2002, arriba mencionado).
Estudios genéticos en modelos de legumbre Medicago truncaluta y Lotus japonicus han llevado a identificar genes implicados en la percepción y transducción de los factores Nod. Recientemente se han clonado genes que codifican para dos tipos de serina/treonina-quinasas de tipo receptor transmembrana con regiones putativas extracelulares que contienen dominios LysM (LysM-RLKs), necesarias para las respuestas relativas a los factores Nod y a la infección rizobiana (RADUTOIU y col., Nature, vol. 425, pág. 585, 2003; LIMPENS y col., Science, vol. 302, pág. 630, 2003; MADSEN y col., Nature, vol. 425, pág. 637, 2003). Existe la hipótesis de que los productos génicos forman receptores de factor Nod heterodiméricos (RADUTOIU y col., 2003, arriba mencionado).
Aguas abajo estos genes, se han mapeado tres genes en M. truncatula, DMI1, DMI2 y DMI3, necesarios tanto para la nodulación como para la formación de micorrizas arbusculares (simbiosis MA). Los mutantes en DMI1, DMI2 y DMI3 están bloqueados para la mayoría de las respuestas a factores Nod: tienen un fenotipo similar y no inducen ramificación del pelo radicular (sino que, en su lugar, provocan hinchamiento del pelo), ni expresión génica de nodulina temprana, ni división celular cortical (CATOIRA y col., Plant Cell, vol. 12, pág. 1647, 2000). Sin embargo, se diferencian en su capacidad para responder a los factores Nod mediante la inducción de oscilaciones rápidas de la concentración de calcio citoplasmático (pulso de calcio), que se pierde en los mutantes dmi1 y dmi2, pero no en dmi3 (EHRHARDT y col., Cell, vol. 85, pág. 673, 1996; WAIS y col., Proc Natl Acad Sci USA, vol. 97, pág. 13407, 2000). Además, los mutantes en los genes DMI1 y DMI2 (= NORK), que son incapaces de formar nódulos y micorrizas (CATOIRA y col., 2000, arriba mencionado), son defectivos para la mayoría de las respuestas a factores Nod, incluyendo la respuesta del pulso del calcio, pero aún son capaces de generar la respuesta de afluencia rápida del calcio (EHRHARDT y col., 1996, arriba mencionado; SHAW and LONG, Plant Physiol, vol. 131, pág. 976, 2003).
Recientemente se ha demostrado que DMI2 codifica una proteína quinasa de tipo receptor LRR (NORK; ENDRE y col., Nature, vol. 417, pág. 962, 2002).
Los inventores han aislado y caracterizado ahora el gen DMI3 de M. truncatula y han descubierto que codifica un miembro de la pequeña familia vegetal de proteína quinasas dependientes de Ca2+-calmodulina quiméricas. También han identificado el gen DMI3 ortólogo en el guisante.
En diversas plantas se han descrito miembros del grupo CCaMK, que van desde el musgo Physcomitrella hasta plantas superiores, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. DMI3 es muy similar a las CCaMK del arroz, el tabaco y el lirio (73,5% de identidad entre CCaMK de lirio y Medicago). Todas estas proteínas comparten con las proteína quinasas vegetales dependientes del calcio (CDPK) más comunes un dominio quinasa N-terminal. Sin embargo, se diferencian de las CDPK en la estructura de su dominio regulador de unión de calcio C-terminal, que es más similar a un dominio de tipo visinina de mamífero (con tres manos EF de unión al Ca) que al dominio de tipo calmodulina típico de las CDPK (con cuatro manos EF). Entre el dominio quinasa y el dominio de unión de calcio se halla un dominio de unión de calmodulina que está solapado a un dominio autorregulador. Esta estructura permite regular la actividad de la quinasa tanto mediante el calcio como mediante la calmodulina (SATHYANARAYANAN y col., J Biol Chem, vol. 276, pág. 32940, 2001; TAKEZAWA y col., J Biol Chem, vol. 271, pág. 8126, 1996).
La Figura 1 muestra la comparación de CCaMK de M. truncatula (MtCCaMK) y P. sativum (PsCCaMK), caracterizadas por los inventores con respecto a CCaMK previamente caracterizadas de lirio (LlCCaMK: U24188), arroz (OsCCaMK: AK070533), tabaco (NtCCaMK: AF087813) y Physcomitrella (PpCCaMK: AY155462). Sobre las secuencias se indica el dominio de serina/treonina quinasa ( ), el sitio de unión de calmodulina ( ), los motivos de mano EF de unión de calcio ( ) y el sitio de autofosforilación (*) de las CCaMK. Bajo las secuencias se indica la firma del sitio activo de quinasa ( ). Entre las posiciones 60 y 75 de la secuencia de CCaMK de M. truncatula puede detectarse una señal de localización nuclear bipartita putativa, pero ésta no está presente en la secuencia de P. sativum.
Se sabe poco del papel biológico de las CCaMK en las plantas. El hecho de que las CCaMK del lirio, el tabaco y el arroz se expresen de manera preferente en puntas de raíces y anteras en desarrollo (POOVAIAH y col., Planta, vol. 209, pág. 161, 1999; WANG and POOVAIAH, J Biol Chem, vol. 274, pág. 12001, 1999) ha llevado a sugerir que podrían desempeñar un papel en la mitosis y la meiosis (YANG and POOVAIAH, Trends Plant Sci, vol. 8, pág. 505, 2003).
Los inventores demuestran aquí por primera vez, mediante el uso de mutantes de DMI3, que una CCaMK desempeña un papel en la vía de señalización que conduce a la endomicorrización y en el proceso de desarrollo de la nodulación en las legumbres. DMI3 parece actuar inmediatamente aguas abajo del pulso del calcio y aguas arriba de todas las demás respuestas simbióticas. Sin ceñirse a ningún mecanismo en particular, puede plantearse la hipótesis de que el pulso del calcio, y no la afluencia rápida de calcio, es la firma del calcio reconocida por DMI3, cuyo papel sería traducir esta señal a diversos componentes celulares que controlan las respuestas de nodulación y micorrización.
Los descubrimientos de la presente invención permiten suponer que las CCaMK previamente conocidas de las plantas no leguminosas, cuya función era desconocida hasta ahora, también desempeñan un papel en la endomicorrización en dichas plantas y, por tanto, que la modulación de la expresión o actividad de dichas CCaMK puede permitir regular la endomicorrización.
La presente invención proporciona medios para regular las respuestas de nodulación y/o endomicorrización de las plantas con respecto a simbiontes microbianos.
Así, La invención proporciona un método para regular la nodulación y/o endomicorrización en una planta, comprendiendo dicho método la modulación de la expresión o actividad de una CCaMK en dicha planta.
Según una realización preferente de la invención, dicha CCaMK tiene como mínimo un 80% de identidad o como mínimo un 90% de semejanza, preferentemente como mínimo un 85% de identidad o como mínimo un 90% de semejanza, en especial como mínimo un 90% de identidad o como mínimo un 95% de semejanza y en particular como mínimo un 95% de identidad o como mínimo un 99% de semejanza, con el polipéptido de SEQ ID nº: 2.
A no ser que se especifique de otra manera, los valores de identidad o semejanza de secuencia aquí proporcionados están calculados utilizando los programas BLAST (ALTSCHUL y col., Nucleic Acids Res., vol. 25, pág. 3389, 1997) con los parámetros por defecto y secuencia de referencia de longitud completa como ventana comparativa.
Según la invención, la expresión de una CCaMK en una planta puede aumentarse o disminuirse con el fin de modular la nodulación y/o endomicorrización.
La expresión de una CCaMK en una planta puede aumentarse, por ejemplo, expresando en dicha planta un constructo de ADN que produzca dicho polipéptido o alterando el promotor endógeno del gen de CCaMK para una sobreregulación positiva de la expresión génica; a la inversa, puede lograrse una disminución de la expresión de una CCaMK por ejemplo expresando en dicha planta un polinucleótido que induzca el silenciamiento de un gen de CCaMK, por ejemplo mediante una cosupresión o inhibición antisentido. También es posible utilizar ribozimas dirigidas a ARNm de CCaMK o alterar el promotor de CCaMK para una sub-regulación de la expresión génica.
La actividad de la CCaMK en una planta puede aumentarse, por ejemplo, expresando una CCaMK mutante desprovista del dominio autoinhibidor situado alrededor del dominio de unión de calmodulina, como el mutante dado a conocer por RAMACHANDIRAN y col. (J. Biochem. (Tokio), 121, 984-90, 1997). A la inversa, la actividad de la CCaMK en una planta puede disminuirse, por ejemplo, expresando una CCaMK que tenga una mutación que afecte a la función del dominio quinasa.
Preferentemente dicha CCaMK se selecciona de entre la CCaMK de Medicago truncatula de SEQ ID nº: 2 y la CCaMK de Pisum sativum de SEQ ID nº: 4.
SEQ ID nº: 1 es una secuencia de ADN genómico que codifica la CCaMK de Medicago truncatula de SEQ ID nº: 2; y SEQ ID nº: 3 es una secuencia de ADN genómico que codifica la CCaMK de Pisum sativum de SEQ ID nº: 4.
Otros polinucleótidos que codifican una CCaMK pueden obtenerse por métodos bien conocidos en la técnica actual, tales como el "screening" de librerías genómicas o de ADNc de cualesquiera especies de plantas leguminosas capaces de formar nódulos radiculares con rhizobia, utilizando cebadores y/o sondas de ácido nucleico obtenidos de SEQ ID nº: 1, 3 o cebadores o sondas degenerados obtenidos de SEQ ID nº: 2 ó 4.
A modo de ejemplo, tales polinucleótidos pueden obtenerse de librerías genómicas o de ADNc de Papilionoideae, en particular pertenecientes a cualquiera de los géneros Pisum, Glycine, Phaseol us o Medicago.
Un polinucleótido que codifique una CCaMK puede insertarse en un casete de expresión bajo el control de secuencias reguladoras que dirijan la transcripción y traducción del polinucleótido en una célula huésped deseada.
En general, dichas secuencias reguladoras comprenden como mínimo un promotor que impulsa la expresión en la célula hospedadora. Generalmente comprenden también un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación.
Todas o parte de dichas secuencias reguladoras pueden derivarse del gen de CCaMK natural o consistir en secuencias reguladoras heterólogas.
A modo de ejemplo, puede utilizarse el promotor endógeno del gen de CCaMK eventualmente alterado con el fin de realizar una sobre-regulación o una sub–regulación de la expresión génica; también puede sustituirse el promotor de CCaMK endógeno por un promotor heterólogo que proporcione un mayor o menor nivel de expresión y/o un perfil de expresión diferente (es decir un promotor que confiera una expresión inducible o constitutiva, regulada en cuanto al medio ambiente o el desarrollo o específica/selectiva de células o tejidos).
En la técnica actual existe una amplia gama de promotores adecuados para la expresión en diversos hospedadores.
En particular, entre los promotores capaces de dirigir la transcripción en células vegetales, se incluye una gran variedad de promotores, los cuales pueden obtenerse, por ejemplo, de plantas, virus de plantas o bacterias tales Agrobacterium. Incluyen promotores constitutivos, es decir promotores que son activos en la mayoría de los tejidos y células y bajo la mayoría de las condiciones medioambientales, promotores específicos de tejidos o células que son activos sólo o principalmente en ciertos tejidos o ciertos tipos de células y promotores inducibles que se activan mediante estímulos físicos o químicos.
Ejemplos no limitativos de promotores utilizados comúnmente en células vegetales son el promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, el promotor Nos, el promotor rubisco. Puede utilizarse ventajosamente un promotor específico de la raíz o preferido por la raíz.
Entre los ejemplos no limitativos de promotores específicos de raíz o preferidos por la raíz se incluyen el promotor de la alotioneína del maíz (de FRAMOND y col., FEBS 290, 103-106, 1991); EP 452269), el promotor de la quitinasa ácida descrito por SAMAC y col., (Plant Physiol. 93, 907-914, 1990), el promotor de la glutamino-sintetasa específico de la raíz de soja descrito por HIRE y col. (Plant Mol. Biol. 20, 207-218, 1992) o los promotores específicos de la raíz descritos en el documento WO/9113992 o en el documento US 5.837.848.
El casete de expresión puede insertarse en un vector hospedador mediante técnicas convencionales o de ingeniería genética. El vector hospedador puede ser cualquier vector adecuado para la transfección de una célula hospedadora deseada. A modo de ejemplo no limitativo, pueden derivarse vectores adecuados para la transfección de células vegetales y/o para el establecimiento de plantas transgénicas del plásmido inductor tumoral (Ti) de Agrobacterium tumefaciens.
Estos vectores pueden comprender también uno o varios genes marcadores que confieran un fenotipo seleccionable en las células hospedadoras. Ejemplos de genes marcadores son genes indicadores, tales como aquellos que codifican para beta-glucuronidasa (GUS), para proteína verde fluorescente (GFP), para luciferasa. Otros ejemplos de genes marcadores son genes de resistencia a antibióticos, tales como de resistencia a la kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, o genes de resistencia a herbicidas, tales como de resistencia a Basta.
La introducción de un polinucleótido que codifique una CCaMK en células o tejidos hospedadores puede llevarse a cabo por medios bien conocidos en la técnica actual, por ejemplo po transfección, microinyección, electroporación, transducción, introducción balística o similares. En caso de las células vegetales, también puede utilizarse la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes o ventajosamente por Agrobacterium tumefaciens.
Las células, tejidos u órganos transformados pueden utilizarse para regenerar plantas transgénicas. En la técnica actual son bien conocidos numerosos métodos de transformación celular y regeneración vegetal para diversas especies de plantas.
La invención proporciona también medios para evaluar las características de nodulación y/o endomicorrización de una planta, en particular de una legumbre.
En particular, la invención proporciona:
• un método para identificar un alelo de un gen de CCaMK asociado a determinadas características de nodulación y/o endomicorrización, comprendiendo dicho método el aislamiento de un fragmento de ácido nucleico que comprende el gen de CCaMK o una parte del mismo, a partir de como mínimo una planta que expresa dicho fenotipo, y la secuenciación de dicho fragmento.
La invención proporciona además:
• un método para identificar un polimorfismo en el gen de CCaMK asociado a un fenotipo de nodulación y/o endomicorrización, comprendiendo dicho método la identificación, según se describe más arriba, de como mínimo dos alelos diferentes de CCaMK asociados a diferentes fenotipos de nodulación y/o endomicorrización y la comparación de las secuencias de dichos alelos.
Una vez identificado un polimorfismo pueden diseñarse reactivos y kits que permitan la detección rutinaria de dicho polimorfismo. Los reactivos comúnmente utilizados son sondas de ácido nucleico o enzimas de restricción o cebadores de PCR o combinaciones de los mismos. La selección de un reactivo o de una combinación de reactivos depende de la naturaleza del polimorfismo.
Los kits y reactivos preferentes son los que comprendan un conjunto de cebadores que permitan una amplificación por PCR específica de un segmento de ADN que se extiende sobre el locus polimórfico. Para microsatélites y polimorfismos de inserción/deleción pueden ser suficientes los cebadores de PCR, dado que las formas alélicas del polimorfismo pueden diferenciarse por el tamaño del producto de amplificación. En el caso de los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), generalmente se utilizará también una enzima de restricción que permita diferenciar las formas alélicas por la presencia o el tamaño de los fragmentos de restricción.
La invención proporciona también un método para ensayar una planta en cuanto a sus características de nodulación y/o endomicorrización, comprendiendo dicho método la detección de si un alelo de un gen de CCaMK asociado a determinadas características de nodulación y/o endomicorrización está presente en dicha planta.
Según una realización preferente del método de la invención, dichas características de nodulación y/o endomicorrización son la falta de nodulación y/o endomicorrización, o una nodulación y/o endomicorrización reducida y que el alelo del gen de CCaMK asociado a dicho fenotipo no exprese ninguna CCaMK, o exprese un nivel menor de CCaMK, o una CCaMK menos activa que el alelo de tipo salvaje, o una CCaMK inactiva.
Ejemplos de alelos que dan como resultado dicho fenotipo son:
− alelos que presentan un deleción de todo o parte del gen de CCaMK, o que son variantes de corte y empalme del gen de CCaMK, y tienen como resultado la expresión de una CCaMK truncada;
− alelos que presentan una mutación que tiene como resultado la expresión de una variante menos activa o inactiva de CCaMK;
− alelos que presentan una mutación en el promotor de CCaMK que tiene como resultado una menor expresión de CCaMK.
En la Tabla 1 siguiente se citan a modo de ejemplo algunos alelos de CCaMK de Medicago truncatula y Pisum sativum que los inventores han descubierto están asociados a dicho fenotipo:
Tabla 1
- Campo genético
- Mutación
- Medicago truncatula
- deleción de 14 pb: 198-203/parada
- CGA/TGA: R97/parada
- CAA/TAA: Q230/parada
- CAA/TAA: Q230/parada
- CAA/TAA: Q230/parada
- Pisum sativum
- TGG/TGA: W240/parada
- TGT/TGA: S224/parada
- CTT/C-T: L188/parada
- GGG/AGG: G202/R
- TCT/TTT: S24/F
Todas estas mutaciones se hallan en el dominio quinasa.
A continuación se explica la presente invención en detalle mediante la descripción adicional siguiente, que se refiere a ejemplos de obtención y uso de polinucleótidos que codifican una CCaMK de la invención. Sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos se ofrecen sólo a modo ilustrativo de la invención y no constituyen en modo alguno una
5 limitación a la misma.
Se amplificó el gen DMI3 a partir de ADN genómico de M. truncatula de tipo salvaje Jemalong A17 (CATOIRA y col., 2000, arriba mencionado) y dos mutantes de dmi3, TRV25 (SAGAN y col., en Biological nitrogen fixation for the 21st century Elmerich, Kondorosi, Newton, Ed, Kluwer Academic Publishers, pág. 317-318, 1998) y T1-5, ambos defectivos 10 para la nodulación. El mutante T1-5 se obtuvo de una población de semillas mutagenizadas con EMS derivadas de Jemalong A17 ENOD11-GUS (JOURNET y col., Mol Plant Microbe Interact, vol. 14, pág. 737, 2001), mediante screening de las plántulas en cuanto a la falta de actividad GUS en las raíces después del tratamiento con factores Nod.
En la tabla II siguiente se muestran los cebadores PCR utilizados para la amplificación:
Tabla II
- Secuencia
- Cebador Pos. en SEQ ID 1:
- GGCCAAATGTTGAACAGTGA
- cand1A (SEQ ID nº: 5) 2819-2839
- GGGTTTTGATTGCTACTTGTGA
- cand1B (SEQ ID nº: 6) 3288-3315
- TCACCATGGGATATGGAACA
- cand2A (SEQ ID nº: 7) 3166-3185
- CCACAGTTGCAGCTTCAGTC
- cand2B (SEQ ID nº: 8) 3605-3624
- CTTTGTTCCGGTGGTGAACT
- cand3A (SEQ ID nº: 9) 3549-3568
- TGGACATGTTGAGTTTGACGA
- cand3B (SEQ ID nº: 10) 4050-4070
- TCGTGGTTTTAACAAAACTCCA
- cand4A (SEQ ID nº: 11) 3990-4011
- ATTTTGGGCAATGAAAGGTG
- cand4B (SEQ ID nº: 12) 4473-4491
- TTTCGTTAAACTCAACGTATCCAA
- cand5A (SEQ ID nº: 13) 4387-4410
- CATTTGAAGATAATGTCATGAAAAA
- cand5B (SEQ ID nº: 14) 4908-4932
- TGACTTAAAGGACCAATTTATAACAA
- cand6A (SEQ ID nº: 15) 4819-4844
- TCGACATTTTTGCCAGTTGA
- cand6B (SEQ ID nº: 16) 5383-5399
- AAATTTCACAAGGAACCAAACA
- cand7A (SEQ ID nº: 17) 5285-5306
- GAAGCAAAAGGGATCAATGATAA
- cand7B (SEQ ID nº: 18) 5828-5850
- TGTGCAGATAGAGACAATGCAA
- cand8A (SEQ ID nº: 19) 5765-5786
- CAAGTTATGAGGCCCCAATG
- cand8B (SEQ ID nº: 20) 6203-6222
- CAACATTGGGGCCTCATAAC
- cand9A (SEQ ID nº: 21) 6200-6219
- CAATCATATGGCAAAGCCTGT
- cand9B (SEQ ID nº: 22) 6765-6785
- ATCCATGCTCAGGGTAATGC
- cand10A (SEQ ID nº:23) 6674-6693
- ACGACGATCACACTCACAGG
- cand10B (SEQ ID nº:24) 7204-7223
- Las amplificaciones por PCR se realizaron utilizando la polimerasa Taq (IN VITROGEN) según las instrucciones del fabricante (MgCl2 2,5 mmol/1). Programa PCR: *1 ciclo (94º durante 5 min) * 30 ciclos (94º durante 15 s, 55º durante 15 s, 72º durante 1 min); * 1 ciclo (72º durante 7 min).
La secuencia genómica del DMI3 de tipo salvaje está representada en la lista de secuencias adjunta como SEQ ID nº: 1.
El gen DMI3 comprende 7 exones. El marco de lectura abierto de longitud completa de 1.569 nucleótidos codifica para
una proteína de 523 aminoácidos con una masa molecular prevista de 58.600 Da.
La posición de los intrones y exones en la secuencia SEQ ID nº: 1 es la siguiente:
exón: 3171-3901
exón2: 4467-4521
exón3: 4600-4710
exón4: 5000-5232
exón5: 5764-5971
exón6: 6627-6686
exón7: 6769-6942
Un análisis de la secuencia polipeptídica deducida indicaba que DMI3 pertenece al grupo de las proteína-quinasas dependientes del calcio y la calmodulina de las serina-treonina proteína-quinasas, junto con proteínas codificadas por genes previamente caracterizados de tabaco, lirio, arroz y musgo Physcomitrella (Figura 1).
Al igual que estas proteínas, DMI3 comparte con las proteína quinasas vegetales dependientes del calcio (CDPK) más comunes un dominio quinasa N-terminal. Sin embargo, se diferencia de las CDPK en la estructura de su dominio regulador de unión del calcio C-terminal, que es más similar a un dominio de tipo visinina de mamífero (con tres manos EF de unión de calcio) que al dominio de tipo calmodulina típico de las CDPK (con cuatro manos EF). Entre el dominio quinasa y el dominio de unión del calcio se halla un dominio de unión de calmodulina que está solapado a un dominio autorregulador. Esta estructura permite la regulación de la actividad de la quinasa tanto mediante el calcio como mediante la calmodulina.
En la Figura 2 se muestra esquemáticamente la estructura intrón-exón del gen DMI3 y la posición de los motivos y dominios de proteína previstos.
Se indican el dominio quinasa ( ), el dominio de unión de calmodulina (CaMB) ( ) y las manos EF de unión de calcio ( ).
Ejemplo 2: Complementación funcional de una mutación de DMI3 mediante el clon de cCaMK de tipo salvaje.
Se transformaron raíces de plántulas del mutante TRV25 de dmi3, defectivo para la nodulación (SAGAN y col., 1998, arriba mencionado), con Agrobacterium rhizogenes cepa Arqual, que incluye el plásmido pF5 que lleva el gen DMI3 de tipo salvaje.
Se clonó en pCAMBIA2201 (www.cambia.org) un fragmento Xbal de 11 kb, que llevaba la secuencia codificadora de DMI3 de tipo salvaje, 1.040 pb aguas arriba con respecto al codón de iniciación. El plásmido recombinante pF5 resultante se introdujo en A. rhizogenes Arqual mediante electroporación (MCCORMAC y col., Molecular Biotechnology, vol. 9, pág. 155, 1998). Se realizó una transformación de raíz en cabellera del mutante TRV25 de dmi3 como ya se ha descrito (BOISSON-DERNIER y col., Mol Plant Microbe Interact, vol. 14, pág. 695, 2001), con las siguientes modificaciones. En primer lugar se seleccionaron raíces transgénicas en un medio agar de Fahraeus complementado con canamicina (20 mg 1-1), luego se transfirieron las plántulas transformadas a bolsas y se inocularon con el simbionte rizobiano Sinorhizobium meliloti GMI6526 = RCR2011 (pXLGD4), que lleva un gen indicador lacZ para facilitar la visualización en planta de las bacterias.
Dos semanas después de la inoculación se puntuaron los nódulos. Los experimentos se realizaron dos veces. El 90% de las plantas presentaba raíces transformadas según se detectó por la actividad GUS. En total se ensayaron 45 plantas transformadas mediante pF5, 36 de éstas formaron nódulos con una media de 5 nódulos por planta. Un tratamiento con X-Gal y un examen microscópico de una muestra representativa de nódulos reveló la presencia de bacterias dentro de los nódulos. En las 26 plantas de control transformadas mediante el vector pCAMBIA2201 no se detectó ningún nódulo.
Esta complementación, junto con la evidencia genética descrita en el Ejemplo 1, demuestra que el DMI3 codifica una CCaMK necesaria para el fenotipo de nodulación y micorrización.
Ejemplo 3: Patrón de expresión de ARNm de DMI3 en M. truncatula
Se midieron los niveles de ARNm de DMI3 mediante una RT-PCR cuantitativa en hojas, tallos, flores, raíces, raíces 48 h tras la inoculación con S. meliloti, y nódulos de raíz de M. truncatula, y se normalizaron contra AtACTIN2 (MtACT2), que se expresa de manera constitutiva en todos los tejidos ensayados.
Se extrajo ARN total y se trató con ADNasaI. Se sintetizó ADNc a partir de 1 µg de ARN total utilizando el kit Taqman Gold RT-PCR (Perkin-Elmer Applied Biosystems) en un volumen total de 50 µl. Se realizaron reacciones RT-PCR cuantitativas por triplicado en 6,5 µl de ADNc utilizando el kit SYBR-GreenR PCR Master (Perkin-Elmer Applied Biosystems) (40 ciclos de 95ºC durante 10 s, 58ºC durante 1 min) y se realizó una detección en tiempo real en el ABI 7700 y un análisis utilizando el software GeneAmp 5700 SDS (Perkin-Elmer Applied Biosystems).
Cebadores utilizados:
DMI3-1: TCATTGATCCCTTTTGCTTCTCGT (SEQ ID nº: 25),
MtACT2: TGGCATCACTCAGTACCTTTCAACAG (SEQ ID nº: 27),
MtACT2-2: ACCCAAAGCATCAAATAATAAGTCAACC (SEQ ID nº: 28).
Los resultados se muestran en la Figura 3. En las raíces se observó una expresión de DMI3 10 veces mayor que en las flores, mientras que en las hojas y en los tallos no se detectó ninguna expresión significativa. Además, 48 h tras la
10 inoculación se observó una ligera sobre-regulación de la expresión radicular de DMI3 tanto en las raíces como en los nódulos de las raíces, en respuesta a la pareja simbionte S. meliloti.
En paralelo se estudió el gen DMI2 (=NORK), otro gen de M. truncatula necesario para la nodulación y la micorrización, cuya mutación tiene como resultado un fenotipo simbiótico similar al del mutante TRV25 de dmi3, aparte del enriquecimiento de calcio. Su patrón de expresión era similar al de DMI3, aunque el nivel de expresión era mayor en
15 DMI2 (datos no mostrados).
Ejemplo 4: Clonación y aislamiento de un homólogo de DMI3 en el guisante
Ya se han descrito en el guisante mutantes con fenotipos y posiciones de mapa sinténicas similares a las de TRV25. Como en los mutantes de dmi3, los mutantes de guisante en el locus sym9 están alterados inmediatamente aguas abajo con respecto a la respuesta de enriquecimiento del calcio inducida por tratamiento de los pelos radiculares con factores
20 Nod y son defectivos para el rizado de los pelos radiculares, la formación de hebras de infección, la nodulación y la endomicorrización.
Se realizó una amplificación por PCR a partir de ADN genómico de tipo salvaje y mutantes sym9 de P. sativum. Las plantas se muestran en la Tabla III siguiente:
Tabla III
- Variedad
- Referencia
- Frisson
- Tipo salvaje (DUC and MESSAGER, Plant Science, vol. 60, pág. 207, 1989)
- P1
- Mutante sym9 EMS de Frisson (DUC and MESSAGER, 1989, arriba mencionado)
- P2
- Mutante sym9 EMS de Frisson (DUC and MESSAGER, 1989, arriba mencionado)
- P3
- Mutante sym9 EMS de Frisson (DUC and MESSAGER, 1989, arriba mencionado)
- P53
- Mutante sym9 EMS de Frisson (SAGAN y col., Plant Science, vol. 100, pág. 59, 1994)
En la Tabla IV siguiente se indican los cebadores utilizados, diseñados en base a la secuencia de DMI3 de M. truncatula:
Tabla IV
- Secuencia
- Cebador Posición en SEQ ID 1
- GGTGGCGAACTTTTCGATAG
- pscand1 (SEQ ID nº:29) 705-724
- ACCTGAAAAACAATCAAAGCAA
- pscand2 (SEQ ID nº: 30) 1199-1220
- GCAGTTGACTCTCTCTTTGTCC
- pscand3 (SEQ ID nº: 31) 1-14
- TCTGTGCTATTTTCACCACCA
- pscand4 (SEQ ID nº: 32) 506-526
- AACGAGAGAGGACTACAATAGACGA
- pscand6 (SEQ ID nº: 33) 1104-1128
- TCAAAATCACAGCTGGAACC
- pscand7 (SEQ ID nº: 34) 1928-1947
- GGAAGAGGTGGATTTTCTGTTG
- pscand8 (SEQ ID nº: 35) 348-369
- TCAGGCTTCAAATCCCTATGA
- pscand9 (SEQ ID nº: 36) 821-841
- AAAATTGAAATCCTTGGTTGGA
- pscand10 (SEQ ID nº: 37) 1696-1717
- AACACAAACGGAGAGCATCC
- pscand11 (SEQ ID nº: 38) 2161-2180
- AGAAAATCGTGAGGCGGATT
- pscand12 (SEQ ID nº: 39) 1887-1906
- TTGGTGATGCATCCTGATCT
- pscand13 (SEQ ID nº: 40) 2282-2305
- TTGTGGCTTTTCGAGTCTCA
- pscand14 (SEQ ID nº: 41) 2125-2144
- GCAGCTTTGAATTCATCAAATGTA
- pscand15 (SEQ ID nº: 42) 2511-2534
- TGGACGAATAGAAGAGAGAACTACA
- pscand16 (SEQ ID nº: 43) 2562-
- Las amplificaciones por PCR se realizaron utilizando la polimerasa Taq (IN VITROGEN) según las instrucciones del fabricante (MgCl2 2,5 mmol/1). Programa de PCR: *1 ciclo (94º durante 5 min); * 30 ciclos (94º durante 15 s, 55º durante 15 s, 72º durante 1 min) * 1 ciclo (72º durante 7 min).
La secuencia genómica obtenida de P. sativum cv Frisson de tipo salvaje está representada en la lista de secuencias 5 adjunta como SEQ ID nº: 3. El gen comprende 7 exones. Codifica una CCaMK con una gran semejanza global (90% de identidad) con la de M. truncatula. La posición de los intrones y exones en la secuencia SEQ ID nº: 2 es la siguiente: exón1: 294-1048 10 exón2: 1219-1273 exón3: 1349-1459 exón4: 1541-1773 exón5: 1978-2192 exón6: 2284-2330 15 exón7: 2416-parada
Todas las CCaMK secuenciadas de ocho mutantes sym9 de P. sativum, obtenidas en tres contextos genéticos diferentes presentaron alteraciones de un solo par de bases en el dominio quinasa, que según lo previsto alterarían la función de la CCaMK. Esto confirma adicionalmente el papel de la CCaMK en la nodulación y la micorrización. Además, permite la caracterización molecular de un gen principal que controla tanto la nodulación como la micorrización en el guisante, un importante cultivo de granos de leguminosa.
Para la amplificación por PCR de ADN genómico de P. sativum SYM9 en las diferentes variedades de tipo salvaje cultivadas y mutantes sym9 se utilizaron diversas combinaciones de los cebadores siguientes, diseñados en base a la secuencia de DMI3 de M. truncatula.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE DEBELLE, Frédéric LEVY, Julien; BRES, Cécile; ROSENBERG, Charles
<120> CCaMK que interviene en la nodulación y la endomicorrización
<130> MJPbv539/122
<150> EP04290107.4
<151> 2004/01/15
<160> 43
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 11200
<212> ADN
<213> Medicago truncatula
<220>
<221> exón
<222> (3171)..(3901)
<223>
<220>
<221> exón
<222> (4467) .. (4521)
<223>
<220>
<221> exón
<222> (4600)..(4710)
<223>
<220>
<221> exón
<222> (5000) .. (5232)
<223>
<220>
<221> exón
<222> (5764) .. (5971) <223>
<220>
<221> exón
<222> (6627)..(6686) 5 <223>
<220>
<221> exón
<222> (6769)..(6942)
<223> 10 <400> 1
<210> 2
<211> 523
<212> PRT
<213> Medicago truncatula
<400> 2
<210> 3
<211> 2586
<212> ADN
<213> Pisum sativum
<220>
<221> exón
<222> (294) .. (1048)
<223>
<220>
<221> exón
<222> (1219)..(1273)
<223>
<220>
<221> exón
<222> (1349)..(1459)
<223>
<220>
<221> exón
<222> (1541)..(1773)
<223>
<220>
<221> exón
<222> (1978)..(2192)
<223>
<220>
<221> exón
<222> (2284)..(2330)
<223>
<220>
<221> exón
<222> (2416) .. (2586)
<223>
<400> 3
<210> 4
<211> 529
<212> PRT
<213> Pisum sativum
<400> 4
- <210> 5
- <211> 20
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador de PCR
- <400> 5
- ggccaaatgt tgaacagtga
- 20
- <210> 6
- <211> 22
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador de PCR
- <400> 6
- gggttttgat tgctacttgt ga
- 22
- <210> 7
- <211> 20
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador de PCR
- <400> 7
- tcaccatggg atatggaaca
- 20
<210> 8
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 8 ccacagttgc agcttcagtc
<210> 9
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 9 ctttgttccg gtggtgaact
<210> 10
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 10 tggacatgtt gagtttgacg a
<210> 11
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 11 tcgtggtttt aacaaaactc ca
<210> 12
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
22 <223> Cebador de PCR
<400> 12 attttgggca atgaaaggtg
<210> 13
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 13 tttcgttaaa ctcaacgtat ccaa
<210> 14
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 14 catttgaaga taatgtcatg aaaaa
<210> 15
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 15 tgacttaaag gaccaattta taacaa
<210> 16
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 16 tcgacatttt tgccagttga
<210> 17
<211> 22
20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 17 aaatttcaca aggaaccaaa ca
<210> 18
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 18 gaagcaaaag ggatcaatga taa
<210> 19
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 19 tgtgcagata gagacaatgc aa
<210> 20
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 20 caagttatga ggccccaatg
<210> 21
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 21
caacattggg gcctcataac
<210> 22
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 22 caatcatatg gcaaagcctg t
<210> 23
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 23 atccatgctc agggtaatgc
<210> 24
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 24 acgacgatca cactcacagg
<210> 25
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 25 tcattgatcc cttttgcttc tcgt
<210> 26
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
24 <220> <211> 22
- <223> Cebador de PCR
- <400> 26
- gatgctactt cctctttgct gatgc
- 25
- <210> 27
- <211> 26
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador de PCR
- <400> 27
- tggcatcact cagtaccttt caacag
- 26
- <210> 28
- <211> 28
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador de PCR
- <400> 28
- acccaaagca tcaaataata agtcaacc
- 28
- <210> 29
- <211> 20
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador de PCR
- <400> 29
- ggtggcgaac ttttcgatag
- 20
- <210> 30
- <211> 22
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador de PCR
- <400> 30
- acctgaaaaa caatcaaagc aa
- 22
- <210> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 31 gcagttgact ctctctttgt cc
<210> 32
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 32 tctgtgctat tttcaccacc a
<210> 33
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 33 aacgagagag gactacaata gacga
<210> 34
<211> 20’
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 34 tcaaaatcac agctggaacc
<210> 35
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
20 <400> 35
ggaagaggtg gattttctgt tg
<210> 36
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 36 tcaggcttca aatccctatg a
<210> 37
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 37 aaaattgaaa tccttggttg ga
<210> 38
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 38 aacacaaacg gagagcatcc
<210> 39
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de PCR
<400> 39 agaaaatcgt gaggcggatt
<210> 40
<211> 20
<212> ADN
20 <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador de PCR
- <400> 40
- ttggtgatgc atcctgatct
- 20
- <210> 41
- <211> 20
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador de PCR
- <400> 41
- ttgtggcttt tcgagtctca
- 20
- <210> 42
- <211> 24
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador de PCR
- <400> 42
- gcagctttga attcatcaaa tgta
- 24
- <210> 43
- <211> 25
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador de PCR
- <400> 43
- tggacgaata gaagagagaa ctaca
- 25
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Método para regular la nodulación y/o la endomicorrización en una planta, comprendiendo dicho método modular la expresión o la actividad en dicha planta de una proteína quinasa dependiente del Ca2+-calmodulina (CCaMK).5 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha CCaMK tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad o con al menos un 90% de semejanza con el polipéptido de SEQ ID nº: 2.
- 3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha CCaMK se selecciona de entre la CCaMK de Medicago truncatula, con SEQ ID nº: 2, y la CCaMK de Pisum sativum, con SEQ ID nº: 4.
- 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la expresión o la actividad de 10 dicha CCaMK en la planta se incrementa para aumentar la nodulación y/o la endomicorrización.
-
- 5.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la expresión o la actividad de dicha CCaMK en la planta se disminuye para reducir la nodulación y/o la endomicorrización.
-
- 6.
- Método para identificar un alelo de un gen de CCaMK, estando dicho alelo asociado a un fenotipo determinado de características de nodulación y/o endomicorrización y comprendiendo dicho método el aislamiento de un
15 fragmento de ácido nucleico que comprende el gen de CCaMK o una parte del mismo, a partir de como mínimo una planta que expresa dicho fenotipo, y la secuenciación de dicho fragmento. - 7. Método para ensayar una planta en cuanto a sus características de nodulación y/o endomicorrización, comprendiendo dicho método la detección de si un alelo de un gen de CCaMK asociado a determinadas características de nodulación y/o endomicorrización está presente en dicha planta.
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