CN112899249B

CN112899249B - 延龄草苷鼠李糖基转移酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN112899249B
Application number: CN202110135141.4A
Authority: CN
Inventors: 黎佳; 杨世辉
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2041-02-01
Also published as: CN112899249A

Abstract

本发明公开了一种延龄草苷鼠李糖基转移酶及其编码基因与应用，本发明首次从盾叶薯蓣中分离得到一个关键延龄草苷鼠李糖基转移酶基因，获得其基因序列以及氨基酸序列，并将鼠李糖基转移酶基因转入大肠杆菌进行了异源表达，重组蛋白经纯化后能催化底物延龄草苷转化成薯蓣次苷A。本发明将为薯蓣次苷A的合成提供必要的基因资源，为薯蓣次苷A在异源生物中的高效合成奠定基础，同时也有益于薯蓣皂苷和其它相关的甾体皂苷的异源生物合成，有广阔的应用前景。

Description

延龄草苷鼠李糖基转移酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种延龄草苷鼠李糖基转移酶及其编码基因与应用。

背景技术

盾叶薯蓣以根状茎入药，是我国传统常用中药材，被《中华人民共和国药典》收载，具有清肺止咳、利尿通淋、通经止痛和解毒消肿等功效。盾叶薯蓣的主要活性成分是甾体皂苷，其中薯蓣皂苷是盾叶薯蓣甾体皂苷中主要成分之一，薯蓣皂苷具有抗肿瘤、降血糖、降脂、抗氧化、抗炎、抗抑郁、抗病菌和病毒，抑制肝脏纤维化，保护肺和肾，改善更年期的骨质疏松，缓解类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎病症，预防黑色素色素沉着，驱虫等多种活性，其次级苷薯蓣次苷A也具有明显的抗肿瘤、抗血小板聚集、抗菌等活性，鉴于薯蓣皂苷和薯蓣次苷A的多种药理活性，它们很可能被开发成治疗多种疾病的新药物，有着极其广阔的应用前景。薯蓣皂苷和薯蓣次苷A的苷元都是薯蓣皂苷元，薯蓣皂苷 3 位糖链由一个葡萄糖基和两个鼠李糖基组成，而薯蓣次苷A 的3 位糖链由一个葡萄糖基和一个鼠李糖基组成。目前将薯蓣皂苷元催化成延龄草苷（3 位糖链由一个葡萄糖基组成）的葡萄糖基转移酶基因已有报道，尚没有参与薯蓣次苷A、薯蓣皂苷合成的鼠李糖基转移酶基因的相关报道。

因此参与薯蓣次苷A合成相关的鼠李糖基转移酶基因的挖掘将为异源生物合成薯蓣次苷A提供新的基因资源，为薯蓣次苷A的高效合成奠定基础，同时也有益于薯蓣皂苷和其它相关的甾体皂苷的异源生物合成。

发明内容

本发明提供一种延龄草苷鼠李糖基转移酶及其编码基因与应用。

一种延龄草苷鼠李糖基转移酶，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；

或者，如SEQ ID NO.2所示的蛋白质的羧基端或氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；

或者，将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到具有延龄草苷鼠李糖基转移酶活性的蛋白质；

或者，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列限定的蛋白质分子具有90％以上的同一性的蛋白质分子。

编码上述鼠李糖基转移酶的基因。

编码鼠李糖基转移酶的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；

或者，与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

含有上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

所述的鼠李糖基转移酶或所述的基因在异源生物合成薯蓣次苷A、薯蓣皂苷及其它相关甾体皂苷的应用。

制备延龄草苷鼠李糖基转移酶蛋白质的方法，其特征在于：

将所述的延龄草苷鼠李糖基转移酶蛋白质的编码基因导入植物、动物或微生物受体细胞，得到表达延龄草苷鼠李糖基转移酶蛋白质的重组受体细胞，表达得到延龄草苷鼠李糖基转移酶蛋白质。

所述延龄草苷鼠李糖基转移酶蛋白质来源于盾叶薯蓣（Dioscoreazingiberensis）。

本发明中，“同一性”是指与天然核酸序列或氨基酸序列相似性。两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明具有如下优异效果：本发明首次从盾叶薯蓣中分离得到一个关键延龄草苷鼠李糖基转移酶基因，获得其基因序列以及氨基酸序列，并将鼠李糖基转移酶基因转入大肠杆菌进行了异源表达，重组蛋白经纯化后能催化底物延龄草苷转化成薯蓣次苷A。

本发明将为薯蓣次苷A的合成提供必要的基因资源，为薯蓣次苷A在异源生物中的高效合成奠定基础，同时也有益于薯蓣皂苷和其它相关的甾体皂苷的异源生物合成，有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的盾叶薯蓣叶的总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，M为DNA分子量标准，1为叶总RNA。

图2为本发明PCR扩增延龄草苷鼠李糖基转移酶基因(DzGT1)的全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果图，其中：M为DNA分子量标准，1为PCR扩增产物。

图3为本发明重组蛋白的SDS-PAGE检测图，其中A为纯化的DzGT1重组蛋白的检测图，B为纯化的RHM2重组蛋白的检测图。M为蛋白质分子量标准。

图4为本发明DzGT1体外酶活性的HPLC检测图谱。

具体实施方式

实施例一、延龄草苷鼠李糖基转移酶基因的全长cDNA序列的获得。

1、提取盾叶薯蓣叶的总RNA（图1）。

具体方法如下：称取约100 mg左右盾叶薯蓣叶片样品，切碎后在液氮中进行快速研磨，将磨好的样品粉末用EASYspin plus植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱）提取总RNA。

2、将RNA逆转录成cDNA

利用RevertAid逆转录试剂盒（Thermo Scientific）将RNA逆转录成cDNA。

具体方法如下：向无RNase的PCR管中加入以下成分：RNA：7.5 μl（约1 μg），DNaseI: 1 μl，10×DNase I buffer：1 μl，RNase抑制剂：0 .5 μl。将上述物质混匀，37℃，温育30min。然后加入1 μl 50 mM EDTA，65℃孵育10 min终止反应。在上述混合物的PCR管中加入1 μl Oligo (dT)18（0.5μg/μl）70℃处理5 min，然后立即置于冰上。然后依次加入4 μl的5 ×逆转录酶buffer，1 μl的RNase抑制剂、2 μl dNTP mix(10 mM)、1 μl无RNAase水和1 μl逆转录酶混匀后42℃，保温1小时，合成第一链cDNA。然后70℃，10min，终止反应。cDNA于-80℃冰箱保存。

3、从盾叶薯蓣的转录组数据库拼接unigene集中得到延龄草苷鼠李糖基转移酶基因(命名为DzGT1)的cDNA序列信息，以盾叶薯蓣的cDNA为模板，利用PCR技术扩增DzGT1，所使用引物对为：DzGT1-F 5' GATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGGCCACCCATGCC 3'和DzGT1-R 5'TCAGTCAGTCACGATGAATTCTCAAGCGGTAGCAGCATC 3'。20 μl PCR反应体系为：0.5 μl cDNA模板，引物DzGT1-F与DzGT1-R各0.4 μl，Fastpfu DNA 聚合酶0.2 μl，5X buffer 4 μl，ddH2O14.5 μl。 PCR反应条件：95℃预变性1 min；循环程序为95℃变性20 s，53℃退火20 s，72℃延伸50 s，35个循环，最后72℃，延伸5 min。反应结束后，取5 μl反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，泳道M为DL 2000 DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物，目的片段大小为1500 bp左右（图2）。回收并纯化PCR产物，将其连接到pMD 18-T 载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，之后进行菌落PCR筛选阳性克隆，提取阳性克隆的质粒进行测序。结果表明，该片段的长度为 1479bp，其序列如 SEQ IDNO ：1 所示。

实施例二、含延龄草苷鼠李糖基转移酶基因的重组表达载体构建与重组蛋白表达及纯化。

将延龄草苷鼠李糖基转移酶基因DzGT1克隆到pGEX-2T的多克隆位点得到重组质粒，并使糖基转移酶蛋白的N端与GST标签融合，热激后转入原核表达菌株大肠杆菌BL21中,经鉴定后，挑取单菌落进行培养并用IPTG诱导重组蛋白的表达，借助 GST亲和层析柱对融合蛋白进行分离纯化。纯化的蛋白见图3A。将来源于拟南芥的鼠李糖合成酶(Rhamnosesynthase)基因RHM2（鼠李糖合成酶RHM2催化底物UDP-葡萄糖生成UDP-鼠李糖）克隆到pET-28a的多克隆位点得到重组质粒，并使得鼠李糖合成酶蛋白的N端与HIS标签融合，热激后转入原核表达菌株大肠杆菌Rosetta TM（DE3）中, 经鉴定后，挑取单菌落进行培养并用IPTG诱导重组蛋白的表达，借助镍亲和层析柱对融合蛋白进行分离纯化。纯化的蛋白见图3B。

实施例三、延龄草苷鼠李糖基转移酶体外催化反应。

体外酶反应于30℃在200 μl的Tris–HCl（50 mM, pH8.0）缓冲液中进行，反应体系中包含5 µg左右纯化的DzGT1蛋白(对照中不加入DzGT1蛋白）, RHM2蛋白约20 µg，2 mMDTT，2 mM NADPH， 2 mM的UDP-葡萄糖和200μM的底物，反应结束后，反应液用乙酸乙酯抽提，挥干后用于HPLC检测。HPLC检测结果如图4所示，不加酶DzGT1的对照中，没有产物峰的生成，而加入DzGT1的反应液中能检测到产物（峰1）的生成，其保留时间与薯蓣次苷A一致。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 延龄草苷鼠李糖基转移酶及其编码基因与应用

<130> 20210130

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1479

<212> DNA

<213> 盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)

<400> 1

atggccaccc atgccgggca cgagccacgc cccctgcgcg tgttcttcat ccctttcttc 60

gccactgggc acatgatccc catggtcgac atcgcgcgcc tatttgccgc ccgcggcgtc 120

gacgccaccg ttctcgtcac cccctccaac gccgcactca tatcacgcac catcgacgac 180

gctgccgcta gtggcctccc gatccgcact cttctctacc ccttcccctc cgccgaggtc 240

ggcctccctc ccggcgcgga gaacatcgcc tctgtccccc tcgctgacgc tcccaaggtt 300

gacgccgcct ccctcctcac cgccggcgat cacgaccggc tcctccgact ccaccacccc 360

gacgccgtcg tctccgacac ccacttcgcc tggacgacct ctatcgcgag ggacctccgc 420

atcccccgca taaccttcca cgccattggt ctcttcccag tctgcgtcct tggcagcctc 480

atccgcaacc tcccgcacct ctccgtcacc gacgacgtcc accccttcat cgtccccgac 540

ctccctcacc ccgtccagat gttccgcccg gagctcccag acttcctccg ctccgaaaac 600

accgccatcg cccaagccat gtctgccctc aacgaggccg aggccggcag ccttggcgtc 660

gtcgttaaca gcttcgctga gatagagtcc gcctacgctg actgttacta caagttcgac 720

aatatgcgga cgtggttcgt cggtcccgtg gcgcttgccg acggcggcga gaaagcgtca 780

cgcggcgccg cggcggacgc gaaagcggtt gccaacaggg aactgtgcat gaggtggctg 840

gataagcaga gggagaggtc ggtggtgtac gcgtgcttcg ggagctggtg ccacttctcg 900

gcggcgcagc tgagggagct ggcactgggg ctggaggcgg ccgggcaccc gttcttgtgg 960

gtggtgaggg atgacggcga ggagtggatg ccggagggat tcgaggagag actcggggag 1020

aagggattgg tggtgagagg gtgggccccg caggtggcgg tgctgggcca cgacgctgtc 1080

ggagggttcg tgacgcactg tggatggaac tcggtgctgg aaggggtgag ctccgggttg 1140

ccgatggtga cgtggccgct gtcgacagag cagttcatca atgagaagct ggtggtggag 1200

gtgctgggga cggcggtgag ggcgtgggag gggttcagga gcacggagga gggggagaag 1260

gaggtggtca aagccggaga cgtcgcggcg gcggtggaga aggtgatggg tggcggggag 1320

gaaggggaga agagaagggt aacggcgagg gagtttgggg agaaggctaa ggctgcggtc 1380

aaagtcggtg ggtcctccta cgagggtctc agccgtttga ttggtgagat tagggattgg 1440

cctaagaaga tcaacggttg tgatgctgct accgcttga 1479

<210> 2

<211> 492

<212> PRT

<213> 盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)

<400> 2

Met Ala Thr His Ala Gly His Glu Pro Arg Pro Leu Arg Val Phe Phe

1 5 10 15

Ile Pro Phe Phe Ala Thr Gly His Met Ile Pro Met Val Asp Ile Ala

20 25 30

Arg Leu Phe Ala Ala Arg Gly Val Asp Ala Thr Val Leu Val Thr Pro

35 40 45

Ser Asn Ala Ala Leu Ile Ser Arg Thr Ile Asp Asp Ala Ala Ala Ser

50 55 60

Gly Leu Pro Ile Arg Thr Leu Leu Tyr Pro Phe Pro Ser Ala Glu Val

65 70 75 80

Gly Leu Pro Pro Gly Ala Glu Asn Ile Ala Ser Val Pro Leu Ala Asp

85 90 95

Ala Pro Lys Val Asp Ala Ala Ser Leu Leu Thr Ala Gly Asp His Asp

100 105 110

Arg Leu Leu Arg Leu His His Pro Asp Ala Val Val Ser Asp Thr His

115 120 125

Phe Ala Trp Thr Thr Ser Ile Ala Arg Asp Leu Arg Ile Pro Arg Ile

130 135 140

Thr Phe His Ala Ile Gly Leu Phe Pro Val Cys Val Leu Gly Ser Leu

145 150 155 160

Ile Arg Asn Leu Pro His Leu Ser Val Thr Asp Asp Val His Pro Phe

165 170 175

Ile Val Pro Asp Leu Pro His Pro Val Gln Met Phe Arg Pro Glu Leu

180 185 190

Pro Asp Phe Leu Arg Ser Glu Asn Thr Ala Ile Ala Gln Ala Met Ser

195 200 205

Ala Leu Asn Glu Ala Glu Ala Gly Ser Leu Gly Val Val Val Asn Ser

210 215 220

Phe Ala Glu Ile Glu Ser Ala Tyr Ala Asp Cys Tyr Tyr Lys Phe Asp

225 230 235 240

Asn Met Arg Thr Trp Phe Val Gly Pro Val Ala Leu Ala Asp Gly Gly

245 250 255

Glu Lys Ala Ser Arg Gly Ala Ala Ala Asp Ala Lys Ala Val Ala Asn

260 265 270

Arg Glu Leu Cys Met Arg Trp Leu Asp Lys Gln Arg Glu Arg Ser Val

275 280 285

Val Tyr Ala Cys Phe Gly Ser Trp Cys His Phe Ser Ala Ala Gln Leu

290 295 300

Arg Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Ala Ala Gly His Pro Phe Leu Trp

305 310 315 320

Val Val Arg Asp Asp Gly Glu Glu Trp Met Pro Glu Gly Phe Glu Glu

325 330 335

Arg Leu Gly Glu Lys Gly Leu Val Val Arg Gly Trp Ala Pro Gln Val

340 345 350

Ala Val Leu Gly His Asp Ala Val Gly Gly Phe Val Thr His Cys Gly

355 360 365

Trp Asn Ser Val Leu Glu Gly Val Ser Ser Gly Leu Pro Met Val Thr

370 375 380

Trp Pro Leu Ser Thr Glu Gln Phe Ile Asn Glu Lys Leu Val Val Glu

385 390 395 400

Val Leu Gly Thr Ala Val Arg Ala Trp Glu Gly Phe Arg Ser Thr Glu

405 410 415

Glu Gly Glu Lys Glu Val Val Lys Ala Gly Asp Val Ala Ala Ala Val

420 425 430

Glu Lys Val Met Gly Gly Gly Glu Glu Gly Glu Lys Arg Arg Val Thr

435 440 445

Ala Arg Glu Phe Gly Glu Lys Ala Lys Ala Ala Val Lys Val Gly Gly

450 455 460

Ser Ser Tyr Glu Gly Leu Ser Arg Leu Ile Gly Glu Ile Arg Asp Trp

465 470 475 480

Pro Lys Lys Ile Asn Gly Cys Asp Ala Ala Thr Ala

485 490

Claims

1.一种延龄草苷鼠李糖基转移酶，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；

或者，如SEQ ID NO.2所示的蛋白质的羧基端或氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。

2.编码权利要求1所述鼠李糖基转移酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

4.含有权利要求3所述的基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

5.根据权利要求1所述的鼠李糖基转移酶或权利要求2所述的基因在异源生物合成薯蓣次苷A、薯蓣皂苷及其它相关甾体皂苷的应用。

6.制备权利要求1所述延龄草苷鼠李糖基转移酶的方法，其特征在于：

将权利要求1所述的延龄草苷鼠李糖基转移酶的表达基因导入植物、动物或微生物受体细胞，得到表达权利要求1所述延龄草苷鼠李糖基转移酶的重组受体细胞，表达得到权利要求1所述的延龄草苷鼠李糖基转移酶。

7.根据权利要求1所述延龄草苷鼠李糖基转移酶蛋白质来源于盾叶薯蓣。