RU2020105343A - Экспрессирующие cas мышиные эмбриональные стволовые клетки и мыши и их применения - Google Patents

Экспрессирующие cas мышиные эмбриональные стволовые клетки и мыши и их применения Download PDF

Info

Publication number
RU2020105343A
RU2020105343A RU2020105343A RU2020105343A RU2020105343A RU 2020105343 A RU2020105343 A RU 2020105343A RU 2020105343 A RU2020105343 A RU 2020105343A RU 2020105343 A RU2020105343 A RU 2020105343A RU 2020105343 A RU2020105343 A RU 2020105343A
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
human animal
cas
expression cassette
coding sequence
protein
Prior art date
Application number
RU2020105343A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2782358C2 (ru
RU2020105343A3 (ru
Inventor
Гочунь ГУН
Шарлин ХАНТ
Дайсуке КАДЖИМУРА
Сюзанн ХАРТФОРД
Брайан Замбрович
Original Assignee
Регенерон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Регенерон Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Регенерон Фармасьютикалз, Инк.
Publication of RU2020105343A publication Critical patent/RU2020105343A/ru
Publication of RU2020105343A3 publication Critical patent/RU2020105343A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2782358C2 publication Critical patent/RU2782358C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
    • A01K2217/206—Animal model comprising tissue-specific expression system, e.g. tissue specific expression of transgene, of Cre recombinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism

Claims (71)

1. Способ испытания способности CRISPR/Cas-нуклеазы модифицировать целевой геномный локус in vivo, предусматривающий:
(a) введение не являющемуся человеком животному гидовой РНК, предназначенной для нацеливания на целевую последовательность для гидовой РНК в целевом геномном локусе,
причем не являющееся человеком животное содержит геномно интегрированную экспрессионную кассету Cas, содержащую кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащую один или несколько сигналов ядерной локализации, и
причем гидовую РНК вводят посредством опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV) доставки; и
(b) оценку модификации целевого геномного локуса.
2. Способ по п. 1, в котором AAV представляет собой AAV7, AAV8 или AAV9, и стадия (b) предусматривает оценку модификации целевого геномного локуса в печени.
3. Способ по п. 2, в котором AAV представляет собой AAV8.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором путь введения AAV не являющемуся человеком животному представляет собой внутривенную инъекцию, интрапаренхиматозную инъекцию, интраперитонеальную инъекцию, закапывание в нос или интравитреальную инъекцию.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором экзогенную донорную нуклеиновую кислоту вводят на стадии (a), причем экзогенная донорная нуклеиновая кислота предназначена для рекомбинации с целевым геномным локусом.
6. Способ по п. 5, в котором экзогенная донорная нуклеиновая кислота представляет собой одноцепочечный олигодезоксинуклеотид (ssODN).
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором не являющееся человеком животное представляет собой крысу или мышь.
8. Способ по п. 7, в котором не являющееся человеком животное представляет собой мышь.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором целевой геномный локус содержит целевой ген, и стадия (b) предусматривает измерение экспрессии целевого гена или активности белка, кодируемого целевым геном.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором стадия (b) предусматривает секвенирование целевого геномного локуса в одной или нескольких клетках, выделенных из не являющегося человеком животного.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором стадия (b) предусматривает выделение целевого органа или ткани из не являющегося человеком животного и оценку модификации целевого геномного локуса в целевом органе или ткани.
12. Способ по п. 11, в котором стадия (b) предусматривает оценку модификации целевого геномного локуса в двух или более различных типах клеток в пределах целевого органа или ткани.
13. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором стадия (b) предусматривает выделение нецелевого органа или ткани из не являющегося человеком животного и оценку модификации целевого геномного локуса в нецелевом органе или ткани.
14. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором белок Cas представляет собой белок Cas9.
15. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором экспрессионная кассета Cas дополнительно содержит сигнал полиаденилирования выше кодирующей последовательности для белка Cas, причем сигнал полиаденилирования фланкирован сайтами распознавания рекомбиназы, и причем сигнал полиаденилирования в экспрессионной кассете Cas был вырезан тканеспецифическим образом.
16. Способ по п. 15, в котором сигнал полиаденилирования выше кодирующей последовательности для белка Cas был вырезан в печени.
17. Способ по п. 15 или 16, в котором рекомбиназа, которая распознает сайты распознавания рекомбиназы в экспрессионной кассете Cas, представляет собой Cre-рекомбиназу.
18. Способ по п. 17, в котором не являющееся человеком животное дополнительно содержит геномно интегрированную экспрессионную кассету Cre-рекомбиназы, содержащую кодирующую Cre-рекомбиназу последовательность, функционально связанную с тканеспецифическим промотором.
19. Способ по п. 17 или 18, в котором ген Cre-рекомбиназы функционально связан с одним из промоторов, представленных в таблице 2.
20. Способ по любому из пп. 1-14, в котором экспрессионная кассета Cas дополнительно содержит сигнал полиаденилирования выше кодирующей последовательности для белка Cas, причем сигнал полиаденилирования фланкирован сайтами распознавания рекомбиназы, и причем способ дополнительно предусматривает введение рекомбиназы не являющемуся человеком животному тканеспецифическим образом.
21. Способ по п. 20, в котором рекомбиназу вводят посредством опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV) доставки или опосредованной липидными наночастицами (LNP) доставки.
22. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором экспрессионная кассета Cas дополнительно содержит кодирующую флуоресцентный белок последовательность.
23. Способ по п. 22, в котором экспрессионная кассета Cas содержит мультицистронную нуклеиновую кислоту, содержащую кодирующую последовательность для белка Cas и кодирующую флуоресцентный белок последовательность, разделенные с помощью промежуточного участка внутренней посадки рибосомы (IRES) или промежуточной кодирующей пептид 2A последовательности.
24. Способ по п. 23, в котором мультицистронная нуклеиновая кислота в экспрессионной кассете Cas содержит кодирующую последовательность для белка Cas и кодирующую зеленый флуоресцентный белок последовательность, разделенные с помощью промежуточной кодирующей пептид P2A последовательности.
25. Способ по любому из пп. 1-21, в котором экспрессионная кассета Cas дополнительно не содержит кодирующую флуоресцентный белок последовательность.
26. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором белок Cas содержит метку белка.
27. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором 5’ конец экспрессионной кассеты Cas дополнительно содержит 3’ последовательность сплайсинга.
28. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором экспрессионная кассета Cas функционально связана с эндогенным промотором.
29. Способ по любому из пп. 1-27, в котором экспрессионная кассета Cas функционально связана с экзогенным, конститутивным промотором.
30. Способ по любому предыдущему пункту, в котором экспрессионная кассета Cas кодирует белок, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, 16, 19 или 22.
31. Способ по п. 30, в котором экспрессионная кассета Cas содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28, 29, 30 или 31.
32. Способ по п. 31, в котором экспрессионная кассета Cas содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, 12, 14, 15, 17, 18, 20 или 21.
33. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором экспрессионная кассета Cas интегрирована в локус «безопасная гавань».
34. Способ по п. 33, в котором локус «безопасная гавань» представляет собой локус Rosa26.
35. Способ по п. 34, в котором экспрессионная кассета Cas интегрирована в первый интрон локуса Rosa26.
36. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором не являющееся человеком животное является гетерозиготным в отношении экспрессионной кассеты Cas.
37. Способ по любому из пп. 1-35, в котором не являющееся человеком животное является гомозиготным в отношении экспрессионной кассеты Cas.
38. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором не являющееся человеком животное представляет собой мышь,
причем AAV представляет собой AAV8, доставленный не являющемуся человеком животному с помощью внутривенной инъекции,
причем экспрессионная кассета Cas функционально связана с эндогенным промотором Rosa26, вставлена в первый интрон локуса Rosa26 и содержит от 5’ к 3’ следующее: (i) 3’ последовательность сплайсинга; и (ii) кодирующая последовательность для белка Cas9, дополнительно содержащая один или несколько сигналов ядерной локализации, и
причем стадия (b) предусматривает оценку модификации целевого геномного локуса в печени не являющегося человеком животного.
39. Способ оптимизации способности CRISPR/Cas-нуклеазы модифицировать целевой геномный локус in vivo, предусматривающий:
(I) проведение способа по любому из предыдущих пунктов в первый раз у первого не являющегося человеком животного;
(II) изменение переменной и проведение способа согласно стадии (I) во второй раз с измененной переменной у второго не являющегося человеком животного; и
(III) сравнение модификации целевого геномного локуса на стадии (I) с модификацией целевого геномного локуса на стадии (II), и выбор способа, приводящего к модификации целевого геномного локуса, характеризующейся одним или несколькими из следующего: повышенная эффективность, повышенная точность, повышенная согласованность или повышенная специфичность.
40. Способ по п. 39, в котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой серотип AAV.
41. Способ по п. 39, в котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой путь введения гидовой РНК, вводимой не являющемуся человеком животному.
42. Способ по п. 39, в котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество гидовой РНК, введенной не являющемуся человеком животному.
43. Способ по п. 39, в котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой гидовую РНК, введенную не являющемуся человеком животному.
44. Способ по п. 39, причем способ предусматривает введение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, и причем измененная переменная на стадии (II) представляет собой способ доставки для введения экзогенной донорной нуклеиновой кислоты не являющемуся человеком животному.
45. Способ по п. 39, причем способ предусматривает введение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, и измененная переменная на стадии (II) представляет собой путь введения экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, вводимой не являющемуся человеком животному.
46. Способ по п. 39, причем способ предусматривает введение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, и измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, введенной не являющемуся человеком животному.
47. Способ по п. 39, причем способ предусматривает введение экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, и измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество гидовой РНК, введенной не являющемуся человеком животному, по отношению к концентрации или количеству экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, введенной не являющемуся человеком животному.
48. Способ по п. 39, в котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой экзогенную донорную нуклеиновую кислоту, введенную не являющемуся человеком животному.
49. Не являющееся человеком животное, содержащее геномно интегрированную экспрессионную кассету Cas, содержащую кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащую один или несколько сигналов ядерной локализации.
50. Клетка не являющегося человеком животного, содержащая геномно интегрированную экспрессионную кассету Cas, содержащую кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащую один или несколько сигналов ядерной локализации.
51. Геном не являющегося человеком животного, содержащий геномно интегрированную экспрессионную кассету Cas, содержащую кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащую один или несколько сигналов ядерной локализации.
52. Нацеливающий вектор, содержащий экспрессионную кассету Cas, фланкированную гомологичными плечами, причем экспрессионная кассета Cas содержит кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащую один или несколько сигналов ядерной локализации, и причем гомологичные плечи являются подходящими для направления рекомбинации с требуемым целевым геномным локусом для облегчения геномной интеграции.
53. Способ получения не являющегося человеком животного по п. 49, предусматривающий:
(a) модификацию генома плюрипотентной клетки не являющегося человеком животного для содержания экспрессионной кассеты Cas, содержащей кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащей один или несколько сигналов ядерной локализации;
(b) идентификацию или выбор генетически модифицированной плюрипотентной клетки, содержащей экспрессионную кассету Cas;
(c) введение генетически модифицированной плюрипотентной клетки в эмбрион-хозяин не являющегося человеком животного; и
(d) имплантацию и вынашивание эмбриона-хозяина не являющегося человеком животного в организме суррогатной матери.
54. Способ получения не являющегося человеком животного по п. 49, предусматривающий:
(a) модификацию генома эмбриона на стадии одной клетки не являющегося человеком животного для содержания экспрессионной кассеты Cas, содержащей кодирующую последовательность для белка Cas, дополнительно содержащей один или несколько сигналов ядерной локализации;
(b) выбор генетически модифицированного эмбриона на стадии одной клетки, содержащего экспрессионную кассету Cas; и
(c) имплантацию и вынашивание генетически модифицированного эмбриона на стадии одной клетки в организме суррогатной матери.
RU2020105343A 2017-07-31 2018-07-31 Экспрессирующие cas мышиные эмбриональные стволовые клетки и мыши и их применения RU2782358C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762539275P 2017-07-31 2017-07-31
US62/539,275 2017-07-31
PCT/US2018/044615 WO2019028032A1 (en) 2017-07-31 2018-07-31 EMBRYONIC STEM CELLS OF TRANSGENIC MOUSE CASES AND MICE AND USES THEREOF

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2022125418A Division RU2022125418A (ru) 2018-07-31 2018-07-31 Экспрессирующие cas мышиные эмбриональные стволовые клетки и мыши и их применения

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2020105343A true RU2020105343A (ru) 2021-09-02
RU2020105343A3 RU2020105343A3 (ru) 2021-11-11
RU2782358C2 RU2782358C2 (ru) 2022-10-26

Family

ID=

Also Published As

Publication number Publication date
EP3585159A1 (en) 2020-01-01
JP2020532952A (ja) 2020-11-19
CN110891420A (zh) 2020-03-17
SG11201912235PA (en) 2020-01-30
BR112020001364A2 (pt) 2020-08-11
JP7359753B2 (ja) 2023-10-11
US20210392862A1 (en) 2021-12-23
US20240093316A1 (en) 2024-03-21
AU2018309716A1 (en) 2020-01-16
US11866794B2 (en) 2024-01-09
RU2020105343A3 (ru) 2021-11-11
IL272334A (en) 2020-03-31
CA3067872A1 (en) 2019-02-07
MX2020001178A (es) 2020-09-25
JP2023165953A (ja) 2023-11-17
KR20200032693A (ko) 2020-03-26
WO2019028032A1 (en) 2019-02-07
US20190032155A1 (en) 2019-01-31
US11130999B2 (en) 2021-09-28
CN110891420B (zh) 2022-06-03
CN115074343A (zh) 2022-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2020532952A5 (ru)
US10362771B2 (en) Method for knock-in of DNA into target region of mammalian genome, and cell
JP2021500867A5 (ru)
JP2020533957A5 (ru)
WO2019028023A4 (en) Crispr reporter non-human animals and uses thereof
CN104404036A (zh) 基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法
BR112020001364A2 (pt) métodos para testar e modificar a capacidade de uma crispr/cas nuclease.
RU2019143568A (ru) Способы и композиции для оценки crispr/cas-индуцированной рекомбинации с экзогенной донорной нуклеиновой кислотой in vivo
CN110438160B (zh) 一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用
CN104611368B (zh) 重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用
WO2010010887A1 (ja) 組織発現プロモーター
JPWO2019067875A5 (ru)
CN114457114B (zh) 一种Fars2基因条件性敲除动物模型的构建方法
JP2001511014A (ja) 前立腺特異的調節核酸配列および前立腺特異的抗原を発現するトランスジェニック非ヒト動物
Dmochewitz et al. Genetic engineering of pigs for the creation of translational models of human pathologies
US20210274759A1 (en) A rodent model of b4galt1-mediated functions
RU2022125418A (ru) Экспрессирующие cas мышиные эмбриональные стволовые клетки и мыши и их применения
JP2023511626A (ja) ヒト化ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含む非ヒト動物および使用方法
CN111518785B (zh) 一种高活性piggyBac转座酶及其应用
CN117660527A (zh) 一种ABCA7-Floxp小鼠模型的构建方法和应用
RU2021130741A (ru) Животные, отличные от человека, содержащие гуманизированный локус альбумина
JP2023544333A (ja) ヒトｃｒ１を発現する齧歯類動物
CN116286973A (zh) 一种在肝干细胞中特异性表达Cre的工具鼠模型的构建方法
JP4303907B2 (ja) ラディキシンノックアウト動物
WO2024073404A1 (en) Pompe disease mouse model generation, characterization and methods of use