JPWO2017104068A1

JPWO2017104068A1 - 観察装置

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Publication number: JPWO2017104068A1
Application number: JP2017556292A
Authority: JP
Inventors: 平田　唯史; 唯史平田; 高橋　晋太郎; 晋太郎高橋
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2018-10-04
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: DE112015007195T5; US20180267285A1; JP6633650B2; US10877256B2; CN108369330A; WO2017104068A1; CN108369330B

Abstract

装置を大型化させることなく、細胞等の被写体を標識せずに観察することを目的として、本発明に係る観察装置（１）は、試料（Ｘ）の下方から斜め上方に向けて照明光を射出する照明光学系（６）と、照明光学系（６）から射出された照明光が試料（Ｘ）の上方で反射されて試料（Ｘ）を透過した透過光を試料（Ｘ）の下方において照明光学系（６）とは別経路で撮影する対物光学系（５）とを備え、照明光学系（６）が、光源（６ａ）と、光源（６ａ）からの光を特定の射出領域（６ｅ）に制限するマスク（６ｃ）と、マスク（６ｃ）により制限された光を略平行光にするコリメート光学系（６ｄ）とを備え、射出領域（６ｅ）が、対物光学系（５）の瞳面に投影されたときに、射出領域（６ｅ）の投影像が、瞳の辺縁部に部分的に重なるように照明光学系（６）が配置されている。

Description

本発明は、観察装置に関するものである。

細胞等の被写体を標識せずに観察する装置として、位相差観察法や微分干渉観察法を用いた観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。

特開平７−２６１０８９号公報

しかしながら、特許文献１の観察装置は、被写体を挟んで撮影光学系と照明光学系とを配置する必要があり、装置が大型化、複雑化するという不都合がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、装置を大型化させることなく、細胞等の被写体を標識せずに観察することができる観察装置を提供することを目的としている。

本発明の一態様は、試料の下方から斜め上方に向けて照明光を射出する照明光学系と、該照明光学系から射出された照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において前記照明光学系とは別経路で撮影する対物光学系とを備え、前記照明光学系が、光源と、該光源からの光を特定の射出領域に制限するマスクと、該マスクにより制限された光を略平行光にするコリメート光学系とを備え、前記射出領域が、前記対物光学系の瞳面に投影されたときに、前記射出領域の投影像が、前記瞳の辺縁部に部分的に重なるように前記照明光学系が配置されている観察装置である。

本態様によれば、光源から発せられた照明光は試料の下方から斜め上方に向けて射出された後、試料の上方において反射されて試料を上方から下方に透過させられる。試料を透過した透過光は、試料の下方に配置されている照明光学系とは別経路の対物光学系によって撮影される。光源部および対物光学系の両方を試料の下方に配置したので、装置を大型化させることなく、透過光を撮影することにより細胞等の被写体を標識せずに観察することができる。

また、光源から発せられた光はマスクによって射出領域が制限された照明光となって試料に照射され、コリメート光学系によって略平行光にされた後に試料の上方において反射されて、試料の下方の対物光学系の瞳面近傍に入射される。コリメート光学系によって略平行光となった照明光が試料の上方において反射されるので、反射位置の高さが変動しても対物光学系に入射する透過光の角度を変動させなくて済む。その結果、反射位置の高さが変動しても、光源の位置調整が不要であり、観察装置のロバスト性を向上することができる。

上記態様においては、条件式（１）を満足してもよい。
（１）０．０５≦ｄ／Ｄ≦０．４
ここで、Ｄは前記対物光学系の瞳直径、Ｄは前記射出領域を前記瞳面に投影したときの光束直径である。

このようにすることで、明るさムラがなく、高コントラストの像による観察を行うことができる。条件式（１）の下限を下回ると対物光学系内のビネッティングの影響を受け易く、明るさムラが発生し易くなる。また、対物光学系内のレンズ面のゴミや傷が、像に投影されて目立ち易くなる。条件式の上限を上回ると、試料のコントラストが弱くなり、標本を観察し難くなる。

また、上記態様においては、条件式（２）を満足してもよい。
（２）０．１≦ｄｓ／（ＮＡｏ・Ｆｉ）≦０．８
ここで、ｄｓは前記照明光学系から射出される照明光の傾斜方向の前記射出領域の大きさ、Ｆｉは前記コリメート光学系の焦点距離、ＮＡｏは前記対物光学系の前記試料側の開口数である。

また、上記態様においては、条件式（３）を満足してもよい。
（３）ＮＡｏ−ｄｓ・Ｆｉ／2Ｆｏｐ²≦θ≦ＮＡｏ＋ｄｓ・Ｆｉ／2Ｆｏｐ²
ここで、ｄｓは前記照明光学系から射出される照明光の傾斜方向の前記射出領域の大きさ、Ｆｉは前記コリメート光学系の焦点距離、ＮＡｏは前記対物光学系の前記試料側の開口数、Ｆｏｐは前記対物光学系の瞳より前記試料側の焦点距離、θは前記コリメート光学系により略平行光に変換された照明光の、前記対物光学系の光軸に対する前記試料の位置での傾斜角度である。
このようにすることで、対物光学系に入射してくる透過光の光束の一部が対物光学系の瞳の辺縁にかかっており、試料の像にコントラストを与えることができる。

また、上記態様においては、前記射出領域が、輪帯の一部を構成する形状であってもよい。
このようにすることで、対物光学系に対して、透過光が様々な方向から入り込むので、対物光学系におけるビネッティングの影響を抑え、コントラストを維持したまま像の明るさムラを低減することができる。

また、上記態様においては、前記マスクが、前記射出領域内に、径方向内方に向かって透過率が連続的または段階的に低くなる減光部を備えていてもよい。
このようにすることで、周辺部に向かって明るくなる照明光を構成でき、対物光学系のビネッティングの影響で像の周辺部が暗くなるのを補償することができる。

また、上記態様においては、前記マスクが、前記射出領域内に、径方向内方に向かって透過率が連続的または段階的に高くなる減光部を備えていてもよい。
このようにすることで、細胞のコントラストを向上することができる。

本発明によれば、装置を大型化させることなく、細胞等の被写体を標識せずに観察することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る観察装置を示す縦断面図である。図１の観察装置に備えられた照明マスクの一例を示す正面図である。図１の観察装置に備えられた明るさ絞りと入射される光束位置との関係を示す正面図である。図１の観察装置の作用を説明する対物光学系の縦断面図である。図１の観察装置により取得される試料の像の例を示す図である。図１の観察装置の他の効果を説明する縦断面図である。図２の照明マスクの変形例を示す正面図である。図１の観察装置の他の変形例を示す縦断面図である。図１の観察装置の他の変形例を示す縦断面図である。図１の観察装置に備えられる照明光学系の変形例を示す図である。図１の観察装置に備えられる照明光学系の他の異変形例を示す図である。図１の観察装置に備えられる照明光学系の他の変形例を示す図である。図２の照明マスクの他の変形例を示す正面図である。図２の照明マスクの他の変形例を示す正面図である。

本発明の第１の実施形態に係る観察装置１について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、図１に示されるように、細胞等の試料Ｘを収容した容器２を載置するステージ３と、該ステージ３の下方に配置され、ステージ３を上方から透過して来る光を集光する対物レンズ５ａを備え、試料Ｘを透過した光を撮影する対物光学系５と、対物光学系５の径方向外方に配置され、ステージ３を透過して上方に照明光を射出する対物光学系５とは別経路の照明光学系６とを備えている。

ステージ３は、対物光学系５および照明光学系６の上方を覆うように、光学的に透明な材質、例えば、ガラスからなる載置台３ａを備え、容器２は載置台３ａの上面に載置されるようになっている。
容器２は、例えば、天板２ａを有する細胞培養フラスコであり、全体的に光学的に透明な樹脂により構成されている。

照明光学系６は、図１に示されるように、対物光学系５の外側に配置されたＬＥＤ光源（光源）６ａと、ＬＥＤ光源からの光を拡散させる拡散板６ｂと、該拡散板６ｂに備えられ、ＬＥＤ光源６ａからの照明光を特定の射出領域に制限する照明マスク（マスク）６ｃと、制限された射出領域から射出され次第に拡散する照明光を略平行光にするコリメートレンズ（コリメート光学系）６ｄとを備えている。

照明マスク６ｃは、図２に示されるように遮光部材に、照明光を透過させる円形の開口６ｅ（射出領域）を有している。
コリメートレンズ６ｄは、容器２の天板２ａによって反射されて対物光学系５に入射する透過光が、対物光学系５に対して傾斜することにより偏斜照明となるように、コリメートレンズ６ｄの光軸Ａを照明マスク６ｃの中心軸Ｂに対して水平方向にシフトして配置されている。

シフト量をｙ、コリメートレンズ６ｄの焦点距離をＦｉとすると、コリメートレンズ６ｄによって略平行光となって斜め上方に射出される照明光の鉛直方向に対する角度θは、
θ＝ｙ／Ｆｉ
となる。

また、図３に示されるように、対物光学系５の瞳面に備えられた明るさ絞り５ｂの瞳径をＤ、照明光の対物光学系５の光軸Ｃに対する傾き方向の光束Ｅの横幅をｄとすると、以下の条件式（１）を満足している。
（１）０．０５≦ｄ／Ｄ≦０．４

このようにすることで、明るさムラがなく、高コントラストの像による観察を行うことができる。条件式（１）の下限を下回ると対物光学系５内のビネッティングの影響を受け易く、明るさムラが発生し易くなる。また、対物光学系５内のレンズ面のゴミや傷が、像に投影されて目立ち易くなる。条件式の上限を上回ると、試料Ｘのコントラストが弱くなり、試料Ｘを観察し難くなる。

ｄおよびＤは下式により導出される。
ｄ＝ｄｓ・Ｆｏｐ／Ｆｉ
Ｄ＝２ＮＡ・Ｆｏｐ

ここで、ｄｓは照明光が斜め方向に射出される方向の照明マスク６ｃの開口６ｅの大きさ（図２に示す例では直径寸法）、Ｆｏｐは対物レンズ５ａの瞳より試料Ｘ側の焦点距離、ＮＡｏは対物レンズ５ａの試料Ｘ側の開口数である。
これを変形することにより、条件式（２）を満足している。
（２）０．１≦ｄｓ／（ＮＡｏ・Ｆｉ）≦０．８

さらに、試料Ｘの像にコントラストをつけるために、対物光学系５の瞳面に投影された照明光の光束の一部が対物光学系５の瞳の辺縁（明るさ絞りの辺縁）にかかっていることが好ましい。最適な条件は、対物光学系５に斜め上方から入射してくる透過光の中心と、瞳の辺縁とが一致する位置である。
この条件は以下の条件式（３）を満足することにより満たされる。
（３）ＮＡｏ−ｄｓ・Ｆｉ／2Ｆｏｐ²≦θ≦ＮＡｏ＋ｄｓ・Ｆｉ／2Ｆｏｐ²

角度θが条件式（３）の下限を下回ると、試料Ｘの像のコントラストが低くなり観察し難くなる。一方、角度θが条件式（３）の上限を上回ると、試料Ｘの像は暗視野像となり、視野が暗く、試料Ｘの輪郭をはっきり観察し難くなる。

このように構成された本実施形態に係る観察装置１の作用について以下に説明する。
照明光学系６のＬＥＤ光源６ａから発せられた照明光は照明マスク６ｃを通過することにより、所定の大きさを有する射出領域に制限された光束として上方に向けて射出され、上方に配されているコリメートレンズ６ｄを通過することによって略平行光に変換されるとともに、対物光学系５の光軸Ｃに向かって傾斜する光束となる。

コリメートレンズ６ｄから斜め上方に向かう略平行光は、ステージ３を構成している載置台３ａ、容器２の底面および液体Ｙを透過して、容器２の天板２ａで反射され、斜め下方の試料Ｘに斜め上方から照射される偏斜照明となる。そして、試料Ｘを透過した透過光が容器２の底面および載置台３ａを透過した後に対物レンズ５ａによって集光され、結像レンズ５ｃによって結像され、撮像素子５ｄによって撮影される。

すなわち、試料Ｘを斜め上方から透過する略平行光からなる照明光は、試料Ｘを透過した透過光が対物レンズ５ａによって集光される。試料Ｘが存在しない領域を透過した透過光は、屈折されることなく、略平行光のまま対物レンズ５ａに入射するので、対物レンズ５ａの瞳面に配置されている明るさ絞り５ｂの辺縁に一部がかかった状態の照明マスク６ｃの開口６ｅの像を投影した後、明るさ絞り５ｂおよびフレア絞り５ｅを通過した透過光が結像レンズ５ｂによって結像され、撮像素子５ｄにより撮像される。

試料Ｘが存在する領域を透過した透過光は、試料Ｘの屈折率が周囲の屈折率と異なることによって屈折させられる。
図４において、試料Ｘを通過しない光線ａ，ｅおよび試料Ｘの表面に直交して入射する光線ｃは屈折することなく明るさ絞り５ｂの辺縁の内側を通過するので、明るい像を結ぶ。

一方、図４において試料Ｘの左端を透過した光線ｂは、屈折させられて明るさ絞り５ｂの辺縁によってケラレる。
さらに、図４において試料Ｘの右端を透過した光線ｄは、屈折させられて明るさ絞り５ｂのより中心に近い領域を通過させられ、結像レンズ５ｃによって明るい像を結ぶ。

その結果、図５に示されるように、明るさムラが少なく、試料Ｘに陰影のついた高コントラストの像を取得することができる。すなわち、試料Ｘが影によって立体的に見えるので、観察し易さが向上する。

この場合において、本実施形態によれば、コリメートレンズ６ｄによって略平行光にされた照明光が、斜め上方に射出されるので、図６に示されるように、天板２ａの高さの異なる容器２がステージ３に載置された場合でも、対物光学系５に入射される照明光の傾斜角度を変化させずに済むという利点がある。すなわち、容器２の高さが変動しても、透過光の光束の対物光学系５の瞳面への入射位置を変動させずに済むので、瞳面に入射する光束が部分的に明るさ絞り５ｂにかかるような配置を維持することができて、コントラストのついた試料Ｘの像を観察することができる。

なお、本実施形態においては、照明マスク６ｃとして円形の開口６ｅを有するものを例示したが、これに代えて、図７に示されるように照明光の傾斜する方向に幅ｄｓを有する長方形状の開口６ｅを有するものを採用してもよい。

また、本実施形態においては、コリメートレンズ６ｄの光軸Ａを対物レンズ５ａの光軸Ｃと平行にして、照明マスク６ｃの中心軸Ｂを水平方向にシフトさせることで、コリメートレンズ６ｄから斜め上方に射出される照明光を傾斜させることとしたが、これに代えて、図８および図９に示されるように、コリメートレンズ６ｄの光軸Ａを対物光学系５の光軸Ｃに対して傾斜させてもよい。

図８に示す例では、傾斜させたコリメートレンズ６ｄの光軸Ａに照明マスク６ｃの中心軸Ｂを一致させている。また、図９に示す例では、傾斜させたコリメートレンズ６ｄの光軸Ａに対して照明マスク６ｃの中心軸Ｂを光軸Ａに直交する方向にシフトさせている。
この場合、以下の条件式が成立する。
θ＝α＋ｙ／Ｆｉ
ここで、αは対物光学系５の光軸Ｃに対するコリメートレンズ６ｄの光軸Ａの傾きである。

このようにすることで、コリメートレンズ６ｄの光軸Ａに近いところを照明光が通過するので、図１の場合と比較して収差の発生が少なく、光束全域で質のよい平行光束を得ることができるという利点がある。また、図９のように光軸Ａ，Ｂのシフトを併用した方が、コリメートレンズ６ｄの傾き量が少なくて済み、設置スペースを低減して小型化を図ることができる。

また、照明光を傾斜させる方法としては、図１０に示されるように、コリメートレンズ６ｄによって水平方向に射出させた略平行光を仰角が４５°より小さいミラー１１、あるいは図１１に示されるプリズム１２によって偏向する方法を採用してもよい。図１２に示されるように、ＬＥＤ光源６ａとコリメートレンズ６ｄとの間にミラー１１やプリズム１２を配置してもよい。

また、照明マスク６ｃの開口６ｅによる射出領域の形状としては、図１３に示されるように、輪帯の一部を切り出したような円弧状あるいは扇形状を採用してもよい。このような射出領域を瞳面に投影したときに、その径方向の外側の一部が明るさ絞り５ｂの辺縁にかかるように配置すればよい。

このような射出領域の形状を採用することで、対物光学系５に入射する照明光の方向が一方向に限られず、種々の方向から入射するので、対物光学系５内におけるビネッティングの影響を低減して、コントラストを維持したまま像の明るさムラの発生を抑制することができるという利点がある。

また、このような射出領域の形状を採用した場合、図１４に示されるように、径方向外方に向かって透過率が高くなるような透過率勾配を有する減光部Ｆを射出領域に持たせることにしてもよい。このようにすることで、対物光学系５のビネッティングの影響で像の周辺部が暗くなることを補償することができる。

また、このような射出領域の形状を採用した場合、図１４とは逆に、径方向外方に向かって透過率が低くなるような透過率勾配を有する減光部Ｆを射出領域に持たせることにしてもよい。このようにすることで、細胞のコントラストを向上することができる。

１観察装置
５対物光学系
６照明光学系
６ａＬＥＤ光源（光源）
６ｃ照明マスク（マスク）
６ｄコリメートレンズ（コリメート光学系）
６ｅ開口（射出領域）
Ｆ減光部
Ｘ試料

Claims

試料の下方から斜め上方に向けて照明光を射出する照明光学系と、
該照明光学系から射出された照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において前記照明光学系とは別経路で撮影する対物光学系とを備え、
前記照明光学系が、光源と、該光源からの光を特定の射出領域に制限するマスクと、該マスクにより制限された光を略平行光にするコリメート光学系とを備え、
前記射出領域が、前記対物光学系の瞳面に投影されたときに、前記射出領域の投影像が、前記瞳の辺縁部に部分的に重なるように前記照明光学系が配置されている観察装置。
条件式（１）を満足する請求項１に記載の観察装置。
（１）０．０５≦ｄ／Ｄ≦０．４
ここで、Ｄは前記対物光学系の瞳直径、Ｄは前記射出領域を前記瞳面に投影したときの光束直径である。
条件式（２）を満足する請求項１に記載の観察装置。
（２）０．１≦ｄｓ／（ＮＡｏ・Ｆｉ）≦０．８
ここで、ｄｓは前記照明光学系から射出される照明光の傾斜方向の前記射出領域の大きさ、Ｆｉは前記コリメート光学系の焦点距離、ＮＡｏは前記対物光学系の前記試料側の開口数である。
条件式（３）を満足する請求項１に記載の観察装置。
（３）ＮＡｏ−ｄｓ・Ｆｉ／2Ｆｏｐ²≦θ≦ＮＡｏ＋ｄｓ・Ｆｉ／2Ｆｏｐ²
ここで、ｄｓは前記照明光学系から射出される照明光の傾斜方向の前記射出領域の大きさ、Ｆｉは前記コリメート光学系の焦点距離、ＮＡｏは前記対物光学系の前記試料側の開口数、Ｆｏｐは前記対物光学系の瞳より前記試料側の焦点距離、θは前記コリメート光学系により略平行光に変換された照明光の、前記対物光学系の光軸に対する前記試料の位置での傾斜角度である。
前記射出領域が、輪帯の一部を構成する形状である請求項１から請求項４のいずれかに記載の観察装置。
前記マスクが、前記射出領域内に、径方向内方に向かって透過率が連続的または段階的に低くなる減光部を備える請求項５に記載の観察装置。
前記マスクが、前記射出領域内に、径方向内方に向かって透過率が連続的または段階的に高くなる減光部を備える請求項５に記載の観察装置。