JPWO2008093722A1 - フェノチアジン誘導体色素の検出方法およびそれに用いる発色剤試薬 - Google Patents
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Abstract
フェノチアジン誘導体色素を、最大吸収を示す波長より長波長側でも検出することを可能とするフェノチアジン誘導体色素検出方法を提供する。フェノチアジン誘導体色素を含む反応系に、5-ヒドロキシ-１-(4-スルホフェニル)-4-(4-スルホフェニルアゾ)ピラゾール-3-カルボン酸塩、6-ヒドロキシ-5-(4-スルホフェニルアゾ)-2-ナフタレンスルホン酸塩、3-ヒドロキシ-4-(4-スルホナフチルアゾ)-2，7-ナフタレンジスルホン酸塩、7-ヒドロキシ-8-(4-スルホナフチルアゾ)-1，3-ナフタレンジスルホン酸塩、3’，6’-ジヒドロキシ-2’，4’，5’，7’-テトラヨードスピロ[イソベンゾフラン-1(3H），9’-(9H)キサンテン]-3-オン塩、3’，6’−ジヒドロキシ-2’，4’，5’，7’-テトラブロモ-4，5，6，7，-テトラクロロスピロ[イソベンゾフラン-1（3H），9’-[9H］キサンテン]-3-オン塩、4，5，6，7-テトラクロロ-3’，6’-ジヒドロキシ-2’，4’，5’，7’-テトラヨードスピロ[イソベンゾフラン-1（3H），9’-［9H］キサンテン]-3-オン塩またはフラボノイド系色素を添加した後、波長610〜730ｎｍにおける吸光度測定によりフェノチアジン誘導体色素を検出する。
Description
本発明は、フェノチアジン誘導体色素の検出方法、フェノチアジン誘導体色素の検出を利用した目的成分の測定方法、および、それに用いる発色剤試薬に関する。
目的成分の測定（定性、定量）方法として、酸化還元反応を利用した酵素法が広く実用に供されている。この方法は、例えば、測定する目的成分から酸化物質を生成させ、この酸化物質と酸化により発色化合物を生成する発色剤とを酸化酵素によって反応させ、生じた発色の吸光度を測定する方法である。この方法において、吸光度の大きさは、生成した発色化合物の量に相当し、生成した発色化合物の量は、生成した酸化物質の量に相当し、酸化物質の量は、目的成分の量に相当する。つまり、生じた発色（生成した発色化合物）の検出によって、このような酸化還元反応を介して、間接的に目的成分を測定できる。
前記酵素法に使用する発色剤としては、例えば、トリンダー試薬や、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（商品名ＤＡ−６４；和光純薬社製）がある。また、発色化合物であるメチレンブルー等のフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤として、例えば、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（商品名ＤＡ−６７；和光純薬社製、以下、「ＤＡ−６７」ともいう）、１０−（アセチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、特許文献３記載の１０−（フェニルカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、特許文献４記載の１０−（３−（メチルカルボキシアミノ）−ヘキサメチル−アミノ）−フェノチアジン、１０−（３−（メチルカルボキシアミノ）−４−メチル−フェニル）−アミノ）−フェノチアジン、１０−（（３−（メチルカルボキシアミノメチル）−フェニル）−メチルアミノ）−フェノチアジン、１０−（１−ナフタレンアミノ）−フェノチアジン、１０−（メチル）−フェノチアジン、１０−（フェニルアミノ）−フェノチアジン、１０−（メチルアミノ）−フェノチアジン等が知られている。これらの中でも、ＤＡ−６７等のように、メチレンブルー等のフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤は、フェノチアジン誘導体色素が５９０〜６７０ｎｍという比較的長波長側に極大吸収を持つことから、以下のような理由により、重要視されている。
すなわち、体液のような試料は、目的成分以外に様々な成分を含んでおり、中には、５００ｎｍ付近やそれ以下の波長領域に吸収を持つ成分も存在する。このため、前述のような酵素法においては、目的成分以外の成分による影響を回避するため、酸化還元反応により生成する発色化合物は、できるだけ長波長側で検出可能であることが望まれる。このため、前述のように５９０〜６７０ｎｍに極大吸収を持つフェノチアジン誘導体色素を生成するＤＡ−６７等の発色剤は、特に有用と考えられている。
しかしながら、例えば、全血試料や血球試料のようにヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」という）を含む試料は、約５７０〜６３０ｎｍでの色素検出に影響を与える程度の吸収を示し、さらに、Ｈｂのメト化によって、約５７０〜６７０ｎｍに、フェノチアジン誘導体色素の検出に影響を与える程の吸収を示すおそれがある。したがって、フェノチアジン誘導体色素を生成する前述のような発色剤であっても、このような試料に適用するには、測定への影響が懸念される。
さらに、臨床化学用に特化した自動分析装置には、検出波長が固定されており、例えば６１０〜６６０ｎｍには検出波長を持たず、７００ｎｍに検出波長を持つものがある。しかし、６１０〜６７０ｎｍに極大吸収を持つフェノチアジン誘導体色素は、７００ｎｍでの検出が極めて困難であるため、このように７００ｎｍに検出波長を持つ既存の装置で測定することができない。
また、例えば青色を呈するメチレンブルーは、還元によって無色のロイコメチレンブルーになる。このような性質を利用して、メチレンブルー等のフェノチアジン誘導体色素そのものを発色剤として使用し、目的成分から還元物質を生成させてフェノチアジン誘導体色素を還元し、還元による青色の消失（フェノチアジン誘導体色素の減少）を測定することによっても、目的成分を測定できる（特許文献１および特許文献２）。しかし、この場合であっても、前述と同様の問題が生じる。
特開２０００−２１４１５２号公報
特開２０００−２１４１５５号公報
特公平４−２７８３９号公報
特公昭６０−３３４７９号公報
そこで、本発明は、フェノチアジン誘導体色素を、極大吸収を示す波長より長波長側であっても検出することが可能であるフェノチアジン誘導体色素検出方法の提供を目的とする。
本発明のフェノチアジン誘導体色素の検出方法は、反応系におけるフェノチアジン誘導体色素を吸光度測定により検出する方法であって、フェノチアジン誘導体色素の検出工程を含み、前記検出工程において、下記式（Ｉ）で表される化合物、下記式（ＩＩ）で表される化合物およびフラボノイド系色素からなる群から選択された少なくとも一つの色素物質の存在下で、フェノチアジン誘導体色素の検出を行うことを特徴とする。
Ｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ｒ２ ・・・（Ｉ）
前記式（Ｉ）において、
Ｒ１は、
Ｒ１およびＲ２において、
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、
Ｙは、水素またはＳＯ３Ｘであり、
各Ｘは同一でも異なっていても良く、各Ｙは同一でも異なっていても良く、
Ｚは、水素、メチル基またはメトキシ基であり、各Ｚは同一でも異なっていても良い。
前記式（II）において、
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであって、各Ｘは、同一でも異なっていても良く、
Ｙは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであって、各Ｙは、同一でも異なっていても良い。
Ｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ｒ２ ・・・（Ｉ）
前記式（Ｉ）において、
Ｒ１は、
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、
Ｙは、水素またはＳＯ３Ｘであり、
各Ｘは同一でも異なっていても良く、各Ｙは同一でも異なっていても良く、
Ｚは、水素、メチル基またはメトキシ基であり、各Ｚは同一でも異なっていても良い。
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであって、各Ｘは、同一でも異なっていても良く、
Ｙは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであって、各Ｙは、同一でも異なっていても良い。
本発明の目的成分の測定方法は、フェノチアジン誘導体色素の検出により試料中の目的成分を測定する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｅ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ） 前記試料中の目的成分から酸化物質または還元物質を生成させる工程
（Ｂ） 前記試料に、酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤を添加する発色剤添加工程
（Ｃ） 前記酸化物質または還元物質と前記発色剤との酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成させる工程
（Ｄ） 本発明のフェノチアジン誘導体色素検出方法によりフェノチアジン誘導体色素を検出して、前記フェノチアジン誘導体色素の生成の有無または生成量を測定する工程
（Ｅ） 前記測定結果から、前記試料中の目的成分の有無または量を決定する工程
（Ａ） 前記試料中の目的成分から酸化物質または還元物質を生成させる工程
（Ｂ） 前記試料に、酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤を添加する発色剤添加工程
（Ｃ） 前記酸化物質または還元物質と前記発色剤との酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成させる工程
（Ｄ） 本発明のフェノチアジン誘導体色素検出方法によりフェノチアジン誘導体色素を検出して、前記フェノチアジン誘導体色素の生成の有無または生成量を測定する工程
（Ｅ） 前記測定結果から、前記試料中の目的成分の有無または量を決定する工程
また、本発明の目的成分の測定方法は、前記（Ｂ）〜（Ｄ）工程に代えて、下記（Ｂ’）〜（Ｄ’）工程を含む方法であってもよい。
（Ｂ’） 前記試料に、発色剤としてフェノチアジン誘導体色素を添加する工程
（Ｃ’） 前記試料中の目的成分から生成した還元物質とフェノチアジン誘導体色素とを酸化還元反応させる工程
（Ｄ’） 本発明のフェノチアジン誘導体色素の検出方法によりフェノチアジン誘導体色素を検出して、添加した前記フェノチアジン誘導体色素の減少の有無または減少量を測定する工程
（Ｂ’） 前記試料に、発色剤としてフェノチアジン誘導体色素を添加する工程
（Ｃ’） 前記試料中の目的成分から生成した還元物質とフェノチアジン誘導体色素とを酸化還元反応させる工程
（Ｄ’） 本発明のフェノチアジン誘導体色素の検出方法によりフェノチアジン誘導体色素を検出して、添加した前記フェノチアジン誘導体色素の減少の有無または減少量を測定する工程
本発明のシフト剤は、フェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルをシフトさせるシフト剤であって、前記式（Ｉ）で表される化合物、前記式（ＩＩ）で表される化合物およびフラボノイド系色素からなる群から選択された少なくとも一つの色素物質を含むことを特徴とする。
本発明の発色剤試薬は、前記本発明の検出方法に使用する発色剤試薬であって、酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する基質およびフェノチアジン誘導体色素のいずれか一方の発色剤、および、前記本発明のシフト剤を含むことを特徴とする。
本発明のように、前記色素物質の存在下であれば、フェノチアジン誘導体色素本来の極大吸収波長５９０〜６７０ｎｍより長波長側であっても、フェノチアジン誘導体色素を検出することが可能となった。このため、例えば、試料中に５７０〜６７０ｎｍ付近に吸収を示す成分が含まれる場合であっても、それによる影響を回避してフェノチアジン誘導体色素を検出することができる。また、本発明によれば、例えば、７００ｎｍの吸光度が増加することから、検出波長が７００ｎｍに固定された装置であってもフェノチアジン誘導体色素を検出可能である。このように、本発明の方法によれば、フェノチアジン誘導体色素の検出条件が改善され、従来よりも、フェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤やフェノチアジン誘導体色素の発色剤としての適用範囲を、さらに広げることができるため、例えば、臨床検査等において極めて有用な方法といえる。
＜吸収スペクトルのシフト剤＞
本発明のシフト剤は、フェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルをシフトさせるシフト剤であって、前記式（Ｉ）で表される化合物、前記式（ＩＩ）で表される化合物およびフラボノイド系色素、からなる群から選択された少なくとも一つの色素物質を含むことを特徴とする。
本発明のシフト剤は、フェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルをシフトさせるシフト剤であって、前記式（Ｉ）で表される化合物、前記式（ＩＩ）で表される化合物およびフラボノイド系色素、からなる群から選択された少なくとも一つの色素物質を含むことを特徴とする。
前記色素物質は、前述のように、フェノチアジン誘導体色素と共存させることによって、フェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルを長波長側にシフトすることができる。したがって、本発明における色素物質は、前述のようにフェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルを変化させる、吸収スペクトルのシフト剤として使用できる。また、本発明において、「吸収スペクトルのシフト」とは、例えば、フェノチアジン誘導体色素の本来の吸収極大波長が長波長側にシフトすること、または、吸収極大波長はシフトしないが、吸収スペクトルが長波長側にシフトすること等を意味する。本発明のシフト剤は、例えば、適度な距離を持ってマイナス荷電の基を二つ有する物質であることが好ましい。このマイナス荷電の基と、フェノチアジン骨格の両側の＋に荷電するＮとが電気的に結合し、共鳴構造を長くすることでシフトが生じると推測される。なお、この推測に本発明は制限されない。
本発明のシフト剤において、前記色素物質は、一種類でもよいし、二種類以上を含有してもよい。
前記式（Ｉ）において、
Ｒ１は、
Ｒ１およびＲ２において、
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、
Ｙは、水素またはＳＯ３Ｘであり、
各Ｘは同一でも異なっていても良く、各Ｙは同一でも異なっていても良く、
Ｚは、水素、メチル基またはメトキシ基であり、各Ｚは同一でも異なっていても良い。
Ｒ１は、
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、
Ｙは、水素またはＳＯ３Ｘであり、
各Ｘは同一でも異なっていても良く、各Ｙは同一でも異なっていても良く、
Ｚは、水素、メチル基またはメトキシ基であり、各Ｚは同一でも異なっていても良い。
前記式（Ｉ）で表される色素物質としては、例えば、５−ヒドロキシ−１−（４−スルホフェニル）−４−（４−スルホフェニルアゾ）ピラゾール−３−カルボン酸またはその塩（例えば、三ナトリウム塩）、
６−ヒドロキシ−５−（４−スルホフェニルアゾ）−２−ナフタレンスルホン酸またはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
３−ヒドロキシ−４−（４−スルホナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸（「３−ヒドロキシ−４−［（スルホナトナフタレン−１−イル）ジアゼニル］ナフタレン−２，７−ジスルホン酸」ともいう）またはその塩（例えば、三ナトリウム塩）、
７−ヒドロキシ−８−（４−スルホナフチルアゾ）−１，３−ナフタレンジスルホン酸もしくはその塩（例えば、三ナトリウム塩）または水和物（例えば、１１／２水和物）
等があげられる。これらの塩や水和物としては、例えば、市販品であるタートラジン（黄色４号）、黄色５号、赤色２号、赤色４０号、赤色１０２号等があげられる。これらの色素物質は、食用であってもよいし、非食用であってもよい。
６−ヒドロキシ−５−（４−スルホフェニルアゾ）−２−ナフタレンスルホン酸またはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
３−ヒドロキシ−４−（４−スルホナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸（「３−ヒドロキシ−４−［（スルホナトナフタレン−１−イル）ジアゼニル］ナフタレン−２，７−ジスルホン酸」ともいう）またはその塩（例えば、三ナトリウム塩）、
７−ヒドロキシ−８−（４−スルホナフチルアゾ）−１，３−ナフタレンジスルホン酸もしくはその塩（例えば、三ナトリウム塩）または水和物（例えば、１１／２水和物）
等があげられる。これらの塩や水和物としては、例えば、市販品であるタートラジン（黄色４号）、黄色５号、赤色２号、赤色４０号、赤色１０２号等があげられる。これらの色素物質は、食用であってもよいし、非食用であってもよい。
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであって、各Ｘは、同一でも異なっていても良く、
Ｙは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであって、各Ｙは、同一でも異なっていても良い。
本発明において、「ハロゲン」とは、任意のハロゲン元素を指す。前記ハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が挙げられる。
また、前記式（ＩＩ）で表される色素物質としては、例えば、
３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン］−３−オンもしくはその塩（例えば、二ナトリウム塩）または水和物（例えば、一水和物）、
３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラブロモ−４，５，６，７，−テトラクロロスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
４，５，６，７−テトラクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
２，４，５，７−テトラブロモ−３，６−ジヒドロキシキサンテン−９−スピロ−１’−３Ｈ−イソベンゾフラン−３’−オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
３，６-ジヒドロキシキサンテン‐９‐スピロ‐１'‐３’Ｈ‐イソベンゾフラン‐３’‐オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）等があげられる。これらの塩や水和物としては、例えば、赤色３号、赤色１０４号、赤色１０５号、エオシン（アシッドレッド８７）、ウラニン等が使用できる。これらの色素物質は、食用であってもよいし、非食用であってもよい。
３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン］−３−オンもしくはその塩（例えば、二ナトリウム塩）または水和物（例えば、一水和物）、
３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラブロモ−４，５，６，７，−テトラクロロスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
４，５，６，７−テトラクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
２，４，５，７−テトラブロモ−３，６−ジヒドロキシキサンテン−９−スピロ−１’−３Ｈ−イソベンゾフラン−３’−オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
３，６-ジヒドロキシキサンテン‐９‐スピロ‐１'‐３’Ｈ‐イソベンゾフラン‐３’‐オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）等があげられる。これらの塩や水和物としては、例えば、赤色３号、赤色１０４号、赤色１０５号、エオシン（アシッドレッド８７）、ウラニン等が使用できる。これらの色素物質は、食用であってもよいし、非食用であってもよい。
前記フラボノイド系色素としては、例えば、フラボノイドや、フラボノイドの重合体等があげられる。前記フラボノイドとしては、例えば、市販のカキ色素（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ ｃｏｌｏｒ ｆｒｏｍ Ｄｉｐｏｓｐｙｒｏｓ ｋａｋｉ ＴＨＵＮＢ．）があげられる。前記カキ色素は、通常、果実から抽出したフラボノイドを主成分とする。また、前記フラボノイドの重合体としては、例えば、市販のカカオ色素（Ｃａｃａｏ ｃｏｌｏｒ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｏｂｔｏｍａ ｃａｃａｏ ＬＩＮＮＥ）があげられる。前記カカオ色素は、通常、アントシアニンの重合体を主成分とする。前記アントシアニンの重合体は、例えば、下記式で表される。下記式中、ｎは重合度である。ｎは、特に制限されないが、例えば、５以上であり、好ましくは６以上である。ｎの上限は特に制限されない。Ｒは、配糖体ガラクチュロン酸である。
本発明におけるフェノチアジン誘導体色素は、特に制限されないが、ジアミノフェノチアジンまたはその誘導体があげられる。
また、前記フェノチアジン誘導体色素としては、例えば、下記式（III）で表される化合物、その互変異性体若しくは立体異性体、またはそれらの塩があげられる。
前記式（III）中、Ｒ３〜Ｒ６は、それぞれ水素原子またはアルキル基であり、同一でも異なっていても良く、前記アルキル基は、例えば、炭素原子数１〜６の直鎖または分枝アルキル基があげられ、特にメチル基が好ましい。前記式（III）中、Ｚは、それぞれ、水素原子、アルキル基、ニトロ基、アミノ基、ハロゲン、スルホ基、または、カルボキシル基であり、同一でも異なっていてもよい。前記Ｚにおいて、前記アルキル基としては、例えば、炭素原子数１〜６の直鎖または分枝アルキル基があげられ、特にメチル基が好ましい。
なお、本発明においては、前記式（Ｉ）、（II）および（III）で表される色素は、その互変異性体または立体異性体（例：幾何異性体、配座異性体および光学異性体）等の異性体であっても良い。また、前記式（III）においては、塩の場合、カウンターイオンは特に制限されないが、例えば、六フッ化リン酸イオン（PF6 -）、テトラフルオロほう酸イオン(BF4 -)、水酸化物イオン（OH-）、酢酸イオン、炭酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、ハロゲン化物イオン、次亜ハロゲン酸イオン、亜ハロゲン酸イオン、ハロゲン酸イオン、過ハロゲン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン(OSO2CF3 -)、テトラキスペンタフルオロフェニルボレートイオン[B(C6F5)4 -]等のアニオン（陰イオン）があげられる。前記ハロゲン化物イオンとしては、例えばフッ化物イオン（F-）、塩化物イオン（Cl-）、臭化物イオン（Br-）、ヨウ化物イオン（I-）等があげられる。前記次亜ハロゲン酸イオンとしては、例えば次亜フッ素酸イオン、次亜塩素酸イオン、次亜臭素酸イオン、次亜ヨウ素酸イオン等があげられる。前記亜ハロゲン酸イオンとしては、例えば亜フッ素酸イオン、亜塩素酸イオン、亜臭素酸イオン、亜ヨウ素酸イオン等があげられる。前記ハロゲン酸イオンとしては、例えばフッ素酸イオン、塩素酸イオン、臭素酸イオン、ヨウ素酸イオン等があげられる。前記過ハロゲン酸イオンとしては、例えば過フッ素酸イオン、過塩素酸イオン、過臭素酸イオン、過ヨウ素酸イオン等があげられる。
本発明において、「ハロゲン」とは、任意のハロゲン元素を指す。前記ハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が挙げられる。また、本発明において、「アルキル基」とは、特に限定されない。前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基等が挙げられる。また、本発明において、置換基等に異性体が存在する場合は、特に制限がない限り、どの異性体でも良い。例えば、単に「プロピル基」という場合はn-プロピル基およびイソプロピル基のどちらでも良い。単に「ブチル基」という場合は、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基およびtert-ブチル基のいずれでも良い。
前記フェノチアジン誘導体色素の具体例としては、例えば、下記化学式で表されるメチレンブルー、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、トルイジンブルーＯ、１，９−ジメチル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、メチレングリーン等があげられる。
＜フェノチアジン誘導体色素検出方法＞
反応系におけるフェノチアジン誘導体色素を吸光度測定により検出する方法であって、
フェノチアジン誘導体色素の検出工程を含み、
前記検出工程において、前記式（Ｉ）で表される化合物、前記式（ＩＩ）で表される化合物およびフラボノイド系色素からなる群から選択された少なくとも一つの色素物質（本発明のシフト剤）の存在下で、フェノチアジン誘導体色素の検出を行うことを特徴とする。
反応系におけるフェノチアジン誘導体色素を吸光度測定により検出する方法であって、
フェノチアジン誘導体色素の検出工程を含み、
前記検出工程において、前記式（Ｉ）で表される化合物、前記式（ＩＩ）で表される化合物およびフラボノイド系色素からなる群から選択された少なくとも一つの色素物質（本発明のシフト剤）の存在下で、フェノチアジン誘導体色素の検出を行うことを特徴とする。
本発明において、前記色素物質は、前述の通りであり、本発明のシフト剤を使用することができる。前記色素物質は、フェノチアジン誘導体色素の検出時において前記反応系に存在していればよく、例えば、前記検出工程に先立って、添加することができる。
本発明におけるフェノチアジン誘導体色素は、前述のように特に制限されない。本発明において検出するフェノチアジン誘導体色素の由来は、特に制限されず、例えば、酸化還元反応によってフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤由来のフェノチアジン誘導体色素や、発色剤として添加したフェノチアジン誘導体色素そのものがあげられる。
前記酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤としては、特に制限されないが、例えば、酸化または還元によってフェノチアジン誘導体色素を遊離（脱離）する基質があげられる。
具体例として、酸化によりフェノチアジン誘導体色素であるメチレンブルーを遊離する基質としては、例えば、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンまたはその塩（例えば、商品名ＤＡ−６７、和光純薬社製）、１０−（アセチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンまたはその塩、特許文献３記載の１０−（フェニルカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンまたはその塩等があげられる。また、特許文献４に記載の化合物Ｎｏ．II−４〜９、II−１０である、１０−（３−（メチルカルボキシアミノ）−ヘキサメチル−アミノ）−フェノチアジン、１０−（３−（メチルカルボキシアミノ）−４−メチル−フェニル）−アミノ）−フェノチアジン、１０−（（３−（メチルカルボキシアミノメチル）−フェニル）−メチルアミノ）−フェノチアジン、１０−（１−ナフタレンアミノ）−フェノチアジン、１０−（メチル）−フェノチアジン、１０−（フェニルアミノ）−フェノチアジン、１０−（メチルアミノ）−フェノチアジンや、これらの塩もあげられる。中でも、水溶性が高いことから、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩が好ましい。
また、フェノチアジン誘導体色素であるメチレンブルーを生成する発色剤としては、この他に、例えば、ロイコメチレンブルー等のロイコ化合物があげられる。ロイコメチレンブルーは、無色の化合物（還元型）であり、酸化によってメチレンブルー（酸化型）となる。このため、ロイコメチレンブルーは、例えば、酸化物質を検出するための基質として使用できる。本発明においては、例えば、前記反応系に発色剤としてロイコメチレンブルーを添加し、ロイコメチレンブルーと前記反応系における酸化物質との酸化還元反応により、メチレンブルーを生成させ、これを吸光度測定すればよい。また、メチレンブルー以外のフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤としては、各種フェノチアジン誘導体色素のロイコ体等があげられる。
このような発色剤は、一般的に、試料中の目的成分を、酸化還元反応を利用して検出する際に使用される。本発明においては、例えば、前記反応系に前記発色剤を添加し、前記発色剤と前記反応系における酸化物質または還元物質との酸化還元反応により、前記発色剤からフェノチアジン誘導体色素を生成（遊離）させる。この遊離したフェノチアジン誘導体色素の量は、酸化物質または還元物質の量に相当することから、遊離したフェノチアジン誘導体色素の有無や量を検出することによって、反応系における酸化物質もしくは還元物質の有無または量を判断できる。前記酸化物質や還元物質は、例えば、試料中の目的成分から酸化還元反応によって生成させればよい。また、試料中の目的成分が酸化物質または還元物質の場合は、これをそのまま前記発色剤と反応させてもよいし、目的成分からさらに酸化物質または還元物質を生成させ、これと前記発色剤とを反応させてもよい。
なお、本発明において「発色剤」とは、前述のように、酸化還元反応によって色を呈するフェノチアジン誘導体色素を生成する基質だけでなく、フェノチアジン誘導体色素そのものも含まれる。例えば、メチレンブルーの場合、前述のように、メチレンブルー（酸化型）は、還元によって無色のロイコメチレンブルー（還元型）になる。このため、メチレンブルーは、例えば、還元物質を検出するための基質として使用することができる。そこで、本発明においては、例えば、まず、前記反応液に発色剤としてメチレンブルーを添加し、添加したメチレンブルーと前記反応系における還元物質との酸化還元反応により、ロイコメチレンブルーを生成させる。そして、メチレンブルーを吸光度測定し、メチレンブルーの減少の有無または量を測定すればよい。つまり、発色剤として添加したメチレンブルーの減少を測定することによって、反応系における還元物質の有無や量を判断することができる。メチレンブルー以外のフェノチアジン誘導体色素についても、同様であり、例えば、前記反応液に発色剤としてフェノチアジン誘導体色素を添加し、添加したフェノチアジン誘導体色素と前記反応系における還元物質との酸化還元反応を行い、フェノチアジン誘導体色素を吸光度測定し、フェノチアジン誘導体色素の減少の有無または量を測定すればよい。
本発明において、前記色素物質は、フェノチアジン誘導体色素の吸光度測定を行う前に反応系に添加すればよい。したがって、前記色素物質は、フェノチアジン誘導体色素を生成（遊離）または消失させる酸化還元反応の前後いずれのタイミングで反応系に添加してもよいし、酸化還元反応の開始と同時または途中で添加してもよい。なお、反応系は、試験紙のようなドライ系、反応液のようなウェット系（溶液）のいずれでもよい。
前記色素物質の添加割合は、特に制限されないが、例えば、反応系に含まれるフェノチアジン誘導体色素１モルに対して、例えば、１〜１０００モル、好ましくは２〜２００モルであり、より好ましくは４〜１００モルである。また、前記色素物質の添加割合は、例えば、反応液に添加する発色剤の量に応じて決定でき、発色剤１モルに対して、例えば、０．１〜１０００モル、好ましくは１〜５００モルであり、より好ましくは４〜３００モルである。
また、反応系における前記色素物質の最終濃度は、例えば、１×１０−７〜０．１ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは２×１０−７〜０．０５ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは５×１０−７〜０．０３ｍｏｌ／Ｌである。前記反応液における前記発色剤の最終濃度は、特に制限されないが、例えば、１×１０−６〜０．１ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは５×１０−６〜０．０１ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは５×１０−６〜０．００１ｍｏｌ／Ｌである。
フェノチアジン誘導体色素の極大吸収波長は、それぞれ、一般的に、約５９０〜６７０ｎｍであることが知られている。そして、そのスペクトルから、従来の方法では、波長約５５０〜６８０ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、前記色素物質との共存により、フェノチアジン誘導体色素のスペクトルが本来のスペクトルよりも長波長側にシフトするため、従来法における前述の検出波長域よりも長波長域での測定が可能である。すなわち、本発明によれば、例えば、６７０ｎｍ以上、６８０ｎｍ以上、６９０ｎｍ以上での測定も可能である。本発明における検出波長は、例えば、５６０〜７３０ｎｍであり、好ましくは６００〜７１５ｎｍである。このように本発明の方法によれば、従来法では検出できなかった７００ｎｍ近辺での測定が可能であることから、例えば、検出波長が７００ｎｍに固定された既存の自動分析装置にも適用可能である。具体例として、前記色素物質の共存下、フェノチアジン誘導体色素溶液（例えば、１０−６ｍｏｌ／Ｌ）の７００ｎｍの吸光度を測定した場合、色素物質非存在下での７００ｎｍの吸光度に対して、例えば、２〜２０倍の吸光度が得られる。
具体例として、例えば、メチレンブルーの極大吸収波長は、一般的に約６６０〜６７０ｎｍ（例えば、約６６６ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長６００〜６８０ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、６７０ｎｍ以上、６８０ｎｍ以上、６９０ｎｍ以上での測定も可能である。本発明におけるメチレンブルーの検出波長は、例えば、６１０〜７３０ｎｍであり、好ましくは６５０〜７１５ｎｍであり、より好ましくは６６０〜７００ｎｍである。
（アズールＡ）
アズールＡの極大吸収波長は、一般的に約６３０〜６４０ｎｍ（例えば、約６３４ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長５５０〜６７５ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、約６８０ｎｍ以上、約６９０ｎｍ以上、約７００ｎｍ以上での測定が可能であり、検出波長は、例えば、約５９０〜７１５ｎｍであり、好ましくは約６１０〜７００ｎｍである。
（アズールＢ）
アズールＢの極大吸収波長は、一般的に約６１０〜６２０ｎｍ（例えば、約６１３ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長５５０〜６７５ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、約６７５ｎｍ以上、約６９０ｎｍ以上、約７００ｎｍ以上での測定が可能であり、検出波長は、例えば、約５７５〜７１０ｎｍであり、好ましくは約６００〜７００ｎｍである。
（アズールＣ）
アズールＣの極大吸収波長は、一般的に約６１０〜６２５ｎｍ（例えば、約６１９ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長５４０〜６５０ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、約６５０ｎｍ以上、約６６０ｎｍ以上、約６７０ｎｍ以上での測定が可能であり、検出波長は、例えば、約５８０〜６９０ｎｍであり、好ましくは約５９０〜６８０ｎｍである。
（トルイジンブルーＯ）
トルイジンブルーＯの極大吸収波長は、一般的に約６２５〜６３５ｎｍ（例えば、約６３１ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長５５０〜６７０ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、約６７０ｎｍ以上、約６９０ｎｍ以上、約７００ｎｍ以上での測定が可能であり、検出波長は、例えば、約６００〜７００ｎｍであり、好ましくは約６１０〜６９０ｎｍである。
（１，９−ジメチル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩）
１，９−ジメチル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩の極大吸収波長は、一般的に約５９０〜６００ｎｍ（例えば、約５９２ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長５２０〜６７５ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、約６７５ｎｍ以上、約６８５ｎｍ以上、約７００ｎｍ以上での測定が可能であり、検出波長は、例えば、約５４０〜７１０ｎｍであり、好ましくは約５７０〜７００ｎｍである。
（メチレングリーン）
メチレングリーンの極大吸収波長は、一般的に約６０５〜６１５ｎｍ（例えば、約６０９ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長５４０〜６７５ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、約６７５ｎｍ以上、約６９０ｎｍ以上、約７００ｎｍ以上での測定が可能であり、検出波長は、例えば、約５５０〜７１０ｎｍであり、好ましくは約５８０〜７００ｎｍである。
（アズールＡ）
アズールＡの極大吸収波長は、一般的に約６３０〜６４０ｎｍ（例えば、約６３４ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長５５０〜６７５ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、約６８０ｎｍ以上、約６９０ｎｍ以上、約７００ｎｍ以上での測定が可能であり、検出波長は、例えば、約５９０〜７１５ｎｍであり、好ましくは約６１０〜７００ｎｍである。
（アズールＢ）
アズールＢの極大吸収波長は、一般的に約６１０〜６２０ｎｍ（例えば、約６１３ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長５５０〜６７５ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、約６７５ｎｍ以上、約６９０ｎｍ以上、約７００ｎｍ以上での測定が可能であり、検出波長は、例えば、約５７５〜７１０ｎｍであり、好ましくは約６００〜７００ｎｍである。
（アズールＣ）
アズールＣの極大吸収波長は、一般的に約６１０〜６２５ｎｍ（例えば、約６１９ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長５４０〜６５０ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、約６５０ｎｍ以上、約６６０ｎｍ以上、約６７０ｎｍ以上での測定が可能であり、検出波長は、例えば、約５８０〜６９０ｎｍであり、好ましくは約５９０〜６８０ｎｍである。
（トルイジンブルーＯ）
トルイジンブルーＯの極大吸収波長は、一般的に約６２５〜６３５ｎｍ（例えば、約６３１ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長５５０〜６７０ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、約６７０ｎｍ以上、約６９０ｎｍ以上、約７００ｎｍ以上での測定が可能であり、検出波長は、例えば、約６００〜７００ｎｍであり、好ましくは約６１０〜６９０ｎｍである。
（１，９−ジメチル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩）
１，９−ジメチル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩の極大吸収波長は、一般的に約５９０〜６００ｎｍ（例えば、約５９２ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長５２０〜６７５ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、約６７５ｎｍ以上、約６８５ｎｍ以上、約７００ｎｍ以上での測定が可能であり、検出波長は、例えば、約５４０〜７１０ｎｍであり、好ましくは約５７０〜７００ｎｍである。
（メチレングリーン）
メチレングリーンの極大吸収波長は、一般的に約６０５〜６１５ｎｍ（例えば、約６０９ｎｍ）であり、従来法では、例えば、波長５４０〜６７５ｎｍの範囲で吸光度測定ができるにとどまっている。これに対して、本発明の方法によれば、例えば、約６７５ｎｍ以上、約６９０ｎｍ以上、約７００ｎｍ以上での測定が可能であり、検出波長は、例えば、約５５０〜７１０ｎｍであり、好ましくは約５８０〜７００ｎｍである。
本発明のフェノチアジン誘導体色素の検出方法は、フェノチアジン誘導体色素の検出工程を含むあらゆる測定（例えば、定性や定量）方法に適用できる。このため、例えば、酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成または消失させ、フェノチアジン誘導体色素の有無またはその量の増減を測定することによって、目的物質を定性または定量する方法等へ適用することが好ましい。
＜目的成分の測定方法＞
つぎに、本発明の第１の検出方法は、前述のように、フェノチアジン誘導体色素の検出により試料中の目的成分を測定する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｅ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ） 前記試料中の目的成分から酸化物質または還元物質を生成させる工程
（Ｂ） 前記試料に、酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤を添加する発色剤添加工程
（Ｃ） 前記酸化物質または還元物質と前記発色剤との酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成させる工程
（Ｄ） 本発明のフェノチアジン誘導体色素の検出方法によりフェノチアジン誘導体色素を検出して、前記フェノチアジン誘導体色素の生成の有無または生成量を測定する工程
（Ｅ） 前記測定結果から、前記試料中の目的成分の有無または量を決定する工程
つぎに、本発明の第１の検出方法は、前述のように、フェノチアジン誘導体色素の検出により試料中の目的成分を測定する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｅ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ） 前記試料中の目的成分から酸化物質または還元物質を生成させる工程
（Ｂ） 前記試料に、酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤を添加する発色剤添加工程
（Ｃ） 前記酸化物質または還元物質と前記発色剤との酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成させる工程
（Ｄ） 本発明のフェノチアジン誘導体色素の検出方法によりフェノチアジン誘導体色素を検出して、前記フェノチアジン誘導体色素の生成の有無または生成量を測定する工程
（Ｅ） 前記測定結果から、前記試料中の目的成分の有無または量を決定する工程
また、本発明の第２の検出方法は、前記（Ｂ）〜（Ｄ）工程に代えて、下記（Ｂ’）〜（Ｄ’）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ） 前記試料中の目的成分から酸化物質または還元物質を生成させる工程
（Ｂ’） 前記試料に、発色剤としてフェノチアジン誘導体色素を添加する工程
（Ｃ’） 前記試料中の目的成分から生成した還元物質とフェノチアジン誘導体色素とを酸化還元反応させる工程
（Ｄ’） 本発明のフェノチアジン誘導体色素の検出方法によりフェノチアジン誘導体色素を検出して、添加した前記フェノチアジン誘導体色素の減少の有無または減少量を測定する工程
（Ｅ） 前記測定結果から、前記試料中の目的成分の有無または量を決定する工程
（Ａ） 前記試料中の目的成分から酸化物質または還元物質を生成させる工程
（Ｂ’） 前記試料に、発色剤としてフェノチアジン誘導体色素を添加する工程
（Ｃ’） 前記試料中の目的成分から生成した還元物質とフェノチアジン誘導体色素とを酸化還元反応させる工程
（Ｄ’） 本発明のフェノチアジン誘導体色素の検出方法によりフェノチアジン誘導体色素を検出して、添加した前記フェノチアジン誘導体色素の減少の有無または減少量を測定する工程
（Ｅ） 前記測定結果から、前記試料中の目的成分の有無または量を決定する工程
なお、本発明は、前述のような本発明のシフト剤（前記色素物質）の存在下で、フェノチアジン誘導体色素の検出を行うことが特徴であって、その他の工程や条件等については何ら制限されない。
本発明における目的成分は、例えば、フェノチアジン誘導体色素の検出を利用した測定が可能であれば、その種類は何ら制限されず、例えば、目的成分から酸化還元反応により酸化物質または還元物質を生成できるものがあげられる。前記目的成分自体が酸化物質または還元物質である場合は、前述のように、目的成分から酸化物質や還元物質をさらに生成させてもよいし、例えば、前記（Ａ）工程を省略し、前記（Ｂ）工程または前記（Ｂ’）工程において、酸化物質または還元物質である目的成分そのものを前記発色剤と反応させてもよい。前記目的成分の具体例としては、例えば、糖化ヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、尿酸、コレステロール、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられる。
例示した目的成分の中でも、生体の状態を示す重要な指標である糖化Ｈｂの測定に適用することが好ましい。糖化Ｈｂには、例えば、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸（バリン）のα‐アミノ基にグルコースが結合したもの（以下、「ＨｂＡ１ｃ」ともいう）や、Ｈｂのリジンの側鎖アミノ基にグルコースが結合したもの（以下、「ＧＨｂＬｙｓ」ともいう）がある。そして、前者の値（ＨｂＡ１ｃ％）は、Ｈｂ量に対するＨｂＡ１ｃ量の比率（割合、％）で表され、生体内血糖値の過去（約１〜２ヶ月）の履歴を反映することが知られている。また、後者の値（ＧＨｂＬｙｓ％）は、Ｈｂ量に対するＧＨｂＬｙｓ量の比率（割合、％）で表され、最近、本発明者らによって食後高血糖を反映することが明らかにされた（別途特許出願中）。このように、Ｈｂの糖化率は、糖尿病の診断、予防、治療等において非常に重要な指標であり、さらに優れた測定方法への改善が求められていることから、その測定に本発明を適用することが望ましい。
本発明の測定方法において、前記試料の種類は、何ら制限されない。具体例としては、例えば、全血、血漿、血清、血球等の血液試料、尿、髄液等の生体試料や、飲料水、食品類等があげられる。目的成分が血球内成分の場合には、例えば、血球や血球を含む全血を溶血処理して試料を調製できる。溶血方法は、特に制限されず、例えば、浸透圧差を利用する方法、超音波による方法、界面活性剤処理方法等が使用できる。浸透圧差を利用する場合、全血（または血球）に対して、例えば、２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血させればよい。
本発明の測定方法において、試料の種類は何ら制限されないが、以下の理由から、血液試料に適用することが好ましい。フェノチアジン誘導体色素検出を利用した目的成分の測定方法は、前述のように、比較的長波長側での測定が可能であることから、広く採用されている。しかし、血液試料（特に血球成分を含む試料）にはＨｂが存在し、Ｈｂがメト化されると、フェノチアジン誘導体色素の本来の極大吸収波長で吸収を示すことから、フェノチアジン誘導体色素検出に影響を及ぼすおそれがあった。これに対して、本発明によれば、フェノチアジン誘導体色素をさらに長波長域で検出できるため、従来法におけるメト化Ｈｂによる影響を軽減でき、測定精度をより向上できる。したがって、血液成分である糖化Ｈｂや糖化アルブミン等を測定する際には、特に有用な方法といえる。
つぎに、本発明の目的成分の測定方法について、目的成分が糖化Ｈｂであり、そのＨｂＡ１ｃ％を、酸化によりフェノチアジン誘導体色素を遊離する発色剤を用いて測定する一例をあげて説明する。なお、本発明は、この例に限定されるものではない。
（プロテアーゼ処理）
まず、試料中の糖化Ｈｂをプロテアーゼで処理する。この工程は、必須ではないが、次工程におけるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）を、Ｈｂの糖化部分に効率良く作用できることから好ましい。
まず、試料中の糖化Ｈｂをプロテアーゼで処理する。この工程は、必須ではないが、次工程におけるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）を、Ｈｂの糖化部分に効率良く作用できることから好ましい。
前記プロテアーゼとしては、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来プロテアーゼ等が使用でき、好ましくはエンドプロテアーゼである。市販品としては、例えば、メタロプロテアーゼ（アークレイ社製）、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム社製）、パパインＭ−４０（天野エンザイム社製）、商品名プロテアーゼＮ（フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（東洋紡社製：商品名トヨチーム）等があげられる。
特に、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端ペプチドを切り出す場合には、β鎖Ｎ末端に特異的に作用してＮ末端ペプチドの切断を触媒するプロテアーゼ（例えば、特開２０００−３００２９４号公報、特開２００４−３４４０５２号公報等）が好ましい。また、β鎖Ｎ末端バリンの切断を触媒するプロテアーゼとしては、例えば、国際公開第２０００／５０５７９号パンフレット（日本国特許３６６８８０１）、国際公開第２０００／６１７３２号パンフレット、特開２００２−３１５６００号公報等に開示されているプロテアーゼがあげられる。
この反応液におけるプロテアーゼの添加割合は、例えば、０．００１〜３００，０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．０１〜３０，０００ＫＵ／Ｌである。前記反応液中のＨｂ濃度が０．００５ｍＭの場合、プロテアーゼの添加割合は、例えば、０．０１〜３００，０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．０５〜３０，０００ＫＵ／Ｌである。プロテアーゼの活性「Ｕ」は、３５℃で、１分間に１マイクロモルのチロシンに相当する２７５ｎｍの吸光度の増加を与える酵素量を１Ｕとする。
前記プロテアーゼ処理は、例えば、緩衝液中で行うことが好ましく、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が使用できる。また、プロテアーゼ反応液のｐＨは、例えば、４〜１０の範囲であり、好ましくは６〜９であり、例えば、前述のような緩衝液によってｐＨを調整してもよい。
プロテアーゼ処理の条件は特に制限されないが、処理温度は、例えば、１０〜４０℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間は、例えば、１〜１００分程度であり、好ましくは１〜１０分である。
また、このプロテアーゼ処理は、例えば、以下に示すような促進化合物の存在下で行ってもよい。このような促進化合物の存在下で、Ｈｂをプロテアーゼ処理すれば、プロテアーゼ処理の効率化・短縮化が可能になる。また、効率良いプロテアーゼ処理が可能であるため、例えば、処理に使用するプロテアーゼの増量も不要となる。
前記促進化合物としては、例えば、下記式（IV）で表される化合物があげられる。
Ｒ−Ｘ ・・・（IV）
Ｒ−Ｘ ・・・（IV）
前記式（IV）において、Ｒは、炭素数が９以上のアルキル基、置換アルキル基、アシル基または置換アシル基である。具体例としては、炭素数９〜１６の直鎖アルキル基もしくは直鎖アシル基、炭素数１０〜４０であり主鎖炭素数が９〜１６である分枝鎖アルキル基もしくは分枝鎖アシル基、または、シクロアルキルで置換された直鎖アルキル基（例えば、シクロアルキルの炭素数が３〜８であり、シクロアルキルを除く直鎖の炭素数が４〜１３）等があげられる。前記シクロアルキルは、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、シクロブチル等があげられる。前記式（IV）において、Ｘは、糖残基であり、例えば、単糖または二糖の残基であることが好ましい。前記単糖としては、例えば、マンノシド、グルコシド、チオグルコシド等、二糖としては、マルトシド、フルクトピラノシル−グルコピラノシド、チオマルトシド等があげられる。これらの糖の構造は、α、β、Ｄ、Ｌのいずれでもよい。また、糖の環式構造に結合する水素や、ＯＨ基の水素は、例えば、Ｎａ、Ｋ、ハロゲン等で置換されてもよい。なお、本発明において、Ｒと糖残基の環式構造との結合を介している原子（例えば、−Ｏ−、−Ｓ−等）は、糖残基の構成要素とする。
前記式（IV）の促進化合物の具体例としては、例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）、６−シクロヘキシルヘキシル−β−Ｄ−マルトシド、スクロースモノラウレート（β−Ｄ−フルクトピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドモノドデカノエート）、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド（ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド）、５−シクロヘキシルペンチル−β−Ｄ−マルトシド、ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−αβ−Ｄ−マルトシド、ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド、および、３−オキサトリデシル−α−Ｄ−マンノシド等があげられる。これらの化合物の化学式を以下に示す。これらの中でも、前記式（IV）におけるＲ（アルキル鎖）の炭素数が１２以上である、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、スクロースモノラウレート、ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド等が好ましい。また、Ｒの炭素数が同じ場合（例えば、炭素数が同じアルキル基とアシル基）、より好ましくはアシル基であり、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）が好ましい。
プロテアーゼ処理の反応液における前記促進化合物の添加割合は、例えば、０．０１〜２００ｍＭの範囲であり、好ましくは０．４〜１００ｍＭである。前記反応液中のＨｂ濃度が０．００５ｍＭの場合、前記促進化合物の添加割合は、例えば、０．４〜１００ｍＭの範囲であり、好ましくは１〜１００ｍＭである。なお、前記促進化合物とプロテアーゼの添加順序は何ら制限されず、同時でもよいし、それぞれを順不同で添加することもできる。
プロテアーゼ処理の条件は、前述のように特に制限されないが、促進化合物を共存させる場合、その処理時間は制限されず、特に上限は制限されず、例えば、０．１〜６０分程度でプロテアーゼ処理を行うことが可能である。処理時間は、好ましくは０．１〜４５分、より好ましくは０．２〜２０分であり、特に好ましくは０．２〜５分である。前記促進化合物の存在下でプロテアーゼ処理を行う場合、より迅速にアミノ酸やペプチドの切り出しを行えるため、前述のような処理時間であっても十分に切断処理が可能である。
また、前記促進化合物としては、前記式（IV）の化合物の他に、例えば、ニトロ化合物があげられる。これらはいずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。ニトロ化合物としては、例えば、亜硝酸やその塩があげられる。亜硝酸塩としては、特に制限されないが、例えば、亜硝酸カリウム、亜硝酸アミル、亜硝酸ブチル、ニトログリセリン、亜硝酸ナトリウム、パラニトロクロルベンゼン、トリニトロトルエン、ニトロベンゼン等があげられる。プロテアーゼ処理の反応液における前記ニトロ化合物の添加割合は、特に制限されないが、例えば、前記反応液中のＨｂ濃度が０．００５ｍＭの場合、前記ニトロ化合物の添加割合は、例えば、０．００５ｍＭ以上が好ましく、より好ましくは０．０５〜２ｍＭである。
前記促進化合物としては、前述の化合物の他に、例えば、テトラゾリウム化合物があげられる。前記テトラゾリウム化合物としては、特に制限されないが、例えば、2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium salt、2-(4-iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium salt、2-(2-methoＸy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium salt、2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium salt、3,3’-(1,1’-biphenyl-4,4’-diyl)-bis(2,5-diphenyl)-2H-tetrazolium salt、3,3’-[3,3’-dimethoＸy-(1,1’-biphenyl)-4,4’-diyl]-bis[2-(4-nitropenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium salt]、2,3-diphenyl-5-(4-chlorophenyl)tetrazolium salt、2,5-diphenyl-3-(p-diphenyl)tetrazolium salt、2,3-diphenyl-5-(p-diphenyl)tetrazolium salt、2,5-diphenyl-3-(4-styrylphenyl)tetrazolium salt、2,5-diphenyl-3-(m-tolyl)tetrazolium salt、2,5-diphenyl-3-(p-tolyl)tetrazolium salt、2,3-diphenyl-5-(2-thienyl)tetrazolium salt、2-benzothiazoyl-3-(4-carboＸy-2-methoＸyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium salt、 2,2’-dibenzothiazolyl-5,5’-bis[4-di(2-sulfoethyl)carbamoylphenyl]-3,3’-(3,3’-dimethoＸy-4,4’-biphenylene)ditetrazolium salt、3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium salt、2,3-diphenyl-5-cyanotetrazolium salt、2,3-diphenyl-5-carboＸytetrazolium salt、2,3-diphenyl-5-methyltetrazolium salt、2,3-diphenyl-5-ethyltetrazolium salt等があげられ、特に好ましくは、2-(4-iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium saltである。前記テトラゾリウム化合物は、促進化合物として作用する他に、例えば、血液試料のようにアスコルビン酸等の還元物質を含む試料の場合、これらの酸化還元反応への影響を回避することもできる。前記影響の回避を目的とする場合、テトラゾリウム化合物は、次工程のＦＡＯＤ処理に先立って試料に添加すればよい。なお、前述のような促進化合物として作用も有することから、テトラゾリウム化合物は、プロテアーゼ処理の前に添加することが好ましい。
前記テトラゾリウム化合物の添加量は、特に制限されないが、例えば、試料１μＬ当たり、０．００１〜１００μｍｏｌになるように添加することが好ましく、より好ましくは０．００５〜１０μｍｏｌの範囲、特に好ましくは、０．０１〜１μｍｏｌの範囲である。
（ＦＡＯＤ処理工程）
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られたＨｂ断片にＦＡＯＤを添加し、Ｎ末端バリンの糖化部分にＦＡＯＤを作用させ、酸化物質である過酸化水素を生成させる。糖化ＨｂのＨｂＡ１ｃを測定する場合、プロテアーゼによるＨｂ切断物は、β鎖Ｎ末端糖化バリンまたは前記糖化バリンを含むペプチドであって、β鎖Ｎ末端バリンの糖化部分にＦＡＯＤを作用させればよい。なお、Ｈｂ断片は、前述のように、使用するプロテアーゼの種類の選択によって決定できる。
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られたＨｂ断片にＦＡＯＤを添加し、Ｎ末端バリンの糖化部分にＦＡＯＤを作用させ、酸化物質である過酸化水素を生成させる。糖化ＨｂのＨｂＡ１ｃを測定する場合、プロテアーゼによるＨｂ切断物は、β鎖Ｎ末端糖化バリンまたは前記糖化バリンを含むペプチドであって、β鎖Ｎ末端バリンの糖化部分にＦＡＯＤを作用させればよい。なお、Ｈｂ断片は、前述のように、使用するプロテアーゼの種類の選択によって決定できる。
前記ＦＡＯＤは、特に制限されないが、α-アミノ基が糖化されたアミノ酸またはペプチドに作用して、過酸化水素およびα−ケトアルデヒドを発生する反応を触媒する酵素（以下、「ＦＡＯＤ−α」という）が好ましい。このような触媒反応は、例えば、下記式（１）で表すことができる。
Ｒ１-ＣＯ-ＣＨ２-ＮＨ-Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２
→Ｒ１-ＣＯ-ＣＨＯ ＋ ＮＨ２-Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ２ …（１）
Ｒ１-ＣＯ-ＣＨ２-ＮＨ-Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２
→Ｒ１-ＣＯ-ＣＨＯ ＋ ＮＨ２-Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ２ …（１）
前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−[ＣＨ（ＯＨ）]ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
−[ＣＨ（ＯＨ）]ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（１）において、Ｒ２は、特に制限されないが、例えば、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４ …（２）
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４ …（２）
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示し、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（３）
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（３）
このようなＦＡＯＤ−αとしては、例えば、国際公開第２００４／０２９２５１号パンフレットに記載のフルクトシルアミンオキシダーゼ、特開２００４−２７５０１３号公報や特開２００４−２７５０６３号公報記載のフルクトシルアミンオキシダーゼ、ペニシリウム属由来のＦＡＯＤ（特開平８−３３６３８６号公報）等が使用できる。このようなＦＡＯＤを使用すれば、例えば、β鎖Ｎ末端バリン以外が糖化されていても、バリンの糖化部分以外には作用し難いため、より精度の高いＨｂＡ１ｃの測定が可能となる。
なお、ＦＡＯＤは、前記（１）以外の基質特異性をさらに有していてもよい。このようなＦＡＯＤとしては、例えば、前記糖化されたα−アミノ基と糖化されたアミノ酸側鎖基の両方に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−αＳ」という）があげられる。具体例として、例えば、商品名ＦＰＯＸ-ＣＥ（キッコーマン社製）、商品名ＦＰＯＸ−ＥＥ（キッコーマン社製）、市販の商品名ＦＯＤ（旭化成社製）、ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平８−１５４６７２号公報）、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平７−２８９２５３号公報）、アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ９９／２００３９）等があげられる。このようなＦＡＯＤの場合、例えば、プロテアーゼの種類を適宜選択し、β鎖Ｎ末端のアミノ酸やペプチドを特異的に切断するプロテアーゼと組み合わせることによって、他の糖化部位への作用を抑制することが可能である。
ＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。ＦＡＯＤ処理の条件は、特に制限されないが、反応液のｐＨは、例えば、６〜９であり、処理温度は、例えば、１０〜３８℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間も特に制限されず、例えば、０.１〜６０分、好ましくは０.１〜５分である。
ＦＡＯＤ処理の反応液におけるＦＡＯＤの添加割合は、例えば、０.０１〜５０ＫＵ/Ｌの範囲であり、好ましくは０.５〜１０ＫＵ／Ｌである。ＦＡＯＤの活性「Ｕ」は、フルクトシルバリンを基質として１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する量を１Ｕとする。
（フェノチアジン誘導体色素生成工程応）
つぎに、反応液に前述のような発色剤を添加して、前記ＦＡＯＤ処理によって生じた過酸化水素と前記発色剤との酸化還元反応を行う。この反応によって前記発色剤が酸化され、フェノチアジン誘導体色素が生成される。
つぎに、反応液に前述のような発色剤を添加して、前記ＦＡＯＤ処理によって生じた過酸化水素と前記発色剤との酸化還元反応を行う。この反応によって前記発色剤が酸化され、フェノチアジン誘導体色素が生成される。
この酸化還元反応には、触媒として酸化酵素を使用することが好ましく、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）があげられる。この反応は、前記ＦＡＯＤ処理と同様に緩衝液中で行われることが好ましく、前述のような緩衝液が使用できる。ＰＯＤ処理の条件は、特に制限されないが、反応液のｐＨは、例えば、５〜９であり、処理温度は、例えば、１０〜４０℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間も特に制限されず、例えば、０.１〜５分である。反応液におけるＰＯＤの添加割合は、例えば、０.０１〜３００ＫＵ/Ｌの範囲であり、好ましくは０.５〜４０ＫＵ／Ｌである。ＰＯＤの活性「Ｕ」は、１分間に１マイクロモルのグアイヤコールを酸化できる量を１Ｕとする。
また、反応液における発色剤の添加割合は、例えば、０.００１〜１０ｍＭの範囲であり、好ましくは０.００５〜２ｍＭである。
（吸光度測定工程）
つぎに、反応液に前述の色素物質を添加してから、フェノチアジン誘導体色素の吸光度測定を行う。この色素物質の添加のタイミングは、前述のように吸光度測定前であれば何ら限定されず、例えば、フェノチアジン誘導体色素の生成工程の前後いずれであってもよいし、前記発色剤や酸化酵素の添加と同時であってもよい。
つぎに、反応液に前述の色素物質を添加してから、フェノチアジン誘導体色素の吸光度測定を行う。この色素物質の添加のタイミングは、前述のように吸光度測定前であれば何ら限定されず、例えば、フェノチアジン誘導体色素の生成工程の前後いずれであってもよいし、前記発色剤や酸化酵素の添加と同時であってもよい。
前記色素物質の添加割合は、特に制限されないが、発色剤１モルに対して、例えば、０．１〜１０００モル、好ましくは１〜５００モルであり、より好ましくは５〜３００モルであり、また、反応液における最終濃度は、例えば、０．００１〜１００ｍｍｏｌ/Ｌであり、好ましくは０．００５〜５０ｍｍｏｌ/Ｌ、より好ましくは０．０１〜１０ｍｍｏｌ/Ｌである。
吸光度測定には、例えば、分光光度計や従来公知の検出機器が使用できる。反応液の吸光度は生成したフェノチアジン誘導体色素量を示し、生成したフェノチアジン誘導体色素の量は過酸化水素の量に、過酸化水素の量はＨｂにおけるβ鎖Ｎ末端バリンの糖化量に、それぞれ対応する。したがって、吸光度測定によって、間接的にＨｂの糖化量（ＨｂＡ１ｃ濃度）を求めることができる。さらに、別途、試料中の全Ｈｂ量（Ｈｂ濃度）を測定し、下記式に示すように、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端バリンの糖化量（ＨｂＡ１ｃ濃度）と試料中の全Ｈｂ量（Ｈｂ濃度）との比（１００分率）を算出することによって、ＨｂＡ１ｃ％を求めることができる。なお、Ｈｂ量は、従来公知の方法や、市販の試薬キットによって測定できる。
ＨｂＡ１ｃ％＝（β鎖Ｎ末端バリンの糖化量/Ｈｂ量）×１００
ＨｂＡ１ｃ％＝（β鎖Ｎ末端バリンの糖化量/Ｈｂ量）×１００
吸光度からのＨｂ糖化量の算出は、例えば、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端の既知糖化量と吸光度との関係をプロットした検量線を用いればよい。例えば、β鎖Ｎ末端糖化量が既知であるＨｂ標準液について、前述と同様にして吸光度測定を行い、この標準液の測定値と既知糖化量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、この検量線に前述のように測定した吸光度を代入することによって、β鎖Ｎ末端の糖化量が算出できる。
また、糖化ＨｂのＧＨｂＬｙｓ％を測定する場合には、例えば、以下の点以外は、前述のＨｂＡ１ｃ％測定と同様に行うことができる。
プロテアーゼとしては、前述と同様のものが使用できるが、中でも、リジンもしくはリジンペプチドを切り出す場合には、例えば、国際公開第２００２／００６５１９号パンフレットに記載のプロテアーゼ等を使用することが好ましい。
ＦＡＯＤとしては、特に制限されないが、アミノ酸側鎖のアミノ基（例えば、ε-アミノ基）が糖化されたアミノ酸またはペプチドに作用して下記式（１’）に示す反応を触媒する酵素（ＦＡＯＤ−Ｓ）が好ましい。
Ｒ１-ＣＯ-ＣＨ２-ＮＨ-Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２
→Ｒ１-ＣＯ-ＣＨＯ ＋ ＮＨ２-Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ２ …（１’）
Ｒ１-ＣＯ-ＣＨ２-ＮＨ-Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２
→Ｒ１-ＣＯ-ＣＨＯ ＋ ＮＨ２-Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ２ …（１’）
前記式（１’）において、Ｒ１は、前記式（１）のＲ１と同様であり、Ｒ２は下記式（４’）で示すことができる。下記式（４’）において「−（ＣＨ２）４−」は、リジンの側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。
−（ＣＨ２）４−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ６）−ＣＯ−Ｒ７ …（４’）
−（ＣＨ２）４−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ６）−ＣＯ−Ｒ７ …（４’）
また、前記式（４’）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５’）で示すことができる。なお、下記式（５’）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＣＯ−ＣＲ３Ｈ−ＮＨ）ｎ−Ｈ …（５’）
−（ＣＯ−ＣＲ３Ｈ−ＮＨ）ｎ−Ｈ …（５’）
また、前記式（４’）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（４’）で示すことができる。なお、下記式（６’）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（６’）
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（６’）
前記糖化されたアミノ酸側鎖に特異的に作用するＦＡＯＤ−Ｓとしては、例えば、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（日本生物工学会大会 平成１２年度 「Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来アミノ酸オキシダーゼの基質特異性の変換；藤原真紀 他」）等があげられる。なお、ＦＡＯＤは、前記式（１’）以外の基質特異性をさらに有していてもよく、前述のようなＦＡＯＤ−αＳを使用することもできる。このようなＦＡＯＤの場合、例えば、国際公開第２００２／００６５１９号パンフレットに記載のプロテアーゼ等のように、Ｎ末端のα位アミノ基が糖化された糖化アミノ酸を生成しないプロテアーゼ（例えば、リジンやリジンを含むペプチドを特異的に切断するプロテアーゼ）を選択し、これと組み合わせることによって、他の糖化部位への作用を抑制することが可能である。
ＧＨｂＬｙｓ％は、吸光度測定によって、間接的にＨｂのＬｙｓの側鎖アミノ基の糖化量（ＧＨｂＬｙｓ濃度）を求め、下記式に示すように、Ｌｙｓの側鎖アミノ基の糖化量（ＧＨｂＬｙｓ濃度）と試料中の全Ｈｂ量（Ｈｂ濃度）との比（１００分率）を算出することによって、求めることができる。
ＧＨｂＬｙｓ％＝（Ｌｙｓの側鎖アミノ基の糖化量/Ｈｂ量）×１００
ＧＨｂＬｙｓ％＝（Ｌｙｓの側鎖アミノ基の糖化量/Ｈｂ量）×１００
なお、Ｈｂの糖化率（％）の測定において、各処理工程は、前述のように別々に行ってもよいが、測定に影響しない範囲において各処理を同時に行ってもよい。具体例としては、以下のような組み合わせで各処理を同時に行うことができる。また、プロテアーゼ、ＦＡＯＤ、ＰＯＤ、発色基質の添加順序も特に制限されず、中でも、前記色素物質は、フェノチアジン誘導体色素の吸光度測定前であれば、いずれの工程で添加してもよい。
１ ： 溶血処理＋プロテアーゼ処理
２ ： プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
３ ： ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
４ ： プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
１ ： 溶血処理＋プロテアーゼ処理
２ ： プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
３ ： ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
４ ： プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
＜発色剤試薬＞
つぎに、本発明の発色剤試薬は、前記本発明のフェノチアジン誘導体色素の検出方法または本発明の目的成分の測定方法に使用する発色剤試薬であって、酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する化合物およびフェノチアジン誘導体色素のいずれか一方の発色剤、および、本発明のシフト剤（前述の色素物質）を含むことを特徴とする。
つぎに、本発明の発色剤試薬は、前記本発明のフェノチアジン誘導体色素の検出方法または本発明の目的成分の測定方法に使用する発色剤試薬であって、酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する化合物およびフェノチアジン誘導体色素のいずれか一方の発色剤、および、本発明のシフト剤（前述の色素物質）を含むことを特徴とする。
前記発色剤試薬における前記発色剤と前記色素物質との添加割合は、特に制限されないが、例えば、発色剤１モルに対して、色素物質が、例えば、０．１〜１０００モルであり、好ましくは１〜５００モルであり、より好ましくは４〜３００モルである。また、前記発色剤試薬における発色剤と色素物質の濃度は、特に制限されず、例えば、反応系に添加した際の終濃度や反応系への添加による希釈割合等を考慮して適宜決定できる。
前記発色剤試薬は、ドライ（固体）、ウェット（液体）のいずれでもよい。この試薬を添加する反応系が液体の場合には、例えば、使用時に適当な溶媒に溶解して液体試薬としてもよいし、液体状態で保存して使用することもできる。前述の色素物質、その中でも特に、５−ヒドロキシ−１−（４−スルホフェニル）−４−（４−スルホフェニルアゾ）ピラゾール−３−カルボン酸およびその塩、黄色５号や赤色２号等は、液体試薬に適用することが好ましい。この色素物質を液体状態で発色剤と共存させた場合、前記色素物質の存在によって、例えば、液体内の発色剤に対する光の照射が遮断され、前記発色剤の自然発色が抑制される。このため、本発明によれば、発色剤試薬を長時間液体状態で保存することが可能であり、特に、ＤＡ−６７のように光に対して不安定な発色剤を使用する際に適している。
前記発色剤試薬のｐＨは、特に制限されず、例えば、発色剤の種類や、目的の測定方法における反応系のｐＨ条件等に応じて適宜決定できる。具体例としては、例えば、４〜９であり、好ましくは５〜９である。また、発色剤が１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（商品名ＤＡ−６７；和光純薬社製）の場合は、例えば、４〜１０であり、好ましくは５〜９である。
本発明の発色剤試薬は、例えば、発色剤と本発明のシフト剤（色素物質）のみを含む試薬でもよいが、例えば、目的の測定方法に応じて、さらに、種々の酵素や添加物等を含んでもよい。
本発明の発色剤試薬について、前述の糖化Ｈｂの測定方法に使用する一例をあげて説明する。なお、本発明は、この例に限定されるものではない。
前述のように糖化Ｈｂの測定（糖化率の測定）においては、例えば、プロテアーゼ、ＦＡＯＤ、ＰＯＤ、発色剤を使用するが、以下の第１試薬と本発明の発色剤試薬である第２試薬とを組み合わせて使用することができる。
第１試薬は、例えば、ＦＡＯＤ、ＰＯＤを含む試薬であり、この他に、例えば、緩衝剤、血球溶血用の界面活性剤、プロテアーゼ処理を促進する前記促進化合物等を含んでもよい。これらの各成分の含有割合は、特に制限されないが、例えば、反応系における第１試薬の最終希釈倍率を１．３倍と設定した場合、例えば、ＦＡＯＤ ０．３〜１０ＫＵ／Ｌ、ＰＯＤ １〜５０ＫＵ／Ｌ、緩衝剤１０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ、界面活性剤０．１〜１０ｇ／Ｌ、促進化合物０．１〜１０ｇ／Ｌであり、ｐＨは、例えば、５〜８である。
第２試薬は、例えば、色素物質、プロテアーゼ、発色剤を含む試薬であり、この他に、例えば、緩衝剤、塩化カルシウム等の塩、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等を含んでもよい。これらの各成分の含有割合は、特に制限されないが、例えば、反応系における第２試薬の最終希釈倍率を５．３倍と設定した場合、例えば、色素物質１０〜１０００ｍｇ／Ｌ、プロテアーゼ１００〜５０００ＫＵ／Ｌ、発色剤０．００５〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、緩衝剤１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、塩化カルシウム０．５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム０．１〜３ｍｍｏｌ／Ｌであり、ｐＨは、例えば、４〜７である。
本発明の発色剤試薬は、本発明のフェノチアジン誘導体色素の検出方法または目的成分の測定方法に使用する試薬キットの構成試薬として使用できる。本発明における試薬キットは、本発明の発色剤試薬を含み、具体例としては、前述のような第１試薬および本発明の発色剤試薬である第２試薬を含む構成があげられる。
また、本発明の発色剤試薬によれば、本発明のシフト剤（前記色素物質）を発色剤と共存させることによって、例えば、フェノチアジン誘導体色素の自然発生を抑制することもできる。このため、本発明のシフト剤は、例えば、前記発色剤からのフェノチアジン誘導体色素の自然発生を抑制する抑制剤としても使用できる。前記色素物質を前記抑制剤として使用する場合、前記発色剤試薬における発色剤と色素物質との含有割合や濃度は、特に制限されず、前述と同様である。
＜吸収スペクトルのシフト方法＞
本発明のシフト方法は、反応系におけるフェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルをシフトさせる方法であって、前記反応系に、前記色素物質（本発明のシフト剤）を添加することを特徴とする。前述のように、本発明のシフト剤によれば、フェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルを長波長側にシフトすることができる。具体的な方法は、例えば、本発明のフェノチアジン誘導体色素検出方法と同様である。
本発明のシフト方法は、反応系におけるフェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルをシフトさせる方法であって、前記反応系に、前記色素物質（本発明のシフト剤）を添加することを特徴とする。前述のように、本発明のシフト剤によれば、フェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルを長波長側にシフトすることができる。具体的な方法は、例えば、本発明のフェノチアジン誘導体色素検出方法と同様である。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
各種シフト剤とメチレンブルーとを共存させ、メチレンブルーについて、吸光度ピークのシフト、もしくは、スペクトルの長波長側へのシフトが生じているか否かを確認した。
（シフト剤）
Ｎｏ．１ タートラジン
Ｎｏ．２ 食品添加物 食用黄色５号
Ｎｏ．３ 食品添加物 食用赤色２号
Ｎｏ．４ 食品添加物 食用赤色３号
Ｎｏ．５ 食品添加物 食用赤色１０２号
Ｎｏ．６ 食品添加物 食用赤色１０４号
Ｎｏ．７ 食品添加物 食用赤色１０５号
Ｎｏ．８ カカオ色素（関東化学社製）
Ｎｏ．９ カキ色素（関東化学社製）
Ｎｏ．１ タートラジン
Ｎｏ．２ 食品添加物 食用黄色５号
Ｎｏ．３ 食品添加物 食用赤色２号
Ｎｏ．４ 食品添加物 食用赤色３号
Ｎｏ．５ 食品添加物 食用赤色１０２号
Ｎｏ．６ 食品添加物 食用赤色１０４号
Ｎｏ．７ 食品添加物 食用赤色１０５号
Ｎｏ．８ カカオ色素（関東化学社製）
Ｎｏ．９ カキ色素（関東化学社製）
（反応液組成）
メチレンブルー ０．４ｍｇ／Ｌ
ＭＯＰＳ ３００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
シフト剤 ３００ｍｇ／Ｌ
メチレンブルー ０．４ｍｇ／Ｌ
ＭＯＰＳ ３００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ６．５）
シフト剤 ３００ｍｇ／Ｌ
前記反応液のスペクトルを分光光度計（商品名ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−３３００：日立社製）により測定し、メチレンブルーのスペクトルにおける極大吸収波長、最大吸光度、ならびに、７００ｎｍの吸光度を確認した。また、比較例１として、シフト剤無添加の反応液についても同様に測定を行った。これらの結果を下記表１に示す。また、シフト剤Ｎｏ．１（タートラジン）またはシフト剤Ｎｏ．８（カカオ色素）を含む反応液（実施例）およびシフト剤無添加の反応液（比較例）のスペクトルを図１および図２にそれぞれ示す。なお、両図において、実線が実施例、点線が比較例のスペクトルである。
前記表１に示すように、いずれのシフト剤を使用した場合も、最大の吸光度を示す極大吸収波長が長波長側にシフトするか、極大吸収波長は変化しないがスペクトルが全体的に長波長側にシフトするという傾向が観察された。前者の現象は、シフト剤Ｎｏ.１〜３および５で観察された。具体的には、代表して図１に示すように、シフト剤Ｎｏ.１を用いた反応液では、極大吸収波長が６６６ｎｍから長波長側にシフトし、７００ｎｍの吸光度も比較例１に対して約５倍程度に増加しており、十分に測定可能な吸光度であることがわかる。また、後者の現象は、シフト剤Ｎｏ.４および６〜９で観察された。具体的には、代表して図２に示すように、シフト剤Ｎｏ.８を用いた反応液では、極大吸収波長は６６４ｎｍであるが、６６４ｎｍの吸光度が減少し、且つ、スペクトルが全体的に長波長側にシフトしている。このため、７００ｎｍの吸光度が比較例１よりも増加した。なお、吸光度測定においては、通常、吸光度が０．０５程度を示せば十分に信頼できる測定値と判断できる。このため、実施例によれば、７００ｎｍにおいて十分な測定値が得られていると判断できる。
酸化によりメチレンブルーを生成する発色剤ＤＡ−６７と前記実施例１のシフト剤とを用いて、ＨｂＡ１ｃ％の測定を行った。
（試料）
下記商品を下記希釈液で２７倍希釈したもの（以下、それぞれ「Ｌｏｗ」、「Ｍｅｄｉｕｍ」、「Ｈｉｇｈ」という）を試料とした。また、コントロールとして精製水を使用した。
＜Ｌｏｗ＞
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｌｏｗ ＨｂＡ１ｃ，Ｎｏｒｍａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝３．２％）
＜Ｍｅｄｉｕｍ＞
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｍｅｄｉｕｍ ＨｂＡ１ｃ，Ｍｅｄｉｕｍ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝５．１％）
＜Ｈｉｇｈ＞
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｈｉｇｈ ＨｂＡ１ｃ，Ｎｏｒｍａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝７．５％）
下記商品を下記希釈液で２７倍希釈したもの（以下、それぞれ「Ｌｏｗ」、「Ｍｅｄｉｕｍ」、「Ｈｉｇｈ」という）を試料とした。また、コントロールとして精製水を使用した。
＜Ｌｏｗ＞
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｌｏｗ ＨｂＡ１ｃ，Ｎｏｒｍａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝３．２％）
＜Ｍｅｄｉｕｍ＞
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｍｅｄｉｕｍ ＨｂＡ１ｃ，Ｍｅｄｉｕｍ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝５．１％）
＜Ｈｉｇｈ＞
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｈｉｇｈ ＨｂＡ１ｃ，Ｎｏｒｍａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝７．５％）
（方法）
前記各試料６．５μＬと精製水６．５μＬとを混合し、さらに下記第１試薬（Ｒ１）７８μＬを混合した。この混合液を３７℃で５分間インキュベートした後、下記第２試薬（Ｒ２）１９．５μＬを添加して３７℃でプロテアーゼ処理ならびに発色反応を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ０）および波長６９４ｎｍの吸光度（Ａ０’）と、第２試薬添加５分後の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ５）および波長６９４ｎｍの吸光度（Ａ５’）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）により測定し、その差（Ａ５−Ａ０）および（Ａ５’−Ａ０’）を求めた。なお、比較例２として、シフト剤無添加の第２試薬を使用したものについても同様に測定を行った。これらの結果を下記表４に示す。下記表４において、かっこ内の数値は、試料コントロール（精製水）の結果との差を示す。
前記各試料６．５μＬと精製水６．５μＬとを混合し、さらに下記第１試薬（Ｒ１）７８μＬを混合した。この混合液を３７℃で５分間インキュベートした後、下記第２試薬（Ｒ２）１９．５μＬを添加して３７℃でプロテアーゼ処理ならびに発色反応を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ０）および波長６９４ｎｍの吸光度（Ａ０’）と、第２試薬添加５分後の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ５）および波長６９４ｎｍの吸光度（Ａ５’）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）により測定し、その差（Ａ５−Ａ０）および（Ａ５’−Ａ０’）を求めた。なお、比較例２として、シフト剤無添加の第２試薬を使用したものについても同様に測定を行った。これらの結果を下記表４に示す。下記表４において、かっこ内の数値は、試料コントロール（精製水）の結果との差を示す。
（シフト剤）
Ｎｏ．１ タートラジン（キシダ化学社製） １００ｍｇ／Ｌ
Ｎｏ．２ タートラジン（キシダ化学社製） ２００ｍｇ／Ｌ
Ｎｏ．３ 食品添加物 食用黄色４号（東京化成社製） １００ｍｇ／Ｌ
Ｎｏ．１ タートラジン（キシダ化学社製） １００ｍｇ／Ｌ
Ｎｏ．２ タートラジン（キシダ化学社製） ２００ｍｇ／Ｌ
Ｎｏ．３ 食品添加物 食用黄色４号（東京化成社製） １００ｍｇ／Ｌ
前記表４に示すように、シフト剤無添加である比較例２は、試料のＨｂＡ１ｃ％が上昇するにしたがって（Ｌｏｗ→Ｍｅｄｉｕｍ→Ｈｉｇｈ）、６５８ｎｍの吸光度差（Ａ５−Ａ０）が約０．０１ずつ増加したが、６９４ｎｍの吸光度差（Ａ５’−Ａ０’）は、ほとんど変化が見られなかった。また、ＨｂＡ１ｃ％が高い試料Ｈｉｇｈにおいても、６９４ｎｍの吸光度差は０．００９であり、測定値として信頼性があるオーダー（約０．０１以上）を満たしていなかった。これに対して、シフト剤を加えた実施例２は、いずれのシフト剤を使用した場合にも、試料のＨｂＡ１ｃ％の上昇にしたがって（Ｌｏｗ→Ｍｅｄｉｕｍ→Ｈｉｇｈ）、６９４ｎｍの吸光度差（Ａ５’−Ａ０’）が０．００５〜０．００６ずつ増加した。さらに、最もＨｂＡ１ｃ％が低い試料Ｌｏｗにおいても、前記吸光度差は、０．０１以上を示し、測定値として十分に信頼性があるオーダーを満たしていた。以上の結果から、メチレンブルーの検出において、前述のようなシフト剤を使用すれば、メチレンブルーの検出を従来の６６０ｎｍ付近よりも長波長側で行うことができ、且つ、長波長側でのメチレンブルーの検出を利用して、ＨｂＡ１ｃ％の測定が可能であることがわかった。
各種フェノチアジン誘導体色素と各種シフト剤とを共存させ、前記色素について、吸光度ピークのシフト、もしくは、スペクトルの長波長側へのシフトが生じているか否かを確認した。
（フェノチアジン誘導体溶液）
下記誘導体を１ｍｍｏｌ／ｍＬとなるように、精製水に溶解した。
メチレンブルー（東京化成工業）
ＡｚｕｒｅＣ（Ｆｌｕｋａ社）
ＡｚｕｒｅＡ（Ｆｌｕｋａ社）
１，９−ジメチル−フェノチアジン（１，９−ジメチル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、Ｓｉｇｍａ社）
トルイジンブルーＯ（Ｓｉｇｍａ社）
ＡｚｕｒｅＢ（和光純薬社）
メチレングリーン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ）
下記誘導体を１ｍｍｏｌ／ｍＬとなるように、精製水に溶解した。
メチレンブルー（東京化成工業）
ＡｚｕｒｅＣ（Ｆｌｕｋａ社）
ＡｚｕｒｅＡ（Ｆｌｕｋａ社）
１，９−ジメチル−フェノチアジン（１，９−ジメチル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、Ｓｉｇｍａ社）
トルイジンブルーＯ（Ｓｉｇｍａ社）
ＡｚｕｒｅＢ（和光純薬社）
メチレングリーン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ）
（色素物質溶液）
下記色素物質を１０ｍｍｏｌ／ｍＬとなるように、精製水に溶解した。
Ｎｏ．１ タートラジン
Ｎｏ．２ 食品添加物 食用黄色５号
Ｎｏ．３ 食品添加物 食用赤色２号
下記色素物質を１０ｍｍｏｌ／ｍＬとなるように、精製水に溶解した。
Ｎｏ．１ タートラジン
Ｎｏ．２ 食品添加物 食用黄色５号
Ｎｏ．３ 食品添加物 食用赤色２号
（緩衝液）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ３０ｍｍｏｌ／ｍＬ ｐＨ５．８
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ３０ｍｍｏｌ／ｍＬ ｐＨ７．６
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ３０ｍｍｏｌ／ｍＬ ｐＨ５．８
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液 ３０ｍｍｏｌ／ｍＬ ｐＨ７．６
調製直後の前記反応液について分光光度計（商品名Ｖ−５５０：日本分光社製）によりスペクトルの測定を行い、極大吸収波長、ならびに、７００ｎｍの吸光度を確認した。また、比較例として、色素物質無添加の反応液についても同様に測定を行った。
まず、表６に、前記反応液における極大吸収波長を示す。なお、下記表において、かっこ内の数値は、対照と実施例との極大吸収波長の差を示す。下記表に示すように、いずれのフェニチアジン誘導体色素も、各色素物質の存在下において、極大吸収波長を対照よりも長波長側にシフトすることができた。
つぎに、下記表７に、前記反応液の７００ｎｍの吸光度を示す。下記表において、かっこ内の数値は、対照と実施例との７００ｎｍにおける吸光度の差を示す。下記表に示すように、いずれのフェニチアジン誘導体色素も、各シフト剤の存在下において、７００ｎｍにおける吸光度が上昇した。
さらに、図３〜図５に、各種フェノチアジン誘導体色素と各種シフト剤とを含む反応液のスペクトルを示す。なお、これらの結果は、シフト剤単独の吸収スペクトルを削除した後のスペクトルです。図３〜図５において、（Ａ）はメチレンブルー、（Ｂ）はＡｚｕｒｅＣ、（Ｃ）はＡｚｕｒｅＡ（Ｆｌｕｋａ社）、（Ｄ）は１，９−ジメチル−フェノチアジン、（Ｅ）はトルイジンブルーＯ、（Ｆ）はＡｚｕｒｅＢ、（Ｇ）はメチレングリーンの結果である。また、同図において、０の実線は対照（シフト剤無添加）、Ｎｏ．１の破線はタートラジン、Ｎｏ．２の破線は食用黄色５号、Ｎｏ．３の破線は食用赤色２号の結果を示す。各図に示すように、いずれのフェノチアジン誘導体色素についても、対照（１の実線）と比較して、シフト剤の存在下において、吸収スペクトルの長波長側へのシフトが確認された。
一般的に光により分解され易いという性質を示すメチレンブルー生成発色剤について、色素物質（前記シフト剤）の共存下、前記色素物質による、メチレンブルーの自然発生によるバックグラウンド上昇の抑制を確認した。
実施例２と同じ第２試薬（Ｒ２）を調製後、光に暴露した状態で冷蔵庫内に３０日間保存した。なお、第２試薬に添加した色素物質は、実施例２におけるＮｏ．１（タートラジン１００ｍｇ／Ｌ）およびＮｏ．３（食品添加物食用黄色４号１００ｍｇ／Ｌ）である。
下記第１試薬（Ｒ１−３）７８μＬと精製水１３μＬとを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、保存後の前記第２試薬（Ｒ２）１９．５μＬを添加した。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長６９４ｎｍの吸光度（Ａ０’）と、第２試薬の添加５分後の反応液における波長６９４ｎｍの吸光度（Ａ５’）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）により測定し、その差（Ａ５’−Ａ０’）を求めた。また、比較例３として、色素物質無添加の第２試薬を使用したものについても同様に測定を行った。なお、第２試薬のバックグラウンドの上昇を公平に比較するために、下記第１試薬（Ｒ１−３）には、多量のタートラジンを添加した。
前記表９に示すように、色素物質無添加の第２試薬を用いた比較例３に対して、色素物質を加えた第２試薬を用いた各実施例４は、６９４ｎｍにおける吸光度上昇（バックグラウンド上昇）を抑制することができた。つまり、前記発色剤は光で分解し易い性質を有しているが、第２試薬に色素物質を加えることによって、光が遮断され、メチレンブルーの自然生成が抑制されたといえる。このため、発色剤と前記色素物質とを共存させれば、前述のように、長波長域での測定が可能になるだけでなく、例えば、使用時まで液体で保存することも可能となり、光に弱い発色剤を使用する測定方法において非常に有用な試薬となる。
酸化によりメチレンブルーを生成するメチレンブルー生成発色剤ＤＡ−６７について、前記色素物質の共存下で、光を照射し、前記色素物質（シフト剤）による、生成発色剤の分解抑制効果（メチレンブルーの自然発生の抑制）を確認した。
（ＤＡ−６７溶液）
実施例２と同様のＤＡ−６７を０．０５ｍｍｏｌ／ｍＬとなるように、３０ｍｍｏｌ／ｍＬのＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．６）に溶解した。
実施例２と同様のＤＡ−６７を０．０５ｍｍｏｌ／ｍＬとなるように、３０ｍｍｏｌ／ｍＬのＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．６）に溶解した。
（色素物質溶液）
下記色素物質を１０ｍｍｏｌ／ｍＬとなるように、精製水に溶解した。
Ｎｏ．１ タートラジン
Ｎｏ．２ 食品添加物 食用黄色５号
Ｎｏ．３ 食品添加物 食用赤色２号
下記色素物質を１０ｍｍｏｌ／ｍＬとなるように、精製水に溶解した。
Ｎｏ．１ タートラジン
Ｎｏ．２ 食品添加物 食用黄色５号
Ｎｏ．３ 食品添加物 食用赤色２号
ＤＡ−６７の終濃度が０．０２５ｍｍｏｌ/ｍＬ、色素物質の終濃度が所定濃度（０．１ｍｍｏｌ/ｍＬ、０．２ｍｍｏｌ/ｍＬ、０．４ｍｍｏｌ/ｍＬ）となるように、前記ＤＡ−６７溶液、色素物質および精製水とを混合して、サンプル（各１０ｍＬ）を調製した。これらのサンプルを入れた透明ガラスの容器を、１５時〜１６時の１時間、南向きのすりガラスの近くに放置し、日光に暴露した。温度は２５℃であった。暴露後、分光光度計（Ｖ−５５０、日本分光）によりスペクトルの測定をした。また、対照として、色素物質溶液に代えて精製水を使用し、同様の測定を行った。各サンプルについて、各色素物質に応じた最大吸収波長における吸光度の測定結果を下記表に示す。前記最大吸収波長は、それぞれ、Ｎｏ．１（タートラジン）が６６６ｎｍ、Ｎｏ．２（黄色５号）が６８１ｎｍ、Ｎｏ．３（赤色２号）が６４６ｎｍである。なお、下記表において、最大発色吸光度とは、各サンプル組成において、含有する全ＤＡ−６７からメチレンブルーが生成された場合の吸光度であり、メチレンブルー生成率とは、暴露後のメチレンブルーの生成率であって、最大発色吸光度を１００％とした場合の暴露後の吸光度の割合により表される。
前記表に示すように、色素物質の共存下でＤＡ−６７を日光に暴露した場合、色素物質無添加の対照と比較して、暴露による吸光度の上昇は抑制された。すなわち、色素物質によって、ＤＡ−６７からのメチレンブルーの生成（自然発生）が抑制された。
以上のように、本発明によれば、例えば、フェノチアジン誘導体色素を含む反応系に前記色素物質を添加することによって、最大吸収を示す波長より長波長側であっても、フェノチアジン誘導体色素を検出することが可能となった。このため、例えば、試料中に６６０ｎｍに吸収を示す目的外成分が含まれる場合であっても、それによる影響を回避してフェノチアジン誘導体色素を検出することが可能である。また、７００ｎｍにおける吸収が増加することから、例えば、検出波長が７００ｎｍに設定された装置であってもフェノチアジン誘導体色素を検出することが可能となった。このように、本発明の方法によれば、フェノチアジン誘導体色素の検出条件が改善されるため、従来よりもフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤やフェノチアジン誘導体色素の発色剤としての適用範囲をより一層広げることができる。
前記フラボノイド系色素としては、例えば、フラボノイドや、フラボノイドの重合体等があげられる。前記フラボノイドとしては、例えば、市販のカキ色素（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ ｃｏｌｏｒ ｆｒｏｍ Ｄｉｐｏｓｐｙｒｏｓ ｋａｋｉ ＴＨＵＮＢ．）があげられる。前記カキ色素は、通常、果実から抽出したフラボノイドを主成分とする。また、前記フラボノイドの重合体としては、例えば、市販のカカオ色素（Ｃａｃａｏ ｃｏｌｏｒ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ ＬＩＮＮＥ）があげられる。前記カカオ色素は、通常、アントシアニンの重合体を主成分とする。前記アントシアニンの重合体は、例えば、下記式で表される。下記式中、ｎは重合度である。ｎは、特に制限されないが、例えば、５以上であり、好ましくは６以上である。ｎの上限は特に制限されない。Ｒは、配糖体ガラクチュロン酸である。
（フェノチアジン誘導体色素生成工程）
つぎに、反応液に前述のような発色剤を添加して、前記ＦＡＯＤ処理によって生じた過酸化水素と前記発色剤との酸化還元反応を行う。この反応によって前記発色剤が酸化され、フェノチアジン誘導体色素が生成される。
つぎに、反応液に前述のような発色剤を添加して、前記ＦＡＯＤ処理によって生じた過酸化水素と前記発色剤との酸化還元反応を行う。この反応によって前記発色剤が酸化され、フェノチアジン誘導体色素が生成される。
また、前記式（４’）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６’）で示すことができる。なお、下記式（６’）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（６’）
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（６’）
Claims (35)
- 反応系におけるフェノチアジン誘導体色素を吸光度測定により検出する方法であって、
フェノチアジン誘導体色素の検出工程を含み、
前記検出工程において、下記式（Ｉ）で表される化合物、下記式（II）で表される化合物およびフラボノイド系色素からなる群から選択された少なくとも一つの色素物質の存在下で、フェノチアジン誘導体色素の検出を行うことを特徴とするフェノチアジン誘導体色素検出方法。
Ｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ｒ２ ・・・（Ｉ）
前記式（Ｉ）において、
Ｒ１は、
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、
Ｙは、水素またはＳＯ３Ｘであり、
各Ｘは同一でも異なっていても良く、各Ｙは同一でも異なっていても良く、
Ｚは、水素、メチル基またはメトキシ基であり、各Ｚは同一でも異なっていても良い。
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであって、各Ｘは、同一でも異なっていても良く、
Ｙは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであって、各Ｙは、同一でも異なっていても良い。 - 前記式（Ｉ）で表される化合物が、
５−ヒドロキシ−１−（４−スルホフェニル）−４−（４−スルホフェニルアゾ）ピラゾール−３−カルボン酸およびその塩、
６−ヒドロキシ−５−（４−スルホフェニルアゾ）−２−ナフタレンスルホン酸およびその塩、
３−ヒドロキシ−４−（４−スルホナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸およびその塩、
６−ヒドロキシ−５−［（２−メトキシ−５−メチル−４−スルホナトフェニル）ジアゼニル］ナフタレン−２−スルホン酸およびその塩
ならびに、
７−ヒドロキシ−８−（４−スルホナフチルアゾ）−１，３−ナフタレンジスルホン酸およびその塩
からなる群から選択された少なくとも一つの色素物質である、請求の範囲１記載の検出方法。 - 前記式（II）で表される化合物が、
３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン］−３−オンおよびその塩、
３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラブロモ−４，５，６，７，−テトラクロロスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンおよびその塩、
４，５，６，７−テトラクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンおよびその塩、
２，４，５，７−テトラブロモ−３，６−ジヒドロキシキサンテン−９−スピロ−１’−３Ｈ−イソベンゾフラン−３’−オンおよびその塩、ならびに、
３，６-ジヒドロキシキサンテン‐９‐スピロ‐１'‐３’Ｈ‐イソベンゾフラン‐３’‐オンおよびその塩
からなる群から選択された少なくとも一つの色素物質である、請求の範囲１記載の検出方法。 - 前記フラボノイド系色素が、カキ色素およびカキ色素の少なくとも一方である、請求の範囲１記載の検出方法。
- 前記反応系に添加する前記色素物質の割合が、フェノチアジン誘導体色素１モルに対して、１〜１０００モルの範囲である、請求の範囲１記載の検出方法。
- 前記検出工程における吸光度の測定波長が、６１０〜７３０ｎｍの範囲である、請求の範囲１記載の検出方法。
- 前記検出工程に先立って、前記反応系に前記色素物質を添加する、請求の範囲１記載の検出方法。
- 前記フェノチアジン誘導体色素が、ジアミノフェノチアジンまたはその誘導体である請求の範囲１記載の検出方法。
- 前記フェノチアジン誘導体色素が、下記式（III）で表される化合物、その互変異性体若しくは立体異性体、またはそれらの塩である請求の範囲１記載の検出方法。
Ｚは、それぞれ、水素原子、アルキル基、ニトロ基、アミノ基、ハロゲン、スルホ基、または、カルボキシル基であり、同一でも異なっていてもよい。 - Ｒ３〜Ｒ６において、前記アルキル基が、炭素原子数１〜６の直鎖または分枝アルキル基である請求の範囲９記載の検出方法。
- Ｒ３〜Ｒ６において、前記アルキル基がメチル基である請求の範囲９記載の検出方法。
- Ｚにおいて、前記アルキル基が、炭素原子数１〜６の直鎖または分枝アルキル基である請求の範囲９記載の検出方法。
- Ｚにおいて、前記アルキル基がメチル基である請求の範囲９記載の検出方法。
- 前記フェノチアジン誘導体色素が、メチレンブルー、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、トルイジンブルーＯ、１，９−ジメチル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、およびメチレングリーンからなる群から選択される少なくとも一つである、請求の範囲１記載の検出方法。
- 前記フェノチアジン誘導体色素が、メチレンブルーである、請求の範囲１記載の検出方法。
- 前記反応系に、酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤を添加して、前記発色剤と前記反応系における酸化物質または還元物質との酸化還元反応により、フェノチアジン誘導体色素を生成させる発色剤添加工程を含み、
前記フェノチアジン誘導体色素の検出工程において、吸光度測定により、フェノチアジン誘導体色素の生成の有無または生成量を測定する、請求の範囲１記載の検出方法。 - 前記フェノチアジン誘導体色素がメチレンブルーであり、
前記発色剤が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンおよびその塩、ならびに、ロイコメチレンブルーからなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲１６記載の検出方法。 - 前記反応系に、発色剤としてフェノチアジン誘導体色素を添加して、前記フェノチアジン誘導体色素と前記反応系における還元物質とを酸化還元反応させる工程を含み、
前記フェノチアジン誘導体色素の検出工程において、吸光度測定により、前記反応系に添加したフェノチアジン誘導体色素の減少の有無または減少量を測定する、請求の範囲１記載の検出方法。 - 前記フェノチアジン誘導体色素がメチレンブルーであって、
前記メチレンブルーと前記反応系における還元物質との酸化還元反応により、メチレンブルーからロイコメチレンブルーを生成させる、請求の範囲１８記載の検出方法。 - 前記反応系における前記色素物質の割合が、前記発色剤１モルに対して、０．１〜１０００モルの範囲である、請求の範囲１５または１７記載の検出方法。
- 前記反応系における前記色素物質の終濃度が、１×１０−６〜０．１ｍｏｌ／Ｌの範囲である、請求の範囲１６または１８記載の検出方法。
- フェノチアジン誘導体色素の検出により試料中の目的成分を測定する方法であって、
下記（Ａ）〜（Ｅ）工程を含むことを特徴とする測定方法。
（Ａ） 前記試料中の目的成分から酸化物質または還元物質を生成させる工程
（Ｂ） 前記試料に、酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤を添加する発色剤添加工程
（Ｃ） 前記酸化物質または還元物質と前記発色剤との酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成させる工程
（Ｄ） 請求の範囲１記載のフェノチアジン誘導体色素の検出方法によりフェノチアジン誘導体色素を検出して、前記フェノチアジン誘導体色素の生成の有無または生成量を測定する工程
（Ｅ） 前記測定結果から、前記試料中の目的成分の有無または量を決定する工程 - 前記（Ｂ）〜（Ｄ）工程に代えて、下記（Ｂ’）〜（Ｄ’）工程を含む、請求の範囲２２記載の測定方法。
（Ｂ’） 前記試料に、発色剤としてフェノチアジン誘導体色素を添加する工程
（Ｃ’） 前記試料中の目的成分から生成した還元物質とフェノチアジン誘導体色素とを酸化還元反応させる工程
（Ｄ’） 請求の範囲１記載のフェノチアジン誘導体色素の検出方法によりフェノチアジン誘導体色素を検出して、添加した前記フェノチアジン誘導体色素の減少の有無または減少量を測定する工程 - 前記目的成分が、糖化タンパク質である、請求の範囲２２記載の測定方法。
- 前記（Ａ）工程において、糖化タンパク質にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて、酸化物質として過酸化水素を生成させる、請求の範囲２２記載の測定方法。
- 前記（Ｃ）工程において、酸化酵素により、前記過酸化水素と前記発色剤との酸化還元反応を行い、フェノチアジン誘導体色素を生成させる、請求の範囲２２記載の測定方法。
- 前記フェノチアジン誘導体色素がメチレンブルーであり、
前記（Ｂ）工程における前記発色剤が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンおよびその塩の少なくとも一方である、請求の範囲２２記載の測定方法。 - フェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルをシフトさせるシフト剤であって、
下記式（Ｉ）で表される化合物、下記式（ＩＩ）で表される化合物およびフラボノイド系色素からなる群から選択された少なくとも一つの色素物質を含むことを特徴とするシフト剤。
Ｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ｒ２ ・・・（Ｉ）
前記式（Ｉ）において、
Ｒ１は、
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、
Ｙは、水素またはＳＯ３Ｘであり、
各Ｘは同一でも異なっていても良く、各Ｙは同一でも異なっていても良く、
Ｚは、水素、メチル基またはメトキシ基であり、各Ｚは同一でも異なっていても良い。
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであって、各Ｘは、同一でも異なっていても良く、
Ｙは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであって、各Ｙは、同一でも異なっていても良い。 - 前記式（Ｉ）で表される化合物が、
５−ヒドロキシ−１−（４−スルホフェニル）−４−（４−スルホフェニルアゾ）ピラゾール−３−カルボン酸およびその塩、
６−ヒドロキシ−５−（４−スルホフェニルアゾ）−２−ナフタレンスルホン酸およびその塩、
３−ヒドロキシ−４−（４−スルホナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸およびその塩、
６−ヒドロキシ−５−［（２−メトキシ−５−メチル−４−スルホナトフェニル）ジアゼニル］ナフタレン−２−スルホン酸およびその塩
ならびに、
７−ヒドロキシ−８−（４−スルホナフチルアゾ）−１，３−ナフタレンジスルホン酸およびその塩
からなる群から選択された少なくとも一つの色素物質である、請求の範囲２８記載のシフト剤。 - 前記式（ＩＩ）で表される化合物が、
３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン］−３−オンおよびその塩、
３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラブロモ−４，５，６，７，−テトラクロロスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンおよびその塩、
４，５，６，７−テトラクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンおよびその塩、
２，４，５，７−テトラブロモ−３，６−ジヒドロキシキサンテン−９−スピロ−１’−３Ｈ−イソベンゾフラン−３’−オンおよびその塩、ならびに、
３，６-ジヒドロキシキサンテン‐９‐スピロ‐１'‐３’Ｈ‐イソベンゾフラン‐３’‐オンおよびその塩
からなる群から選択された少なくとも一つの色素物質である、請求の範囲２８記載のシフト剤。 - 前記フラボノイド系色素が、カカオ色素およびカキ色素の少なくとも一方である、請求の範囲２８記載のシフト剤。
- 請求の範囲１記載の検出方法に使用する発色剤試薬であって、
酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する化合物およびフェノチアジン誘導体色素のいずれか一方の発色剤、および、請求の範囲２８記載のシフト剤を含むことを特徴とする発色剤試薬。 - 前記発色剤が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンおよびその塩の少なくとも一方である、請求の範囲３２記載の発色剤試薬。
- 前記シフト剤の添加割合が、前記発色剤１モルに対して、０．１〜１０００モルの範囲である、請求の範囲３２記載の発色剤試薬。
- 前記発色剤試薬のｐＨが、４〜９である、請求の範囲３２記載の発色剤試薬。
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