JPWO2006098006A1

JPWO2006098006A1 - 抗炎症剤

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Publication number: JPWO2006098006A1
Application number: JP2007507976A
Authority: JP
Inventors: 康夫三宅; 伊藤　洋子; 洋子伊藤
Original assignee: Maruzen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Maruzen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2005-03-15
Filing date: 2005-03-15
Publication date: 2008-08-21
Anticipated expiration: 2025-03-15
Also published as: US20100120903A1; CN101198341A; WO2006098006A1; US8563054B2; EP1859834A1; EP1859834B1; JP4994222B2; US20080152734A1; EP1859834A4

Abstract

本発明は、マメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物、及びマメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物の水抽出残渣の少なくともいずれかを有機溶媒で抽出処理して得られる油溶性甘草抽出物を含有してなり、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用（即ち、ヒスタミン遊離抑制作用）、血小板凝集抑制作用及びホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用から選択される少なくとも１種の作用を有する抗炎症剤である。

Description

本発明は、油溶性甘草抽出物（以下、「油溶性甘草エキス」と称することもある）を含有してなり、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、血小板凝集抑制作用及びホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用から選択される少なくとも１種の作用を有し、特に皮膚外用剤として好適に用いられる抗炎症剤に関する。

古くから甘草（Ｌｉｃｏｒｉｃｅ）は、生薬として知られており、現在では主として食品用甘味料、医薬品、医薬部外品等の原料として使用されている。これらの中でも、甘草の水抽出物であるグリチルリチン及びグリチルレチン酸は、抗炎症作用、抗潰瘍作用、及び抗アレルギー作用などの優れた薬理作用を有し、広く飲食品、医薬品及び化粧品などに利用されている。

一方、甘草をエタノール、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出した油溶性甘草抽出物（油溶性甘草抽出物）は、上記グリチルリチン及びグリチルレチン酸以外にも多くのフラボノイドを含有することが知られている。この油溶性甘草抽出物は、例えば、抗酸化作用（特許文献１参照）、酸化防止作用（特許文献２参照）、美白作用（特許文献３及び特許文献４参照）、紫外線吸収作用（特許文献５参照）、などの有用な作用を有することが開示されている。

しかしながら、前記油溶性甘草抽出物が、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、血小板凝集抑制作用及びホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用から選択される少なくとも１種の作用を有し、例えば、接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡、その他の肌荒れに伴う各種皮膚疾患等に有用であることは、全く知られていないのが現状である。

特開昭５８−２１７５８３号公報特開昭５９−４６２１０号公報特開平１−１４９７０６号公報特開平１−３１１０１１号公報特開平１−１５７９０９号公報

本発明は、かかる現状に鑑みてなされたものであり、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、血小板凝集抑制作用及びホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用から選択される少なくとも１種の作用を通じて、炎症性疾患を予防及び改善し得る抗炎症剤を提供することを目的とする。

前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。
＜１＞油溶性甘草抽出物を含有することを特徴とする抗炎症剤である
＜２＞油溶性甘草抽出物が、マメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物、及びマメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物の水抽出残渣の少なくともいずれかを抽出処理して得られる前記＜１＞に記載の抗炎症剤である。
＜３＞マメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物の根、根茎、葉、及び茎、並びにこれらの水抽出残渣の少なくともいずれかを有機溶媒で抽出処理して得られる前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の抗炎症剤である。
＜４＞有機溶媒が、エタノール、含水エタノール、及び酢酸エチルから選択される少なくとも１種である前記＜３＞に記載の抗炎症剤である。
＜５＞マメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物が、グリチリザグラブラ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｇｌａｂｒａ）、グリチリザインフラタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｉｎｆｌａｔａ）、グリチリザアラレアシス（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａａｒａｌｅａｓｉｓ）、グリチリザウラレンシス（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓ）及びグリチリザエチナタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅｃｈｉｎａｔａ）から選択される少なくとも１種である前記＜２＞から＜４＞のいずれかに記載の抗炎症剤である。
＜６＞油溶性甘草抽出物が、グラブリジン及びリコカルコンＡの少なくともいずれかのフラボノイドを含む前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の抗炎症剤である。
＜７＞グラブリジン及びリコカルコンＡの少なくともいずれかのフラボノイドの油溶性甘草抽出物における合計含有量が、乾燥固形分で１〜８０質量％である前記＜６＞に記載の抗炎症剤である。
＜８＞グリチリザグラブラ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｇｌａｂｒａ）の油溶性甘草抽出物におけるグラブリジンの含有量が、乾燥固形分で１質量％以上である前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の抗炎症剤である。
＜９＞グリチリザエチナタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅｃｈｉｎａｔａ）の油溶性甘草抽出物におけるリコカルコンＡの含有量が、乾燥固形分で１質量％以上である前記＜５＞から＜８＞のいずれかに記載の抗炎症剤である。
＜１０＞グリチリザインフラタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｉｎｆｌａｔａ）の油溶性甘草抽出物におけるリコカルコンＡの含有量が、乾燥固形分で１質量％以上である前記＜５＞から＜９＞のいずれかに記載の抗炎症剤である。
＜１１＞油溶性甘草抽出物が、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、血小板凝集抑制作用及びホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用から選択される少なくとも１種の作用を有する前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の抗炎症剤である。
＜１２＞皮膚外用剤として用いられる前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の抗炎症剤である。

本発明の抗炎症剤は、油溶性甘草抽出物を含有してなり、特にマメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物、及びマメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物の水抽出残渣の少なくともいずれかを有機溶媒で抽出処理して得られ、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用（即ち、ヒスタミン遊離抑制作用）、血小板凝集抑制作用、ホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用を通して、これらの関与する炎症を効果的に予防及び改善を図ることができる。
また、本発明の抗炎症剤は、使用感と安全性に優れているので、特に、皮膚外用剤に好適に用いられる。ここで、本発明において、「皮膚外用剤」とは、皮膚に適用される各種薬剤を意味し、例えば、化粧料、医薬部外品、医薬品、などを含む概念である。

本発明の抗炎症剤は、油溶性甘草抽出物を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
前記油溶性甘草抽出物は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、マメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物、及びマメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物の水抽出残渣の少なくともいずれかを有機溶媒により抽出処理して得られるものが好適である。

前記マメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物としては、特に制限はなく、目的とする有効成分に応じて適宜選択することができるが、例えば、グリチリザグラブラ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｇｌａｂｒａ）、グリチリザインフラタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｉｎｆｌａｔａ）、グリチリザアラレアシス（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａａｒａｌｅａｓｉｓ）、グリチリザウラレンシス（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、グリチリザエチナタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅｃｈｉｎａｔａ）、などが挙げられ、これらの中でも、グリチリザグラブラ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｇｌａｂｒａ）、グリチリザエチナタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅｃｈｉｎａｔａ）、グリチリザインフラタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｉｎｆｌａｔａ）が特に好ましい。
なお、甘草は、生産地の名前を冠して呼ばれることが多く、例えば、中国東北西北甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、新彊甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅｃｈｉｎａｔａ）、ロシア甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｇｌａｂｒａ）、スペイン甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅｃｈｉｎａｔａ）、モンゴル産甘草、アフガニスタン甘草、などの別名がある。

前記油溶性甘草抽出物の抽出原料としては、上記甘草の根、根茎、葉、及び茎のいずれの部位でも使用することができるが、グラブリジン、リコカルコンＡ等のフラボノイドの含有率が高い点から根及び根茎の少なくともいずれかが特に好ましい。該抽出原料は、生のものを使用しても乾燥させたものを使用してもよいが、乾燥根、乾燥根茎が特に好ましい。
また、前記油溶性甘草抽出物の抽出原料としては、上記甘草の抽出原料の水抽出残渣を用いることもできる。
前記甘草の水抽出残渣とは、該甘草からグリチルリチンなどを得るために水、温水及び熱水、並びに中性乃至微アルカリ性の冷水、温水及び熱水の少なくともいずれかで抽出した後の固形残渣を意味する。なお、前記水抽出後の残渣は、含水及び乾燥状態のいずれであってもよい。
このように甘草の水抽出残渣を抽出原料として用いることにより、甘草の水抽出残渣の有効利用が図れ、生産性が向上するという利点がある。

前記有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルエーテル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、含水メタノール、含水エタノール、含水プロパノールなどが挙げられる。更に超臨界流体として二酸化炭素を用いることもできる。これらの有機溶媒の中では、エタノール、含水エタノール、酢酸エチルを用いることが安全性の点で好ましい。前記含水エタノールとしては、エタノール濃度３０〜９９質量％のものが好適である。

前記甘草又は甘草水抽出残渣から前記有機溶媒を用いて甘草油性抽出物を得るための抽出条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抽出原料に対し２〜１５倍量の有機溶媒を加え、撹拌しながら常温で抽出する方法、加熱乾留して抽出する方法が挙げられる。また、これらの方法をそれぞれ単独で、又は組み合わせて繰り返し操作すれば、抽出効率が向上するのでより好ましい。

得られた抽出液は、遠心分離及びろ過により不溶物を取り除いた後、油溶性甘草抽出物として、そのまま使用することもできるし、更に常法により、濃縮して使用することもできる。また、目的とする生理的効果が低下しない範囲で脱臭及び脱色などを適宜行ってもよい。この脱臭及び脱色には、活性炭、合成吸着樹脂及びイオン交換樹脂などを用いることが一般的である。また、適当な方法で抽出液を乾燥させれば、油溶性甘草抽出物として、黄褐色の抽出物粉末を得ることができる。
得られた液状抽出物をそのまま、又は液状抽出物を濃縮したもの、更には液状抽出物の粉末或いは固形の乾燥物が油溶性甘草抽出物として利用される。

前記油溶性甘草抽出物からのフラボノイドの精製方法としては、特に制限はなく、公知の有機化合物の精製方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、順相シリカゲルクロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーのいずれかにより処理した後、アセトンから結晶化させる方法により行うことができる。この方法によれば、比較的容易に有効成分の純品を得ることができる。また、他の精製方法としては、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化成株式会社製）等の合成吸着体によるカラムクロマトグラフィー、液−液向流抽出、などが挙げられる。

前記油溶性甘草抽出物に含まれるフラボノイドとしては、抽出原料である甘草種によって異なり一概には規定できないが、例えば、グラブリジン、グラブレン、リコカルコンＡ、リコカルコンＢ、グリシクマリン、グリソフラボンなどが挙げられ、これらの中でも、高い抗炎症作用を有する点からグラブリジン、グラブレン、リコカルコンＡ、リコカルコンＢが特に好ましく、グラブリジン、リコカルコンＡが最も好ましい。
前記グラブリジン及びリコカルコンＡの少なくともいずれかのフラボノイドの前記油溶性甘草抽出物における合計含有量は、乾燥固形分で１〜８０質量％が好ましく、５〜６０質量％がより好ましい。

前記グリチリザグラブラ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｇｌａｂｒａ）の油溶性甘草抽出物におけるグラブリジンの含有量は、乾燥固形分で１質量％以上が好ましく、１０質量％以上がより好ましく、２０〜５０質量％が更に好ましい。
前記グリチリザエチナタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅｃｈｉｎａｔａ）の油溶性甘草抽出物におけるリコカルコンＡの含有量は、乾燥固形分で１質量％以上が好ましく、５質量％以上がより好ましく、１０〜４０質量％が更に好ましい。
前記グリチリザインフラタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｉｎｆｌａｔａ）の油溶性甘草抽出物におけるリコカルコンＡの含有量は、乾燥固形分で１質量％以上が好ましく、５質量％以上がより好ましく、１０〜４０質量％が更に好ましい。

本発明の抗炎症剤は、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用（即ち、ヒスタミン遊離抑制作用）、血小板凝集抑制作用、ホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用から選択される少なくとも１種の作用を通じて、接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡等の皮膚疾患を始めとした各種炎症性疾患を予防及び改善することができる。

ここで、前記ヒアルロニダーゼはヒアルロン酸の加水分解酵素であり、肥満細胞中にあってその活性化により、肥満細胞から脱顆粒に関与していると言われている。そこで、ヒアルロニダーゼの活性化を阻害することにより、ヒアルロン酸の安定化を図り、肥満細胞からの種々のケミカルメディエーターの放出を防ぐことができ、保湿性の強化、又は抗炎症作用が期待できる。
また、細胞内のヒスタミンが遊離されると同時にヘキソサミニダーゼも遊離されることから、ヘキソサミニダーゼ遊離を指標にヒスタミン遊離抑制作用を評価することができる。前記ヒスタミンは、マスト細胞（肥満細胞）内に存在し、マスト細胞が刺激を受けると脱顆粒反応により放出され、起炎及びアレルギー物質として作用する。また、活性化されたマスト細胞から放出されたヒスタミンは、血管透過性亢進、平滑筋収縮、粘液分泌亢進等をもたらし、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、じんま疹等のアレルギー疾患を生じさせる。したがってヘキソサミニダーゼの遊離抑制、即ちヒスタミンの遊離抑制により、アレルギー疾患性疾患や炎症性疾患を予防及び治療することができる。
前記血小板凝集は、アラキドン酸カスケードのホスホリパーゼＡ_２の活性化を招き、それによりロイコトリエンＢやプロスタグランジンＥ_２等が放出されて起炎物質となる。このため、血小板の凝集を阻害及び抑制する物質によりアレルギー疾患性疾患や炎症性疾患を予防及び治療することができる。
前記ホスホリパーゼＡ_２は、アラキドン酸の代謝経路であるアラキドン酸カスケードの重要酵素であって、ホスホリパーゼＡ_２が過剰に活性化するとアラキドン酸の代謝に異常が起こり、炎症、アレルギー、喘息、虚血、心筋梗塞等を引き起こす。したがってホスホリパーゼＡ_２の活性化を阻害することにより、アレルギー疾患性疾患や炎症性疾患を予防及び治療することができる。

本発明の抗炎症剤は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、皮膚外用剤として好適に用いられる。該皮膚外用剤としては、皮膚に適用される各種薬剤を意味し、例えば、化粧料、医薬部外品、医薬品、などが含まれる。前記皮膚外用剤としては、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ゼリー、リップクリーム、口紅、入浴剤、トニック、リンス、シャンプー、アストリンゼント、などが挙げられる。

前記抗炎症剤の前記皮膚外用剤における配合量は、皮膚外用剤の種類や抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、前記油溶性甘草抽出物に換算して０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい。

以上説明した本発明の抗炎症剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、下記実施例に何ら限定されるものではない。

（製造例１）
−油溶性甘草抽出物の調製−
甘草（ＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｇｌａｂｒａＬｉｎｎｅｖａｒ．ｇｌａｎｄｕｌｉｆｅｒａＲｅｇｅｌｅｔＨｅｒｄｅｒ）の根１ｋｇに無水エタノ−ル１０Ｌを加えて、還流下で５時間抽出を行った。得られた抽出液は減圧濃縮した。この濃縮した抽出液に酢酸エチル１Ｌを加え、還流下で５時間抽出し、減圧乾燥した後、粉砕して油溶性甘草抽出物１０ｇを得た。
得られた製造例１の油溶性甘草抽出物中におけるフラボノイドの含有率を高速液体クロマトグラフィー（日本分光株式会社製）を用いて定量した結果、グラブリジンが２０質量％含まれていた。

（製造例２）
−油溶性甘草抽出物の調製−
甘草（ＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｇｌａｂｒａＬｉｎｎｅｖａｒ．ｇｌａｎｄｕｌｉｆｅｒａＲｅｇｅｌｅｔＨｅｒｄｅｒ）の根１ｋｇに無水エタノ−ル１０Ｌを加え、還流下で５時間抽出を行った。得られた抽出液を減圧濃縮した。この濃縮した抽出液に酢酸エチル１Ｌを加え，還流下で５時間抽出を行った。これを合成吸着体（三菱化成株式会社製）で粗精製し、減圧乾燥後、粉砕して油溶性甘草抽出物５ｇを得た。
得られた製造例２の油溶性甘草抽出物中におけるフラボノイドの含有率を高速液体クロマトグラフィー（日本分光株式会社製）を用いて定量した結果、グラブリジンが４０質量％含まれていた。

（製造例３）
−油溶性甘草抽出物の調製−
甘草（ＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｉｎｆｌａｔａＢａｔａｌｉｎ）の根１ｋｇに無水エタノ−ル１０Ｌを加え、還流下で５時間抽出を行った。得られた抽出液を減圧濃縮した。この濃縮した抽出液に酢酸エチル１Ｌを加え、還流下で５時間抽出を行った。得られた抽出液を減圧濃縮した。この濃縮液に酢酸エチル１Ｌを加え、還流下で５時間抽出し、減圧乾燥後、粉砕して、油溶性甘草抽出物３０ｇを得た。
得られた製造例３の油溶性甘草抽出物中におけるフラボノイドの含有率を高速液体クロマトグラフィー（日本分光株式会社製）で定量した結果、リコカルコンＡが２０質量％含まれていた。

（製造例４）
−グラブリジンの精製−
製造例２で得られた油溶性甘草エキス２０ｇをクロロホルムに溶解し、シリカゲル（シリカゲル６０、メルク社製品）にまぶした後、乾燥した。この乾燥物を、上記と同じシリカゲル１ｋｇを充填したカラム上に積層充填し、クロロホルム／メタノール混合液（３０：１）で溶出し、グラブリジン含有画分を採取した。この画分の溶媒を減圧下に留去して固形物５.８ｇを得た。次いで、得られた固形物を少量のメタノールに溶解し、逆相シリカゲル（ＯＤＳＤＭ１０２０Ｔ、富士シリシア社製）にまぶして乾燥し、あらかじめ逆相シリカゲル８００ｇを充填したカラム上に積層充填した。このカラムに、溶出溶媒としてメタノール／水混合液（６０：４０）を流し、グラブリジン含有画分を採取した。この画分から溶媒を減圧下に留去し、得られた固形物（４.３ｇ）をアセトン４０ｍｌに溶解し、５℃にて３日間静置して、グラブリジンの結晶３.８ｇを得た。

（製造例５）
−リコカルコンＡの精製−
製造例３で得られた油溶性甘草エキス１２０ｇをクロロホルムに溶解し、シリカゲル（シリカゲル６０、メルク社製品）にまぶした後、乾燥した。この乾燥物を、上記と同じシリカゲル３ｋｇを充填したカラム上に積層充填し、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル混合液（２：１）で溶出し、リコカルコンＡ含有画分を採取した。この画分の溶媒を減圧下に留去して固形物５０ｇを得た後、少量のメタノールに溶解し、逆相シリカゲル（ＯＤＳＤＭ１０２０Ｔ、富士シリシア社製）にまぶして乾燥し、あらかじめ逆相シリカゲルを充填したカラム上に積層充填した。このカラムに、溶出溶媒としてメタノール／水混合液（６０：４０）を流し、リコカルコンＡ含有画分を採取した。この画分から溶媒を減圧下に留去し、得られた固形物（２５ｇ）をしてメタノール／水混合液（７０：３０）に溶解し、室温で１日間静置して、リコカルコンＡの結晶１５．２ｇを得た。

（実施例１）
−ヒアルロニダーゼ活性阻害試験−
製造例１〜５で調製した抽出物及び精製物（以下、「サンプル」と称することがある）について、以下のようにしてヒアルロニダーゼ活性阻害作用を試験した。
まず、各サンプルを溶解した０．１ｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液(ｐＨ３．５)０．２ｍＬにヒアルロニダーゼ溶液（ＴｙｐｅＩＶ−Ｓ(ｆｒｏｍｂｏｖｉｎｅｔｅｓｔｉｓ;ＳＩＧＭＡ４００ＮＦｕｎｉｔｓ／ｍＬ)０．１ｍＬを加え、３７℃にて２０分間反応した。
次に、活性化剤として２．５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム０．２ｍＬを加え、３７℃にて２０分間反応した。これに０．４ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸カリウム溶液（ｆｒｏｍｒｏｂｓｔｅｒｃｏｍｂ）０．５ｍＬを加え、３７℃にて４０分間反応した。その後、０．４ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム０．２ｍＬを加えて反応を止め、冷却した後、各反応溶液にホウ酸溶液０．２ｍＬを加え、３分間煮沸した。氷冷後、ｐ−ＤＡＢＡ（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド）試薬６ｍＬを加え、３７℃にて２０分間反応した。その後、波長５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。

次いで、同様の操作と吸光度測定を酵素を添加せずに行った。更に、コントロールとして、サンプル溶液の代わりに蒸留水を加えた場合について、同様の操作と吸光度測定を行った。
以上の測定結果から、下記数式１によりヒアルロニダーゼ活性阻害率（％）を算出した。
＜数式１＞
ヒアルロニダーゼ活性阻害率（％）＝［１−（Ｓｔ−Ｓｂ）／（Ｃｔ−Ｃｂ）］×１００
ただし、前記数式１中、Ｓｔは、サンプル溶液の波長５８５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｓｂは、サンプル溶液ブランクの波長５８５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｃｔはコントロール溶液の波長５８５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｃｂはコントロール溶液ブランクの波長５８５ｎｍにおける吸光度を表す。

次に、サンプル濃度を段階的に減少させて上記ヒアルロニダーゼ活性阻害率の測定を行い、ヒアルロニダーゼ活性を５０％抑制するサンプル濃度を内挿法により求めた。結果を表１に示す。この値が小さいほどヒアルロニダーゼ活性阻害作用が強いことを表す。

表１の結果から、製造例１〜３の油溶性甘草抽出物、製造例４のグラブリジン、及び製造例５のリコカルコンＡが、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有することが確認された。

（実施例２）
−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用試験−
製造例１〜５で調製した抽出物及び精製物（以下、「サンプル」と称することがある）について、以下のようにしてヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を試験した。なお、細胞内のヒスタミンが遊離されると同時にヘキソサミニダーゼも遊離されることから、ヘキソサミニダーゼ遊離を指標にヒスタミン遊離抑制作用を評価することができる。
まず、ラット好塩基球白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）を２５ｍＬの培養フラスコに入れた培地（１５％ＦＢＳ添加Ｓ−ＭＥＭ培地；以下同じ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を４．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度にＳ−ＭＥＭ培地で希釈し、マウスモノクロナール抗ジニトロフェニル基ＩｇＥ（ＤＮＰ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ＩｇＥ）が終濃度０．５μｇ／ｍＬとなるよう添加した後、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、Ｓ−ＭＥＭ培地を抜き、シラガニアン（Ｓｉｒａｇａｎｉａｎ）緩衝液５００μＬにて洗浄を２回行った。
次に、シラガニアン（Ｓｉｒａｇａｎｉａｎ）緩衝液３０μＬ、及びシラガニアン（Ｓｉｒａｇａｎｉａｎ）緩衝液にて調製した各サンプル１０μＬを加え、３７℃にて１０分静置した。その後、１００ｎｇ／ｍＬのジニトロフェニル化ウシ血清アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳＡ）溶液１０μＬを加え、３７℃にて１５分静置し、ヘキソサミニダーゼを遊離させた。
その後、９６ｗｅｌｌプレートを氷上に静置することにより遊離を停止した。各ｗｅｌｌの細胞上清１１０μＬ及び１ｍｍｏｌ／Ｌのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミド（ｐ−ＮＡＧ）溶液１０μＬを、新たな９６ｗｅｌｌプレートに添加し、３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、各ｗｅｌｌに０．１ｍｏｌ／ＬＮａ_２ＣＯ_３／ＮａＨＣＯ_３２５０μＬを加え、波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。

次いで、空試験として、細胞上清１０μＬ及び０．１ｍｏｌ／ＬのＮａ_２ＣＯ_３／ＮａＨＣＯ_３２５０μＬの混合液の波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定して、補正した。
以上の測定結果から、下記数式２により、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率を求めた。
＜数式２＞
ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率（％）＝［１−（Ｂ−Ｃ）／Ａ］×１００
ただし、前記数式２中、Ａは、サンプル無添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｂは、サンプル添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度を表す。Ｃは、サンプル添加，ｐ−ＮＡＧ無添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度を表す。

次に、サンプル濃度を段階的に減少させて上記ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率の測定を行い、ヘキソサミニダーゼの遊離を５０％阻害するサンプル濃度を内挿法により求めた。結果を表２に示す。この値が小さいほどヘキソサミニダーゼの遊離阻害作用が強いことを表す。

表２の結果から、製造例１〜３の油溶性甘草抽出物、及び製造例５のリコカルコンＡが、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用（即ち、ヒスタミン遊離抑制作用）を有することが確認できた。

（実施例３）
−血小板凝集抑制作用−
製造例１〜５で調製した抽出物及び精製物（以下、「サンプル」と称することがある）について、以下のようにして血小板凝集抑制作用を試験した。
まず、７７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を１／１０量加えて採血したウサギの血液を遠心（１８０×ｇ、１０分、室温）して血小板浮遊液を得た。次いで、遠心（８１０×ｇ、１０分、４℃）し、上清を除去して血小板を得た。これを血小板洗浄液（０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム：０．１５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．４）：７７ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）＝９０：８：２）に浮遊させ、上記と同様に遠心し、得られた血小板を血小板浮遊液（１４５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウム及び５．５ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含む１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））に浮遊させて、血小板数を調整（３．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／μＬ）して、洗浄済み血小板浮遊液を調製した。
次に、得られた洗浄済み血小板浮遊液２２２μＬに２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム溶液１μＬを加え、３７℃で１分間反応した。これに各サンプル２μＬを加え、更に２分間反応し、撹拌子を入れて１分間撹拌した後、凝集惹起剤として１０ｐｐｍコラーゲン溶液２５μＬを添加して３７℃にて１０分間の血小板の凝集率を血小板凝集測定装置（ＰＡＭ１２ＣＬ、メバニクス株式会社製）により測定し、下記数式３から、血小板凝集抑制率Ａを求めた。別に、サンプル溶液の代わりにサンプル溶液の溶媒を添加しない以外は、上記と同様に操作して血小板凝集率Ｂを測定した。
＜数式３＞
血小板凝集抑制率（％）＝〔（Ｂ−Ａ）／Ｂ〕×１００
ただし、前記数式３中、Ａは凝集惹起剤添加、サンプル溶液添加時の血小板凝集率を意味する。Ｂは凝集惹起剤添加、サンプル溶液無添加時の血小板凝集率を意味する。

次に、サンプル濃度を段階的に減少させて上記血小板凝集抑制率の測定を行い、血小板の凝集を５０％阻害するサンプル濃度を内挿法により求めた。結果を表３に示す。この値が小さいほど血小板凝集抑制作用が強いことを表す。

表３の結果から、製造例１〜３の油溶性甘草抽出物、製造例４のグラブリジン、及び製造例５のリコカルコンＡが、血小板凝集抑制作用を有することが確認された。

（実施例４）
−ホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用−
製造例１〜５で調製した抽出物及び精製物（以下、「サンプル」と称することがある）について、以下のようにしてホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用を試験した。
まず、ラット白血病細胞のＲＢＬ−２Ｈ３細胞を７５ｃｍ^２のフラスコで１５ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ_２−９５％ａｉｒの下で培養し、常法により細胞を集めた。得られた細胞を１５ｖ／ｖ％のＦＢＳ含有ＭＥＭ培地にて５×１０^５個／ｍＬになるよう調整した。更に〔^３Ｈ〕アラキドン酸（５０μＣｉ／５００μＬ）を、３μＬ／１０ｍＬの割合で加えた。得られた調製液を２４穴プレートに１ｍＬ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２９５％ａｉｒの下で一晩培養した。各ｗｅｌｌ中の培地を捨て、ＰＢＳ（−）で洗浄後、無血清ＭＥＭ培地を加え、３７℃にて３０分間、インキュベーションした。
次に、サンプルを溶解した溶液を各穴に加え、同様に１０分間インキュベーションした。更に、１ｍｍｏｌ／ＬのＡ２３１８７（シグマ社製）を１０μＬ加え、３７℃にて５分間インキュベーションした。反応後、水冷下に上清５００μＬを取り、シンチレーションカクテル６ｍＬを加えて液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。

次いで、同様の方法により、空試験（Ａ２３１８７刺激なし）及びコントロール（サンプル溶液の溶媒）について測定した。
得られた測定結果から、下記数式４によりホスホリパーゼＡ_２活性阻害率を求めた。
＜数式４＞
ホスホリパーゼＡ_２活性阻害率（％）＝〔（Ｂ−Ａ）／(Ｂ−Ｃ)〕×１００
ただし、前記数式４中、Ａはサンプル添加時の放射活性を表す。Ｂはコントロールの放射活性を表す。Ｃは空試験の放射活性を表す。

次に、サンプル濃度を段階的に減少させて上記ホスホリパーゼＡ_２活性阻害率の測定を行い、ホスホリパーゼＡ_２活性を５０％阻害するサンプル濃度を内挿法により求めた。結果を表４に示す。この値が小さいほどホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用が強いことを表す。

表４の結果から、製造例１〜３の油溶性甘草抽出物が、ホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用を有することが確認できた。

（配合実施例１）
下記組成の抗炎症作用を有するクリームを常法により製造した。

（配合実施例２）
下記組成の抗炎症作用を有する乳液を常法により製造した。

（配合実施例３）
下記組成の抗炎症作用を有するパックを常法により製造した。

（配合実施例４）
下記組成の抗炎症作用を有するクリームを常法により製造した。

（配合実施例５）
下記組成の抗炎症作用を有するパックを常法により製造した。

本発明の抗炎症剤は、マメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物、及びマメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物の水抽出残渣の少なくともいずれかを有機溶媒で抽出処理して得られ、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、血小板凝集抑制作用及びホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用から選択される少なくとも１種の作用を有し、特に化粧水、クリーム、乳液、ローション、パックなどの皮膚化粧料などとして好適に用いられる。

Claims

油溶性甘草抽出物を含有することを特徴とする抗炎症剤。
油溶性甘草抽出物が、マメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物、及びマメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物の水抽出残渣の少なくともいずれかを抽出処理して得られる請求の範囲第１項に記載の抗炎症剤。
マメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物の根、根茎、葉、及び茎、並びにこれらの水抽出残渣の少なくともいずれかを有機溶媒で抽出処理して得られる請求の範囲第１項から第２項のいずれかに記載の抗炎症剤。
有機溶媒が、エタノール、含水エタノール、及び酢酸エチルから選択される少なくとも１種である請求の範囲第３項に記載の抗炎症剤。
マメ科グリチリザ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）属植物が、グリチリザグラブラ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｇｌａｂｒａ）、グリチリザインフラタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｉｎｆｌａｔａ）、グリチリザアラレアシス（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａａｒａｌｅａｓｉｓ）、グリチリザウラレンシス（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓ）及びグリチリザエチナタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅｃｈｉｎａｔａ）から選択される少なくとも１種である請求の範囲第２項から第４項のいずれかに記載の抗炎症剤。
油溶性甘草抽出物が、グラブリジン及びリコカルコンＡの少なくともいずれかのフラボノイドを含む請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の抗炎症剤。
グラブリジン及びリコカルコンＡの少なくともいずれかのフラボノイドの油溶性甘草抽出物における合計含有量が、乾燥固形分で１〜８０質量％である請求の範囲第６項に記載の抗炎症剤。
グリチリザグラブラ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｇｌａｂｒａ）の油溶性甘草抽出物におけるグラブリジンの含有量が、乾燥固形分で１質量％以上である請求の範囲第５項から第７項のいずれかに記載の抗炎症剤。
グリチリザエチナタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅｃｈｉｎａｔａ）の油溶性甘草抽出物におけるリコカルコンＡの含有量が、乾燥固形分で１質量％以上である請求の範囲第５項から第８項のいずれかに記載の抗炎症剤。
グリチリザインフラタ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｉｎｆｌａｔａ）の油溶性甘草抽出物におけるリコカルコンＡの含有量が、乾燥固形分で１質量％以上である請求の範囲第５項から第９項のいずれかに記載の抗炎症剤。
油溶性甘草抽出物が、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、血小板凝集抑制作用及びホスホリパーゼＡ_２活性阻害作用から選択される少なくとも１種の作用を有する請求の範囲第１項から第１０項のいずれかに記載の抗炎症剤。
皮膚外用剤として用いられる請求の範囲第１項から第１１項のいずれかに記載の抗炎症剤。