KR102062854B1

KR102062854B1 - 복분자 뿌리의 활성분획물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102062854B1
Application number: KR1020120091937A
Authority: KR
Inventors: 이순근; 정유진; 박종호; 임효정; 임소라; 송미애; 이동수; 박송희
Original assignee: 유씨엘 주식회사
Priority date: 2012-08-22
Filing date: 2012-08-22
Publication date: 2020-01-07
Also published as: KR20140025239A

Abstract

본 발명은 복분자(Rubus coreanus MIQ) 뿌리의 활성분획물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 복분자(Rubus coreanus MIQ) 뿌리의 활성분획물이 여드름의 초기 증상을 억제하는 5α-리덕타아제(5α-Reductase)저해에 의한 피지 과잉생성 억제작용, 과각질화 억제작용, 진행성 여드름에 대해 유도성 나이트릭옥사이드 활성 억제작용을 나타냄으로써 여드름 예방 및 개선하는 효과를 가짐은 물론이고, 경피수분손실 억제작용에 의한 피부보습 효과를 가지는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

복분자 뿌리의 활성분획물을 함유하는 화장료 조성물 {Cosmetic composition containing active fractions of Rubus coreanus MIQ root}

본 발명은 복분자(Rubus coreanus MIQ) 뿌리의 활성분획물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 여드름 진행과정에서 나타나는 주요 기작을 차단하여 여드름을 효과적으로 예방 및 개선하는 효과를 가짐은 물론이고, 피부에의 보습효과도 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.

여드름(심상성 좌창 : Acne vulgaris)은 모낭 및 피지선에 발생하는 만성 염증성 질환이다. 여드름 발생원인은 크게 피지분비의 증가, 모낭상피의 이상 과각질화, 및 혐기성 피부 상재균인 프로피오니 박테리움 아크네의 증식이 주 원인이라할 수 있겠으나, 호르몬의 불균형, 스트레스, 치우친 식생활, 몸 상태의 불량 등 신체나 정신 상태에 영향을 받기 때문에 여드름의 발생원인은 매우 복잡하다.

여드름의 진행과정을 살펴보면, 초기단계는 지나치게 분비된 피지가 모공에 쌓여 모포안이 피지의 압력으로 팽창되어 코메도(Comedo)가 되고, 모공이 막힌 것은 흰 여드름(폐쇄면포)이 되고, 모공의 끝이 조금 열려서 검게 보이는 것은 검은 여드름(개방면포)이 된다. 더욱더 여드름이 진행되면 세균이 염증을 일으켜서 피부가 붉고 좁쌀 같은 것이 생기는 홍색 구진형이 되고, 이것이 곪아서 고름을 지닌 농포형이 된다.

여드름은 90% 정도가 10대에 나타나지만, 20∼30대의 성인 남녀에게도 나타나기도 한다. 10대의 여드름과 성인의 여드름은 다소의 차이를 보인다. 10대 여드름은 주로 피지분비가 왕성하게 되는 봄, 여름에 걸쳐서 이마, 얼굴전체 및 지성피부에서 발생하기 쉬운 반면, 성인 여드름의 경우는 부위가 한정되지 않고 연중 내내 발생을 되풀이 하는 경향이 있다. 성인 여드름의 원인으로 주목받는 호르몬에는 피지선을 자극해서 피지를 분비시키는 남성호르몬과 그 작용을 억제하는 여성호르몬의 균형이 붕괴되면서 피지가 과잉으로 분비되어 여드름이 발생한다.

여드름 치료를 위하여 의약 영역에서는 에리드로마이신, 벤조일퍼록사이드 등의 항생제를 이용하여 여드름 균을 억제하거나, 여성 호르몬인 에스트로젠을 사용하여 피지분비를 조절하여 여드름 치료를 수행해 왔으나, 심각한 부작용을 가지고 있으며 지속적으로 사용할 수 없는 단점이 있었다. 화장품 영역에서는 비타민 A 유도체를 이용한 피부각질 제거 및 트리클로산, 살리실산 등을 이용하여 여드름 균을 제거하였다. 그러나 이러한 치료방법은 어느 정도의 효과를 나타내지만, 대부분 피부발적, 피부과민 또는 광과민 등의 부작용 및 빈번한 재발이 문제점으로 지적되었다. 또한, 여드름은 그 자체는 치료되더라도 여드름이 없어진 곳에 색소가 침착되어 기미로 되기도 하고, 표면이 함몰되어 구멍이 형성되기도 한다.

한편, 복분자(Rubus coreanus MIQ)는 루버스 속 장미과에 속하는 낙엽 활목이다. 루버스 속은 종의 분화가 다양하여 학자에 따라서는 200 내지 300종으로 분류하고 있으며, 약용으로 사용되는 복분자종(Rubus coreanus MIQ), 산딸기종(Rubus crataegifolius), 멍석딸기종(Rubus parvifolius Linnevar iphyllus) 등이 그 대표적인 예이다.

복분자는 과실, 잎 및 뿌리가 각기 다른 약리작용을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 복분자 뿌리 추출물의 경우는 다양한 세균 또는 곰팡이균에 대해 항균작용을 가지고 있으므로 여드름, 충치, 이질, 무좀 등의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있음이 보고된 바 있다 [한국공개특허 제2006-84263].

복분자는 그 부위에 따라 다른 약리 작용을 가지고 있음은 부위별로 다른 활성성분이 존재할 것으로 예측되고 있다. 현재까지 보고된 바에 의하면, 복분자 열매의 활성성분으로는 상귄(sanguiin) H-4, 상귄(sanguiin) H-6, 갈산(gallic acid)이 보고되었다. 복분자 잎의 활성성분은 2종의 가수성 탄닌 예를 들면, 엘라그산(ellagic acid), 상귄 H-5와 4종의 플라보노이드 예를 들면, 캠퍼롤(kaempferol), 쿼세틴(quercetin), 쿼세틴 3-O-β-D-글루쿠로니드 나트륨염, 쿼세틴 3-O-β-D-글루쿠로니드 소듐 카보실레이트가 보고되었다. 복분자 줄기의 활성성분은 4개의 활성성분 예를 들면, 에피카테친(epicatechin), 카테친(catechin), 프로시아니딘(procyanidin) B-4 및 상귄 H-4가 보고되었다. 하지만 복분자 뿌리의 활성성분에 대해서는 현재까지 어떠한 문헌에도 보고된 바 없다.

본 발명자들은 피부에 안전하면서 여드름의 예방 및 개선에 효과가 있는 천연물 함유 화장료 조성물을 개발하기 위해 민간요법 및 관련서적, 논문 등의 문헌정보를 근거로 자생식물의 피부 생리활성에 대한 연구를 수행하였다. 그 결과, 복분자(Rubus coreanus MIQ) 뿌리로부터 얻은 활성분획물이 여드름의 초기 증상을 개선하는 5α-리덕타아제(5α-Reductase) 저해 활성, 유도성 나이트릭옥사이드의 억제활성, 및 경피수분손실(TWEL) 방지하는 활성이 탁월함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 피지 과잉생성 억제, 과각질화 억제, 유도성 나이트릭옥사이드 활성억제 작용이 탁월한 복분자 뿌리의 활성분획물을 함유하는 여드름 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 경피수분손실(TWEL)을 방지하는 작용을 가지고 있는 복분자 뿌리의 활성분획물을 함유하는 피부보습용 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 복분자 뿌리로부터 얻은 활성분획물을 수득하는 일련의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 과제 해결을 위해, 본 발명은 복분자 뿌리로부터 얻은 활성분획물을 함유하는 여드름 예방 및 개선용 화장료 조성물을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 복분자 뿌리로부터 얻은 활성분획물을 함유하는 피부보습용 화장료 조성물을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은

(1) 복분자 (Rubus coreanus MIQ) 뿌리를 세척, 건조 및 세절하는 단계;

(2) 복분자 뿌리 세절물을 용매로 추출하고, 여과 및 농축하여 복분자 뿌리 추출물을 얻는 단계; 및

(3) 추출물을 분획한 후에 여과, 농축 및 동결건조하여 복분자 뿌리의 활성분획물 분말을 얻는 단계;

를 포함하는 복분자 딸기(Rubus coreanus MIQ) 뿌리로부터 활성분획물을 수득하는 방법을 그 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 여드름 질환을 예방 및 개선하는데 탁월한 효과를 나타낸다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부 보습력을 부여하는데 탁월한 효과를 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 "활성분획물"은 "추출 분획물" 및/또는 "추출 후 분획물" 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 복분자(Rubus coreanus MIQ) 뿌리의 활성분획물을 수득하는 방법을 좀 더 구체적으로 설명하면 하기와 같다.

먼저, 복분자(Rubus coreanus MIQ) 뿌리를 세척, 건조 및 세절하여 준비한다. 본 발명의 실시예에서는 활성분획물의 수득율 향상을 위하여, 복분자 (Rubus coreanus MIQ) 뿌리로서 우리나라 전북 고창지역에서 재배되는 루버스 속(Rubus sp.) 장미과(Rosaceae)에 속하는 낙엽 활목 중, 약용으로 사용되는 복분자(Rubus coreanus MIQ) 뿌리를 사용하고 있다. 그러나 다른 산지의 복분자(Rubus coreanus MIQ) 뿌리를 사용하더라도 본 발명이 목적하는 활성분획물을 충분히 수득할 수 있다. 복분자(Rubus coreanus MIQ) 뿌리는 물로 세척하고 건조시킨 후 미세한 크기로 세절한다.

그런 다음, 복분자 뿌리 세절물을 용매로 추출하고, 여과 및 농축하여 복분자 뿌리 추출물을 얻는다. 상기 추출은 5 내지 50 중량배 정도의 추출용매를 사용하여 30∼100℃에서 3∼48시간동안, 바람직하게는 50∼80℃에서 12∼24시간 동안 추출한다. 상기 추출에 사용되는 용매는 물 또는 통상의 추출용 용매를 사용할 수 있다. 이러한 추출용매는 구체적으로 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 프로판올, 부탄올, 글리세롤, 프로필렌글라이콜, 1,3-부틸렌글라이콜, 솔비톨, 말티톨, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 및 메틸렌클로라이드로 이루진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다. 추출용매로서 바람직하게는 물 또는 물과 에탄올의 혼합용매를 사용할 수 있다.

추출액은 통상의 방법으로 여과한다. 필요에 따라 잔사는 같은 방법으로 1회 이상 더 추출할 수 있다. 여과액은 통상의 방법으로 감압 농축하여 복분자 뿌리의 추출물을 얻는다.

그런 다음, 복분자 뿌리의 추출물을 분획하고, 통상의 방법으로 여과, 농축 및 동결건조하여 활성분획물 분말을 얻는다. 분획은 용매분획, 에탄올 분획 등에 의해 수행할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 추출 농축물에 에탄올을 분획하는 방법을 수행하여, 활성분획물을 수득한다. 얻어진 활성분획물은 통상의 방법으로 여과 및 농축한 후에, 동결건조하여 활성분획물 분말을 수득한다.

이상의 제조과정을 통해 수득한 복분자(Rubus coreanus MIQ) 뿌리의 활성분획물은 본 발명에 따른 화장료 조성물은 전체 조성물 총 중량에 대해 0.0001∼20 중량% 범위로 함유될 수 있다. 활성분획물의 함량이 0.0001 중량% 미만으로 사용하면 그 첨가효과가 미미하고, 20 중량%를 초과하여 사용하여도 그 효과가 특별히 증진되지 않으며 오히려 천연물의 과다 사용으로 유통기한을 단축시킬 수 있다. 좋기로는 본 발명에 따른 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 복분자 뿌리의 활성분획물이 0.01∼1 중량% 범위로 첨가하는 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물 활성성분으로서 상기한 복분자 뿌리의 활성분획물을 단독으로 사용할 수 있으나, 필요에 따라 공지의 피부각질 제거제, 여드름 균 억제성분과 함께 사용할 수 있다. 예를 들면, 살리실산, 트리클로산, 아젤라익산, 티트리오일 및 비오틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상을 더 포함시킴으로써 그 효능이 더 증강될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기한 복분자 뿌리의 활성분획물을 분말상으로 첨가할 수도 있겠으나, 다른 화장료 성분과의 혼화성 등을 고려하여 적절한 희석용매로 희석하여 사용할 수 있다. 상기 희석 용매는 상기한 추출용매로 사용한 것과 동일한 물질들 중에서 선택하여 사용할 수 있으며, 특히 피부에 안전한 물 또는 글리세린, 1,3-부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜, 솔비톨, 말티톨 등의 폴리올을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 활성분획물 분말과 희석 용매는 1:3 내지 1:7의 중량비로 혼합하는 것이 바람직하나, 본 발명이 이에 한정하는 것은 아니고 통상의 혼합 비율로 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 토너, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 앰플, 로션, 에센스, 영양 크림, 아이 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 포밍 워시, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 젤, 워시오프 팩, 필오프 팩, 시트상 마스크 팩, 하이드로젤 마스크 팩, 리포젤 마스크팩, 클레이 마스크 팩, 비누, 스프레이, 선 크림, 선 로션, 선 밤, 선 미스트, 비비 크림, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프라이머 제품 등 다양한 화장품 제형에 사용될 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 하기의 실시예와 실험예를 통해 보다 상세하게 설명하겠으나, 하기 실시예와 실험예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예] 추출물 또는 활성분획물의 제조

실시예 1. 복분자 뿌리 활성분획물의 제조

복분자 뿌리 200 g을 정제수로 세척, 건조하고 세절하였다. 정제수와 에탄올 7 : 3 혼합용매를 약 10배 부피량으로 가하여 추출하였다. 냉각콘덴서를 장착하여 용매가 증발되는 것을 방지하였고, 60 내지 80℃ 온도를 유지하면서 12시간동안 가열하여 추출하였다. 추출액을 400 메쉬 여과포로 여과하였고, 잔사는 같은 방법으로 1회 더 추출하였다. 추출액을 상온으로 냉각하여 와트만 2번 여과지로 여과한 후, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치(Buchi Rotavapor R-124, Water Bath B-480 Made in switzerland, Eyela A-3S Tokyo rikakikai)를 사용하여 60∼80℃로 유지하면서 증류하였으며, 이때 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 감압농축하여 복분자 뿌리의 추출물 64 g을 얻었다.

복분자 뿌리의 활성분획물을 수득하기 위하여, 상기에서 얻은 복분자 뿌리의 추출물을 감압농축 한후 에탄올을 이용하여 분획하였다. 얻어진 활성분획물은 상온으로 냉각하여 와트만 2번 여과지로 여과한 후, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치(Buchi Rotavapor R-124, Water Bath B-480 Made in switzerland, Eyela A-3S Tokyo rikakikai)를 사용하여 60∼80℃로 유지하면서 증류하였으며, 이때 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 감압농축한 후에, 동결 건조시켜 복분자 뿌리의 활성분획물 분말 6.2 g을 얻었다.

얻어진 복분자 뿌리의 활성분획물 분말은 5배 부피량의 1,3-부틸렌글라이콜과 혼합하여 하기 실험에서 시료로 사용하였다.

비교예 1. 복분자 뿌리 추출물의 제조

복분자 뿌리 200 g을 정제수로 세척, 건조하고 세절하였다. 정제수와 에탄올 7: 3 혼합용매를 약 10배 부피량으로 가하여 추출하였다. 냉각콘덴서를 장착하여 용매가 증발되는 것을 방지하였고, 60 내지 80℃ 온도를 유지하면서 12시간동안 가열하여 추출하였다. 추출액을 400 메쉬 여과포로 여과하였고, 잔사는 같은 방법으로 1회 더 추출하였다. 추출액을 상온으로 냉각하여 와트만 2번 여과지로 여과한 후, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치(Buchi Rotavapor R-124, Water Bath B-480 Made in switzerland, Eyela A-3S Tokyo rikakikai)를 사용하여 60∼80℃로 유지하면서 증류하였으며, 이때 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 감압농축한 후에, 동결 건조시켜 복분자 뿌리의 추출물 분말 12.8 g을 얻었다.

얻어진 복분자 뿌리의 추출물 분말은 5배 부피량의 1,3-부틸렌글라이콜과 혼합하여 하기 실험에서 시료로 사용하였다.

비교예 2. 복분자 열매 추출물의 제조

상기 비교예 1과 동일한 방법으로 추출하여 복분자 열매의 추출물 분말 시료를 얻었다.

비교예 3. 복분자 잎 추출물의 제조

상기 비교예 1과 동일한 방법으로 추출하여 복분자 잎의 추출물 분말 시료를 얻었다.

비교예 4. 복분자 줄기 추출물의 제조

상기 비교예 1과 동일한 방법으로 추출하여 복분자 줄기의 추출물 분말 시료를 얻었다.

비교예 5. 복분자 껍질 추출물의 제조

상기 비교예 1과 동일한 방법으로 추출하여 복분자 껍질의 추출물 분말 시료를 얻었다.

상기 실시예 1과 비교예 1 내지 5에서 얻어진 활성분획물 또는 추출물의 수득량, 얻어진 동결건조 분말의 양, 생약의 중량대비 동결건조 분말의 수율을 정리하여 하기 표 1에 나타내었다.

복분자 부위		활성분획물 또는 추출물의 수득량 (g)	동결건조 분말 (g)	수율 (%)
뿌리	활성분획물	18	6.2	3.1
뿌리	추출물	64	12.8	6.4
열매 추출물		81	16.2	8.1
잎 추출물		108	21.8	10.9
줄기 추출물		65.5	13.1	6.6
껍질 추출물		87.0	17.4	8.7

[제제예]

제제예 1. 에센스의 제조

복분자 뿌리의 활성분획물(실시예 1)을 하기 표 2의 조성물에 포함시켜 에센스를 제조하였다.

비교제제예 1. 에센스 제조

복분자 뿌리 활성분획물 혹은 추출물이 포함되지 않은 에센스를 제제예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

원료명	함량(중량%)
원료명	제제예 1	비교 제제예 1
1) 소르비탄스테아레이트	0.30	0.30
2) 폴리소르베이트-60	0.50	0.50
3) 사이클로펜타실록산	1.50	1.50
4) 호호바오일	1.00	1.00
5) 마카다미아오일	1.00	1.00
6) 올리브오일	1.00	1.00
7) 디메치콘	0.50	0.50
9) 카보머	0.20	0.20
10) 잔탄검	0.05	0.05
11) 1,3-부틸렌글라이콜	6.00	6.00
12) 글리세린	4.00	4.00
13) 1,2-헥산디올	1.50	1.50
14) 소듐아크릴레이트/소듐아크릴로일디메틸타우레이트 코폴리머	0.30	0.30
15) 알지닌	0.20	0.20
16) 복분자 뿌리의 활성분획물	1.0	-
17) 향료	적량	적량
8) 정제수	잔량 100.00	잔량 100.00

상기 표 2에 나타낸 1) 내지 7)의 원료를 정확히 칭량하여 유상(Oil Phase) 탱크에 넣고 75℃로 가열 용해하였다.

수상(Water Phase) 원료 중 정제수 잔량과 원료 11), 12), 13)을 유화탱크에 주입하고, 가열하여 75℃로 유지하였다. 원료 8의 정제수를 25 중량%로 칭량하여 75℃로 가열, 교반하면서 원료 9)와 10)을 소량씩 투입하여 균질한 점성액을 만들고 유화탱크에 주입하였다.

75℃에서 용해된 유상원료를 감압하여 유화탱크에 주입한 후, HM 3500 rpm, PM 25 rpm, 온도 75℃, 시간 5분 동안 호모믹싱한 후 원료 14)를 유화탱크에 주입하여 균질 분산하고, 이어서 원료 15를 소량의 정제수에 용해한 뒤, 유화탱크에 넣고 3분간 호모믹싱하면서 균질, 분산하였다.

탈포하면서 냉각하여 45℃에서 원료 15), 16), 17)을 각각 유화탱크에 주입하여 균질, 분산하여 냉각한 뒤, 28℃에서 작업종료하고 토출하여 숙성하여 에센스를 제조하였다.

[실험예]

실험예 1. 5α-리덕타아제 저해력 평가실험

본 실험에서는 상기 실시예 1과 비교예 1 내지 5에서 얻어진 시료 각각에 대하여 5α-리덕타아제 저해력을 평가하였다.

효소로는 테스토스테론 5α-리덕타아제를 사용하였으며, 상기 효소 제조를 위한 모든 과정은 0∼4℃에서 행하였다. 실험용 쥐로는 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 계로서 8주령된 흰색 암쥐를 사용하였다. 실험용 쥐는 디에틸 에테르로 호흡 마취하고 경추이탈로 죽인 후, 해부하여 간을 적출하여, 인산완충액(PBS)으로 3회 세척한 후 3배 용량의 차가운 완충액(50 mM 인산나트륨, PH 6.8, 0.25 M 백당, 1 mM 디치오스레이톨)를 첨가하여 세포 파쇄기(Polytron Homogenizer)로 간세포를 분쇄하여 균질화한 후 현탁액을 조제하였다. 이 현탁액에서 5α-리덕타아제를 분리하기 위하여 현탁액을 초음파 분쇄(Ultrasonication, 5min)하였다. 그리고, 유효 단백질 층을 얻기 위하여 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 5 min)하고, 상등액을 상기 완충액에 현탁하여 -80℃에 보관하였다. 상기의 방법으로 얻어진 단백질 현탁액의 단백질 정량은 브래드포드 방법(Bradford method)으로 수행하였으며, 엘리자 판독기(ELISA reader)를 사용하여 정확한 단백질량을 결정하였다.

5α-리덕타아제 활성 저해 효과를 평가하기 위해 사용된 반응용액은 50 mM의Na₂HPO₄(PH 6.8), 25 mM의 KCl, 500 mM의 NADPH 및 50 mM의 (3H) 테스토스테론(Testosterone)이 포함되어 있다. 상기 반응용액 50 μL에 상기 실시예 1과 비교예 1 내지 5에서 얻은 각각의 시료 10 uL를 첨가한 후, 단백질 현탁액 200 μL/40 μL를 가하여 반응용액의 부피를 100 μL로 하였다. 37℃ 수욕상에서 10분간 반응시킨 후 250 μL의 반응종결 시액(사이클로헥산:에틸아세테이트=7:3 혼합액)을 가하여 반응을 종결시켰다. 그리고, 반응종결 시액에 추출된 스테로이드(Steroids)를 얻기 위하여 원심분리한 후 상등액을 취하여 후드(Hood)에서 하루 방치하여 반응용매를 휘발시켰다. 잔류물을 클로로포름 20 μL에 녹이고 이것을 TLC 플레이트상에 스폿팅(Spoting)하고 TLC 챔버에서 30분간 전개(전개용매: 톨루엔/아세톤= 4/1)하였다. 전개된 플레이트를 하이퍼필름(Hyperfilm)에 3일간 감광시키고 감광된 면적을 농도계로 측정하였으며, 아래 수학식 1에 의해 테스토스테론 5α-리덕타아제의 활성 저해율을 계산하였다.

[수학식 1]

(상기 수학식 1에서, A는 시료가 미 첨가된 조건에서의 테스토스테론으로부터 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율을 나타내고, B는 시료가 첨가된 조건에서의 테스토스테론으로부터 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율을 나타낸다.)

상기 실시예 1과 비교예 1 내지 5에서 얻어진 시료에 대한 5α-리덕타아제 활성 저해율을 계산한 결과는 하기 표 3과 같다.

시료		처치농도^*(%)	효소활성 저해율 (%)
뿌리	활성분획물	0.3	87.3
	추출물	0.3	67.3
열매 추출물		0.3	48.6
잎 추출물		0.3	37.8
줄기 추출물		0.3	21.1
껍질 추출물		0.3	32.4
농도(%): 효소반응액 중의 활성분획물 또는 추출물의 농도

실험예 2. 과각질화 억제력 평가시험

본 실험에서는 상기 실시예 1과 비교예 1 내지 5에서 얻은 시료와 양성대조군(1% 락트산을 70% 에탄올에 용해한 용액) 각각의 과각질화 억제력을 평가하였다.

피부를 구성하는 모든 세포는 적절한 대사과정을 통하여 피부의 항상성을 유지하기 위해 세포의 생성속도와 박리속도를 일정하게 유지한다. 그래서 피부의 재생속도는 각질층이 박리되는 속도를 측정하여 간접적으로 알 수 있으며, 또한 피부의 각질박리 속도는 각질박리에 따른 피부의 변색정도를 측정하여 박리속도를 측정한다. 본 실험에서는 인체 피부의 과각질화 억제력을 평가하기 위해, 피부 변색제로 셀프태닝(Self tanning) 제품에 사용되고 있는 디하이드록시아세톤(Dihydroxy Acetone)을 착색제로 사용하였다. 구체적인 실험방법은 하기와 같다.

20대 초반에서 40대 초반의 남녀 20명을 선정하여 윗 팔뚝 안쪽을 실험부위로 선정하여 착색시키기 전의 피부밝기를 측정한 후 10% 다이하이드록시아세톤 용액 0.4 mL를 힐탑 쳄버(Hill top chamber)를 이용하여 착색시켰다. 24시간 경과 후, 착색부위를 색화계로 측정하고 복분자 추출물을 0.2%, 0.5%, 1.0%의 농도로 0.4 mL씩 1일 2회 30분간 적용 후 색화계로 매일 측정하였다. 다이하이드록시아세톤을 적용 24시간 후 측정된 색화계 값을 100으로 하여 매일 탈색되는 값을 %로 환산하여 계산하였다. 판정은 착색된 부위가 정상적인 색으로 돌아오는 시간(일)으로 판정하였다.

[수학식 2]

실험물질			시험농도별 환원일(일)			과각질화 억제율 (%)
실험물질			1 %	0.5 %	0.2%	과각질화 억제율 (%)
실 험 군	뿌리	활성분획물	8	11	13	31.6∼57.9
	뿌리	추출물	10	13	15	21.6∼47.9
	열매 추출물		11	13	16	15.8∼42.1
	잎 추출물		14	16	18	5.3∼26.3
	줄기 추출물		13	15	17	10.5∼31.6
	껍질 추출물		13	14	16	15.8∼31.6
양성대조군 (락트산 1%+70%에탄올 용액)			10	12	15	9.0∼47.4
음성대조군 (70%에탄올 용액)			19			-

상기 표 4의 결과에 의하면, 상기 시험군 중에서도 복분자 뿌리의 활성분획물이 과각질화 억제효과가 탁월하였고, 양성대조군(락트산)에 비교하여도 과각질화 억제효과가 뛰어남을 알 수 있다. 즉, 복복분자 뿌리의 활성분획물은 디하이드록시아세톤으로 착색된 피부를 빠른 시간(일)내에 정상피부 색으로 돌아오게 하는 각질박리 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

실험예 3. 유도성 나이트릭옥사이드 생성효소의 활성 억제 평가시험

본 실험에서는 상기 실시예 1에서 얻은 복분자 뿌리의 활성분획물 시료에 대하여 염증의 억제효과를 알아보기 위하여 유도성 나이트릭옥사이드 생성효소(iNOS :Inducible Nitric Oxide Sythase)의 활성 억제 정도를 평가하였다.

본 실험에서는 생쥐의 대식세포(Mouse macrophage cell line)인 Raw264.7 세포를 이용하였다. 상기 세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 10% 우태아혈청(FBS), Antibiotic-antimycotic(GIBCO, Cat No.15240-062)과 함께 75 ㎠ 플라스크에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였고, 이 세포가 80% 이상 Confluence할 때 계대배양하였다.

그 실험방법은 하기와 같다. Raw264.7 세포를 DMEM 배지에 1Ⅹ10⁵세포농도로 현탁시켜 24웰 플레이트에 접종하였다. 80% 이상 Confluence가 되었을 때, 시료를 농도별로 처리하였고 1시간 후 인위적인 염증 유발인자인 1 ㎍/mL 리포폴리삭카라이드(LPS)를 처리하여 24시간동안 더 배양하였다. Raw264.7 세포주로부터 생성된 산화질소(NO)의 양은 세포배양액 중에 존재하는 NO₂형태로서 그 후, 배지인 상층액을 회수하여 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 넣고 그리스 시약(Griess reagent, Sigma)을 동량 첨가하여 상온에서 10분간 가볍게 흔들어 주어 570 nm에서 흡광도를 측정함으로써 NO 생성량을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

시료/LPS처리유무		처리농도(%)	세포생존율(%)	NO 생성량(μM)
대조군/LPS 미처리		대조군	100.00	1.21
대조군/LPS 처리		대조군	79.39	4.92
복분자 뿌리/LPS 처리	활성분획물	0.05	92.6	3.97
		0.10	94.2	3.79
		0.30	96.9	3.10
		0.5	98.1	2.90
	추출물	0.05	87.69	4.08
		0.10	92.6	3.97
		0.30	94.02	3.79
		0.50	96.95	3.10
인도메타신/LPS 처리		100 μM	96.59	3.26

상기 표 5에 의하면, LPS 처리된 대조군은 LPS 미처리된 대조군에 비교하여 NO의 생성량이 증가하였다. LPS 처리된 실험군에 있어, 복분자 뿌리의 활성분획물(실시예 1)의 농도가 증가할수록 NO의 생성량이 감소하는 경향을 보였다. 세포 생존율이 80% 이상 유지되는 상태(독성이 없음)에서 복분자 뿌리의 활성분획물을 처리 시 NO의 생성량이 두드러지게 줄어든 것은 세포독성으로 인한 Raw 세포의 절대적 수의 감소 때문이 아니라, 현저한 항염 효과에 의한 NO의 감소 때문이다.

실험예 4. 보습효과 평가시험

본 실험에서는 상기 실시예 1에서 얻은 복분자 뿌리의 활성분획물 시료에 대하여 보습효과를 평가하였다.

본 실험은 실내온도 25℃, 상대습도 50% 조건의 실내에서 건강한 남녀 20명(평균연령 35세)을 대상으로 실험을 실시하였다.

복분자 뿌리의 활성분획물(실시예 1)을 1% 1,3-부틸렌글라이콜 수용액으로 만들어 시료로 사용하였고, 대조구로 1,3-부틸렌글라이콜 수용액을 사용하였다. 시료와 대조구 각각을 팔 상박에 1일 2회 4주간 도포한 후 피부 손상도 측정기(Tewameter)를 이용하여 경피수분 손실량(Transepidermal Water Loss)의 값을 측정하고, 시간에 따른 변화량인 △TEWL을 계산하였다. 또한 피부 수분 측정기(Corneometer)를 이용하여 경피수분량(0∼150 범위)에 따른 전기 전도도의 변화로 보습효과를 판정하였다.

실험물질		TWEL 변화값(g/㎠)	Corneometer 값
복분자 뿌리	활성분획물	4.5	135
복분자 뿌리	추출물	3.8	126
대조구 (1,3-부틸렌글라이콜)		3.1	107

상기 표 6에 나타낸 경피수분 손실량(TWEL) 및 피부 수분량에 의하면, 일반적인 화장품 보습제로 사용되는 1,3-부틸렌글라이콜 수용액(대조구)에 비교하여 복분자 뿌리의 활성분획물(실시예 1)을 처리하였을 때 현저히 피부보습 효과가 개선됨을 확인 할 수 있었다.

실험예 5. 독성실험(MTT Assay법)

본 실험에서는 상기 실시예 1에서 얻은 복분자 뿌리의 활성분획물의 피부 안전성을 평가하였다.

본 실험에서는 인간 피부세포주인 각질형성세포주(HaCaT, Keratinocytes)를 사용하였다. 상기 세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 10% 우태아혈청(FBS), Antibiotic-antimycotic(GIBCO, Cat No.15240-062)과 함께 75 ㎠ 플라스크에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였고, 이 세포가 80% 이상 Confluence할 때 계대배양하였다.

그 실험방법은 하기와 같다. 세포를 24 웰에 1x10⁴로 분주한 후 세포배양 조건에서 Confluence가 80%에 도달할 때까지 배양하였다. 배지를 버리고 10% 인산완충액(PBS)으로 세척한 다음 10% FBS가 포함하지 않는 새로운 배지를 넣고, 일정 농도의 시험물질을 처리하여 24시간 추가 배양하였다. MTT 용액(5 mg/mL)을 각 웰에 50 uL씩 넣고 3시간 추가 배양하였다. 배양액을 제거한 다음, 다이메톡시설폭사이드(DMSO, Amresco,0231-500ML)를 200 uL씩 넣고 10분간 흔들어 준 다음, 100 uL를 96 웰에 취하여 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 판독기로 540 nm에서 흡광도를 측정한다. 세포독성 정도는 순수한 물을 사용한 대조구의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

그 결과, 실시예 1의 복분자 뿌리의 활성분획물을 24시간 처리시 0.05% 농도에서 92.6%, 0.1% 농도에서 95.0%, 0.5% 농도에서 98.8% 그리고 1.00% 농도에서 99.9%로 나타났다. 대조구와 비교하여 독성(세포 생존율 80% 이상 독성없는 범위)을 보이지 않으므로, 본 발명의 복분자 뿌리의 활성분획물이 피부 안전성이 높은 물질임을 알 수 있다.

이상의 실험을 통하여 확인되었듯이, 본 발명에 따른 복분자 뿌리의 활성분획물은 여드름의 주요 기작으로 알려진 5α-리덕타아제(5α-Reductase) 저해에 의한 피지 과잉생성억제, 과각질화 억제작용과 진행성 여드름에 대해 유도성 나이트릭옥사이드의 억제 활성에 의한 항염 작용에 있어 각별한 효능을 나타내며, 경피수분손실(TWEL)을 방지하여 보습 유지력이 탁월하였으며, 피부에 안전하였음을 알 수 있다.

실험예 6. 여드름 예방 및 개선에 대한 임상실험

상기 제제예에서 제조된 에센스의 여드름 개선 효과를 알아보기 위해 하기의 방법으로 임상실험을 실시하였다.

피험자로는 얼굴에 여드름을 가지고 있는 10대 후반 내지 30대 초반 사이의 남녀 30명을 선정하였다. 제제예 1의 에센스는 얼굴 좌측, 비교 제제예 1의 에센스는 얼굴 우측에 아침, 저녁으로 1일 2회 도포하여 8주간 여드름 개선효과를 평가하였다. 판정방법은 실험 시작 전의 피시험자의 피부상태, 여드름의 상태에 따라 일정한 등급을 매기고 사진촬영을 하였고, 8주 후 여드름예방 및 개선 정도를 사진촬영 및 육안관찰에 의해 판정하였으며, 판정기준은 하기 표 7에 나타내었다.

등 급	피부상태 판정기준
0	정상적인 상태
1	면포의 수가 매우 작거나 염증이 진행되지 않은 상태
2	면포의 수나 크기가 중간정도로 염증이 진행되지 않은 상태
3	적은 수의 염증성 구진이 존재하는 상태
4	작고 광범위한 결정 및 염증성 면포가 존재하는 상태
5	적은 수 및 작은 크기의 구진성 결절이 존재하는 상태
6	중간정도의 염증성 결절이 존재하는 상태
7	많은 수의 염증성 결절이 존재하는 상태
8	심한 결절성 면포가 존재하는 상태
9	심한 낭포 및 염증성 결절이 존재하는 상태

임상시험 결과에 대한 판단은, 상기 표 7의 판정기준으로 피시험자의 여드름에 대한 등급이 3등급 이상의 감소를 나타내면 '효과우수'로 판단하고, 1 내지 2 등급의 감소를 나타내면 '효과중간'으로 판단하고, 감소가 나타나지 않으면 '효과없음'으로 판단하고, 시험전의 등급보다 시험후의 등급이 높으면 '악화됨'으로 판단한다.

본 발명에 따른 복분자 뿌리의 활성분획물이 포함된 제제예 1의 에센스와, 미포함된 비교 제제예 1의 에센스를 임상시험하여 얻은 판단결과를 하기 표 8에 나타내었다.

에센스의 여드름 예방 및 개선효과
에센스	구분	효과우수	효과중간	효과없음	악화됨	부작용
제제예 1	시험군 (n=30)	20(66.7%)	7(23.3%)	3(10.0%)	0	0
비교제제예 1	대조군 (n=30)	0	8(26.7%)	18(60%)	4(13.3%)	0

상기 임상결과를 종합해 볼 때 본 발명에 따른 복분자 뿌리의 활성분획물이 포함된 에센스(제제예 1)는 이를 함유하지 않은 에센스(비교제제예 1)에 비하여 여드름 예방 및 개선효과가 우수하였다.

Claims

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(1) 복분자 딸기(Rubus coreanus MIQ)의 뿌리를 세척, 건조 및 세절하는 단계;
(2) 복분자 딸기의 뿌리 세절물을 30% 에탄올 수용액을 추출용매로 하여 60 내지 80℃의 온도를 유지하면서 추출하고, 여과 및 농축하여 복분자 딸기의 뿌리 추출물을 얻는 단계; 및
(3) 상기 추출물은 에탄올을 분획용매로하여 분획한 후에 여과, 농축 및 동결건조하여 복분자 딸기 뿌리의 추출 분획물 분말을 얻는 단계;
를 포함하고,
상기 추출 분획물로부터 여드름 예방 또는 개선에 관한 유효성분을 수득하는, 복분자 딸기 뿌리의 추출 분획물 제조 방법.
(1) 복분자 딸기(Rubus coreanus MIQ)의 뿌리를 세척, 건조 및 세절하는 단계;
(2) 복분자 딸기의 뿌리 세절물을 30% 에탄올 수용액을 추출용매로 하여 60 내지 80℃의 온도를 유지하면서 추출하고, 여과 및 농축하여 복분자 딸기의 뿌리 추출물을 얻는 단계; 및
(3) 상기 추출물을 에탄올을 분획용매로하여 분획한 후에 여과, 농축 및 동결건조하여 복분자 딸기의 뿌리의 추출 분획물 분말을 얻는 단계;
를 포함하고,
상기 추출 분획물로부터 피부보습에 관한 유효성분을 수득하는, 복분자 딸기 뿌리의 추출 분획물 제조 방법.
삭제
제 6항 또는 제 7항에 있어서,
상기 (2) 단계는,
복분자 딸기의 뿌리 세절물을 30% 에탄올 수용액을 추출용매로 하여 추출하여 제1 추출액을 얻는 단계 및
상기 제1 추출액을 여과한 뒤 잔사물을 30% 에탄올 수용액을 추출용매로 하여 추출하여 제2 추출액을 얻는 단계를 포함하는, 복분자 딸기 뿌리의 추출 분획물 제조 방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서,
상기 (3) 단계는,
상기 추출물을, 에탄올을 분획용매로 분획하여 제1 추출 분획물을 얻는 단계,
상기 제1 추출 분획물을 상온에서 냉각한 후에 여과한 뒤, 60 내지 80℃의 온도로 증류시켜 증발액을 얻는 단계 및
상기 증발액을 감압 농축한 후에 동결 건조시켜 제2 추출 분획물을 얻는 단계를 포함하는, 복분자 딸기 뿌리의 추출 분획물 제조 방법.