KR20100124132A

KR20100124132A - 효소처리를 이용한 혼합생약재 추출물을 함유하는 피부 주름개선용 화장료 조성물 및 그 추출방법

Info

Publication number: KR20100124132A
Application number: KR1020090043218A
Authority: KR
Inventors: 윤경섭; 정택규; 임경란; 홍인기
Original assignee: 주식회사 사임당화장품
Priority date: 2009-05-18
Filing date: 2009-05-18
Publication date: 2010-11-26
Also published as: KR101142541B1

Abstract

본 발명은 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향을 일정 비율로 혼합하고 효소처리를 이용하여 추출한 혼합생약재 추출물 및 이를 이용한 피부 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 상기 혼합생약재 추출물을 함유한 피부 주름개선용 화장료 조성물은 피부 주름개선과 관련된 항산화, 엘라스타아제 발현저해 및 피부 주름개선 임상평가에서 우수한 효과를 발휘함으로써 피부 주름개선에 매우 효과적일 뿐만 아니라, 피부에 적용이 부작용이 없어 매우 안전하다.

백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령, 감송향, 혼합생약재, 주름개선, 화장료, 항산화

Description

효소처리를 이용한 혼합생약재 추출물을 함유하는 피부 주름개선용 화장료 조성물 및 그 추출방법{Anti-wrinkle cosmetic composition containing oriental herb extract treated by enzyme and its extraction method}

본 발명은 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향의 혼합생약재 추출물 추출물을 함유하는 피부 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향을 일정 비율로 혼합하고 효소처리를 이용하여 추출한 혼합생약재 추출물 및 이를 이용한 피부 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 혼합생약재 추출물과 피부 주름개선용 화장료 조성물은 우수한 피부 주름개선 효과가 있으면서도 사용 시 피부자극 및 부작용이 없어 안전하다.

피부는 다양한 외부자극과 접하는 기회가 많기 때문에 다른 기관들에 비해 주름이 발생하기 쉽다. 그 중에서도 얼굴 피부는 태양광선, 건조 외기 및 공해 물질 등에 직접적으로 노출되어 있어 그렇지 않은 피부보다 주름 등의 노화현상이 조기에 발생한다.

피부조직의 노화에 따른 가장 특징적인 변화는 피부기질(matrix)의 변화로서, 진피층에 있는 섬유아세포(human skin fibroblast)가 노화되어 섬유질과 기질의 생성능력이 줄어들게 된다. 기질의 양이 전반적으로 감소하여 피부의 두께가 얇아지며 피부의 탄력을 저하시켜 주름이 형성된다. 즉, 노화가 진행됨에 따라 피부는 탄력성의 저하, 혈액순환의 장애, 피부 장벽의 약화 등이 심해지게 된다.

이와 함께, 피부가 자외선에 노출되면 피부세포 손상의 주원인인 자유라디칼(free radical)과 활성산소종(reactive oxygen species)이 생성된다. 이들은 DNA의 손상을 유발하고, 세포막구조를 공격하여 노화반점을 발생시키며 피부를 촉촉하고 부드러우며 유연하게 탄력을 유지시키는 교원질과 섬유질을 공격하여 주름생성을 가속화할 수도 있다.

이러한 외부환경 또는 내부기작에 의하여 발생하는 피부주름을 줄이기 위하여 많은 화장품이 연구되고 있다. 최근 화장품 개발에 있어 천연물을 이용하여 피부에 영양을 공급하고, 화학적 합성에 의한 화장품이 피부에 미치는 독성 작용을 최소화하면서 부작용을 줄이고, 피부의 각종 증상을 치료하는 효과까지 갖춘 순수 한방 처방을 이용한 한방화장품 개발에 대한 관심이 높아지고 있다.

전술한 바와 같이 피부주름 및 노화방지를 목적으로 하여 다양한 천연소재 및 화장료 조성물들이 개발되어 왔다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-0722955호 “피부노화방지 및 주름억제 기능을 갖는 생약재조성물”에 상엽을 메탄올로 추출한 상엽추출물과, 구기자를 물로 추출한 구기자추출물과, 도인을 메탄올로 추출한 도인추출물을 각각 40 ~ 70 : 5 ~ 20 : 10 ~ 50 의 중량비율로 혼합하여 제조한 피부노화방지 및 주름억제 기능을 갖는 생약재조성물이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-07531860호 “생약추출 혼합물을 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물”에 하수오, 백복령, 우슬, 당귀, 구기자, 토사자 및 인삼으로 이루어진 생약추출 혼합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지용 화장료 조성물이 개시되어 있다.

또한 대한민국 특허출원 제10-2004-0106688호 “피부주름에 개선 효과 있는 전통 생약재를 함유하는 화장품 조성물”에 생약재 추출물을 사용하여 그것을 유효성분으로 하는 것을 특징으로, 피부의 노화 방지 및 피부의 피부결 및 피부주름의 개선효과를 갖는 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형의 화장료 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 특허출원 제10-2006-0103224호 “항산화, 항균, 보습, 미백, 주름개선 및 노화방지 효과를 나타내는 노인전용 화장조성료의 발명”에 감잎, 지실, 녹두, 애엽, 유근피, 빈랑자, 당귀, 박하, 감초, 다시마, 백지, 상지, 천궁, 은행, 어성초, 대추, 인삼, 녹차, 표고버섯을 포함하는 혼합생약추출물을 함유하는 조성물이 개시되어 있다.

백부자(白附子, Aconitum koreanum Raymond)는 노랑돌쩌귀라고도 하며, 미나리아제비과(Ranunculaceae)에 속하는 다년생 식물, 부자의 뿌리이다. 백부자의 주요성분은 아코니틴(aconitine)계, 아티신(atisine)계, 히제나민(higenamine), 코리네인(coryneine), 요코노사이드(yokonoside) 등이 알려져 있으며 한방에서 강심작용, 해열진통작용 등이 있는 것으로 알려져 있다. 백부자를 포함한 화장료 조성물로서 대한민국 등록특허 제10-0785505호에 항산화효과와 미백효과를 갖는 한방 약재 추출물과 그 추출물의 제조방법이 개시되어 있다.

백지(白芷, Angelica dahurica Bentham et Hooker)는 산형과(Umbelliferae)에 속하는 여러해살이풀인 구릿대의 뿌리이다. 백지의 주요성분은 옥시페우세다민(oxypeucedamin), 비야칸겔리콜(byakangelicol), 잔토톡신(xanthotoxin) 등과 같은 쿠마린(coumarin)계로 알려져 있으며 한방에서는 유행성 감기로 인한 두통, 코막힘, 콧물을 다스리는 진통약이며, 위장장애, 산전 산후두통, 어지럼증, 치통, 안면신경통, 마비 등에 유효하다. 또한 월경 뒤 하혈이나, 대하, 대변에 피가 섞여 나올 때, 축농증으로 인한 두통, 창양, 종독, 피부궤양 등에도 효과가 있다. 또한 약리작용으로 항균 작용, 동물의 연수 혈관 운동 중추, 호흡중추, 미주 신경 및 척수부의 흥분 작용, 관상동맥 혈류량 증가작용, 백전풍(白殿風 : 살갗에 흰 반점이 생기는 병증), 은설병(銀屑病 : 만성피부병으로, 홍반과 구진으로 인하여 피부 표면에 여러 층으로 된 백색 비늘가루가 생기는 병증)에 유효작용이 보고되었다. 백지를 이용한 화장료 조성물로서 대한민국 등록특허 제10-0272463호 “화장품에 이용하기 위한 천연물에서 추출한 추출물”, 제10-0820237호 “항산화 및 보습 활성을 나타내는 복합 생약 추출물을 포함하는 화장료 조성물”, 제10-0525994호 “복방 생약 추출물을 함유하는 화장료 조성물” 등에 이 개시되어 있다.

영릉향(零陵香, Lysimachia foenum-graecum Hance)은 앵초과(Primulaceae)의 두해살이풀, 줄기는 높이가 70cm 정도이며, 잎은 어긋나고 겹잎으로 여름에 잎겨드랑이에서 꽃줄기가 나와서 작은 나비 모양의 꽃이 피며, 그 꽃이 풍한사로 인한 감기로 두통이 있을 때 쓰이며, 향기로 흉복부의 팽만 증상을 치료하며, 코막힘이나 치통에도 진통작용을 나타낸다. 유럽이 원산지로 우리나라에도 분포하며 한방에서는 진통작용, 항염증작용 및 미백효과가 있는 것으로 알려져 있다. 영릉향을 이용한 화장료 조성물로 대한민국 등록특허 제10-0272463호에 화장품에 이용하기 위한 천연물에서 추출한 추출물이 개시되어 있다.

향부자(香附子, Cyperus rotundus Linne)는 사초과(Cyperaceae)에 다년생 초본인 향부자의 뿌리로서 주요성분으로는 알파-사이페론(α-cyperone), 사이페렌(cyperene), 사이페롤(cyperol) 등이 있으며 한방에서는 항염작용, 항균작용 및 항산화작용 등이 알려져 있다. 향부자를 이용한 화장료 조성물로 대한민국특허 제10-0537960호 “ 생약재 추출물을 함유하는 화장료 조성물 및 그 추출 방법”, 일본특허 JP2002-29923 “콜라겐 생산 프로모터, 에스테라아제 활성 저해제, 콜라겐 활성 저해제 및 피부 화장료“가 개시되어 있다.

백복령(白茯笭, Poria cocos Wolf)은 잔나비걸상과(Polyporaceae)에 속하는 초본인 복령균의 균핵이다. 백복령의 주요성분은 포도당의 다당체인 패치만(pachyman)과 트리터페노이드 계열인 페치믹산(pachymic acid)이 있으며 한방에서는 이혈작용, 항균작용, 혈당강하효과 등의 효과가 알려진바 있다. 백복령을 이용한 화장료 조성물로서 대한민국특허 제 10-0545044호 “ 나노리포좀으로 안정화시킨 한약재 복합체 추출액 함유화장료 조성물”, 제10-0753186호 “생약추출 혼합물을 함유하는 피부 노화 방지용 화장료조성물” 등이 개시되어 있다.

감송향(甘松香, Nardostachys chinensis Batal)은 마타리과(Valerianaceae)에 속하는 초본인 감송향의 근경이다. 감송향의 주요성분은 나르도스태크 놀(nardostachnol), 아리스톨렌(aristolen), 자타만신(jatamansin) 등의 성분이 있으며, 한방에서는 항염증작용, 항균작용, 항산화작용 등의 효과가 알려진바 있다. 감송향을 이용한 화장료 조성물로 대한민국 등록특허 제10-0546735호 “피부 미백제 조성물”, 제10-0858438호 “피부 미용팩의 조성물” 등이 개시되어 있다.

본 발명에서는 피부주름 및 노화방지에 효과적인 한방 생약재 재료를 탐색하여 상기와 같은 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향을 선별하는 한편, 선별된 생약재에 효소처리 과정을 적용함으로써 물성과 유효성을 향상시킴으로써, 상기 선행기술들과는 다른 각각의 생약재 단일추출물에 비해 항산화 및 주름개선 효과가 향상된 혼합생약재 추출물을 개발하고 본 발명에 이르게 되었다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 피부 부작용을 초래하지 않으면서, 피부 주름개선을 검정하는 항산화, 엘라스타아제 활성저해의 효과가 있어 피부 주름개선에 유용한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

따라서 본 발명의 목적은 이러한 기술적 과제를 달성하기 위하여 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향의 혼합생약재로부터 추출용매를 이용하여 얻어진 1차 추출물을 효소처리 과정을 통하여 2차 정제하는 데 있어서, 그 분리 추출방법을 확립하고 추출된 성분을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 및 이를 이용한 화장료를 제공함에 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해 제공되는 화장료용 유효성분 물질을 분리 및 추출하는 방법은, (a) 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향을 정선, 정량하여 혼합하여 혼합생약재를 준비하는 단계, (b) 상기 혼합생약재에 추출용매를 가한 후, 추출공정을 통해 혼합생약재 조추출물을 제조하는 단계, (c) 상기 혼합생약재 조추출물을 효소처리하여 반응시켜 혼합생약재 추출물을 수득하고, 이를 정제하는 단계로 진행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 (a)단계에서 준비되는 혼합생약재에 포함되는 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향 각각의 함량은, 생약재 전체 중량대비 각각 10 내지 40중량%이면 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 (b)단계에서 생약재에 가해지는 추출용매는 당 업계에 알려진 임의의 추출용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 탄소수 1 내지 4인 무수 또는 함수 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올, 글리세린, 프로필렌글라이콜 및 부틸렌글라이콜로 구성된 용매군 중에서 선택된 하나의 순수용매 또는 둘 이상이 조합된 혼합용매가 이용되며, 상기 추출용매는 상기 생약재 전체 부피 대비 1 내지 20배의 양이면 바람직하다.

한편, 상기 (b)단계에서 수행되는 추출공정은 추출용매를 사용하여 진행되는 당 업계에 알려진 일반적인 추출공정을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 37 ℃의 온도조건에서 1 내지 15일간 침적 추출하는 방법으로 진행하거나, 냉각콘덴서를 장착시킨 후 50 내지 95℃의 온도조건에서 4 내지 20시간 동안 가온 추출하는 방법으로 진행할 수도 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 (c)단계에서 혼합생약재 조추출물에 대한 효소처리과정은 상기 조추출물을 농축하여 추출용매를 제거한 후, 1 내지 10중량%의 에탄올을 함유하는 정제수 혼합용매에 재분산하고, 전체 용매에 대하여 1 내지 10중량%의 효소를 첨가하고 12시간 동안 50°C에서 처리한다.

상기 (c)단계에서 사용되는 효소는 탄수화물가수분해효소(carbohydrase) 및 펙틴가수분해효소(pectinase) 중에서 선택된 1종의 효소 또는 이들이 혼합된 복합효소가 이용될 수 있다.

상기 탄수화물가수분해효소로는 Viscozyme L 및 Celluclast 1.5LFG, (Novozymes, Denmark)을 사용할 수 있고, 펙틴가수분해효소로는 Pectinex 100L(Novozymes, Denmark)을 사용할 수 있다.

전술한 바와 같이 본 발명에 따른 피부주름을 개선할 수 있는 화장료 조성물은 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향의 혼합생약재를 추출용매로 추출하고, 추출된 혼합생약재 조추출물을 효소처리하여 얻어진 혼합생약재 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해 제공되는 화장료 조성물은 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향의 혼합생약재로부터 추출용매를 이용하여 추출된 혼합생약재 추출물을 전체 화장료 중량 대비 0.001 내지 50중량%를 포함하 는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, “유효성분”이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능·효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 혼합생약재 추출물을 이용하여 제조된 화장료는 기초화장용 또는 메이크업용 제품류인 화장수류, 에센스류, 크림류, 로션류, 팩류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 등의 제형으로 제조되어 이용될 수 있다. 액상, 크림상, 페이스트상, 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 통상적인 화장료 제조법으로 제조될 수 있다. 상기 다양한 제형으로 제조된 화장료는 피부 주름개선용으로 이용될 수 있는 기능적 특성을 갖는다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향의 효소 처리된 혼합생약재 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 천연물로서 피부부작용이 없으며, 피부의 주름개선과 관련한 항산화효과, 엘라스타아제 활성저해효과가 우수하여 피부의 주름을 개선하는데 매우 유용하다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1 내지 5>

정선된 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향을 하기 표 1에 나타낸바 와 같이 각각의 중량%로 혼합한 혼합생약재 50 g를 추출기에 넣은 후, 에탄올과 정제수의 각각의 혼합비율에 따라 추출용매 500 mL를 가하고, 4시간씩 2회 반복 환류 냉각 추출하였다. 추출여액을 와트만 2번 여과지로 여과하고 회전식 증발 건조기로 감압 농축하여 용매를 완전히 제거한 후, 다시 40중량% 부틸렌글라이콜 수용액을 250 mL에 녹여 여과하여 혼합생약재 조추출물을 얻었다.

구 분	함량(g)
구 분	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
백부자	10	10	10	10	10
백지	10	10	10	10	10
영릉향	10	10	10	10	10
향부자	10	10	10	10	10
백복령	5	5	5	5	5
감송향	5	5	5	5	5
에탄올	500	375	250	125	-
정제수	-	125	250	375	500

<실시예 6 내지 11>

정선된 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향을 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 각각의 중량%로 혼합한 혼합생약재 50 g를 추출기에 넣은 후, 에탄올과 정제수의 각각의 혼합비율에 따라 추출용매 500 mL를 가하고, 4시간씩 2회 반복 환류 냉각 추출하였다. 상기 추출액을 와트만 2번 여과지로 여과하여 1차 혼합생약재 조추출물을 얻었다. 다시 상기 혼합생약재 조추출물을 회전식 증발 건조기로 감압 농축하여 용매를 완전히 제거한 후, 10중량% 에탄올 수용액을 500 mL에 녹이고 선택된 1종의 효소를 각각 15 mL씩 첨가하고 50℃ 항온이 유지되는 진탕 배양기(shaking incubator)에서 12시간 동안 배양하였다. 상기 효소 처리된 혼합생약재 조추출물을 다시 와트만 2번 여과지로 여과하고 여과된 추출여액을 다시 회전식 증발 건조기로 감압 농축하여 용매를 완전히 제거한 후, 40중량% 부틸렌글라이콜 수용액을 250 mL에 녹여 다시 여과하여 혼합생약재 추출물을 얻었다.

구 분	함량(g)
구 분	실시예 6	실시예 7	실시예 8	비교예 1	실시예 9	실시예 10	실시예 11	비교예 2
백부자	10	10	10	10	10	10	10	10
백지	10	10	10	10	10	10	10	10
영릉향	10	10	10	10	10	10	10	10
향부자	10	10	10	10	10	10	10	10
백복령	5	5	5	5	5	5	5	5
감송향	5	5	5	5	5	5	5	5
정제수	375	375	375	375	250	250	250	250
에탄올	125	125	125	125	250	250	250	250
Viscozyme L	15	-	-	-	15	-	-	-
Pectinex 100L	-	15	-	-	-	15	-	-
Celluclast 1.5LFG	-	-	15	-	-	-	15	-

<비교예 1 내지 2>

전술한 실시예 6 내지 11에서 효소처리를 이용한 추출방법과 동일한 방법으로 진행하되 효소를 처리하지 않은 혼합생약재 추출물을 제조하여 상기 실시예 6 내지 11과 비교하였다.

<비교예 3 내지 8>

정선된 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향을 하기 표 3에 나타낸바 와 같이 각각 단일약재로서 50 g를 추출기에 넣은 후, 에탄올과 정제수의 각각의 혼합비율에 따라 추출용매 500 mL를 가하고, 4시간씩 2회 반복 환류 냉각 추출하였다. 추출여액을 와트만 2번 여과지로 여과하고 회전식 증발 건조기로 감압 농축하여 용매를 완전히 제거한 후, 다시 40중량% 부틸렌글라이콜 수용액을 250 mL에 녹여 여과하여 각각의 단일생약재 추출물을 얻었다.

구 분	함량(g)
구 분	비교예 3	비교예 4	비교예 5	비교예 6	비교예 7	비교예 8
백부자	50	-	-	-	-	-
백지	-	50	-	-	-	-
영릉향	-	-	50	-	-	-
향부자	-	-	-	50	-	-
백복령	-	-	-	-	50	-
감송향	-	-	-	-	-	50
정제수	375	375	375	375	375	375
에탄올	125	125	125	125	125	125

<실험예 1> 항산화효과 평가시험

본 발명에 따른 화장료의 유효성분물질로서 상기 실시예에서 제조한 혼합생약재 추출물이 갖는 항산화효과를 알아보기 위하여 자유라디칼소거시험(Free Radical Scavenging Activity Test)을 실시하였다. 자유라디칼소거시험은 Kim 등(Kor. J. Pharmacogn., 24(4), 299~303, 1993)의 방법을 변형한 것으로써, 안정한 자유라디칼인 DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl, Sigma사) 시약을 사용하였다.

먼저, 0.2 mM DPPH 용액 1 mL에 상기 추출 실시예에 따라 수득된 각각의 시료를 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 2 mL 혼합하고, 실온에서 10분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 한편, 상기 자유라디칼소거시험에서의 대조군은 시료용액 대신 메탄올을 넣어 같은 방법으로 측정하며, DPPH 용액 대신 메탄올을 넣어 실시예 각각에 대한 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

하기 수학식 1을 이용하여 자유라디칼소거율을 수치로 계산하여 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3 및 표 4에서, SC₅₀은 자유라디칼소거율 50%를 달성하기 위해 소요되는 시료의 농도로서 다른 성분물질과 상대적으로 비교할 때 사용되는 수치로서 값이 작을수록 소거율이 높음을 나타낸다. 실험은 각각 3회씩 수행하여 평균값±표준편차로 나타내었다.

활성산소소거시험은 Noro 등(Chem. Pharm. Bull., 31, 3984~3987, 1983)의 방법을 변형한 것으로, 활성산소(superoxide anion)의 소거시험은 잔틴/잔틴옥시다제(xanthine/xanthine oxidase) 효소반응에 의한 활성산소 발생계를 이용하여 활성산소에 의한 니트로블루테트라졸리움(nitroblue tetrazolim, NBT)의 산화에 의한 흡광도의 변화를 측정하였다. Na₂CO₃ 2.4 mL, xanthine 0.1 mL, EDTA 0.1 mL, BSA 0.1 mL, NBT 0.1 mL, 시료 0.1 mL을 넣고 잘 혼합하여 25℃에서 10분간 정치하였다. Xanthine oxidase 0.1 mL을 넣고 25℃에서 20분간 반응시킨 후, 6 mM CuCl₂를 넣어 반응을 정지시키고, 광파장 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 한편, 상기 활성산소소거시험에서의 대조군은 시료용액 대신 정제수를 넣어 같은 방법으로 측정하며, xanthine oxidase 용액 대신 정제수를 넣어 실시예 각각에 대한 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

하기 수학식 2를 이용하여 활성산소소거율을 수치로 계산하여 하기 표 3 및 표 4에 나타내었으며 실험은 각각 3회씩 수행하여 평균값±표준편차로 나타내었다. 하기 표 3 및 4에서 IC₅₀은 활성산소소거율 50%를 달성하기 위해 소요되는 시료의 농도로서 다른 성분물질과 상대적으로 비교할 때 사용되는 수치로서 값이 작을수록 소거율이 높음을 나타낸다.

대조군의 흡광도 - 각 추출물의 흡광도

자유라디칼 소거율(%) = --------------------------------------- X 100

대조군의 흡광도

대조군의 흡광도 - 각 추출물의 흡광도

활성산소 소거율(%) = --------------------------------------- X 100

대조군의 흡광도

구 분	SC₅₀(μL/mL)	IC₅₀(μL/mL)
실시예 1	19.479 ± 0.660	225.944 ± 4.146
실시예 2	10.721 ± 0.516	97.949 ± 0.684
실시예 3	8.927 ± 0.073	102.422 ± 1.090
실시예 4	8.642 ± 0.194	130.602 ± 2.776
실시예 5	10.566 ± 0.549	141.729 ± 1.083

상기 표 4에 나타낸 결과와 같이, 자유라디칼소거시험 결과에서는 실시예 1 내지 5에서 50중량% 에탄올 수용액과 25중량% 에탄올 수용액을 사용하여 추출한 실시예 3과 4가 실시예 1과 2 및 실시예 5에 비해 양호한 소거활성을 보였다. 반면에 활성산소소거시험 결과에서는 75중량%, 50중량% 에탄올 수용액을 사용하여 추출한 실시예 2와 3이 상대적으로 양호한 활성산소 소거활성을 보였다.

상기의 결과를 근거로 하여 50중량% 에탄올 수용액과 25중량% 에탄올 수용액을 사용하여 전술한 효소처리를 이용한 추출방법인 실시예 6 내지 11 및 비교예 1 내지 2와 단일 약재추출물인 비교예 3 내지 8을 수행하였으며, 동일하게 자유라디칼소거시험과 활성산소소거시험을 진행하였으며 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

구 분	SC₅₀(μL/mL)	IC₅₀(μL/mL)
실시예 6	8.223 ± 0.040	53.579 ± 1.532
실시예 7	9.606 ± 0.232	68.978 ± 1.394
실시예 8	9.456 ± 0.186	110.599 ± 1.451
실시예 9	9.304 ± 0.211	68.941 ± 1.007
실시예 10	10.298 ± 0.129	68.464 ± 1.787
실시예 11	10.168 ± 0.068	105.225 ± 3.187
비교예 1	12.030 ± 0.088	172.143 ± 1.929
비교예 2	14.571 ± 0.368	137.089 ± 1.772
비교예 3	16.720 ± 0.421	420.344 ± 1.583
비교예 4	35.484 ± 1.128	-
비교예 5	18.182 ± 0.551	632.344 ± 1.352
비교예 6	12.012 ± 0.648	921.468 ± 6.745
비교예 7	-	-
비교예 8	13.333 ± 0.408	808.371 ± 1.966

상기 표 5에 나타낸 결과와 같이, 자유라디칼소거시험 결과에서는 효소를 사용하지 않은 비교예 1과 2에 비해 실시예 6 내지 11이 상대적으로 양호한 소거활성을 보였다. 또한, 활성산소소거시험 결과에서도 자유라디칼소거시험 결과와 같이 비교예 1과 2에 비해 실시예 6 내지 11이 상대적으로 양호한 소거활성을 보였다. 특히, 효소 중 Viscozyme L을 처리하여 제조한 실시예 6 및 실시예 9가 상대적으로 소거활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 각각의 단일생약재 추출물인 비교예 3 내지 8의 자유라디칼 소거활성 및 활성산소 소거활성에 비해 본 발명의 효소 처리된 혼합생약재추출물인 실시예 6 내지 11의 유효성이 크게 향상되었음을 확인하였다.

<실험예 2> 주름개선효과 평가시험

본 발명에 따른 화장료의 유효성분물질로서 상기 실시예에서 제조한 혼합생약재 추출물이 갖는 주름개선 효과를 확인하기 위해 엘라스타아제(elastase)에 대한 활성저해를 측정하였다.

엘라스틴(elastin)을 분해하는 효소인 엘라스타아제의 활성을 측정하는 방법으로 엘라스타아제 기질인 N-Succinyl-ala-ala-ala-ρ-nitroaniline (Sigma)을 이용하여 ρ-nitroaniline이 분해되면서 생기는 색의 변화를 405nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 엘라스타아제 활성을 측정하는 방법이다. 완충액은 0.267 M Tris-HCl (pH 8.0, Sigma), 기질액은 8.8 mM N-Succinyl-ala-ala-ala-ρ-nitroaniline, 효소액은 돼지췌장 엘라스타아제를 10 μg/mL (Sigma)의 농도로 사용하였다. 완충액 60 μL, 기질액 20 μL과 각각의 시료를 1 mg/mL 농도로 희석한 시료 100 μL을 혼합한 후, 효소액 20 μL을 넣어 25℃ 항온수조에서 15분간 반응시켜 ρ-nitroaniline의 생성량을 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 파장 405 nm에서 측정하였다.

상기 주름개선 효과시험을 위한 대조군은 시료액 대신 정제수를 넣어 같은 방법으로 측정하며, 효소액 대신 정제수를 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻은 경우로 설정하였다. 하기 수학식 3을 이용하여 엘라스타아제 활성저해효과를 수치로 계산하여 하기 표 6에 나타내었으며, 실험은 각각 3회씩 수행하여 평균값±표준편차로 나타내었다. 하기 표 6에 IC₅₀은 엘라스타아제 활성저해율 50%를 달성하기 위해 소요되는 시료의 농도로서 다른 성분물질과 상대적으로 비교할 때 사용되는 수치로서 값이 작을수록 소거율이 높음을 나타낸다.

대조군의 흡광도 - 각 추출물의 흡광도

엘라스타아제 활성저해율(%) = --------------------------------------- X 100

대조군의 흡광도

구 분	IC₅₀(μL/mL)
실시예 1	697.086 ± 6.053
실시예 2	580.301 ± 1.192
실시예 3	552.062 ± 4.954
실시예 4	513.692 ± 3.241
실시예 5	442.427 ± 3.096
실시예 6	399.063 ± 6.365
실시예 7	369.512 ± 8.378
실시예 8	323.857 ± 3.524
실시예 9	441.621 ± 3.091
실시예 10	461.340 ± 17.352
실시예 11	397.229 ± 4.056
비교예 1	546.911 ± 4.231
비교예 2	562.386 ± 4.958
비교예 3 (저해율, %)	25.622 ± 0.660
비교예 4 (저해율, %)	30.345 ± 0.406
비교예 5 (저해율, %)	41.185 ± 0.226
비교예 6 (저해율, %)	32.799 ± 2.014
비교예 7 (저해율, %)	17.156 ± 0.926
비교예 8 (저해율, %)	10.939 ± 0.375

상기 표 6에 나타낸 결과와 같이, 효소처리를 적용하지 않은 실시예 1 내지 5 및 비교예 1과 2에 비하여 효소처리를 적용한 실시예 6 내지 11에서 상대적으로 엘라스타아제 활성저해효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 비교예 3 내지 8의 단일생약재 추출물의 경우는 엘라스타아제 활성저해율 50%를 달성하기 위해 소요되는 시료의 농도인 IC₅₀이 나타나지 않았으며, 1 mL/mL의 농도에서 상기 10~40%의 저해율을 보임으로서 효소 처리된 혼합생약재 추출물인 실시예 6 내지 11에서 유효성이 현저히 개선되었음을 확인할 수 있었다.

<제형예 1 및 그 비교제형예 1>

상기 실시예 6에 따른 혼합생약재 추출물을 포함한 영양스킨의 성분구성을 하기 표 7과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

번호	성 분	제형예 1	비교제형예 1
1	정제수	잔량	잔량
2	카보머	0.05	0.05
3	하이드록시에칠셀루로오스	0.05	0.05
4	부틸렌글라이콜	3.0	3.0
5	글리세린	2.0	2.0
6	피이지-1500	0.5	0.5
7	에탄올	4.0	4.0
8	폴리소르베이트80	0.2	0.2
9	트리에탄올아민	0.05	0.05
10	방부제	미량	미량
11	실시예 6에 따른 혼합생약재 추출물	2.0	－

상기 표 7의 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1(정제수)에 성분 2와 3을 교반 분산시킨 후, 성분 4 내지 6을 가하고, 성분 8 내지 10을 성분 7에 용해시킨 물질과 분취된 성분 4에 용해시킨 성분 11을 차례로 가하여 혼합하는 방식으로 제조하였다.

상기 제형예 1에 대한 그 비교제형예 1은 혼합생약재 추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

<제형예 2 및 그 비교제형예 2>

상기 추출 실시예 6에 따른 혼합생약재 추출물을 함유한 영양로션의 성분구성을 하기 표 8과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

번호	성 분	제형예 2	비교제형예 2
1	세테아릴알코올	1.0	1.0
2	글리세릴스테아레이트	0.7	0.7
3	폴리소르베이트60	1.2	1.2
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.3	0.3
5	세틸옥타노에이트	6.0	6.0
6	스쿠알란	4.0	4.0
7	마카데이나넛오일	3.0	3.0
8	부틸렌글라이콜	4.0	4.0
9	글리세린	4.0	4.0
10	카보머	0.15	0.15
11	산탄검	0.03	0.03
12	방부제	미량	미량
13	정제수	잔량	잔량
14	아르기닌	0.15	0.15
15	실시예 6에 따른 혼합생약재 추출물	5.0	－

상기 표 8의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1 내지 7을 70℃의 온도에서 가열 용해시킨 다음, 성분 8 내지 12를 성분 13에 용해 분산시켜 70℃로 가열한 것에 유화한다. 이후, 상기 유화한 것을 성분 14로 중화하고, 56℃의 온도로 냉각한 후, 분취된 성분 8에 용해시킨 성분 15를 가하여 교반하고 실온에서 냉각하여 제조하였다.

상기 제형예 2에 대한 그 비교제형예 2는 성분 15인 추출 실시예 5에 따른 혼합생약재 추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

<제형예 3 및 그 비교제형예 3>

상기 추출 실시예 6에 따른 혼합생약재 추출물을 함유한 영양에센스의 성분구성을 하기 표 9와 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

번호	성 분	제형예 3	비교제형예 3
1	정제수	잔량	잔량
2	카보머	0.2	0.2
3	하이드록시에칠셀루로오스	0.1	0.1
4	부틸렌글라이콜	8.0	8.0
5	글리세린	6.0	6.0
6	소듐히아루로네이트	150	15.0
7	에탄올	4.0	4.0
8	폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.1	0.1
9	트리에탄올아민	0.2	0.2
10	방부제	미량	미량
11	실시예 6에 따른 혼합생약재추출물	10.0	-

상기 표 9의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1(정제수)에 성분 2와 3을 교반 분산시킨 후, 성분 4 내지 5 및 6을 가하고, 성분 8 내지 10을 성분 7에 용해시킨 물질과 분취된 성분 4에 용해시킨 성분 11을 차례로 가하여 혼합하는 방식으로 제조하였다.

상기 제형예 3에 대한 그 비교제형예 3은 성분 11인 추출 실시예5에 따른 혼합생약재 추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

<제형예 4 및 그 비교제형예 4>

상기 추출 실시예 6에 따른 혼합생약재 추출물을 함유한 영양크림의 성분구성을 하기 표 10과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

번호	성 분	제형예 4	비교제형예 4
1	세테아릴알코올	1.5	1.5
2	글리세릴스테아레이트	1.0	1.0
3	폴리소르베이트 60	1.2	1.2
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.3	0.3
5	세틸옥타노에이트	6.0	6.0
6	스쿠알란	8.0	8.0
7	아프리코드커넬오일	4.0	4.0
8	디메치콘	1.0	1.0
9	부틸렌글라이콜	5.0	5.0
10	그릴세린	4.0	4.0
11	마그네슘알루미늄실리케이트	0.2	0.2
12	산탄검	0.05	0.05
13	방부제	미량	미량
14	정제수	잔량	잔량
15	실시예 6에 따른 혼합생약재 추출물	10.0	－

한편, 상기 표 10의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1 내지 8을 70℃의 온도에서 가열 용해시킨 다음, 성분 9 내지 13을 성분 14에 용해 분산시켜 70℃로 가열한 것에 유화한다. 이후, 상기 유화한 것을 56℃의 온도로 냉각한 후, 분취된 성분 9에 용해시킨 성분 15를 가하여 교반하고 실온에서 냉각하여 제조하였다.

상기 제형예 4에 대한 그 비교제형예 4는 성분 15인 추출 실시예 5에 따른 혼합생약재 추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

<제형예 5 및 그 비교제형예 5>

상기 추출 실시예 6에 따른 혼합생약재 추출물을 함유한 영양팩의 성분구성을 하기 표 11과 같이 구성하여 제조하였다. 이때, 성분함량의 단위는 중량%이다.

번호	성 분	제형예 5	비교제형예 5
1	정제수	잔량	잔량
2	부틸렌글라이콜	3.0	3.0
3	글리세린	2.0	2.0
4	폴리비닐알코올	2.0	2.0
5	폴리비닐피롤리돈	10.0	10.0
6	셀룰로오스검	0.3	0.3
7	마이카	2.0	2.0
8	카올린	2.0	2.0
9	에탄올	5.0	5.0
10	폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.3	0.3
11	방부제	미량	미량
12	실시예 6에 따른 혼합생약재추출물	15.0	-

상기 표 11의 각 성분번호로 구별된 성분 중에서, 먼저 성분 1(정제수)에 성분 2와 3을 첨가한 후, 성분 4 내지 6을 가하여 교반 분산시키면서 70℃로 가열한다. 다음 성분 7 내지 8을 가하여 충분히 분산시키고 56℃의 온도로 냉각한다. 성분 10 내지 11을 성분 9에 용해시킨 물질과 분취된 성분 2에 용해시킨 성분 12를 차례로 가하여 교반하고 실온으로 냉각하여 제조하였다.

상기 제형예 5에 대한 그 비교제형예 5는 성분 12인 추출 실시예5에 따른 혼합생약재 추출물을 제외한 나머지 성분구성이나 제조방법은 동일하게 진행하여 제조한 것을 설정하였다.

<실험예 3. 피부의 주름개선효과 및 피부자극 관능시험>

본 발명에 따른 피부 주름개선용 화장료 조성물의 피부 주름개선효과 및 피부자극을 평가하기 위하여, 상기 제형예 4와 비교제형예 4에서 제조된 영양크림을 이용하여 관능시험을 실시하였다.

구체적으로, 제형예 4와 비교제형예 4의 영양크림을 피부에 각각 도포했을 때 피부의 주름개선효과를 측정하기 위하여 20세 이상의 여성 20명에게 안면 왼쪽 부분에는 제형 실시예 4의 영양크림(시험군)을, 안면 오른쪽 부분에는 제형 비교예 4의 영양크림(대조군)을 1일 1회 12주간 지속적으로 사용하게 하였다.

관능시험에서 피부의 주름개선효과 항목에 대하여는 비교제형예 4의 영양크림을 기준으로 제형예 4의 영양크림이 나타내는 주름개선효과를 상대적으로 평가하게 하였고, 피부자극에 대한 관능평가는 피부의 가려움, 따가움 및 홍반 등의 현상을 평가하게 하였다. 평가는 매우 우수(5점), 우수(4점), 보통(3점), 나쁨(2점), 매우 나쁨(1점)의 오점법 기준에 의거하여 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다. 표 12에서 피부자극은 피부자극이 없는 정도를 나타낸다.

번호	피부자극		주름개선효과
번호	제형예 4	비교제형예 4	제형예 4
1	5	5	4
2	3	4	5
3	5	4	4
4	4	4	5
5	5	4	4
6	3	4	3
7	5	5	5
8	4	4	4
9	4	4	4
10	5	4	4
11	4	3	3
12	4	4	4
13	5	5	4
14	3	4	4
15	5	5	4
16	5	5	4
17	4	5	4
18	5	4	4
19	3	5	3
20	4	4	5
평균	4.25	4.30	4.05

상기 표 12에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 제형예 4의 화장료 조성물에 대한 피부자극 평가점수는 4.25 점으로 매우 양호하게 평가되어, 비교제형예 4와 마찬가지로 피부자극 정도가 낮아 피부 안전성이 우수함을 확인할 수 있었다.

또한, 제형 비교예 4 대비 제형 실시예 4의 화장료 조성물이 가진 상대적인 피부의 주름개선효과는 평가점수 4.05점으로 개선 정도가 우수함을 알 수 있었다.

<실험예 4. 피부의 안전성 실험>

상기 추출 실시예 6에 따른 혼합생약재 추출물과 제형예 4에 대한 피부 안전성, 즉 피부반응의 관찰을 통해서 자극 혹은 알레르기성 반응의 발생 여부를 알아보기 위하여 한국식품의약품안전청 기준 피부안전성 검사법에 따라 인체첩포시험을 실시하였다.

피험자로 20세 이상 50세 이하의 건강한 성인 남, 여 30명을 선정하였고, 첩포시험은 대상자 상박 내측에 첩포를 부착하였으며 48시간이 지난 후 첩포를 제거하였다. 약 60분간 안정을 취하도록 한 후 첫 판독을 시행하였고, 첩포 부착 후 96시간이 경과한 후 2차 판독을 시행하였다. 판정기준은 하기 표 13에 나타낸 바와 같다.

반응	가중치	판정의 기준
-	0	무반응
±	0.5	희미한 홍반
+	1	경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진
++	2	뚜렷한 홍반, 구진 및 수포

첩포 부착 후 48시간과 96시간에 판독한 결과를 하기 수학식 4를 이용하여 시료에 대한 피부 반응도를 산출하였다.

Σ(가중치)X(반응인원수)

피부반응도(%) = ------------------------------- X 100

3(가중치) X 30(전체인원수)

첩포시험의 검사 결과에 근거하여 계산된 양성 반응을 보인 시료의 피부 자극도를 하기 표 13에 나타내었다.

시료	48시간		96시간		반응도(%)
시료	+	++	+	++	48시간	96시간	평균
실시예 6	·	·	·	·	0.00	0.00	0.00
제형예 4	·	·	·	·	0.00	0.00	0.00

상기 표 14에 제시된 바와 같이, 각각의 추출 실시예 6과 제형 실시예 4는 인체첩포시험에서 하기 표 15에 따른 피부 반응도 판정 기준에 의하면 무자극으로 민감한 피부에 사용해도 좋은 결과로 나타났다. 따라서 상기 추출 실시예들에 따른 혼합생약재 추출물은 천연물로서 피부부작용이 없는 안전한 성분으로 나타났다.

피부의 평균 반응도	판정 기준
0.0 ~ 0.9	무자극
1.0 ~ 2.9	경자극
3.0 ~ 4.9	중자극
5.0 이상	강자극

Claims

백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향을 유효성분으로 포함하는 피부 주름개선 활성을 갖는 혼합생약재 추출물.
제 1항에 있어서, 상기 혼합생약재 추출물이 혼합생약재를 추출용매 추출하여 혼합생약재 조추출물을 제조하고, 상기 혼합생약재 조추출물을 효소로 처리하여 얻어진 혼합생약재 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 주름개선 활성을 갖는 혼합생약재 추출물.
제 1항에 있어서, 상기 혼합생약재에 포함되는 백부자, 백지, 영릉향, 향부자, 백복령 및 감송향 각각의 함량은, 혼합생약재 전체 중량대비 각각 10 내지 40중량%인 것을 특징으로 하는 피부 주름개선 활성을 갖는 혼합생약재 추출물.
제 2항에 있어서, 상기 혼합생약재의 추출에 사용되는 추출용매가 정제수, 탄소수 1 내지 4인 무수 또는 함수 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올, 글리세린, 프로필렌글라이콜 및 부틸렌글라이콜로 구성된 용매군 중에서 선택된 하나의 순수용매 또는 둘 이상이 조합된 혼합용매인 것을 특징으로 하는 피부 주름개선 활성을 갖는 혼합생약재 추출물.
제 2항에 있어서, 상기 혼합생약재 조추출물은 효소 처리에 이용되는 효소가 탄수화물가수분해효소 또는 펙틴가수분해효소 중 어느 하나 또는 둘 이상이 조합된 복합효소인 것을 특징으로 피부 주름개선 활성을 갖는 혼합생약재 추출물.
제 5항에 있어서, 상기 탄수화물가수분해효소가 Viscozyme L 또는 Celluclast 1.5LFG, (Novozymes, Denmark) 중 어느 하나이고, 상기 펙틴가수분해효소로가 Pectinex 100L(Novozymes, Denmark)인 것을 특징으로 하는 피부 주름개선 활성을 갖는 혼합생약재 추출물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 혼합생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 화장료 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 화장료 조성물에 함유되는 혼합생약재 추출물 함량은 화장료 조성물 전체 중량 대비 0.001 내지 50중량%인 것을 특징으로 하는 피부 주름개선용 화장료 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 화장수류, 에센스류, 크림류, 로션류, 팩류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 중 선택된 어느 하나의 제형으로 액상, 크림상, 페이스트상, 고체상 중 선택된 어느 하나의 성상을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 주름개선용 화장료 조성물.