JPH11506416A

JPH11506416A - カルシトニンサーモンアナローグ、その製造、医薬用途及び分析用試薬としての用途

Info

Publication number: JPH11506416A
Application number: JP8523975A
Authority: JP
Inventors: パオロアルベルトベロネージ; エマニュエラペシェチェラ; アンナマリアベロネージ
Original assignee: Therapicon SRL
Current assignee: Therapicon SRL
Priority date: 1995-02-08
Filing date: 1996-02-02
Publication date: 1999-06-08
Also published as: CA2210664A1; PL183398B1; PL312683A1; DE69607749T2; DE29622959U1; WO1996024618A1; ZA96779B; JP4123309B2; EP0726075A1; EP0809512A1; PT809512E; HU9600266D0; ES2173267T3; KR960030948A; BR9607410A; PT809654E; WO1996024370A1; CA2212520A1; AU4787996A; US6087338A

Abstract

(57)【要約】本発明は、式Ｉ（式中、Ｒ₁は、−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｈ若しくは−Ｃｙｓ−Ｓ−ＯＨ又はその炭素原子数２〜５個のアルキル基のエステル若しくはエーテル若しくはその薬学的に許容される塩若しくはその異性体を示し、Ｒ₂は、水素若しくはヒドロキシ又はその炭素原子数２〜５個のアルキル基のエステル若しくはエーテル若しくはその薬学的に許容される塩若しくはそれぞれの異性体、或いは、Ｒ₂は、アセトアミドメチル又はその類似物を示す。）で表される新規な置換されたサーモンカルシトニン（サルカトニン）アナローグに関する。該アナローグは、骨粗鬆症、高カルシウム血症、パジェット病のような疾患の予防又は治療のための医学的性質を有しており、分析試験用の参照として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】カルシトニンサーモンアナローグ、その製造、医薬用途及び分析用試薬としての用途本発明は、新規な置換されたサーモンカルシトニン（サルカトニン（salcaton in））アナローグに関する。より具体的には、本発明は、骨粗鬆症、高カルシウム血症、パジェット病のような疾患の予防又は治療のために、分析的試験のための参照として有用なサルカトニンアナローグ並びにその製造法及びその用途に関する。低カルシウム血の性質を有するサルカトニン及びその製造は、下記の文書に開示されている：低カルシウム血症薬として有用な本発明の新規なサルカトニンアナローグは、下記式により表される：（式中、Ｒ₁は、−Ｃｙｓ−ＳＨ若しくはＣｙｓ−Ｓ−ＯＨ：又は−Ｃｙｓ−エーテル若しくは−Ｃｙｓ−Ｓ−エステル（エーテル若しくはエステルは、２〜５個の炭素原子を有する）若しくはその薬学的に許容される塩若しくは異性体を示す；Ｒ₂は、−Ｈ、−ＯＨ、２〜５個の炭素原子を有するエステル若しくはエーテル、若しくはアセトミドメチル（acetomidomethyl）（若しくは類似物）、その薬学的に許容される塩若しくは異性体を示す。）好ましいＲ₁及びＲ₂を下記に示す：化合物１及び２又はその混合物を、慣用的に、以下、ヒドロキシサルカトニンと定義し、化合物３を、慣用的にデス−ｃｙｓ¹−サルカトニンと呼ぶ。本発明の新規なサルカトニンアナローグは、式Ｉ（式中、Ｒ₁は、−Ｃｙｓ− ＳＨ若しくは−Ｃｙｓ−Ｓ−ＯＨ又は−Ｃｙｓ−Ｓ−エーテル若しくは−Ｃｙｓ −Ｓ−エステル（エーテル若しくはエステルは、２〜５個の炭素原子を有する）若しくはその薬学的に許容される塩若しくは異性体を示す；Ｒ₂は、水素若しくはヒドロキシ又は２〜５個の炭素原子を有するエステル若しくはエーテル及びその薬学的に許容される塩若しくはそれぞれの異性体、或いは、Ｒ₂は、アセトアミドメチル又はその類似物を示す。）にて表される３１又は３２のアミノ酸のポリペプチドを含む。本発明の好ましい実施形態は、 (i) Ｒ₁が、−Ｃｙｓ−Ｓ−ＯＨ若しくはエステルの場合、Ｒ₂が水素原子、又は (ii) Ｒ₂＝−ＯＨ若しくはエステルの場合、Ｒ₁が−Ｃｙｓ−Ｈである。本発明は、好適な無機又は有機酸のいずれの薬学的に許容される塩も含む。好適な無機酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸である。好適な有機酸は、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸及びマレイン酸等のカルボン酸を含む。上記塩は、既に当業者に周知の慣用されている方法により調製できる。驚くべきことに、本発明化合物が生理的又は病的な骨の再吸収を阻害し、低カルシウム血症薬として有用であることが今や見出された。実際、骨の再吸収の阻害は、ヒドロキシプロリンの尿排泄の減少により測定され、それは、アルカリ性ホスファターゼの高くて病的な血清レベルの低下及びカルシウムバランスの正常化と関連し、コラーゲン及び骨組織を再構築（rebuildi ng）し、数ヶ月の治療後にＣａ²⁺の全血液含量を低下させるのを促進する。さらに、サルカトニンアナローグは、鎮痛作用を発揮し、痛みの一部又は全てを減少させる。サルカトニンアナローグは、パジェット症（変形性骨炎）、ガンにより引き起こされる高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、ビタミンＤ中毒、いずれも緊急の治療を要しかつ長引くものであり、異なる原因による骨粗鬆症に必要に応じてそれぞれ不健康な状態及びズーデック症に特異的な関連する他の治療と組み合わせて使用され得る。サルカトニンアナローグの薬理学的活性を評価するために、BP 1993 Volume I ，587頁に示されているように、３つの異なる投与量（８ｍＩ.Ｕ.／ｒａｔ，１６ｍＩ.Ｕ.／ｒａｔ，３２ｍＩ.Ｕ.／ｒａｔ）を用いて生物学的アッセイによる予備的スクリーニングを行い、ここに報告される、３つの測定の平均値により表された以下の結果を得た：本発明化合物は、非経口経路により投与可能な溶液若しくは懸濁液のような液剤、鼻内噴霧又は直腸カプセルとして調剤されるのが有利である。注射可能な剤形は、上記化合物の適当な薬学的キャリヤー溶液又は懸濁液であり、該キャリヤーは、他の薬学的に許容される賦形剤又はアジュバントを伴う又は伴わない殺菌された水等の液体である。鼻内噴霧として使用するために、本発明のサルカトニンアナローグの溶液又は懸濁液を、使いやすい賦形剤を伴う又は伴わない水性製剤として調剤し、加圧された吸入器又は噴霧若しくは霧化する投与ポンプを備えた適当な容器に詰めてもよい。ここに記載される新規な化合物の推奨される１日の投与量は、活性アナローグの効果的な量を単位量中に供給するために、１０Ｉ.Ｕ.〜４００Ｉ.Ｕ.、さらに好ましくは、１００Ｉ．Ｕ．〜２００Ｉ．Ｕ．の広い範囲で量的に変わり得る。ここで用いられているように、“Ｉ.Ｕ.”という用語は、Blanche Lane，Sout h Mimms，Potters Bar，Hertfordshire，E6 30G，U.K.の the National Institu te for Biological Standards and Control により確立されたヒト、サーモン、ブタ、ウナギカルシトニンの適切なInternational Reference Preparation（Ｉ．Ｒ．Ｐ．）によるものである。本発明の他の好ましい実施形態は、新規な化合物、より具体的には、ヒドロキシサルカトニンは、サルカトニン製剤の老化度、従って貯蔵寿命を測定するための選択的で実用的な指示薬又はマーカーとして有利に使用できることである。実際、サルカトニン溶液は、室温における酸素（Ｏ₂）の存在下でのその不安定性のために、段々と劣化し、かなりの量のヒドロキシサルカトニンを生成する。該溶液がＯ₂にさらされた場合、劣化の進行は非常に速く、量的に無節操に（i nconsistent）ヒドロキシサルカトニンを生成し、そのためヒドロキシサルカトニン含有量とサルカトニン製剤の老化度との間に何の関係も確立できない。これらの理由のため、劣化の進行を低下させるために、サルカトニン溶液の製造を飽和窒素雰囲気下（約１バール）で行うことが望ましい。物質を、冷却された温度条件下で貯蔵することも好ましい。サルカトニン製剤に関係する劣化の進行が直線的であることを確立するために、分析試験の条件は標準化され、実験試料は酸素含有量＜１ｐ.ｐ.ｍ.に調整され、４°〜８℃又は２２℃のいずれかの温度で別々に貯蔵される。このような条件下、意外にも、いったん、貯蔵期間中に生成するヒドロキシサルカトニンの量を本発明の合成ヒドロキシサルカトニンを参照標準として用いて分析的に測定すると、サルカトニン製剤の老化度、従って貯蔵寿命を測定できることが明らかにされた。事実、添付されたグラフ１は、サルカトニン製剤（アンプル１００Ｉ.Ｕ.／ｍｌ）の６つのバッチの異なる間隔におけるヒドロキシサルカトニンの含有量の分析を示し、製剤と上記参照標準の老化度が良い１次性を示し、従って、それらの貯蔵寿命を評価するのに実用的で適したパラメーターを意味する。ヒドロキシサルカトニンは、サルカトニン（バッチＮｏ．６Ｑ１、ＵＣＢ−バイオプロダクツ（UCB-Bioproducts）の商標，ベルギー）から合成される。該合成は、Ｈ₂Ｏ₂、過ギ酸、過塩素酸、Ｏ₃、クロラニル又はそれらの等価物のような適当な酸化剤を用いる酸化工程によるものであり、サルカトニンのシステイン１−７の間のジスルフィド架橋を開き、次いで好ましくは１位のシステインを酸化するためのものであるが、酸化された７位のシステインが少量得られてもよい。第一段階はフラスコで行われ、その中でサルカトニンを適した希釈酸に完全に溶解させ、酸化中に溶液が凝固するのを防ぐために、攪拌しながら無水メタノールを加える。サルカトニン溶液および酸化剤を、サイドアームがシールされた、ガラスで栓をした試験管の別々のアームに移す。試薬を、−７℃〜−１０℃の間（又は０℃）に保った浴中で３０分間冷却し、管を軽くたたくことにより混合する。反応を、同様の制御された温度において約２．５時間行う。次いで、得られたヒドロキシサルカトニンを、適当な樹脂を含有する慣用されている分離カラム（スフェリソーブ（Spherisorb）Ｃ₁₈、２５０ｘ４．６ｍｍ、５μ）上で精製し、いったん溶液をクロマトグラフにかけ、ヒドロキシサルカトニンを、サルカトニンと生成する可能性のある関連物質との混合物から分離し、アセトニトリルを溶媒として用いることにより合成アナローグを樹脂の対応箇所から移動させる。その後、アセトニトリルを、慣用されている方法を用いてヒドロキシサルカトニン含有溶液から完全に除去する。ヒドロキシサルカトニンを分析試験用の参照標準として使用するために、同一物の水の貯蔵溶液を調製し、約−８０℃にて凍結状態に保ち、凍結乾燥し、調製から６ヶ月以内に使用する。使用の直前に、凍結乾燥されたヒドロキシサルカトニンを、分析する試料のものと同じ適したビヒクルと混合し、適当な参照標準溶液を得る。次に、濃度が判っているこの標準を、ＨＰＬＣ／ＭＳシステムに注入し、検量グラフ（calibration graph）を得る。標準グラフと比較することにより試験製剤の正確な老化度を評価する目的で、上記グラフを、ピークを同定するため、及び、貯蔵されたサルカトニン溶液中のヒドロキシサルカトニンの量を測定するために後に用いる。分析測定を、“イオンスプレー（ion-spray）”イオン源を備えたパーキンエルマー質量分析計サイエックスＡＰＩ III（Perkin Elmer Mass Spectrometer S ciex API III）を用いて行う。該質量分析計は、パーキンエルマーＩＳＳ−１０１オートサンプラー（Perkin Elmer ISS-101 autosampler）を有するアプライドバイオシステムズ１４０ＡシリンジＨＰＬＣ（Applied Biosystems 140A syringe HPLC）に連結している。カラムを、ここに示すグラジエントを用いて溶出させる：（Ａ）アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Ｂ）水＋０．１％ＴＦＡ小口径カラムを、５０μｌ/ｍｉｎにて溶出させる。グラジエントは、１００％のＢ（１０’）の平らな条件より始まり、次いで最初の直線的段階になり、５’でＢが８０％となり、二番目の直線的段階になり、２０’でＢが５０％に達する；この状態を１５’維持する。小口径カラム上の分析を行うために、試験中のサルカトニン製剤の異なる試料を抽出又は洗浄工程を行わずに注入する；それぞれの注入量は、５００μｌである。参照標準については、注入は、凍結乾燥された生成物を使用直前に試料と同じ溶媒混合物に溶解して１００ｎｇ/ｍｌに調製した溶液と同じ量である。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、分割されることなく、小口径カラムでのクロマトグラフィーによる分離中、オンラインで行われる。ＭＳ分析は、走査型の方式により行われ、ｍ／ｚが４００〜２０００の範囲で正イオンを取得する。いくつかの試料を、アルゴンを衝突ガス（衝突ガス濃度３ｘ１０⁴ａｔｏｍｓ/ ｃｍ³）として用い、５０〜２００ｅＶの衝突エネルギーを用いてＭＳ／ＭＳ手法により分析する。より高感度で高精度のヒドロキシサルカトニンの定量的測定を得るために、上記生成物に特有のｍ／ｚ値を選んで、選択されたイオンモニタリングで機器を作動させる。上記分析試験の結果（グラフ１を見よ）は、いったん窒素雰囲気で調製され、制御された温度条件下で貯蔵されると、ヒドロキシサルカトニンは、サルカトニン溶液の老化度を評価するための最も重要で適した指示薬であること示す。実際、上記結果は、ヒドロキシサルカトニンの含有量と分析された試料の老化度との間の明瞭な直線性を明らかにする。本発明を、以下の実施例によりさらに説明するが、いかなる場合であっても、これらは説明のためにのみ提供されるものであって、多数の変形が当業者に明らかになるように、その意図又は範囲において本発明を限定して解釈するものでない。実施例１ヒドロキシサルカトニンの合成方法。サルカトニン２００ｍｇ（バッチＮｏ．６Ｑ１、ＵＣＢ−バイオプロダクト、ベルギー）を、ギ酸（９９％）５．０ｍｌ中に完全に溶解させ、その後無水メタノール１．０ｍｌを加えた。これとは別に、９９％ギ酸９．５ｍｌに３０％Ｈ₂Ｏ₂０．５０ｍｌを加えることにより過ギ酸を調製し、得られた溶液を栓をしたフラスコ中に室温（２５℃）で２時間放置した。該サルカトニン溶液及び過ギ酸を、サイドアームをシールした、ガラスで栓をした試験管の別々のアームに移した。両方の試薬を、−７℃〜１０℃に保った浴中で３０分間冷却し、管を軽くたたくことにより混合させた。反応を、一定の温度で約２．５時間行った。得られたヒドロキシサルカトニンを、以下の予備的方法を用いて精製した：装置：試料の注入のためのギルソンポンプ（モデル３０２）に連結した５０６０ＢバリアンＨＰＬＣ。カラム：スフェリソーブＣ₁₈、（２５０ｘ４．６ｍｍ、５μ）溶離液：Ａ）アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）Ｂ）水＋０．１％ＴＦＡによりつくられるグラジエント流量：１ｍｌ/ｍｉｎヒドロキシサルカトニンを、アセトニトリルを用いることによりカラムの関連箇所から移動させ、その後当該分野において既に周知の慣用されている方法により完全に除去した。得られた収率は、７２．７％であった。実施例２ヒドロキシサルカトニンのアンプル（０．０２ｍｇ／ｍｌ）５，０００本の調製。溶液１ｍｌは：ヒドロキシサルカトニン０．０２ｍｇ氷酢酸２．００ｍｇ酢酸ナトリウム三水和物２．００ｍｇ塩化ナトリウム７．５０ｍｇ注入用蒸留水１．００ｍｇを含有する。注入用蒸留水約４．５リットルを、予め蒸気により滅菌し、脱パイロジェンしたステンレス鋼の溶解用容器（dissolutor）に入れ、約８℃に冷却した。溶解用容器は、攪拌器を備えており、フィルターを通した無菌の窒素の導入により、制御された細菌状態に密封されている。酢酸ナトリウム三水和物及び氷酢酸を、成分が完全に溶解するまで一定で遅い攪拌の下で添加した。緩衝溶液のｐＨは、４．２±０．３の範囲であった。ヒドロキシサルカトニンの全量を、これとは別に、滅菌し、脱パイロジェンした２５ｍｌ三角フラスコに冷たい緩衝溶液約５ｍｌを導入することにより溶解させ、ヒドロキシサルカトニンの母溶液を得た。いったん、ヒドロキシサルカトニンを完全にヒドロキシサルカトニンの母溶液に溶解させ、一定の遅い攪拌の下、基礎溶液に加えた。注入可能な製剤用の残りの蒸留水を、溶解用容器に加え、５ｋｇの溶液を得、ｐＨ（ｐＨ４．２±０．３の間であること）を再び調べた。次いで、得られた溶液を、細孔サイズ０．４５μｍのプレカートリッジ（商標ポール）、次いで細孔サイズ０．２２μｍの二番目のカートリッジ（商標ポール）を用いて濾過することにより滅菌し、最後に自動的にそれぞれ１ｍｌを含有するアンプルに分割した。実施例３ヒドロキシサルカトニンの鼻内噴霧ボトル（０．９ｍｌ；０．０２ｍｇ/ｍｌ）２，０００個の製造１ｍｌの溶液は：ヒドロキシサルカトニン０．０２ｍｇクエン酸ナトリウム二水和物１２．３６ｍｇクエン酸一水和物１２．１１ｍｇタウロコール酸ナトリウム１０．００ｍｇエデト酸二ナトリウム１．００ｍｇ塩化ベンザルコニウム０．２３ｍｇ蒸留水１．００ｍｇを含有する。蒸留水１．０ｋｇを、フィルターを通した無菌の窒素の導入により、制御された細菌状態に密封されている滅菌ステンレス鋼容器に入れた。溶液（Ａ）を、これとは別に、蒸留水約０．５リットル中に：クエン酸ナトリウム二水和物２４．７２ｇクエン酸一水和物２４．２２ｇタウロコール酸ナトリウム２０．０ｇエデト酸二ナトリウム２．０ｇを含有するようにして調製した。いったん上記溶液を完全に溶解させると、ｐＨが３．６〜４．５の範囲であることを確かめ、溶解用容器に入れられる水に添加した。一定の遅い攪拌の下、塩化ベンザルコニウム０．４６ｇを加えた。ヒドロキシサルカトニンの全量を、これとは別に、メスフラスコに入った溶液（Ａ）５０ｍｌに溶解させ、ヒドロキシサルカトニンの母溶液を得た。いったんヒドロキシサルカトニンを完全に溶解させると、母溶液を一定の遅い攪拌の下で溶解用容器に加え、残りの水（約０．５リットル）を、容積２リットルになるまで入れた。得られた溶液を、滅菌フィルター（商標ポール、０．２２μ）を通して濾過し、自動充填操作によりそれぞれ溶液０．９ｍｌを含有する鼻内噴霧ボトルに詰めた。我々の発明のいくつかの形態だけが具体的に詳細に記載されてきたが、本発明の意図の範囲及び添付の請求の範囲の範囲内の全てにおける他の具体的な形態が実施されてもよく、多くの変化がなされてもよいであろうことは当業者にとって明らかである。実施例４デス−ｃｙｓ¹−サルカトニンアンプル（１ｍｌ、０．０５ｍｇ/ｍｌ）３，０００本の製造。１ｍｌの溶液は：デス−ｃｙｓ¹−サルカトニン０．０５ｍｇ塩化ナトリウム５．００ｍｇ酢酸ナトリウム２．００ｍｇ氷酢酸２．００ｍｇ注入用蒸留水１．００ｍｌを含有する。注入用蒸留水約２．５リットルを、蒸気により滅菌及び脱パイロジェンしたステンレス鋼の溶解用容器に入れ、約１２℃で冷却した。該溶解用容器は、攪拌器を備えており、フィルターを通した無菌の窒素（０．２２μｍのポールフィルターにより無菌にされている窒素）の導入により、制御された細菌状態を確実にするために、密封されている。完全に溶解するまでの一定で遅い攪拌の下で、塩化ナトリウム１５ｇ、酢酸ナトリウム６ｇ及び氷酢酸６ｇを加えた。溶液のｐＨは、約４．０であった。デス−ｃｙｓ¹−サルカトニン（１５０ｍｇ）を、これとは別に、殺菌し、脱パイロジェンした２５ｍｌ三角フラスコに、前もって調製された溶液約７．５ｍｌを入れることにより溶解させ、デス−ｃｙｓ¹−サルカトニンの母溶液を得、一定で遅い攪拌の下、より大きな溶液に加えた。注入可能な製剤用の残りの蒸留水を、溶解用容器に加えて３リットルの溶液を得、そのｐＨを（ｐＨ４．０±０．２であることを）再び確かめた。得られた溶液を、細孔サイズ０．４５μｍのプレカートリッジ（商標ポール）、次いで細孔サイズ０．２２μｍの二番目のカートリッジ（商標ポール）を用いて濾過することにより滅菌し、最後に通常のアンプル充填機器を用いて、自動的にそれぞれ１ｍｌを含有するアンプルに分割した。実施例５化合物１２の鼻内噴霧ボトル（１．３ｍｌ、０．０７ｍｇ/ｍｌ）４，０００個の製造。１ｍｌの溶液は：化合物１２０．０７ｍｇ塩化ナトリウム６．００ｍｇクエン酸ナトリウム二水和物４．６３ｍｇクエン酸一水和物３．００ｍｇｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル１．３０ｍｇｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル０．２０ｍｇ酢酸ナトリウム１．００ｍｇアルキルアミドプロピルベタイン０．２０ｍｇ（alkylamidopropylbetain）二回蒸留水（Bidistilled water）１．００ｍｌを含有する。二回蒸留水（２．６リットル）を、制御された細菌状態を保持するためにフィルターを通した無菌の窒素を導入している密封された滅菌ステンレス鋼容器に入れた。溶液（Ａ）を、これとは別に、二回蒸留水約１．３リットル中に：塩化ナトリウム３１．２０ｇクエン酸ナトリウム二水和物２４．０７ｇクエン酸一水和物１５．６０ｇ酢酸ナトリウム５．２０ｇを含有するようにして調製した。上記溶液の調製後、ｐＨが４．２±０．５の範囲であることを確認し、溶解用容器に入れられる蒸留水に加えた。一定の遅い攪拌の下、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル６．７６ｇ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル１．０４ｇ及びアルキルアミドプロピルベタイン１．０４ｇを添加した。化合物１２（３６４ｍｇ）を、これとは別に、メスフラスコに入った溶液（Ａ）４５５ｍｌに溶解させ、化合物１２の母溶液を得、一定で遅い攪拌の下、溶解用容器に加えた。残りの水（約８４５ｍｌ）を入れ、５．２リットルの溶液を得た。得られた溶液を、滅菌フィルター（商標ポール、０．２２μｍ）を通して濾過し、通常の自動充填器を用いてそれぞれ１．３ｍｌの溶液を含有する鼻内噴霧ボトルに分配した。実施例６合成ヒドロキシサルカトニンを劣化の進行の指示薬として用いた、（４°〜８ ℃の温度で貯蔵された）サルカトニン製剤の老化のクロマトグラフィーによる分析的測定。実施例１で示したようにして既に合成された凍結乾燥ヒドロキシサルカトニン１００ｎｇを、蒸留水１０ｍｌに溶解させることにより、濃度１０ｎｇ/ｍｌの純粋なヒドロキシサルカトニンの参照標準溶液を調製する。抽出又は浄化工程を行わずに、試験中のサルカトニン製剤をそのまま用いる。用いるＨＰＬＣ/ＭＳシステムは、以下の通りである：ＨＰＬＣ装置：パーキンアイマーＩＳＳ−１０１オートサンプラー（Perkin Ime r ISS-101 autosampler）を備えたアプライドバイオシステムズ１４０ＡシリンジＨＰＬＣ溶出液：（Ａ）アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸（Ｂ）水＋０．１％トリフルオロ酢酸流速：５０μｌ/ｍｉｎ．注入量５００μｌＭＳ装置：オンスプレーイオン源を備えたパーキンエルマー質量分析計サイエックスＡＰＩ III。 m/z範囲：４００〜２０００ｍ／ｚ衝突ガス：アルゴン衝突ガスの濃度：１０⁴ ａｔｏｍ/ｃｍ³ 衝突エネルギー５０〜２００ｅＶＨＰＬＣ/ＭＳの検討から、試験されたサルカトニン製剤は、参照標準と比較して１．４６％の全ヒドロキシサルカトニンの含有量を示した。劣化の進行の指示薬としてヒドロキシサルカトニンの総含有量の上記数値を用いることにより、検量グラフ１上で、試験されるサルカトニン製剤の老化度を１２ヶ月の範囲内で決定することが可能である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１月２２日【補正内容】明細書カルシトニンサーモンアナローグ、その製造、医薬用途及び分析用試薬としての用途本発明は、新規な置換されたサーモンカルシトニン（サルカトニン（salcaton in））アナローグに関する。より具体的には、本発明は、骨粗鬆症、高カルシウム血症、パジェット病のような疾患の予防又は治療のために、分析的試験のための参照として有用なサルカトニンアナローグ並びにその製造法及びその用途に関する。低カルシウム血の性質を有するサルカトニン及びその製造は、下記の文書に開示されている：先行技術文献は全て、低カルシウム血の性質を有するカルシトニンサーモン（サルカトニン）の原料及びその製に関する。カルシトニンサーモンの分子は、１位のシステインと７位のシステインのＳ− Ｓ架橋により特徴付けられる。本発明の出願人は、驚くべきことに、１位と７位の間のジスルフィド架橋を切り、種々の置換基が導入され得るカルシトニンサーモン分子のアナローグは、低カルシウム血活性が極めて優れており、分析用試薬として用いることができることを見出した。低カルシウム血症薬として有用な、３１又は３２のアミノ酸に置換されている本発明の新規なサルカトニンアナローグは、下記式により表される：（式中、Ｒ₁は、−Ｃｙｓ−ＳＨ若しくはＣｙｓ−Ｓ−ＯＨ：又は−Ｃｙｓ−エーテル若しくは−Ｃｙｓ−Ｓ−エステル（エーテル若しくはエステルは、２〜５個の炭素原子を有する）若しくはその薬学的に許容される塩若しくは異性体を示す；Ｒ₂は、−Ｈ、−ＯＨ、２〜５個の炭素原子を有するエステル若しくはエーテル又はその薬学的に許容される塩若しくは異性体を示す。）好ましいＲ₁及びＲ₂を下記に示す：化合物１及び２又はその混合物を、慣用的に、以下、ヒドロキシサルカトニンと定義する。本発明の好ましい実施形態は、 (i) Ｒ₁が、−Ｃｙｓ−Ｓ−ＯＨ若しくはエステルの場合、Ｒ₂が水素原子、又は (ii) Ｒ₂＝−ＯＨ若しくはエステルの場合、Ｒ₁が−Ｃｙｓ−Ｈである。本発明は、好適な無機又は有機酸のいずれの薬学的に許容される塩も含む。好適な無機酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸である。好適な有機酸は、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸及びマレイン酸等のカルボン酸を含む。上記塩は、既に当業者に周知の慣用されている方法により調製できる。驚くべきことに、本発明化合物が生理的又は病的な骨の再吸収を阻害し、低カルシウム血症薬として有用であることが今や見出された。実際、骨の再吸収の阻害は、ヒドロキシプロリンの尿排泄の減少により測定され、それは、アルカリ性ホスファターゼの高くて病的な血清レベルの低下及びカルシウムバランスの正常化と関連し、コラーゲン及び骨組織を再構築（rebuilding）し、数ヶ月の治療後にＣａ²⁺ の全血液含量を低下させるのを促進する。さらに、サルカトニンアナローグは、鎮痛作用を発揮し、痛みの一部又は全てを減少させる。サルカトニンアナローグは、パジェット症（変形性骨炎）、ガンにより引き起こされる高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、ビタミンＤ中毒、いずれも緊急の治療を要しかつ長引くものであり、異なる原因による骨粗鬆症に必要に応じてそれぞれ不健康な状態及びズーデック症に特異的な関連する他の治療と組み合わせて使用され得る。サルカトニンアナローグの薬理学的活性を評価するために、BP（英国薬局方（ British Pharmacopoeia））1993 Volume I，587頁に示されているように、３つの異なる投与量（８ｍＩ.Ｕ.／ｒａｔ，１６ｍＩ.Ｕ.／ｒａｔ，３２ｍＩ.Ｕ .／ｒａｔ）を用いて生物学的アッセイによる予備的スクリーニングを行い、ここに報告される、３つの測定の平均値により表された以下の結果を得た。本発明化合物は、非経口経路により投与可能な溶液若しくは懸濁液のような液剤、鼻内噴霧又は直腸カプセルとして調剤されるのが有利である。注射可能な剤形は、上記化合物の適当な薬学的キャリヤー溶液又は懸濁液であり、該キャリヤーは、他の薬学的に許容される賦形剤又はアジュバントを伴う又は伴わない殺菌された水などの液体である。鼻内噴霧として使用するために、本発明のサルカトニンアナローグの溶液又は懸濁液を、使いやすい賦形剤を伴う又は伴わない水性製剤として調剤し、加圧された吸入器又は噴霧若しくは霧化する投与ポンプを備えた適当な容器に詰めてもよい。ここに記載される新規な化合物の推奨される１日の投与量は、活性アナローグの効果的な量を単位量中に供給するために、１０１.Ｕ.〜４００Ｉ.Ｕ.、さらに好ましくは、１００Ｉ．Ｕ．〜２００Ｉ．Ｕ．の広い範囲で量的に変わり得る。ここで用いられているように、“Ｉ.Ｕ.”という用語は、Blanche Lane，South Mimms，Potters Bar，Hertfordshire，E6 30G，U.K. の the National Institute for Biological Standards and Control により確立されたヒト、サーモン、ブタ、ウナギカルシトニンの適切なInternational Re ference Preparation（Ｉ．Ｒ．Ｐ．）によるものである。本発明の他の好ましい実施形態は、新規な化合物、より具体的には、ヒドロキシサルカトニンは、サルカトニン製剤の老化度、従って貯蔵寿命を測定するための選択的で実用的な指示薬又はマーカーとして有利に使用できることである。実際、サルカトニン溶液は、室温における酸素（Ｏ₂）の存在下でのその不安定性のために、段々と劣化し、かなりの量のヒドロキシサルカトニンを生成する。該溶液がＯ₂にさらされた場合、劣化の進行は非常に速く、ヒドロキシサルカトニンが量的に著しく変わりやすく（不定に）生成され、そのためヒドロキシサルカトニン含有量とサルカトニン製剤の老化度との間に何の関係も確立できない。これらの理由のため、劣化の進行を低下させるために、サルカトニン溶液の製造を飽和窒素雰囲気下（約１ｘ１０⁵Ｐａ（１バール））で行うことが望ましい。物質を、冷却された温度条件下で貯蔵することも好ましい。サルカトニン製剤に関係する劣化の進行が直線的であることを確立するために、分析試験の条件は標準化され、実験試料は酸素含有量＜１ｐ.ｐ.ｍ.に調整され、４°〜８℃又は２２℃のいずれかの温度で別々に貯蔵される。このような条件下、意外にも、いったん、貯蔵期間中に生成するヒドロキシサルカトニンの量を本発明の合成ヒドロキシサルカトニンを参照標準として用いて分析的に測定すると、サルカトニン製剤の老化度、従って貯蔵寿命を測定できることが明らかにされた。事実、添付されたグラフ１は、サルカトニン製剤（アンプル１００Ｉ.Ｕ.／ｍｌ）の６つのバッチの異なる間隔におけるヒドロキシサルカトニンの含有量の分析を示し、製剤と上記参照標準の老化度が良い１次性を示し、従って、それらの貯蔵寿命を評価するのに実用的で適したパラメーターを意味する。ヒドロキシサルカトニンは、サルカトニン（バッチＮｏ．６Ｑ１、ＵＣＢ−バイオプロダクツ（UCB-Bioproducts）の商標，ベルギー）から合成される。該合成は、Ｈ₂Ｏ₂、過ギ酸、過塩素酸、Ｏ₃、クロラニル又はそれらの等価物のような適当な酸化剤を用いる酸化工程によるものであり、サルカトニンのシステイン１−７の間のジスルフィド架橋を開き、次いで好ましくは１位のシステインを酸化するためのものであるが、酸化された７位のシステインが少量得られてもよい。第一段階はフラスコで行われ、その中でサルカトニンを適した希釈酸に完全に溶解させ、酸化中に溶液が凝固するのを防ぐために、攪拌しながら無水メタノールを加える。サルカトニン溶液および酸化剤を、サイドアームがシールされた、ガラスで栓をした試験管の別々のアームに移す。試薬を、−７℃〜−１０℃の間（又は０℃）に保った浴中で３０分間冷却し、管を軽くたたくことにより混合する。反応を、同様の制御された温度において約２．５時間行う。次いで、得られたヒドロキシサルカトニンを、適当な樹脂を含有する慣用されている分離カラム（スフェリソーブ^TM（Spherisorb^TM）Ｃ₁₈、２５０ｘ４．６ｍｍ、５μ）上で精製し、いったん溶液をクロマトグラフにかけ、ヒドロキシサルカトニンを、サルカトニンと生成する可能性のある関連物質との混合物から分離し、アセトニトリルを溶媒として用いることにより合成アナローグを樹脂の対応箇所から移動させる。その後、アセトニトリルを、慣用されている方法を用いてヒドロキシサルカトニン含有溶液から完全に除去する。ヒドロキシサルカトニンを分析試験用の参照標準として使用するために、同一物の水の貯蔵溶液を調製し、約−８０℃にて凍結状態に保ち、凍結乾燥し、調製から６ヶ月以内に使用する。サルカトニン２００ｍｇ（バッチＮｏ．６Ｑ１、ＵＣＢ−バイオプロダクト、ベルギー）を、ギ酸（９９％）５．０ｍｌ中に完全に溶解させ、その後無水メタノール１．０ｍｌを加えた。これとは別に、９９％ギ酸９．５ｍｌに３０％Ｈ₂Ｏ₂０．５０ｍｌを加えることにより過ギ酸を調製し、得られた溶液を栓をしたフラスコ中に室温（２５°Ｃ）で２時間放置した。該サルカトニン溶液及び過ギ酸を、サイドアームをシールした、ガラスで栓をした試験管の別々のアームに移した。両方の試薬を、−７℃〜１０℃に保った浴中で３０分間冷却し、管を軽くたたくことにより混合させた。反応を、一定の温度で約２．５時間行った。得られたヒドロキシサルカトニンを、以下の予備的方法を用いて精製した：装置：試料の注入のためのギルソンポンプ（モデル３０２）に連結した５０６０ＢバリアンＨＰＬＣ。カラム：スフェリソーブ^TMＣ₁₈、（２５０ｘ４．６ｍｍ、５μ）溶離液：Ａ）アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）Ｂ）水＋０．１％ＴＦＡによりつくられるグラジエント流量：１ｍｌ/ｍｉｎヒドロキシサルカトニンを、アセトニトリルを用いることによりカラムの関連箇所から移動させ、その後当該分野において既に周知の慣用されている方法により完全に除去した。得られた収率は、７２．７％であった。いったんヒドロキシサルカトニンを完全に溶解させると、母溶液を一定の遅い攪拌の下で溶解用容器に加え、残りの水（約０．５リットル）を、容積２リットルになるまで入れた。得られた溶液を、滅菌フィルター（商標ポール、０．２２μ）を通して濾過し、自動充填操作によりそれぞれ溶液０．９ｍｌを含有する鼻内噴霧ボトルに詰めた。実施例４化合物１２の鼻内噴霧ボトル（１．３ｍｌ、０．０７ｍｇ/ｍｌ）４，０００個の製造。１ｍｌの溶液は：化合物１２０．０７ｍｇ塩化ナトリウム６．００ｍｇクエン酸ナトリウム二水和物４．６３ｍｇクエン酸一水和物３．００ｍｇｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル１．３０ｍｇｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル０．２０ｍｇ酢酸ナトリウム１．００ｍｇアルキルアミドプロピルベタイン０．２０ｍｇ（alkylamidopropylbetain）二回蒸留水（Bidistilled water）１．００ｍｌを含有する。二回蒸留水（２．６リットル）を、制御された細菌状態を保持するためにフィルターを通した無菌の窒素を導入している密封された滅菌ステンレス鋼容器に入れた。溶液（Ａ）を、これとは別に、二回蒸留水約１．３リットル中に：塩化ナトリウム３１．２０ｇクエン酸ナトリウム二水和物２４．０７ｇクエン酸一水和物１５．６０ｇ酢酸ナトリウム５．２０ｇを含有するようにして調製した。上記溶液の調製後、ｐＨが４．２±０．５の範囲であることを確認し、溶解用容器に入れる蒸留水に加えた。一定の遅い攪拌の下、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル６．７６ｇ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル１．０４ｇ及びアルキルアミドプロピルベタイン１．０４ｇを添加した。化合物１２（３６４ｍｇ）を、これとは別に、メスフラスコに入った溶液（Ａ）４５５ｍｌに溶解させ、化合物１２の母溶液を得、一定で遅い攪拌の下、溶解用容器に加えた。残りの水（約８４５ｍｌ）を入れ、５．２リットルの溶液を得た。得られた溶液を、滅菌フィルター（商標ポール、０．２２μｍ）を通して濾過し、通常の自動充填を用いてそれぞれ１．３ｍｌの溶液を含有する鼻内噴霧ボトルに分配した。我々の発明のいくつかの形態だけが具体的に詳細に記載されてきたが、本発明の意図の範囲及び添付の請求の範囲の範囲内の全てにおける他の具体的な形態が実施されてもよく、多くの変化がなされてもよいであろうことは当業者にとって明らかである。実施例５合成ヒドロキシサルカトニンを劣化の進行の指示薬として用いた、（４°〜８ ℃の温度で貯蔵された）サルカトニン製剤の老化のクロマトグラフィーによる分析的測定。実施例１で示したようにして既に合成された凍結乾燥ヒドロキシサルカトニン１００ｎｇを、蒸留水１０ｍｌに溶解させることにより、濃度１０ｎｇ/ｍｌの純粋なヒドロキシサルカトニンの参照標準溶液を調製する。請求の範囲１．式：（式中、Ｒ₁は、−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｈ若しくは−Ｃｙｓ−Ｓ−ＯＨ又は−Ｃｙｓ− Ｓ−エステル若しくは−Ｃｙｓ−Ｓ−エーテル（エステル若しくはエーテルは、２〜５個の炭素原子を有する）若しくはその薬学的に許容される塩若しくはその異性体を示し、Ｒ₂は、水素若しくはヒドロキシ又は２〜５個の炭素原子を有するエステル若しくはエーテル若しくはその薬学的に許容される塩若しくはその異性体を示す。）で表されるサルカトニンアナローグ。２．Ｒ₁及びＲ₂が以下：から選ばれる請求項１に記載のアナローグ。３．請求項１又は２に記載のアナローグを含有する薬学的製剤。４．アナローグが、適当な薬学的キャリアーの溶液又は懸濁液に含まれる請求項３に記載の薬学的製剤。５．さらに、滅菌水、他の滅菌された液体、薬学的に許容される賦形剤若しくはアジュバント又はそれらの２以上の組合せを含有する請求項４に記載の薬学的製剤。６．適当な試薬と無水メタノールの存在下で、−１０℃から２０℃の範囲の温度において約２．５時間サルカトニンを酸化し、次いで精製することを含む請求項１又は２に記載のアナローグの製造方法。７．適当な試薬が、Ｈ₂Ｏ₂、過ギ酸、過塩素酸、Ｏ₃、クロラニル又はこれらの２以上の組合せである請求項６に記載の方法。８．生理的又は病的な骨の再吸収の阻害に用いられる請求項１若しくは２に記載のアナローグ又は請求項３〜５のいずれかに記載の製剤。９．低カルシウム血症薬として使用される請求項１若しくは２に記載のアナローグ又は請求項３〜５のいずれかに記載の製剤。１０．一日の投与量が１０Ｉ.Ｕ．〜４００Ｉ.Ｕ．である請求項８又は請求項９に記載のアナローグ又は製剤。１１．一日の投与量が１００Ｉ.Ｕ．〜２００Ｉ.Ｕ．である請求項１０に記載のアナローグ又は製剤。１２．請求項１又は２に記載のアナローグを参照標準として用いる、サルカトニン製剤中のヒドロキシサルカトニン含有量の測定方法。１３．クロマトグラフィーによる分析試験である請求項１２に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/74 33/74 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＤＤ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ベロネージアンナマリアイタリア国アイ−06083 バスティアウンブラ（ペルージア）ビアプグリー 15

Claims

【特許請求の範囲】１．式：（式中、Ｒ₁は、−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｈ若しくは−Ｃｙｓ−Ｓ−ＯＨ又は−Ｃｙｓ− Ｓ−エステル若しくは−Ｃｙｓ−Ｓ−エーテル（エステル若しくはエーテルは、２〜５個の炭素原子を有する）若しくはその薬学的に許容される塩若しくはその異性体を示し、Ｒ₂は、水素若しくはヒドロキシ又は２〜５個の炭素原子を有するエステル若しくはエーテル若しくはアセトアミドメチル若しくはその薬学的に許容される塩若しくはその異性体を示す。）で表されるサルカトニンアナローグ。２．Ｒ₁及びＲ₂が以下：から選ばれる請求項１に記載のアナローグ。３．請求項１又は２に記載のアナローグを含有する薬学的製剤。４．アナローグが、適当な薬学的キャリアーの溶液又は懸濁液に含まれる請求項３に記載の薬学的製剤。５．さらに、滅菌水、他の滅菌された液体、薬学的に許容される賦形剤若しくはアジュバント又はそれらの２以上の組合せを含有する請求項４に記載の薬学的製剤。６．適当な試薬と無水メタノールの存在下で、−１０℃から２０℃の範囲の温度において約２．５時間サルカトニンを酸化し、次いで精製することを含む請求項１又は２に記載のアナローグの製造方法。７．適当な試薬が、Ｈ₂Ｏ₂、過ギ酸、過塩素酸、Ｏ₃、クロラニル又はこれらの２以上の組合せである請求項６に記載の方法。８．生理的又は病的な骨の再吸収の阻害に用いられる請求項１若しくは２に記載のアナローグ又は請求項３〜５のいずれかに記載の製剤。９．低カルシウム血症薬として使用される請求項１若しくは２に記載のアナローグ又は請求項３〜５のいずれかに記載の製剤。１０．一日の投与量が１０Ｉ.Ｕ．〜４００Ｉ.Ｕ．である請求項８又は請求項９に記載のアナローグ又は製剤。１１．一日の投与量が１００Ｉ.Ｕ．〜２００Ｉ.Ｕ．である請求項１０に記載のアナローグ又は製剤。１２．請求項１又は２に記載のアナローグを参照標準として用いる、サルカトニン製剤中のヒドロキシサルカトニン又はデス−ｃｙｓ¹−サルカトニン含有量の測定方法。１３．クロマトグラフィーによる分析試験である請求項１２に記載の方法。１４．実施例１に関して実質的に前述されたサルカトニンアナローグ。１５．実施例１に関して実質的に前述されたサルカトニンアナローグの製造方法。１６．実施例２又は実施例３に関して実質的に前述された薬学的製剤の製造方法。１７．図１に関して実質的に前述されたヒドロサルカトニン又はデス−ｃｙｓ¹ −サルカトニン含有量の測定方法。