JPH08506340A

JPH08506340A - 第４級アミン界面活性剤及びｒｎａの単離におけるその利用法

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Publication number: JPH08506340A
Application number: JP6518065A
Authority: JP
Inventors: ドナルド・イーマクフアーレイン，
Original assignee: ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン
Priority date: 1993-02-01
Filing date: 1994-01-12
Publication date: 1996-07-09
Anticipated expiration: 2020-02-02
Also published as: US5728822A; WO1994018156A1; US5985572A; AU6230594A; JP3615545B2

Abstract

(57)【要約】本発明は選ばれた第４級アミン界面活性剤を用いて生物学的試料、さらに具体的には血液からＲＮＡを単離するための新規な方法を開示する。ＲＮＡは迅速に、及び逆転写酵素及びポリメラーゼ連鎖反応を含む方法による分析を可能にするのに十分な量及び質で単離される。

Description

【発明の詳細な説明】第４級アミン界面活性剤及びＲＮＡの単離におけるその利用法発明の分野本発明は一般的に血液及び他の生物学的試料からのリボ核酸の単離に関し、さらに具体的には新規な第４級アミン界面活性剤を用いた単離法に関する。発明の背景分子生物学の分野における研究は、細胞の遺伝的起源及び機能的活性がそのリボ核酸（ＲＮＡ）の研究から推論できることを明らかにした。この情報は臨床業務において、感染症の診断のために、癌遺伝子を発現する細胞の検出のために、家族性疾患の検出のために、宿主防御機構の状態の監視のために、及びＨＬＡ型又は他の同一性のマーカーの決定のために用いることができる。ＲＮＡの単離のための現在の方法は、細胞を崩壊させ、ＲＮＡを溶液中に放出させ、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）からＲＮＡを保護する多様な方法を含む。その後ＲＮＡは、ＲＮＡと共に可溶化されているＤＮＡ及びタンパク質から分離される。同時に細胞を溶解し、ＲＮＡを可溶化し、リボヌクレアーゼを阻害するための強力なカオトロピズム的グアニジニウムの塩の利用はＣｈｉｒｇｗｉｎｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８：５２９４−５２９９（１９７９）に記載された。他の方法は、相分離のためにクロロホルムを用い、酸性ｐＨにおいてフェノールを用いた抽出により、汚染タンパク質及びＤＮＡから可溶化されたＲＮＡを遊離させる［Ｄ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１５２：３３−４１（１９８７）］。通常用いられるＲＮＡの１段階単離は、４Ｍのグアニジニウムイソチオシアナート中で細胞をホモジナイズし、その後酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、フェノール及びクロロホルム／イソアミルアルコールを順に加えることを含む。遠心の後、ＲＮＡはアルコールの添加により上層から沈澱する［Ｐ．ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉａｎｄＮ．Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９（１９８７）及び“ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＲＮＡ”於ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ４．２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１４），ｅｄ．Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ，（１９９１）］。通常はあまり用いられない方法は、細胞懸濁液への熱フェノールの添加、及びその後のアルコール沈澱［Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）］；細胞の溶解及び細胞質ＲＮＡの遊離のためのアニオン性又は非イオン性界面活性剤の利用；ならびにバナジルリボシド複合体及びジエチルピロカーボネートなどのリボヌクレアーゼの阻害剤の利用［Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｓｅｔａｌ，“ＧｕａｎｉｄｉｎｅＩｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＴｏｔａｌＲＮＡ”及び“ＲＮＡＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：ＭｉｎｉＭｅｔｈｏｄ”於ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．１３０−１３８（１９９１）］を含む。米国特許第４級，８４３，１５５号、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉは、酸性ｐＨにおいて安定なフェノールとグアニジニウム塩の混合物を細胞に加える方法を記載している。クロロホルムを用いた相分離の後、水相のＲＮＡをアルコールを用いた沈澱により回収する。細胞を溶解し、同時にＲＮＡ及びＤＮＡを溶液から沈澱させるカチオン性界面活性剤の能力は、米国特許第５，０１０，１８３号においてＭａｃｆａｒｌａｎｅにより記載された。’１８３号特許の方法は、その第１段階がＲＮＡを不溶性とするが、上記の方法の場合は第１段階がＲＮＡを可溶化することであるという点で上記の方法と基本的に異なる。’１８３号特許の好ましい実施態様の場合、界面活性剤であるベンジルジメチル−ｎ−ヘキサデシルアンモニウムクロリドの２％溶液を４０％のウレア及び他の添加剤と共に細胞懸濁液に加え、混合物を遠心する。ペレットをエタノールに再懸濁させ、そこからＲＮＡ及びＤＮＡを塩の添加により沈澱させる。この方法を血液に適用する試みにおいて、発明者は、後者の界面活性剤及び他の商業的に入手可能な界面活性剤の使用がＲＮＡの不十分な沈澱及び血液細胞の不完全な溶解を生ずることを見いだした［下記の表Ｉ及びＩＩを参照］。この目的のための改良されたカチオン性界面活性剤が必要である。血液中のＲＮＡの分析のための現在の方法は増幅法（ポリメラーゼ連鎖反応を含む）を用い、少量で存在するＲＮＡの特定の配列の存在を検出することができる。白血球細胞におけるＲＮＡの研究を望む研究者等は、これらの細胞を遠心法（典型的にフィコール／ヘパック（Ｆｉｃｏｌｌ／ｈｙｐａｑｕｅ）の勾配を介して）により血液から分離し、次いで上記の方法の１つを適用して細胞を単離する傾向がある。かくして全血からのＲＮＡの単離のための確立された方法はない。同様に、ウィルスの研究を望む研究者等は、そのような方法を用いて血漿からウィルスＲＮＡを分離することができる。これらの既知の方法の観点からでも、臨床業務におけるＲＮＡの利用は、ＲＮＡがリボヌクレアーゼなどのヌクレアーゼにより分解される前に細胞中のタンパク質及びＤＮＡからＲＮＡを分離する困難さにより妨げられている。リボヌクレアーゼ及び他のヌクレアーゼは、非保護ＲＮＡを数秒以内に破壊するのに十分な量で血液中に存在する。細胞からのＲＮＡの単離のための成功できる方法は、ヌクレアーゼによるＲＮＡの加水分解を防ぐことができなければならない。当該分野においてまだ、単離されたＲＮＡを臨床研究において用いることができるようにＲＮＡの加水分解及び分解を最少とする、血液、他の液体及び細胞からＲＮＡを単離するための簡単な方法が必要とされている。発明の概略１つの態様において本発明は、選ばれた第４級アミンを含む水性カチオン性界面活性剤溶液の利用を伴う、血液を初めとする生物学的試料からＲＮＡを単離するための新規な方法を提供する。選ばれた第４級アミンは第４級アミンヒドロキシドとリン酸、硫酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸及びクエン酸より成る群からの酸の反応を介して製造される。第４級アミンはアシル基の炭素数が１２、１４、１６又は１８であるアシルトリメチルアンモニウム又はアシルベンジルジメチルアンモニウムであるのが好ましい。さらに別の態様は、前記方法により生成される界面活性剤−核酸複合体からのＲＮＡの回収を含む上記の方法に対する改良を含む。この回収段階は、グアニジニウム塩又は熱ホルムアミドを用いた複合体の可溶化を伴うことができる。別の場合、複合体をエタノール及び塩、又は塩化リチウムの濃水溶液で処理することにより界面活性剤を核酸との会合から抽出し、ＲＮＡを不溶性として残すことができる。他の態様において本発明は、本明細書に記載の少なくとも１種の界面活性剤水溶液を含む、生物学的試料からＲＮＡを単離し、精製するためのキットを提供する。さらに別の態様において本発明は、第４級アミンヒドロキシドとリン酸、硫酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸及びクエン酸より成る群から選ばれる酸の反応により製造される選ばれた第４級アミン塩を含んでなる、生物学的試料からのＲＮＡの抽出に有用な新規な界面活性剤溶液を提供する。本発明の他の態様及び利点は、その好ましい実施態様に関する以下の詳細な説明においてさらに記載する。発明の詳細な記述本発明は選ばれた第４級アミンを含んでなる選ばれた新規なカチオン性界面活性剤を用いた、生物学的試料からのＲＮＡの単離のための方法を提供し、その方法は先行技術の方法に勝る有意な利点を特徴とする。１．本発明の界面活性剤本発明の新規な第４級アミン界面活性剤は下記の式：［式中、Ｒ１〜Ｒ４は独立して炭素数が１〜２０のアルキル鎖及び炭素数が６〜２６のアリール基から選ばれる］により特徴づけられる。適したアリール基はフェニル、低級アルキル−置換ベンジル、及び／又はハロゲン化ベンジルである。第４級アミン界面活性剤の現在好ましいアニオン、すなわち式ＩのＸ^-はホスフェートサルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートである。本発明のＲＮＡ単離法で用いるのに現在好ましい第４級アミン界面活性剤には、アシル基の長さが１２、１４又は１６炭素数であるアシルトリメチルアンモニウムの蓚酸、マロン酸及びコハク酸塩が含まれる。現在最も好ましい界面活性剤はアシル基の長さが１４炭素数であるアシルトリメチルアンモニウムの蓚酸塩である。そのような利用のための他の好ましい第４級アミン界面活性剤にはアシル基の長さが１２、１４、１６又は１８炭素数であるアシルベンジルジメチルアンモニウムの硫酸、リン酸、蟻酸、酢酸及びプロピオン酸塩が含まれる。ヘキサデシルベンジルジメチルアンモニウムの蟻酸、酢酸及びリン酸塩として特徴づけられる式Ｉの界面活性剤も望ましい。本発明の方法において有用な新規なカチオン性界面活性剤は以下の通りにして得ることができる：商業的に入手できる水中の約５〜３０重量／体積％の界面活性剤ハライドを出発材料として用いる。界面活性剤ハライドは水中で約１５％ｗｔ／ｖであるのが好ましい。ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．から、例えばテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含む複数の商業的に入手できる第４級アンモニウムハライドがこの目的のために利用できる。界面活性剤ハライドは、Ｄｏｗｅｘ１（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ）などのヒドロキシド形態に調製されたアニオン交換樹脂に通過させることによりヒドロキシドに変換される。第４級アミンニウムハライドがこのカラムクロマトグラフィー段階を通過すると、樹脂上のヒドロキシル基はハライドイオンに交換される。得られるテトラデシルトリメチルアンモニウムヒドロキシドなどの界面活性剤ヒドロキシドを滴定により検定する。次いで第４級アンモニウムヒドロキシドをリン酸、硫酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸及びクエン酸から成る群より選ばれる酸の添加によりそれと合わせ、それにより中和する。当該技術分野における熟練者は、中和するための選ばれた酸の量を容易に調節することができる。得られる第４級アミン界面活性剤は上記に示した式を有する。ＲＮＡの単離における本発明の方法で用いる場合、新規な界面活性剤は約０．０１〜０．２モルの濃度における、４〜８のｐＨの水溶液の状態である。別の場合、特にＲＮＡ単離法における第４級アミン界面活性剤としてアシルベンジルジメチルアミンニウム塩が用いられる場合、５０ｍＭ過剰の酸を加えるのが有利である。下記の方法において用いるのに特に望ましい式Ｉの新規な界面活性剤溶液は、以下のようにも特徴づけられる。界面活性剤溶液は過度に粘性でなく、すなわち２ｃｐより低い。界面活性剤溶液は典型的保存条件下、すなわち約０〜３０Ｃにおいて約１カ月の保存期間、結晶化しない。さらに界面活性剤が下記のＲＮＡ単離法の過程で血液に加えられ、混合物が遠心される場合、得られるペレットは本方法で用いられる血液の体積に対して小体積であり、暗色ではない。さらにペレットは相当な割合、すなわち約３０％より大きい割合の、血液中に内在する、又は血液と同時に界面活性剤に加えられたＲＮＡを含む。ペレットはヘモグロビン又はその誘導体などの物質を、下記のようなＲＮＡの回収後にＲＮＡの検出に用いられる逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ又は他の酵素の作用を阻害しそうな量で含まない。上記の基準を用い、当該技術分野における熟練者は、本発明のＲＮＡ単離法の実行に有用な多様な式Ｉの新規界面活性剤を得ることができるであろう。これらの式Ｉの新規な界面活性剤は一般的界面活性剤に共通の他の用途を有することもでき、その用途は当該技術分野における熟練者に容易に明らかとなる。２．本発明のＲＮＡ単離法本発明の方法では、生物学的試料を上記の本発明の選ばれたカチオン性界面活性剤溶液と混合する。本発明に従う試料と界面活性剤の接触により試料中の細胞の溶解、及び溶解された細胞からの、界面活性剤との複合体としてのＲＮＡの沈澱が実質的に同時に起こる。沈澱したＲＮＡはカオトロピズム塩及び場合によりフェノール抽出により、あるいはホルムアミド緩衝液により複合体から抽出することができる。別の場合、界面活性剤を可溶化することにより複合体を解離させ、ＲＮＡを不溶性として残し、それによりＲＮＡの高い収率を与えることができる。界面活性剤は、塩化リチウムの濃水溶液で複合体を処理することにより可溶化することができる。好ましい濃度は約２モル〜６モルの塩化リチウムである。複合体を解離させ、界面活性剤を可溶化させる他の処理は、例えば酢酸ナトリウム又は塩化リチウムなどの塩のエタノール性溶液である。ＲＮＡはさらにアルコール沈澱又はカラムクロマトグラフィーにより単離される。これらの方法は下記でより詳細に議論する。本明細書を通じて用いられる“生物学的試料”という用語は、全血、血漿、血清、尿、組織、細胞及び他の体液を含む。本明細書で用いられる“ＲＮＡ”は転移（ｔ）ＲＮＡ、リボソーム（ｒ）ＲＮＡ及びメッセンジャー（ｍ）ＲＮＡを含む。本発明の方法は生物学的試料、特に血液からのＲＮＡ抽出のためのより迅速でより簡単な方法を提供する。本発明の方法は迅速であり、全過程を１時間かそれ以内で完了することができる。重要なことに、本方法により、特に血液から得られるＲＮＡは、それが臨床的又は他の用途、例えば逆転写酵素及びその後のポリメラーゼ連鎖反応における用途などで有用であるような適した純度である。有利なことに、この方法の用途の前に細胞を単離する必要がなく、方法を行うために簡単な装置が必要なだけである。試料を本発明の界面活性剤と合わせた後、組み合わせたものを、ＲＮＡを広範囲に分解せずに臨床的又は他の分析で用いるために実験室に輸送することができる。本発明の方法は、上記で定義された新規なカチオン性界面活性剤の利用に頼っている。下記の実施例に示す通り、これらの新規な界面活性剤は、血液及び他の体液、ならびに無損傷の細胞を含む組織の溶解において予想できない程有効であり、ＲＮＡを沈澱させることにおいて予想できない程有効である。それらは又、水溶液から沈澱しない点で、保存において安定である。本発明を実行する場合、選ばれた生物学的試料、例えば血液を本明細書に記載の選ばれた新規なカチオン性界面活性剤の溶液と迅速に混合する。一般に混合物において、１００体積の界面活性剤溶液当たり５〜４０体積の血液を用いる。血液及び界面活性剤は混合物中で、約５分〜約２４時間接触させておくことができる。現在、約１０分の接触時間が用いられる。他の処理は必要でない。この混合物において、第４級アミン界面活性剤は試料中の核酸と（ＤＮＡ及びＲＮＡの両方）、界面活性剤の尾部の疎水性結合を特徴とする不溶性イオン性複合体を形成する。選ばれた時間の複合体の形成の後、界面活性剤／核酸複合体を混合物から分離する。本分離段階の１つの実施態様の場合、血液−界面活性剤混合物を遠心して界面活性剤／核酸複合体を沈澱させる。これはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心機において約１ｍｌの試料を用い、約５０００〜約１００，０００ｇにおいて約５分〜約３０分で簡単に行うことができる。血液が試料の場合、現在好ましい条件は約１６，０００ｇにおいて約５分であるが、大体同じいずれの遠心も用いることができる。試料が培養細胞である場合、より短い遠心時間及び低速度が望ましい。当該技術分野における熟練者は生物学的試料の性質に依存して適した遠心を決定することができる。遠心の代わりとなる適した方法は約０．２２ミクロンのフィルターを用いた濾過である。分離段階の後、上澄み液を除去し、得られる界面活性剤／核酸複合体を含むペレット（又は濾液）を場合により水で洗浄する。ペレット（又は濾液）を次いで（１）抽出してＲＮＡを可溶化し、それを界面活性剤との複合体から解離させる、又は（２）処理して界面活性剤を可溶化し、それを不溶性ＲＮＡとの複合体から解離させる。本発明の方法の解離段階の１つの実施態様の場合、塩の濃溶液を用いて界面活性剤／ＲＮＡ複合体からＲＮＡを抽出する。典型的にこの目的のために望ましい塩の濃度は、界面活性剤の体積の約５分の１中の８００ｍＭもの過剰の濃度である。リボヌクレアーゼを阻害する塩の利用も有利である。この目的に特に適した塩溶液は、約ｐＨ４において１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液と共に４Ｍのグアニジニウムイソチオシアナートを含む。しかし、他の適した塩溶液をこの段階で用いることができ、但し、ＲＮＡ／界面活性剤複合体を解離させるのに十分な濃度で塩が加えられる。当該技術分野における熟練者は他の塩をこの目的に望ましい濃度で選ぶことができる。他の実施態様の場合、分離段階の後に、ヌクレオチド／界面活性剤複合体からＲＮＡを解離させるための別の段階が続くことができる。この方法の場合、好ましくは適した塩と酸を用いて緩衝された主にホルムアミドを含む抽出溶媒を用い、上記の分離段階から得られるペレットを処理することができる。界面活性剤／ヌクレオチドペレットからＲＮＡを抽出するために有用な好ましい溶媒は、０〜８％ｗ／ｖの酢酸ナトリウム又は酢酸アンモニウム及び０〜１％ｖ／ｖの酢酸を含むホルムアミドが最適である。４％ｗ／ｖの塩及び０．１６％ｖ／ｖの酸を含むホルムアミドがより好ましい。塩及び酸の存在はリボヌクレアーゼを阻害することができる。抽出は約２５℃〜約１００℃において約５〜約３０分の期間、時々渦動させながら行う。現在好ましい条件は時々渦動させながら８０℃において約１０分間である。この段階のための特定の条件の選択は、当該技術分野における熟練者が容易に行うことができる。塩を含む熱ホルムアミドを用いたペレットの抽出は予想に反してＲＮＡの選択的抽出を生ずる。下記に記載するように後にエタノールを添加するとＲＮＡの沈澱を生ずるので、ホルムアミドと共に塩を添加するのも簡単である。抽出されるＲＮＡの質及び量は、場合により抽出溶媒にアウリントリカルボン酸（０．５〜５ｍＭ）又はジエチルピロカーボネートなどのリボヌクレアーゼ阻害剤を加えることによっても向上させることができる。他のリボヌクレアーゼの阻害剤が当該技術分野における熟練者によりこの目的のために選ばれることができる。この抽出の完了時に、混合物を場合により上記の速度と同じか類似の速度で遠心する。上澄み液を等体積のエタノールに加え、混合物を−２０℃か又はそれ以下に冷却する。その後ＲＮＡを遠心してペレットとし、従来の方法により処理する。このエタノール沈澱段階の代わりとなるのは、ＲＮＡを含むホルムアミド抽出物を、従来の流動、スピン−カラム又はプッシュカラム法を用い、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＧＦ−０５などのサイズ排除カラムに通過させることである。ＲＮＡはカラムを平衡化した緩衝液中でカラムから流出する。解離法（２）の実施態様の場合、ＲＮＡを不溶性で残すが界面活性剤を可溶化する方法により核酸／界面活性剤複合体を解離させることができる。これはペレットを塩化リチウムの濃水溶液（ＲＮＡはそこに不溶性）で洗浄することにより行うことができる。好ましい濃度は約２Ｍ〜約６Ｍの塩化リチウムである。他の方法は、エタノールに溶解した塩を用いたペレットの洗浄を含む。好ましい塩は酢酸ナトリウム及び塩化リチウムを含むことができるが、当該技術分野における熟練者は他の適した塩を選ぶことができる。エタノール性溶液が酢酸ナトリウムを含む場合、好ましい塩の量は約２〜約１０％ｗ／ｖである。エタノール性溶液が塩化リチウムを含む場合、好ましい塩の量は約１〜約３０％ｗ／ｖである。選ばれた溶液で洗浄した後、洗浄溶液を捨て、ペレット中に残るＲＮＡを後の処理のために適した緩衝液に溶解することができる。ＲＮＡの第４級アミン界面活性剤とのその複合体からの解離に、方法のいずれの実施態様を用いるかにかかわらず、得られるＲＮＡは場合により本方法に従い、フェノール／クロロホルム抽出によりさらに精製し、両者共上記で引用したＭａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ及びＷａｌｌａｃｅにより記載の従来の方法に従ってエタノール又はイソプロパノールの添加により沈澱させるか、あるいはカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。３．本発明のキット上記の界面活性剤溶液の１つ又はそれ以上を、生物学的試料からのリボ核酸の単離のためのキットとして容易に製造することができる。用いるために現在好ましい界面活性剤はアシル基の炭素数が１４のアシルトリメチルアンモニウムオキザレートである。そのようなキットの他の成分には、この方法の分離及び解離段階を行うために必要な試薬及び容器、すなわちホルムアミド溶媒、グアニジニウムイソチオシアナート溶液、塩化リチウム溶液及び／又はエタノール性溶液が含まれる。場合により上記で限定した追加の精製段階を行うための試薬も、この方法を容易に行うためにそのようなキットに含まれることができる。そのような単離法のためのキットの他の従来の成分もキットに含まれることができる。以下の実施例は本発明の方法を行うための好ましい方法を例示する。これらの実施例は単に例示のためであり、本発明の範囲を制限するものではない。実施例１−方法で用いるための界面活性剤の合成本発明において有用な界面活性剤を以下の通りに合成する。テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドの１５％ｗ／ｖ溶液（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．）を５０℃において水に溶解する。この溶液をヒドロキシド形態の、床体積が適用体積に等しいイオン交換樹脂（Ｂｉｏｒａｄ１（商標），Ｓｉｇｍａ）に通過させる。このカラムにおいて第４級アンモニウム塩のブロミドイオンがヒドロキシドイオンで交換される。得られる界面活性剤ヒドロキシド水溶液を含む流出液を集め、希釈した試料を希ＨＣｌで中性に滴定し、その濃度を決定する。次いで界面活性剤ヒドロキシドを０．５Ｍの蓚酸で中和する。混合物を希釈し、界面活性剤に関して、及び中性反応物（ｎｅｕｔｒａｌｒｅａｃｔｉｏｎ）に関して０．１Ｍ溶液を得る。結果物は本発明で用いるのに望ましいテトラデシルトリメチルアンモニウムオキザレートのわずかに乳光を呈するの無色の水溶液であり、振ると泡立つ。実施例２−追加の界面活性剤の合成本発明で有用な他の界面活性剤を、示されている通り第４級アンモニウムイオン及び酸の素性が異なる以外は実施例１に記載の通りにして合成する。Ｒ１が、長さが１２、１４又は１６炭素数であるアシルであり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がメチルであるアシルトリメチルアンモニウム（Ｓｉｇｍａからブロミド塩として購入）、あるいはＲ１が、長さが１２、１４、１６又は１８炭素数であるアシルであり、Ｒ２がベンジルであり、Ｒ３及びＲ４がメチルであるアシルベンジルジメチルアンモニウム（Ａｌｄｒｉｃｈからクロリド塩として購入）を用いた。実施例１に記載の通り、各第４級アンモニウム塩の水溶液をイオン交換カラムに通過させ、界面活性剤ヒドロキシドを得た。各ヒドロキシドを臭化水素酸、塩酸、リン酸、硫酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸及びクエン酸から成る群より選ばれる酸で中和し、対イオンＸ^-を各界面活性剤においてブロミド、クロリド、ホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートとした。次いでこれらの界面活性剤水溶液を実施例３に記載の通り、血液からＲＮＡを得る実験で用いた。実施例３−界面活性剤による血液の溶解本発明の実用上有用な程度に新規な界面活性剤が血液を溶解する能力を以下の実験により例示する。実施例２に記載の通りに合成した界面活性剤溶液（１ｍｌ）をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管に入れた。１／１０体積の３．２％クエン酸ナトリウムで抗凝固させた２００マイクロリットルの血液を加え、即座に混合した。混合物を１６，０００ｇで５分間遠心し、上澄み液を吸引により除去した。得られたペレットを視覚により調べ、等級分けした。結果を以下の表に示し、表において１２、１４又は１６−ＴＭＡは長さが１２、１４又は１６炭素数のアシルを有するアシルトリメチルアンモニウムを示し、１２、１４、１６又は１８ −ＢＡは長さが１２、１４、１６又は１６炭素数のアシルを有するアシルベンジルジメチルアンモニウムを示す。界面活性剤の対イオンは表の左側に沿って示す。ペレットは以下の数値尺度を用いて等級分けし、それを表Ｉに示す：０＝肉眼でほとんど見えないペレット；１＝わずかに着色したペレット又は管の片側に最小の体積を有する物質のしみ；２＝長軸が２〜３mmで管の底を不完全に覆っている褐色のペレット；３＝長軸が３〜４ｍｍで管の底を完全に覆っている褐色のペレット；４＝長軸が４〜５ｍｍで暗褐色；５＝長軸が５ｍｍより長い。０又は１の得点のペレットは少量のＲＮＡ及びＤＮＡ以外の物質を含む。比較的高い得点を有するペレットは許容できない程多量の、おそらくヘモグロビン又はヘモグロビンの変性形態を含む汚染物質を含む。界面活性剤が４℃で放置又は保存すると溶液から結晶化する傾向のある場合、結果を括弧内で示す。カチオン性界面活性剤が血液細胞を溶解する効率には変動があることがわかる。予想に反してアシルトリメチルアンモニウムのジカルボン酸塩及びアシルベンジルジメチルアンモニウムのモノカルボン酸塩は比較的小さいペレットを生ずる。驚くべきことにアシル鎖の長さはカチオン性界面活性剤が血液を溶解する能力にほとんど影響しない。実施例４−界面活性剤による全血からのＲＮＡの沈澱カチオン性界面活性剤がＲＮＡを沈澱させる効率を調べるために、血液（２００マイクロリットル、クエン酸塩で抗凝固）を、担体として１０マイクログラムのｔＲＮＡ及び２０，０００ｃｐｍの³²Ｐ−ＲＮＡ（２０００塩基転写物）を含む５０マイクロリットルのリン酸塩緩衝生理食塩水と共に１ｍｌの示された界面活性剤（０．１Ｍ）に加えた。１時間後、混合物を遠心し（１６，０００ｇ、５分間）、上澄み液を吸引して捨てた。次いでペレット中に存在する放射性をシンチレーションカウンティングにより評価し、加えられた放射性のパーセントとして表す。結果を下表ＩＩに報告し、表において第４級塩及びイオンは表１におけると同様に示されている。ＲＮＡの９５％か又はそれ以上の沈澱が許容し得ると考えられる。１０１又は１０２％として報告されている値は１００％の滴定誤差範囲内である。界面活性剤がＲＮＡを沈澱させる効率には広い変動があることがわかる。最も有効なのはアシルトリメチルアンモニウムと２価の酸の塩であった。この結果は予想に反していた。対照的に、アシル側鎖の長さはあまり重要でなかった。実施例５−全血からのＲＮＡの単離及び抽出血液の試料（１００マイクロリットル及び４００マイクロリットル）をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中の、実施例１の通りに製造された８００マイクロリットルの１４−ＴＭＡオキザレートに加え、即座に混合した。混合物を室温で０、１５分、３０分又は１時間インキュベートしてから遠心した（１６，０００ｇにおいて５分間）。上澄み液を吸引し、ペレットをリボヌクレアーゼを含まない水で短時間洗浄した。次いでペレットを、４グラムの酢酸ナトリウム及び０．１６ｍＬの酢酸を１００ｍｌのホルムアミドと混合することにより調製した抽出緩衝液を用い、時々渦動させながら８０℃に１０分間加熱することにより抽出した。混合物を遠心し（１６，０００ｇ、５分間）、上澄み液を４００マイクロリットルのエタノールに加え、−８０℃に１０分間冷却した。沈澱したＲＮＡを遠心（１６，０００ｇ、５分間）により収穫し、ホルムアルデヒド試料緩衝液に溶解し、従来の方法によりアガロースにおいて電気泳動させた。エチジウムブロミドを用いて染色した後、紫外光下でゲルを調べると、血液の１００マイクロリットル試料を負荷した列においてｒＲＮＡ及び他のＲＮＡの存在が示された。４００マイクロリットルの血液を負荷した列は部分的に分解したＲＮＡを現した。０、１５分、３０分又は１時間界面活性剤と共にインキュベートした試料を含む列の間で差はなかった。同様の実験において、実施例３に挙げた０又は１のペレットの得点を有する界面活性剤を用いて血液からＲＮＡを単離した。ベンズアルコニウム界面活性剤を用いた収率は一般にアルキルトリメチルアンモニウム界面活性剤を用いた収率より低かった。この理由は明らかでない。実施例６−細胞懸濁液からのＲＮＡ単離及び抽出１００マイロリットル中の１０万個のＨＬ−６０［ＡＴＣＣＣＣＬ２４０］又はＫ５６２［ＡＴＣＣＣＣＬ２４３］ヒト白血病細胞を１ｍｌの１００ｍＭ１４−ＴＭＡオキザレートに加え、遠心した（１６，０００ｇ、５分間）。ペレットを実施例５に記載の通りに抽出し、分析した。ｒＲＮＡ及び他のＲＮＡ種の特徴的バンドがゲル上に見られた。これはＴＭＡオキザレートを培養細胞からのＲＮＡの単離に用いることができることを示す。実施例７−カチオン性界面活性剤及びジチオトレイトールを用いたＲＮＡ単離血液の試料（１００又は２００マイクロリットル）を、１０又は１００ｍＭのジチオトレイトールを含む、又は含まない１．０ｍｌの１４−ＴＭＡオキザレートに加え、遠心の後、０、１０又は１００ｍＭのジチオトレイトールを含むホルムアミドを用いて実施例６に記載の通りにペレットを抽出した。ＲＮＡをエタノールを用いて沈澱させ、アガロースゲル電気泳動により調べた。非分解ＲＮＡの最高の収率は、１００ｍＭのジチオトレイトールを界面活性剤及びホルムアミド抽出緩衝液の両方に加えた場合に得られた。ジチオトレイトールはリボヌクレアーゼを阻害することにより収率を増加させることができる。実施例８−カチオン性界面活性剤及びアウリントリカルボン酸を用いたＲＮＡ単離ジチオトレイトールの代わりに０、０．５又は５ｍＭのアウリントリカルボン酸（Ｓｉｇｍａ）を用いて実施例７と同様の実験を行った。非分解ＲＮＡの最高の収率は５ｍＭのアウリントリカルボン酸をホルムアミド抽出緩衝液に加えた場合に得られた。アウリントリカルボン酸はリボヌクレアーゼを阻害することが知られている。実施例９−抽出されたＲＮＡのカラムクロマトグラフィーを用いた精製ＲＮＡのホルムアミド抽出物を緩衝水溶液で予備平衡化した数個のサイズ排除カラム（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０（商標）又はＴｒｉｓａｃｒｙｌＧＦ−０５（商標））の１つの上でクロマトグラフィーにかけ、重力供給、遠心又は空気圧により溶離する以外は、血液及び放射性ＲＮＡを同時に界面活性剤に加える実施例８と同様の実験を行った。空気圧を用いて溶離したカラムから溶出した放射性画分をアガロースゲル電気泳動により分析し、それは非分解ｒＲＮＡのバンドを現した。この実験はＲＮＡをホルムアミドからカラムクロマトグラフィーにより回収できることを明らかにしている。実施例１０−グアニジニウムイソチオシアナートを用いたＲＮＡ抽出血液の試料（５０〜４００マイクロリットル）を１ｍｌの１４−ＴＭＡオキザレート溶液に加え、１６，０００ｇにおいて５分間遠心した。得られたペレットを、４Ｍのグアニジニウムイソチオシアナート及び２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４を含む水溶液１００マイクロリットルを用い、時々渦動させながら室温で１０分間インキュベートすることにより抽出した。次いで等体積の水− 平衡化フェノール及びクロロホルムの１：１混合物を加え、渦動させることにより乳化した。短時間の遠心（１６，０００ｇ、２分間）により相を分離させ、上の水相を取り出し、等体積のイソプロパノールに加えた。 −２０℃に３０分間冷却した後、沈澱したＲＮＡを遠心（１６，０００、５分間）により収穫し、エタノールで洗浄し、アガロースゲル電気泳動による分析のために再溶解した。これは、細胞ＲＮＡの特徴的エチジウムブロミド染色可能なバンドを現した。この実験は、界面活性剤核酸ペレットから高塩濃度によりＲＮＡを抽出できることを示している。グアニジニウムイソチオシアナートはリボヌクレアーゼを阻害することが知られており、その作用はＲＮＡの回収を容易にすることができる。実施例１１−カチオン性界面活性剤及びホルムアミド抽出を用いた癌遺伝子ＲＮＡの単離慢性骨髄性白血病細胞は２つの染色体の相互転座による、並んだ２つの遺伝子のハイブリッドである癌遺伝子（ｂｃｒ／ａｂｌ）を発現する。この癌遺伝子は正常な細胞では発現されないが不死白血病細胞系Ｋ５６２［ＡＴＣＣＣＣＬ２４３］において発現される。逆転写酵素及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＲＮＡ種の検出のためのＲＮＡの単離における本発明の利用性を示すために、３０〜１０，０００個のＫ５６２細胞を２００マイクロリットルの全血と混合し、実施例５に記載の方法を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡの分析を、Ｓａｗｙｅｒｓｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：５６３−５６７（１９９０）により記載のＰＣＲプライマーを用いて行った。簡単に記載すると、単離されたＲＮＡを再懸濁し、それをＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭのＫＣｌ；４ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭのＴＲＩＳｐＨ８．４；１００ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン）中に２０単位のＲＮａｓｉｎ、５ｍＭのジチオトレイトール、２０ピコモルのプライマーＢ（５’−ＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＴＣ−３’）、［配列番号：１］、１ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む４０マイクロリットル体積において２００単位のＭａｌｏｎｅｙマウス白血病ウィルス逆転写酵素（ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）と共に３７℃で１時間インキュベートすることによりｃＤＮＡを作った。９５℃に加熱することにより反応を停止した。８０マイクロリットルのＰＣＲ緩衝液及び２０ピコモルのプライマーＡ（５’−ＧＡＡＧＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＧＴ−３’）［配列番号：２］を加えた。混合物を１００マイクロリットルの鉱油で覆い、サイクルにプログラムした。すべての方法は“ホットスタート（ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ）”法を用いることにより公開されている方法から修正した。ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）は以下の通りにプログラムした：プライマーＡ及びＢが用いられた場合、９５℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング及び７２℃で１分間伸長。ＰＣＲ産物をエチジウムブロミドを用いて１％アガロースゲル上で分析した。そのような実験で得られたゲルを紫外光下で調べると、血液の２００マイクロリットル試料中に１０００又は２００個のＫ５６２細胞を含む血液試料からの１７９塩基対フラグメントの増幅が明らかにされた。逆転写酵素が含まれなかった標準試料中には増幅産物が検出されなかった。他の類似の実験において、血液からのＲＮＡの沈澱に１６−ＴＭＡスクシネート、１４−ＢＡスクシネート、１６−ＢＡアセテート及び１４−ＢＡホスフェートを含む他の界面活性剤を用いて、及びグアニジニウムイソチオシアナートにより界面活性剤／ヌクレオチドペレットから抽出されたＲＮＡの試料においてｂｃｒ／ａｂｌ癌遺伝子の増幅が得られた。これは、記載された全血からのＲＮＡの単離のためのカチオン性界面活性剤法が、さらに精製する必要がなく逆転写及びＰＣＲによる増幅に適したＲＮＡを与えることを示す。実施例１２−カチオン性界面活性剤及びグアニジニウムイソチオシアナート抽出を用いた癌遺伝子ＲＮＡの単離ＲＮＡの単離に実施例１０のグアニジニウム法を用いる以外は実施例１１と同様の実験を行った。血液試料からのＲＮＡが３０個か又はそれ以上のＫ５６２細胞を含む場合、適したサイズの増幅産物が見られた。この実験は、記載されたグアニジニウムイソチオシアナートを用いた界面活性剤フクレオチド複合体の抽出が、さらに精製せずに増幅に適したＲＮＡを与えることを示している。記載の通り、この方法はＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ染色体を有する慢性骨髄性白血病の患者の血液の１マイクロリットル当たり１個以下の白血病細胞を検出できると思われ、これはこの方法の高い感度を示している。実施例１３−塩化リチウム濃水溶液を用いた培養細胞からのＲＮＡの単離培養されたＨＬ６０又はＫ５６２細胞（１０⁵〜１０⁷細胞）を１ｍｌの１４− ＴＭＡオキザレートに加え、混合物を実施例６に記載の通りに遠心した。ペレットを塩化リチウムの２Ｍ水溶液と混合し、再度遠心し、上澄み液を捨てた。ＲＮＡを含むペレットを７０％のエタノールで洗浄し、緩衝水溶液に溶解した。ＵＶスペクトル分析及びアガロースゲル電気泳動による試験は、非分解ＲＮＡの優れた収率を明らかにした。実施例１４−エタノール性塩溶液を用いた培養細胞からのＲＮＡの単離塩化リチウム溶液を４％の酢酸ナトリウムを含むエタノールで置換する以外は実施例１３に記載の通りに培養細胞からＲＮＡを単離した。この場合も大きく分解されていないＲＮＡの優れた収率が得られた。本発明の多数の修正及び変法が上記に限定した明細書に含まれ、当該技術分野における熟練者には明らかであることが予想される。そのような本発明の組成物及び方法の修正及び変法は明細書に添付される請求の範囲に含まれると思われる。配列表配列番号：１配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：不明配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列ＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＴＣ配列番号：２配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：不明配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列ＧＡＡＧＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＧＴ

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９４年７月１８日【補正内容】請求の範囲１．試料を第４級アミン界面活性剤水溶液と接触させる段階を含んでなり、該第４級アミンが式［式中、Ｒ１〜Ｒ４は独立してアシル基、炭素数が１〜２０のアルキル鎖及び炭素数が６〜２６のアリール基から成る群より選ばれ、Ｘ^-はホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートから成る群より選ばれる］を有する、生物学的試料からＲＮＡを単離する方法。２．該試料が全血である請求の範囲第１項に記載の方法。３．Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つがアリールであり、フェニル、低級アルキル置換ベンジル及びハロゲン化ベンジルから成る群より選ばれる請求の範囲第１項に記載の方法。４．該第４級アミンが、長さが１２、１４又は１６炭素数のアシル基を含むアシルトリメチルアンモニウムであり、Ｘ^-がオキザレート、マロネート及びスクシネートから成る群より選ばれる請求の範囲第３項に記載の方法。５．該第４級アミンが、長さが１４炭素数のアシル基を含むアシルトリメチルアンモニウムであり、Ｘ^-がオキザレートである請求の範囲第４級項に記載の方法。２３．式［式中、Ｒ１〜Ｒ４は独立してアシル基、炭素数が１〜２０のアルキル鎖及び炭素数が６〜２６のアリール基から成る群より選ばれ、Ｘ^-はホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートから成る群より選ばれる］を有する第４級アミン界面活性剤。２４．第４級アミンがアシルトリメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１２、１４又は１６炭素数であり、Ｘ^-がオキザレート、マロネート及びスクシネートから成る群より選ばれる請求の範囲第２３項に記載の界面活性剤。２５．第４級アミンがアシルトリメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１４炭素数であり、Ｘ^-がオキザレートである請求の範囲第２４項に記載の界面活性剤。２６．第４級アミンがアシルベンジルジメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１２、１４、１６又は１８炭素数であり、Ｘ^-がサルフェート、ホスフェート、ホルメート、アセテート及びプロピオネートから成る群より選ばれる請求の範囲第２３項に記載の界面活性剤。２７．第４級アミン界面活性剤水溶液を含んでなり、該第４級アミンが式［式中、Ｒ１〜Ｒ４は独立してアシル基、炭素数が１〜２０のアルキル鎖及び炭素数が６〜２６のアリール基から成る群より選ばれ、Ｘ^-はホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートから成る群より選ばれる］を有する、生物学的試料からリボ核酸を単離するためのキット。２８．第４級アミンがアシルトリメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１２、１４又は１６炭素数であり、Ｘ^-がオキザレート、マロネート及びスクシネートから成る群より選ばれる請求の範囲第２７項に記載のキット。２９．第４級アミンがアシルトリメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１４炭素数であり、Ｘ^-がオキザレートである請求の範囲第２８項に記載のキット。３０．第４級アミンがアシルベンジルジメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１２、１４、１６又は１８炭素数であり、Ｘ^-がサルフェート、ホスフェート、ホルメート、アセテート及びプロピオネートから成る群より選ばれる請求の範囲第２７項に記載のキット。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年８月２５日【補正内容】発明の概略１つの特徴において本発明は、選ばれた第４級アミンを含む水性カチオン性界面活性剤溶液の利用を含む、血液を含む生物学的試料からＲＮＡを単離するための新規な方法を提供する。選ばれた第４級アミンは第４級アミンヒドロキシドとリン酸、硫酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸及びクエン酸より成る群からの酸の反応を介して製造される。第４級アミンはアルキル基の炭素数が１２、１４、１６又は１８であるアルキルトリメチルアンモニウム又はアルキルベンジルジメチルアンモニウムであるのが好ましい。さらに別の特徴は、方法により生成される界面活性剤−核酸複合体からのＲＮＡの回収を含む上記の方法に対する改良を含む。この回収段階は、グアニジニウム塩又は熱ホルムアミドを用いた複合体の可溶化を含むことができる。別の場合、複合体をエタノール及び塩、又は塩化リチウムの濃水溶液で処理することにより界面活性剤を核酸との会合から抽出し、ＲＮＡを不溶性として残すことができる。他の特徴において本発明は、本明細書に記載の少なくとも１種の界面活性剤水溶液を含む、生物学的試料からＲＮＡを単離し、精製するためのキットを提供する。さらに別の特徴において本発明は、第４級アミンヒドロキシドとリン酸、硫酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸及びクエン酸より成る群から選ばれる酸の反応により製造される選ばれた第４級アミン塩を含む、生物学的試料からのＲＮＡの抽出に有用な新規な界面活性剤溶液を提供する。本発明の他の態様及び利点は、その好ましい実施態様に関する以下の詳細な説明においてさらに記載する。発明の詳細な記述本発明は選ばれた第４級アミンを含む選ばれた新規なカチオン性界面活性剤を用いた、生物学的試料からのＲＮＡの単離のための方法を提供し、その方法は先行技術の方法に勝る有意な利点を特徴とする。１．本発明の界面活性剤本発明の新規な第４級アミン界面活性剤は下記の式：［式中、Ｒ１〜Ｒ４は独立して炭素数が１〜２０のアルキル鎖及び炭素数が６〜２６のアリール基から選ばれる］により特徴づけられる。適したアリール基はフェニル、低級アルキル−置換ベンジル、及び／又はハロゲン化ベンジルである。第４級アミン界面活性剤の現在好ましいアニオン、すなわち式ＩのＸ^-はホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートである。本発明のＲＮＡ単離法で用いるのに現在好ましい第４級アミン界面活性剤には、アルキル基の長さが１２、１４又は１６炭素数であるアルキルトリメチルアンモニウムの蓚酸、マロン酸及びコハク酸塩が含まれる。現在最も好ましい界面活性剤はアルキル基の長さが１４炭素数であるアルキルトリメチルアンモニウムの蓚酸塩である。そのような利用のための他の好ましい第４級アミン界面活性剤にはアルキル基の長さが１２、１４、１６又は１８炭素数であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムの硫酸、リン酸、蟻酸、酢酸及びプロピオン酸塩が含まれる。ヘキサデシルベンジルジメチルアンモニウムの蟻酸、酢酸及びリン酸塩として特徴づけられる式Ｉの界面活性剤も望ましい。本発明の方法において有用な新規なカチオン性界面活性剤は以下の通りにして得ることができる：商業的に入手できる水中の約５〜３０重量／体積％の界面活性剤ハライドを出発材料として用いる。界面活性剤ハライドは水中で約１５％ｗｔ／ｖであるのが好ましい。ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．から、例えばテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含む複数の商業的に入手できる第４級アンモニウムハライドがこの目的のために利用できる。界面活性剤ハライドは、Ｄｏｗｅｘ１（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ）などのヒドロキシド形態で製造されたアニオン交換樹脂に通過させることによりヒドロキシドに変換される。第４級アミンニウムハライドがこのカラムクロマトグラフィー段階を通過すると、樹脂上のヒドロキシル基はハライドイオンに交換される。得られるテトラデシルトリメチルアンモニウムヒドロキシドなどの界面活性剤ヒドロキシドを滴定により検定する。次いで第４級アンモニウムヒドロキシドをリン酸、硫酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸及びクエン酸から成る群より選ばれる酸の添加によりそれと合わせ、それにより中和する。当該技術分野における熟練者は、中和するための選ばれた酸の量を容易に調節することができる。得られる第４級アミン界面活性剤は上記に示した式を有する。ＲＮＡの単離における本発明の方法で用いる場合、新規な界面活性剤は約０．０１〜０．２モルの濃度における、４〜８のｐＨの水溶液の状態である。別の場合、特にＲＮＡ単離法における第４級アミン界面活性剤としてアルキルベンジルジメチルアミンニウム塩が用いられる場合ＲＮＡはカラムを平衡化した緩衝液中でカラムから流出する。解離法（２）の実施態様の場合、ＲＮＡを不溶性で残すが界面活性剤を可溶化する方法により核酸／界面活性剤複合体を解離させることができる。これはペレットを塩化リチウムの濃水溶液（ＲＮＡはそこに不溶性）で洗浄することにより行うことができる。好ましい濃度は約２Ｍ〜約６Ｍの塩化リチウムである。他の方法は、エタノールに溶解した塩を用いたペレットの洗浄を含む。好ましい塩は酢酸ナトリウム及び塩化リチウムを含むことができるが、当該技術分野における熟練者は他の適した塩を選ぶことができる。エタノール性溶液が酢酸ナトリウムを含む場合、好ましい塩の量は約２〜約１０％ｗ／ｖである。エタノール性溶液が塩化リチウムを含む場合、好ましい塩の量は約１〜約３０％ｗ／ｖである。選ばれた溶液で洗浄した後、洗浄溶液を捨て、ペレット中に残るＲＮＡを後の処理のために適した緩衝液に溶解することができる。ＲＮＡの第４級アミン界面活性剤とのその複合体からの解離に、方法のいずれの実施態様を用いるかにかかわらず、得られるＲＮＡは場合により本方法に従い、フェノール／クロロホルム抽出によりさらに精製し、両者共上記で引用したＭａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ及びＷａｌｌａｃｅにより記載の従来の方法に従ってエタノール又はイソプロパノールの添加により沈澱させるか、あるいはカラムクロマトグラフイーにより精製することができる。３．本発明のキット上記の界面活性剤溶液の１つ又はそれ以上を、生物学的試料からのリボ核酸の単離のためのキットとして容易に製造することができる。用いるために現在好ましい界面活性剤はアルキル基の炭素数が１４のアルキルトリメチルアンモニウムオキザレートである。そのようなキットの他の成分には、この方法の分離及び解離段階を行うために必要な試薬及び容器、すなわちホルムアミド溶媒、グアニジニウムイソチオシアナート溶液、塩化リチウム溶液及び／又はエタノール性溶液が含まれる。場合により上記で限定した追加の精製段階を行うための試薬も、この方法を容易に行うためにそのようなキットに含まれることができる。そのような単離法のためのキットの他の従来の成分もキットに含まれることができる。以下の実施例は本発明の方法を行うための好ましい方法を例示する。これらの実施例は単に例示のためであり、本発明の範囲を制限するものではない。実施例１−方法で用いるための界面活性剤の合成本発明において有用な界面活性剤を以下の通りに合成する。テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドの１５％ｗ／ｖ溶液（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．）を５０℃において水に溶解する。この溶液をヒドロキシド形態の、床体積が適用体積に等しいイオン交換樹脂（Ｂｉｏｒａｄ１（商標），Ｓｉｇｍａ）に通過させる。このカラムにおいて第４級アンモニウム塩のブロミドイオンがヒドロキシドイオンで交換される。得られる界面活性剤ヒドロキシド水溶液を含む流出液を集め、希釈した試料を希ＨＣｌで中性に滴定し、その濃度を決定する。次いで界面活性剤ヒドロキシドを０．５Ｍの蓚酸で中和する。混合物を希釈し、界面活性剤に関して、及び中性反応物（ｎｅｕｔｒａｌｒｅａｃｔｉｏｎ）に関して０．１Ｍ溶液を得る。結果は本発明で用いるのに望ましいテトラデシルトリメチルアンモニウムオキザレートのわずかに乳光の無色の水溶液であり、振ると泡立つ。実施例２−追加の界面活性剤の合成本発明で有用な他の界面活性剤を、示されている通り第４級アンモニウムイオン及び酸の素性が異なる以外は実施例１に記載の通りにして合成する。Ｒ１が、長さが１２、１４又は１６炭素数であるアルキルであり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がメチルであるアルキルトリメチルアンモニウム（Ｓｉｇｍａからブロミド塩として購入）、あるいはＲ１が、長さが１２、１４、１６又は１８炭素数であるアルキルであり、Ｒ２がベンジルであり、Ｒ３及びＲ４がメチルであるアルキルベンジルジメチルアンモニウム（Ａｌｄｒｉｃｈからクロリド塩として購入）を用いた。実施例１に記載の通り、各第４級アンモニウム塩の水溶液をイオン交換カラムに通過させ、界面活性剤ヒドロキシドを得た。各ヒドロキシドを臭化水素酸、塩酸、リン酸、硫酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸及びクエン酸から成る群より選ばれる酸で中和し、対イオンＸ^-を各界面活性剤においてブロミド、クロリド、ホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートとした。次いでこれらの界面活性剤水溶液を実施例３に記載の通り、血液からＲＮＡを得る実験で用いた。実施例３−界面活性剤による血液の溶解本発明の実行に有用な程度に新規な界面活性剤が血液を溶解する能力を以下の実験により例示する。実施例２に記載の通りに合成した界面活性剤溶液（１ｍｌ）をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管に入れた。１／１０体積の３．２％クエン酸ナトリウムで抗凝固させた２００マイクロリットルの血液を加え、即座に混合した。混合物を１６，０００ｇで５分間遠心し、上澄み液を吸引により除去した。得られたペレットを視覚により調べ、等級分けした。結果を以下の表に示し、表において１２、１４又は１６−ＴＭＡは長さが１２、１４又は１６炭素数のアルキルを有するアルキルトリメチルアンモニウムを示し、１２、１４、１６又は１８−ＢＡは長さが１２、１４、１６又は１６炭素数のアルキルを有するアルキルベンジルジメチルアンモニウムを示す。界面活性剤の対イオンは表の左側に沿って示す。ペレットは以下の数値尺度を用いて等級分けし、それを表Ｉに示す：０＝肉眼でほとんど見えないペレット；１＝わずかに着色したペレット又は管の片側に最小の体積を有する物質のしみ；２＝長軸が２〜３mmで管の底を不完全に覆っている褐色のペレット；３＝長軸が３〜４ｍｍで管の底を完全に覆っている褐色のペレット；４＝長軸が４〜５ｍｍで暗褐色；５＝長軸が５ｍｍより長い。０又は１の得点のペレットは少量のＲＮＡ及びＤＮＡ以外の物質を含む。比較的高い得点を有するペレットは許容できない程多量の、おそらくヘモグロビン又はヘモグロビンの変性形態を含む汚染物質を含む。界面活性剤が４℃で放置又は保存すると溶液から結晶化する傾向のある場合、結果を括弧内で示す。カチオン性界面活性剤が血液細胞を溶解する効率には変動があることがわかる。予想に反してアルキルトリメチルアンモニウムのジカルボン酸塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウムのモノカルボン酸塩は比較的小さいペレットを生ずる。驚くべきことにアルキル鎖の長さはカチオン性界面活性剤が血液を溶解する能力にほとんど影響しない。実施例４−界面活性剤による全血からのＲＮＡの沈澱カチオン性界面活性剤がＲＮＡを沈澱させる効率を調べるために、血液（２００マイクロリットル、クエン酸塩で抗凝固）を、担体として１０マイクログラムのｔＲＮＡ及び２０，０００ｃｐｍの³²Ｐ−ＲＮＡ（２０００塩基転写物）を含む５０マイクロリットルのリン酸塩緩衝生理食塩水と共に１ｍｌの示された界面活性剤（０．１Ｍ）に加えた。１時間後、混合物を遠心し（１６，０００ｇ、５分間）、上澄み液を吸引して捨てた。次いでペレット中に存在する放射性をシンチレーションカウンティングにより評価し、加えられた放射性のパーセントとして表す。結果を下表ＩＩに報告し、表において第４級塩及びイオンは表１におけると同様に示されている。ＲＮＡの９５％か又はそれ以上の沈澱が許容し得ると考えられる。１０１又は１０２％として報告されている値は１００％の滴定誤差範囲内である。界面活性剤がＲＮＡを沈澱させる効率には広い変動があることがわかる。最も有効なのはアルキルトリメチルアンモニウムと２価の酸の塩であった。この結果は予想に反していた。対照的に、アルキル側鎖の長さはあまり重要でなかった。請求の範囲１．試料を第４級アミン界面活性剤水溶液と接触させる段階を含んでなり、該第４級アミンが式［式中、Ｒ１〜Ｒ４は独立して炭素数が１〜２０のアルキル鎖及び炭素数が６〜２６のアリール基から選ばれ、Ｘ^-はホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートから成る群より選ばれる］を有する、生物学的試料からＲＮＡを単離する方法。２．該試料が全血である請求の範囲第１項に記載の方法。３．Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つがアリールであり、フェニル、低級アルキル置換ベンジル及びハロゲン化ベンジルから成る群より選ばれる請求の範囲第１項に記載の方法。４．該第４級アミンが、長さが１２、１４又は１６炭素数のアルキル基を含むアルキルトリメチルアンモニウムであり、Ｘ^-がオキザレート、マロネート及びスクシネートから成る群より選ばれる請求の範囲第３項に記載の方法。５．該第４級アミンが、長さが１４炭素数のアルキル基を含むアルキルトリメチルアンモニウムであり、Ｘ^-がオキザレートである請求の範囲第４級項に記載の方法。６．第４級アミンがアルキルベンジルジメチルアンモニウムであり、アルキル基の長さが１２、１４、１６又は１８炭素数であり、酸が硫酸、リン酸、蟻酸、酢酸及びプロピオン酸から成る群より選ばれる請求の範囲第３項に記載の方法。７．試料中のＲＮＡを含むヌクレオチドと界面活性剤の間に不溶性のイオン性複合体を形成する段階をさらに含む請求の範囲第１項に記載の方法。８．試料及び界面活性剤混合物を遠心することにより溶液から該複合体を分離することを含む請求の範囲第７項に記載の方法。９．濾過により溶液から該複合体を分離することを含む請求の範囲第７項に記載の方法。１０．ヌクレオチド／界面活性剤複合体からＲＮＡを解離させる段階をさらに含む請求の範囲第５項に記載の方法。１１．該解離段階が塩の濃溶液を用いて該複合体を抽出することを含む請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．該溶液が約ｐＨ４において１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液と共に４Ｍのグアニジニウムイソチオシアナートを含む請求の範囲第１１項に記載の方法。１３．該解離段階が、場合により適した塩及び酸を用いて緩衝されたホルムアミド溶媒を用いてＲＮＡを抽出することを含む請求の範囲第１０項に記載の方法。２３．式［式中、Ｒ１〜Ｒ４は独立して炭素数が１〜２０のアルキル鎖及び炭素数が６〜２６のアリール基から選ばれ、Ｘ^-はホスフェート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートから成る群より選ばれる］を有する第４級アミン界面活性剤。２４．第４級アミンがアルキルトリメチルアンモニウムであり、アルキル基の長さが１２、１４又は１６炭素数であり、Ｘ^-がオキザレート、マロネート及びスクシネートから成る群より選ばれる請求の範囲第２３項に記載の界面活性剤。２５．第４級アミンがアルキルトリメチルアンモニウムであり、アルキル基の長さが１４炭素数であり、Ｘ^-がオキザレートである請求の範囲第２４項に記載の界面活性剤。２６．第４級アミンがアルキルベンジルジメチルアンモニウムであり、アルキル基の長さが１２、１４、１６又は１８炭素数であり、Ｘ^-がホスフェート及びプロピオネートから成る群より選ばれる請求の範囲第２３項に記載の界面活性剤。２７．第４級アミン界面活性剤水溶液を含んでなり、該第４級アミンが式［式中、Ｒ１〜Ｒ４は独立して炭素数が１〜２０のアルキル鎖及び炭素数が６〜２６のアリール基から選ばれ、Ｘ^-はホスフェート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートから成る群より選ばれる］を有する、生物学的試料からリボ核酸を単離するためのキット。２８．第４級アミンがアルキルトリメチルアンモニウムであり、アルキル基の長さが１２、１４又は１６炭素数であり、Ｘ^-がオキザレート、マロネート及びスクシネートから成る群より選ばれる請求の範囲第２７項に記載のキット。２９．第４級アミンがアルキルトリメチルアンモニウムであり、アルキル基の長さが１４炭素数であり、Ｘ^-がオキザレートである請求の範囲第２８項に記載のキット。３０．第４級アミンがアルキルベンジルジメチルアンモニウムであり、アルキル基の長さが１２、１４、１６又は１８炭素数であり、Ｘ^-がホスフェート及びプロピオネートから成る群より選ばれる請求の範囲第２７項に記載のキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】１．試料を第４級アミン界面活性剤水溶液と接触させる段階を含んでなり、該第４級アミンが式［式中、Ｒ１〜Ｒ４は独立して炭素数が１〜２０のアルキル鎖及び炭素数が６〜２６のアリール基から選ばれ、Ｘ^-はホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートから成る群より選ばれる］を有する、生物学的試料からＲＮＡを単離する方法。２．該試料が全血である請求の範囲第１項に記載の方法。３．Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つがアリールであり、フェニル、低級アルキル置換ベンジル及びハロゲン化ベンジルから成る群より選ばれる請求の範囲第１項に記載の方法。４．該第４級アミンが、長さが１２、１４又は１６炭素数のアシル基を含むアシルトリメチルアンモニウムであり、Ｘ^-がオキザレート、マロネート及びスクシネートから成る群より選ばれる請求の範囲第３項に記載の方法。５．該第４級アミンが、長さが１４炭素数のアシル基を含むアシルトリメチルアンモニウムであり、Ｘ^-がオキザレートである請求の範囲第４級項に記載の方法。６．第４級アミンがアシルベンジルジメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１２、１４、１６又は１８炭素数であり、酸が硫酸、リン酸、蟻酸、酢酸及びプロピオン酸から成る群より選ばれる請求の範囲第３項に記載の方法。７．試料中のＲＮＡを含むヌクレオチドと界面活性剤の間に不溶性のイオン性複合体を形成する段階をさらに含む請求の範囲第１項に記載の方法。８．試料及び界面活性剤混合物を遠心することにより溶液から該複合体を分離することを含む請求の範囲第７項に記載の方法。９．濾過により溶液から該複合体を分離することを含む請求の範囲第７項に記載の方法。１０．ヌクレオチド／界面活性剤複合体からＲＮＡを解離させる段階をさらに含む請求の範囲第５項に記載の方法。１１．該解離段階が塩の濃溶液を用いて該複合体を抽出することを含む請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．該溶液が約ｐＨ４において１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液と共に４Ｍのグアニジニウムイソチオシアナートを含む請求の範囲第１１項に記載の方法。１３．該解離段階が、場合により適した塩及び酸を用いて緩衝されたホルムアミド溶媒を用いてＲＮＡを抽出することを含む請求の範囲第１０項に記載の方法。１４．塩が酢酸ナトリウム又は酢酸アンモニウムである請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．該酸が酢酸である請求の範囲第１３項に記載の方法。１６．該解離段階が、ＲＮＡが不溶性の塩溶液を用いて該複合体を抽出することを含む請求の範囲第１０項に記載の方法。１７．該溶液がリチウムを含む請求の範囲第１６項に記載の方法。１８．該溶液が塩化リチウムの濃水溶液である請求の範囲第１７項に記載の方法。１９．該解離段階が、ＲＮＡが不溶性の溶媒中の塩を用いて該複合体を抽出することを含む請求の範囲第１０項に記載の方法。２０．該溶媒がエタノールである請求の範囲第１９項に記載の方法。２１．該塩が酢酸ナトリウム又は塩化リチウムである請求の範囲第１９項に記載の方法。２２．生物学的試料が全血、血漿、血清、尿、組織及び細胞から成る群より選ばれる請求の範囲第１項に記載の方法。２３．式［式中、Ｒ１〜Ｒ４は独立して炭素数が１〜２０のアルキル鎖及び炭素数が６〜２６のアリール基から選ばれ、Ｘ^-はホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートから成る群より選ばれる］を有する第４級アミン界面活性剤。２４．第４級アミンがアシルトリメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１２、１４又は１６炭素数であり、Ｘ^-がオキザレート、マロネート及びスクシネートから成る群より選ばれる請求の範囲第２３項に記載の界面活性剤。２５．第４級アミンがアシルトリメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１４炭素数であり、Ｘ^-がオキザレートである請求の範囲第２４項に記載の界面活性剤。２６．第４級アミンがアシルベンジルジメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１２、１４、１６又は１８炭素数であり、Ｘ^-がサルフェート、ホスフェート、ホルメート、アセテート及びプロピオネートから成る群より選ばれる請求の範囲第２３項に記載の界面活性剤。２７．第４級アミン界面活性剤水溶液を含んでなり、該第４級アミンが式［式中、Ｒ１〜Ｒ４は独立して炭素数が１〜２０のアルキル鎖及び炭素数が６〜２６のアリール基から選ばれ、Ｘ^-はホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキザレート、マロネート、スクシネート及びシトレートから成る群より選ばれる］を有する、生物学的試料からリボ核酸を単離するためのキット。２８．第４級アミンがアシルトリメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１２、１４又は１６炭素数であり、Ｘ^-がオキザレート、マロネート及びスクシネートから成る群より選ばれる請求の範囲第２７項に記載のキット。２９．第４級アミンがアシルトリメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１４炭素数であり、Ｘ^-がオキザレートである請求の範囲第２８項に記載のキット。３０．第４級アミンがアシルベンジルジメチルアンモニウムであり、アシル基の長さが１２、１４、１６又は１８炭素数であり、Ｘ^-がサルフェート、ホスフェート、ホルメート、アセテート及びプロピオネートから成る群より選ばれる請求の範囲第２７項に記載のキット。