JPH08320437A - 落射蛍光顕微鏡 - Google Patents
落射蛍光顕微鏡Info
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- JPH08320437A JPH08320437A JP7126636A JP12663695A JPH08320437A JP H08320437 A JPH08320437 A JP H08320437A JP 7126636 A JP7126636 A JP 7126636A JP 12663695 A JP12663695 A JP 12663695A JP H08320437 A JPH08320437 A JP H08320437A
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-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
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- G02B21/06—Means for illuminating specimens
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Abstract
(57)【要約】
【目的】落射蛍光顕微鏡において、蛍光フィルターセッ
トを交換せずに、３重染色以上の蛍光標本の各蛍光色素
から発する蛍光強度を調節可能にする。 【構成】光源１１から発せられた照明光は励起フィルタ
ー１６を通過することにより、複数の狭帯域励起光波長
の光に変換される。その後、照明光はダイクロイックミ
ラー１７で反射し、対物レンズ１８を介して標本２０に
照射される。標本２０から発した蛍光は吸収フィルター
２１を通過した後、観察用接眼レンズ２３又は写真撮影
接眼レンズ２４に導かれる。ダイクロイックミラー１７
よりも前の落射照明光路中には、バンドストップフィル
ター１３が配置されている。このバンドストップフィル
ター１３は、透過波長帯域を吸収し、複数の狭帯域励起
光波長の光の光量を変えるように少なくとも一つの吸収
波長帯域を有している。
トを交換せずに、３重染色以上の蛍光標本の各蛍光色素
から発する蛍光強度を調節可能にする。 【構成】光源１１から発せられた照明光は励起フィルタ
ー１６を通過することにより、複数の狭帯域励起光波長
の光に変換される。その後、照明光はダイクロイックミ
ラー１７で反射し、対物レンズ１８を介して標本２０に
照射される。標本２０から発した蛍光は吸収フィルター
２１を通過した後、観察用接眼レンズ２３又は写真撮影
接眼レンズ２４に導かれる。ダイクロイックミラー１７
よりも前の落射照明光路中には、バンドストップフィル
ター１３が配置されている。このバンドストップフィル
ター１３は、透過波長帯域を吸収し、複数の狭帯域励起
光波長の光の光量を変えるように少なくとも一つの吸収
波長帯域を有している。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医学や生物学などの分
野において、生物組織などの状態を観察するときに利用
される落射蛍光顕微鏡に関し、特に、標本から発する複
数種類の蛍光の強度を調整することができる落射蛍光顕
微鏡に関する。
野において、生物組織などの状態を観察するときに利用
される落射蛍光顕微鏡に関し、特に、標本から発する複
数種類の蛍光の強度を調整することができる落射蛍光顕
微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に、この種の落射蛍光顕微鏡は、医
学、生物学その他の分野において生物組織細胞上で蛍光
標識が施こされた蛋白や遺伝子などを検出するために用
いられている。特に、近年では、微弱な蛍光しか発しな
い物質であっても、複数の蛍光標識による多重染色によ
って、他の物質との間の相互位置関係を調べるために多
用されるようになっている。
学、生物学その他の分野において生物組織細胞上で蛍光
標識が施こされた蛋白や遺伝子などを検出するために用
いられている。特に、近年では、微弱な蛍光しか発しな
い物質であっても、複数の蛍光標識による多重染色によ
って、他の物質との間の相互位置関係を調べるために多
用されるようになっている。
【０００３】従来、このような落射蛍光顕微鏡を用いて
多重染色蛍光標本を観察する場合、各々単一の蛍光色素
のみを観察するための蛍光フィルターセット（励起フィ
ルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターなど）
を色素毎に交換することによって観察が行われていた。
このため、各蛍光色素相互間の位置関係を決定するため
には、各蛍光像を写真やビデオメモリーに多重記録して
表示することが必要であった。
多重染色蛍光標本を観察する場合、各々単一の蛍光色素
のみを観察するための蛍光フィルターセット（励起フィ
ルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターなど）
を色素毎に交換することによって観察が行われていた。
このため、各蛍光色素相互間の位置関係を決定するため
には、各蛍光像を写真やビデオメモリーに多重記録して
表示することが必要であった。
【０００４】蛍光フィルターセットの交換操作は長時間
を要するばかりでなく、例えば、褪色の速い蛍光色素
や、時間をパラメーターとした蛍光色素相互間の位置関
係の検出には不向きである。また、従来の観察方法にお
いては、ダイクロイックミラーや吸収フィルターなどの
部品精度が低いと、蛍光フィルターセットの切り換えに
伴って観察光学系の芯ずれが発生することがあり、蛍光
像から検出される相互位置関係にも誤差が生じるという
問題が生じていた。
を要するばかりでなく、例えば、褪色の速い蛍光色素
や、時間をパラメーターとした蛍光色素相互間の位置関
係の検出には不向きである。また、従来の観察方法にお
いては、ダイクロイックミラーや吸収フィルターなどの
部品精度が低いと、蛍光フィルターセットの切り換えに
伴って観察光学系の芯ずれが発生することがあり、蛍光
像から検出される相互位置関係にも誤差が生じるという
問題が生じていた。
【０００５】このため、最近では、このような問題に対
処可能な蛍光フィルターセットが用いられている。この
蛍光フィルターセットは、２種類の蛍光色素Ａ，Ｂを効
率的に励起する２つの高透過率領域λEA、λEBを有する
励起フィルターと、これら２つの領域λEAとλEBとの間
及び領域λEBよりも長い波長領域の２つの高透過率領域
を有するダイクロイックミラーと、吸収フィルターとを
組み合わせたものであり、２種類の蛍光色素Ａ，Ｂを同
時に観察することができる。
処可能な蛍光フィルターセットが用いられている。この
蛍光フィルターセットは、２種類の蛍光色素Ａ，Ｂを効
率的に励起する２つの高透過率領域λEA、λEBを有する
励起フィルターと、これら２つの領域λEAとλEBとの間
及び領域λEBよりも長い波長領域の２つの高透過率領域
を有するダイクロイックミラーと、吸収フィルターとを
組み合わせたものであり、２種類の蛍光色素Ａ，Ｂを同
時に観察することができる。
【０００６】また、３種類の蛍光色素Ａ，Ｂ，Ｃを同時
に観察することができる蛍光フィルターセットも用いら
れている。この蛍光フィルターセットは、３種類の蛍光
色素Ａ，Ｂ，Ｃを効率的に励起する３つの高透過率領域
λEC、λED、λEEを有する３重励起フィルターと、ダイ
クロイックミラーと、吸収フィルターとを組み合わせた
ものである。
に観察することができる蛍光フィルターセットも用いら
れている。この蛍光フィルターセットは、３種類の蛍光
色素Ａ，Ｂ，Ｃを効率的に励起する３つの高透過率領域
λEC、λED、λEEを有する３重励起フィルターと、ダイ
クロイックミラーと、吸収フィルターとを組み合わせた
ものである。
【０００７】これまでは、蛍光色素毎の蛍光強度の相違
などにより、２種類の蛍光色素を所望の明るさになるよ
うにバランスをとることは難しいとされてきたが、２種
類の蛍光色素の蛍光強度を調節する手段としては、例え
ば、観察光路中の吸収フィルターの特性を変えるか、ま
たは、観察光路中に補助フィルターを挿入し、標本から
発する蛍光を部分的にカットする蛍光カット手段や、照
明光路中に分光選択吸収を示さない中性濃度のＮＤフィ
ルターを挿入するか、または、開口絞りを調節すること
によって照明光の強度を調節する光強度調節手段など考
えられる。
などにより、２種類の蛍光色素を所望の明るさになるよ
うにバランスをとることは難しいとされてきたが、２種
類の蛍光色素の蛍光強度を調節する手段としては、例え
ば、観察光路中の吸収フィルターの特性を変えるか、ま
たは、観察光路中に補助フィルターを挿入し、標本から
発する蛍光を部分的にカットする蛍光カット手段や、照
明光路中に分光選択吸収を示さない中性濃度のＮＤフィ
ルターを挿入するか、または、開口絞りを調節すること
によって照明光の強度を調節する光強度調節手段など考
えられる。
【０００８】しかしながら、前者の蛍光カット手段で
は、カットされた部分の蛍光を励起した励起光が無駄に
なり、その分、蛍光の利用効率が低下し、標本にも余分
なダメージを与えることになる。一方、後者の光強度調
節手段では、２波長の励起光強度を各々独立的に調整で
きないので、２種類の蛍光の強度比を変えることができ
ない。
は、カットされた部分の蛍光を励起した励起光が無駄に
なり、その分、蛍光の利用効率が低下し、標本にも余分
なダメージを与えることになる。一方、後者の光強度調
節手段では、２波長の励起光強度を各々独立的に調整で
きないので、２種類の蛍光の強度比を変えることができ
ない。
【０００９】これらの２重、３重あるいはそれ以上の蛍
光フィルターセットを用いれば、観察光学系の芯ずれの
問題は解消できるが、蛍光強度の相違や蛍光色素の褪色
速度の相違がある場合には、２種類以上の蛍光強度を所
望の明るさに調整することが困難である。その結果、写
真撮影時や観察時に一つの蛍光像が明るすぎたり、また
は、その逆に、暗すぎたりすることがある。
光フィルターセットを用いれば、観察光学系の芯ずれの
問題は解消できるが、蛍光強度の相違や蛍光色素の褪色
速度の相違がある場合には、２種類以上の蛍光強度を所
望の明るさに調整することが困難である。その結果、写
真撮影時や観察時に一つの蛍光像が明るすぎたり、また
は、その逆に、暗すぎたりすることがある。
【００１０】このような問題を解決するため、特開平５
−１５０１６４号公報は、２つの励起光帯域間に透過特
性を有するバンドパスタイプの波長シフトフィルターを
照明光路中に配置することを提案している。この波長シ
フトフィルターは干渉フィルターからなり、落射照明光
軸に対して適当な角度に傾けて透過帯域をシフトさせる
か、あるいは、複数の狭帯域励起光の中の２つの狭帯域
励起光波長に対して、短波長側の狭帯域励起光の透過率
が高いフィルター又は狭帯域励起光の長波長側の透過率
が高いフィルターの何れかを選択し、そのフィルターを
落射照明光路に挿脱自在に配置することによって、透過
光の強度を調整している。この結果、複数の狭帯域励起
光の中の２つの励起光の強度を調整し、２つの蛍光像の
強度を効率的に調整することができるとされている。
−１５０１６４号公報は、２つの励起光帯域間に透過特
性を有するバンドパスタイプの波長シフトフィルターを
照明光路中に配置することを提案している。この波長シ
フトフィルターは干渉フィルターからなり、落射照明光
軸に対して適当な角度に傾けて透過帯域をシフトさせる
か、あるいは、複数の狭帯域励起光の中の２つの狭帯域
励起光波長に対して、短波長側の狭帯域励起光の透過率
が高いフィルター又は狭帯域励起光の長波長側の透過率
が高いフィルターの何れかを選択し、そのフィルターを
落射照明光路に挿脱自在に配置することによって、透過
光の強度を調整している。この結果、複数の狭帯域励起
光の中の２つの励起光の強度を調整し、２つの蛍光像の
強度を効率的に調整することができるとされている。
【００１１】また、特開平６−３３１８９４号公報は、
複数の分離用ダイクロイックミラーを設け、各励起光の
光量を各々個別に調整するための複数の光路を介挿する
ことを提案している。各励起光の光量調整後において各
励起光を１つの光束に集光するために集光用ダイクロイ
ックミラーが配置されており、このダイクロイックミラ
ーを介して落射照明光路に収束光が導入される。
複数の分離用ダイクロイックミラーを設け、各励起光の
光量を各々個別に調整するための複数の光路を介挿する
ことを提案している。各励起光の光量調整後において各
励起光を１つの光束に集光するために集光用ダイクロイ
ックミラーが配置されており、このダイクロイックミラ
ーを介して落射照明光路に収束光が導入される。
【００１２】また、特開平２−１１４４０２号公報で
は、単一波長のバンドパスフィルターを照明光路中に該
光路と垂直に配置し、もう１枚の干渉フィルターを傾動
可能に設け、バンドパスフィルターの単一波長の強度を
連続的に変えられるようにしている。
は、単一波長のバンドパスフィルターを照明光路中に該
光路と垂直に配置し、もう１枚の干渉フィルターを傾動
可能に設け、バンドパスフィルターの単一波長の強度を
連続的に変えられるようにしている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】以上のように種々の解
決策が提案されているが、特開平５−１５０１６４号公
報において提案されている励起光強度を調整する干渉フ
ィルターは、複数の励起光のうちの２つの蛍光強度を調
整できるに過ぎないものである。すなわち、３重以上の
励起光のうちの２つの励起光の強度をこの干渉フィルタ
ーで調整すると、他の励起光は干渉フィルターにより全
てカットされることになり、この干渉フィルターでは３
重励起以上の励起光の強度の調整は不可能である。
決策が提案されているが、特開平５−１５０１６４号公
報において提案されている励起光強度を調整する干渉フ
ィルターは、複数の励起光のうちの２つの蛍光強度を調
整できるに過ぎないものである。すなわち、３重以上の
励起光のうちの２つの励起光の強度をこの干渉フィルタ
ーで調整すると、他の励起光は干渉フィルターにより全
てカットされることになり、この干渉フィルターでは３
重励起以上の励起光の強度の調整は不可能である。
【００１４】また、複数の狭帯域励起光のうちの２つの
励起光波長に対して、透過率の異なる２つのフィルター
を選択して配置する場合には、３つ以上の蛍光の強度に
着目していないために、各々の蛍光強度を自由に変える
ことは不可能である。また、特開平６−３３１８９４号
公報に記載された構成では、複数の狭帯域励起光から各
励起光を分離するダイクロイックミラーと、強度調整を
行うフィルターとを各々設けるために、構成部品が多く
なり、構造も複雑になる。さらに、励起光の損失も大き
くなり、効率的に励起することは困難である。さらに、
特開平２−１１４４０２号公報にはバンドパスフィルタ
ーの特性については何ら言及されておらず、しかも、特
開平５−１５０１６４号と同様の理由により、バンドパ
スフィルターでは３つ以上の蛍光強度の比を調整するこ
とができず、単一波長の励起光の強度を調整することが
できるにすぎない。
励起光波長に対して、透過率の異なる２つのフィルター
を選択して配置する場合には、３つ以上の蛍光の強度に
着目していないために、各々の蛍光強度を自由に変える
ことは不可能である。また、特開平６−３３１８９４号
公報に記載された構成では、複数の狭帯域励起光から各
励起光を分離するダイクロイックミラーと、強度調整を
行うフィルターとを各々設けるために、構成部品が多く
なり、構造も複雑になる。さらに、励起光の損失も大き
くなり、効率的に励起することは困難である。さらに、
特開平２−１１４４０２号公報にはバンドパスフィルタ
ーの特性については何ら言及されておらず、しかも、特
開平５−１５０１６４号と同様の理由により、バンドパ
スフィルターでは３つ以上の蛍光強度の比を調整するこ
とができず、単一波長の励起光の強度を調整することが
できるにすぎない。
【００１５】本発明は上記のような問題点に鑑みてなさ
れたものであり、蛍光フィルターセットを切り換えるこ
となく、さらに、２重染色された蛍光標本だけでなく３
重染色以上の蛍光標本に対しても各蛍光色素から発する
蛍光強度を簡単な操作で変えることができ、観察しやす
い蛍光像を効率的に得ることができる落射蛍光顕微鏡を
提供することを目的とする。
れたものであり、蛍光フィルターセットを切り換えるこ
となく、さらに、２重染色された蛍光標本だけでなく３
重染色以上の蛍光標本に対しても各蛍光色素から発する
蛍光強度を簡単な操作で変えることができ、観察しやす
い蛍光像を効率的に得ることができる落射蛍光顕微鏡を
提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段及び作用】この目的を達成
するため、本発明に係る落射蛍光顕微鏡は、落射照明光
源から投射された光束を複数の狭帯域励起光波長の光に
変換する励起フィルターと、該励起フィルターによって
変換された複数の狭帯域励起光波長の光を標本に照射
し、該標本から発せられる複数種類の蛍光を透過させる
ダイクロイックミラーと、該ダイクロイックミラーを透
過した光から余分な波長域を吸収し、蛍光像の波長を透
過させる吸収フィルターとを有する落射蛍光顕微鏡にお
いて、透過波長帯域を吸収し、前記複数の狭帯域励起光
波長の光の光量を変えるように少なくとも一つの吸収波
長帯域を有するバンドストップフィルターを前記ダイク
ロイックミラーよりも前の落射照明光路中に少なくとも
１個配置したことを特徴とする。
するため、本発明に係る落射蛍光顕微鏡は、落射照明光
源から投射された光束を複数の狭帯域励起光波長の光に
変換する励起フィルターと、該励起フィルターによって
変換された複数の狭帯域励起光波長の光を標本に照射
し、該標本から発せられる複数種類の蛍光を透過させる
ダイクロイックミラーと、該ダイクロイックミラーを透
過した光から余分な波長域を吸収し、蛍光像の波長を透
過させる吸収フィルターとを有する落射蛍光顕微鏡にお
いて、透過波長帯域を吸収し、前記複数の狭帯域励起光
波長の光の光量を変えるように少なくとも一つの吸収波
長帯域を有するバンドストップフィルターを前記ダイク
ロイックミラーよりも前の落射照明光路中に少なくとも
１個配置したことを特徴とする。
【００１７】このバンドストップフィルターの吸収帯域
が複数の狭帯域励起光波長の一部中に存在すると、その
狭帯域励起光の一部が吸収されることによって、励起光
強度が変化する。その他の狭帯域励起光は、バンドスト
ップフィルターが高い透過率を有しているため、カット
されない。さらに、他の狭帯域励起光波長の一部に吸収
帯域を有するバンドストップフィルターを落射照明光路
中に配置することによって、同様に、その狭帯域励起光
の強度を調整することができる。従って、複数の狭帯域
励起光の強度の比を調整することによって、標本から発
する複数の蛍光の強度の比を効率的に調整することがで
きる。
が複数の狭帯域励起光波長の一部中に存在すると、その
狭帯域励起光の一部が吸収されることによって、励起光
強度が変化する。その他の狭帯域励起光は、バンドスト
ップフィルターが高い透過率を有しているため、カット
されない。さらに、他の狭帯域励起光波長の一部に吸収
帯域を有するバンドストップフィルターを落射照明光路
中に配置することによって、同様に、その狭帯域励起光
の強度を調整することができる。従って、複数の狭帯域
励起光の強度の比を調整することによって、標本から発
する複数の蛍光の強度の比を効率的に調整することがで
きる。
【００１８】本発明の好ましい実施態様においては、前
記バンドストップフィルターは、前記複数の狭帯域励起
光波長の中の隣接する二つの狭帯域励起光波長のうち、
短波長側の狭帯域励起光波長の領域をカットし、また
は、該領域に対して部分的に低い透過率を有し、かつ、
長波長側の狭帯域励起光波長の領域では高い透過率を有
する状態から、短波長側の狭帯域励起光波長の領域では
高い透過率を有し、かつ、長波長側の狭帯域励起光波長
の領域をカットし、または、該領域に対して部分的に低
い透過率を有する状態に変化するように、前記落射照明
光路に対して傾斜させて配置することにより、透過波長
帯域をシフトする干渉フィルターであることを特徴とす
る。
記バンドストップフィルターは、前記複数の狭帯域励起
光波長の中の隣接する二つの狭帯域励起光波長のうち、
短波長側の狭帯域励起光波長の領域をカットし、また
は、該領域に対して部分的に低い透過率を有し、かつ、
長波長側の狭帯域励起光波長の領域では高い透過率を有
する状態から、短波長側の狭帯域励起光波長の領域では
高い透過率を有し、かつ、長波長側の狭帯域励起光波長
の領域をカットし、または、該領域に対して部分的に低
い透過率を有する状態に変化するように、前記落射照明
光路に対して傾斜させて配置することにより、透過波長
帯域をシフトする干渉フィルターであることを特徴とす
る。
【００１９】干渉フィルターであるバンドストップフィ
ルターを落射照明光路に対して適当な角度に傾斜させて
配置することにより、バンドストップフィルターに入射
する励起光の入射角が変化する。
ルターを落射照明光路に対して適当な角度に傾斜させて
配置することにより、バンドストップフィルターに入射
する励起光の入射角が変化する。
【００２０】一般に、干渉フィルターの干渉条件は、最
大透過波長をλ、誘電体の光学的な厚さ（誘電体の境界
で生じる位相差も光路長に換算して含ませる）をｔ、境
界における屈折角をΦとすると、次式で表すことができ
る。 ２ｔ・ｃｏｓΦ＝ｍλ ここで、次数ｍを一定とし、かつ、干渉条件を一定とす
ると、波長λはｃｏｓΦに比例する。Φは屈折角である
が、スネルの法則により、入射角と共役なので両者は同
等と考えられる。従って、上式から明らかであるよう
に、入射角が大きくなるほど、ｃｏｓΦが減少し、同時
に、波長λも減少し、最大透過率部分は徐々に低波長側
にシフトしていく。このため、バンドストップフィルタ
ーを光路に垂直な方向の軸から徐々に４５度まで傾斜さ
せていくと、長波長側から短波長側へシフトしていく。
大透過波長をλ、誘電体の光学的な厚さ（誘電体の境界
で生じる位相差も光路長に換算して含ませる）をｔ、境
界における屈折角をΦとすると、次式で表すことができ
る。 ２ｔ・ｃｏｓΦ＝ｍλ ここで、次数ｍを一定とし、かつ、干渉条件を一定とす
ると、波長λはｃｏｓΦに比例する。Φは屈折角である
が、スネルの法則により、入射角と共役なので両者は同
等と考えられる。従って、上式から明らかであるよう
に、入射角が大きくなるほど、ｃｏｓΦが減少し、同時
に、波長λも減少し、最大透過率部分は徐々に低波長側
にシフトしていく。このため、バンドストップフィルタ
ーを光路に垂直な方向の軸から徐々に４５度まで傾斜さ
せていくと、長波長側から短波長側へシフトしていく。
【００２１】すなわち、入射角を０度（光路に垂直な方
向）に近づけていくと、バンドストップフィルターの吸
収帯域が徐々に長波長側にシフトし、複数の狭帯域励起
光のうち隣接する２つの狭帯域励起光の長波長側の狭帯
域励起光にバンドストップフィルターの吸収帯域が重な
ってくるために、長波長側の狭帯域励起光の強度が弱く
なり、バンドストップフィルターの吸収帯域が長波長側
の狭帯域励起光帯域と一致すると長波長側の狭帯域励起
光がカットされる。
向）に近づけていくと、バンドストップフィルターの吸
収帯域が徐々に長波長側にシフトし、複数の狭帯域励起
光のうち隣接する２つの狭帯域励起光の長波長側の狭帯
域励起光にバンドストップフィルターの吸収帯域が重な
ってくるために、長波長側の狭帯域励起光の強度が弱く
なり、バンドストップフィルターの吸収帯域が長波長側
の狭帯域励起光帯域と一致すると長波長側の狭帯域励起
光がカットされる。
【００２２】逆に、入射角を４５度に近づけていくと、
バンドストップフィルターの吸収帯域が徐々に短波長側
にシフトし、複数の狭帯域励起光のうち隣接する２つの
狭帯域励起光の短波長側の狭帯域励起光にバンドストッ
プフィルターの吸収帯域が重なってくるために、短波長
側の狭帯域励起光の強度が弱くなり、バンドストップフ
ィルターの吸収帯域が短波長側の狭帯域励起光帯域と一
致すると短波長側の狭帯域励起光がカットされる。
バンドストップフィルターの吸収帯域が徐々に短波長側
にシフトし、複数の狭帯域励起光のうち隣接する２つの
狭帯域励起光の短波長側の狭帯域励起光にバンドストッ
プフィルターの吸収帯域が重なってくるために、短波長
側の狭帯域励起光の強度が弱くなり、バンドストップフ
ィルターの吸収帯域が短波長側の狭帯域励起光帯域と一
致すると短波長側の狭帯域励起光がカットされる。
【００２３】このバンドストップフィルターは隣接する
２つの狭帯域励起光帯域間にのみ吸収帯域があり、長波
長側の狭帯域励起光帯域では高い透過率を有するので、
その他の狭帯域励起光はカットされない。さらに他の隣
接する２つの狭帯域励起光帯域間に吸収帯域を有するバ
ンドストップフィルターを落射照明光路に対して適当な
角度に傾斜させることによって、隣接する２つの狭帯域
励起光の強度の比を調整することができる。このよう
に、複数の狭帯域励起光の強度の比を調整することによ
って、標本から発する複数の蛍光の強度の比を効率的に
調整することができる。
２つの狭帯域励起光帯域間にのみ吸収帯域があり、長波
長側の狭帯域励起光帯域では高い透過率を有するので、
その他の狭帯域励起光はカットされない。さらに他の隣
接する２つの狭帯域励起光帯域間に吸収帯域を有するバ
ンドストップフィルターを落射照明光路に対して適当な
角度に傾斜させることによって、隣接する２つの狭帯域
励起光の強度の比を調整することができる。このよう
に、複数の狭帯域励起光の強度の比を調整することによ
って、標本から発する複数の蛍光の強度の比を効率的に
調整することができる。
【００２４】本発明の好ましい実施態様においては、前
記ダイクロイックミラーよりも前の前記落射照明光路中
にバンドパスフィルターが設けられる。このバンドパス
フィルターは、複数の狭帯域励起光波長領域のうち、最
も短い波長側の狭帯域励起光波長領域から最も長い波長
側の狭帯域励起光波長領域の間において高い透過率を有
する１枚の干渉フィルターからなる。さらに、このバン
ドパスフィルターは、最も短い波長側の狭帯域励起光波
長領域をカットし、かつ、最も長い波長側の狭帯域励起
光波長領域では高い透過率を有する状態から、最も長い
波長側の透過率をカットし、かつ、最も短い波長側の狭
帯域励起光波長領域では高い透過率を有する状態に変化
するように、前記落射照明光路に対して傾斜させて配置
することにより、透過波長帯域をシフトする。
記ダイクロイックミラーよりも前の前記落射照明光路中
にバンドパスフィルターが設けられる。このバンドパス
フィルターは、複数の狭帯域励起光波長領域のうち、最
も短い波長側の狭帯域励起光波長領域から最も長い波長
側の狭帯域励起光波長領域の間において高い透過率を有
する１枚の干渉フィルターからなる。さらに、このバン
ドパスフィルターは、最も短い波長側の狭帯域励起光波
長領域をカットし、かつ、最も長い波長側の狭帯域励起
光波長領域では高い透過率を有する状態から、最も長い
波長側の透過率をカットし、かつ、最も短い波長側の狭
帯域励起光波長領域では高い透過率を有する状態に変化
するように、前記落射照明光路に対して傾斜させて配置
することにより、透過波長帯域をシフトする。
【００２５】このバンドパスフィルターは干渉フィルタ
ーであるので、０度から４５度まで入射角を変化させる
と、長波長側から短波長側へバンドパスフィルターの透
過帯域がシフトする。
ーであるので、０度から４５度まで入射角を変化させる
と、長波長側から短波長側へバンドパスフィルターの透
過帯域がシフトする。
【００２６】すなわち、入射角を０度に近づけていく
と、バンドパスフィルターの透過帯域が長波長側へシフ
トし、複数の狭帯域励起光波長のうち最も短い波長側の
狭帯域励起光波長帯域の短波長側から徐々にバンドパス
フィルターの不透過帯域に重なるので、最も短波長側の
狭帯域励起光強度が小さくなり、バンドパスフィルター
の不透過領域に完全に重なると、短波長側の狭帯域励起
光がカットされる。この際には、バンドパスフィルター
の透過率は高いため、他の狭帯域励起光はカットされな
い。
と、バンドパスフィルターの透過帯域が長波長側へシフ
トし、複数の狭帯域励起光波長のうち最も短い波長側の
狭帯域励起光波長帯域の短波長側から徐々にバンドパス
フィルターの不透過帯域に重なるので、最も短波長側の
狭帯域励起光強度が小さくなり、バンドパスフィルター
の不透過領域に完全に重なると、短波長側の狭帯域励起
光がカットされる。この際には、バンドパスフィルター
の透過率は高いため、他の狭帯域励起光はカットされな
い。
【００２７】逆に、入射角を４５度に近づけていくと、
バンドパスフィルターの透過帯域が短波長側へシフト
し、複数の狭帯域励起光波長のうち最も長い波長側の狭
帯域励起光波長帯域の長波長側から徐々にバンドパスフ
ィルターの不透過帯域に重なるので、最も長波長側の狭
帯域励起光強度が小さくなり、バンドパスフィルターの
不透過領域に完全に重なると、長波長側の狭帯域励起光
がカットされる。この際には、バンドパスフィルターの
透過率は高いため、他の狭帯域励起光はカットされな
い。
バンドパスフィルターの透過帯域が短波長側へシフト
し、複数の狭帯域励起光波長のうち最も長い波長側の狭
帯域励起光波長帯域の長波長側から徐々にバンドパスフ
ィルターの不透過帯域に重なるので、最も長波長側の狭
帯域励起光強度が小さくなり、バンドパスフィルターの
不透過領域に完全に重なると、長波長側の狭帯域励起光
がカットされる。この際には、バンドパスフィルターの
透過率は高いため、他の狭帯域励起光はカットされな
い。
【００２８】最も短波長側と最も長波長側の狭帯域励起
光波長以外の狭帯域励起光の強度調整は、その狭帯域励
起光を含む隣接する２つの狭帯域励起光波長帯域間に吸
収帯域を有するバンドストップフィルターを落射照明光
路に対して適当な角度に傾斜させることにより、隣接す
る２つの狭帯域励起光の強度の比を調整することができ
る。このバンドストップフィルターとバンドパスフィル
ターを落射照明光路中に独立して傾動可能に配置するこ
とにより、複数の狭帯域励起光の強度の比を調整するこ
とができ、複数の蛍光の強度の比を効率的に調整するこ
とができる。
光波長以外の狭帯域励起光の強度調整は、その狭帯域励
起光を含む隣接する２つの狭帯域励起光波長帯域間に吸
収帯域を有するバンドストップフィルターを落射照明光
路に対して適当な角度に傾斜させることにより、隣接す
る２つの狭帯域励起光の強度の比を調整することができ
る。このバンドストップフィルターとバンドパスフィル
ターを落射照明光路中に独立して傾動可能に配置するこ
とにより、複数の狭帯域励起光の強度の比を調整するこ
とができ、複数の蛍光の強度の比を効率的に調整するこ
とができる。
【００２９】
〔実施例１〕図１は本発明に係る落射蛍光顕微鏡の第一
実施例の構成図である。水銀ランプその他の光源１１か
ら射出された光はコレクターレンズ１２により集光さ
れ、バンドストップフィルター１３、開口絞り１４及び
視野絞り１５を経て、励起フィルター１６を通過する。
この励起フィルター１６は図２に示すような透過率を有
している。励起フィルター１６を通過した光はダイクロ
イックミラー１７で反射し、対物レンズ１８を介して、
ステージ１９上に載置されている標本２０に照射され
る。
実施例の構成図である。水銀ランプその他の光源１１か
ら射出された光はコレクターレンズ１２により集光さ
れ、バンドストップフィルター１３、開口絞り１４及び
視野絞り１５を経て、励起フィルター１６を通過する。
この励起フィルター１６は図２に示すような透過率を有
している。励起フィルター１６を通過した光はダイクロ
イックミラー１７で反射し、対物レンズ１８を介して、
ステージ１９上に載置されている標本２０に照射され
る。
【００３０】標本２０に光が照射されると、標本２０か
らは複数種類の蛍光が発せられる。これらの蛍光は対物
レンズ１８を介してダイクロイックミラー１７に導かれ
る。ダイクロイックミラー１７の出射側には、図２に示
すような透過率を有する吸収フィルター２１と、光路を
観察系又は写真撮影系の何れかに切り換えるビームスプ
リッター２２とが配置されている。ビームスプリッター
２２は光路に挿脱自在に配置されている。ビームスプリ
ッター２２の観察系光路側には接眼光学系２３が、写真
撮影系光路側には写真撮影用接眼レンズ２４がそれぞれ
配置されている。
らは複数種類の蛍光が発せられる。これらの蛍光は対物
レンズ１８を介してダイクロイックミラー１７に導かれ
る。ダイクロイックミラー１７の出射側には、図２に示
すような透過率を有する吸収フィルター２１と、光路を
観察系又は写真撮影系の何れかに切り換えるビームスプ
リッター２２とが配置されている。ビームスプリッター
２２は光路に挿脱自在に配置されている。ビームスプリ
ッター２２の観察系光路側には接眼光学系２３が、写真
撮影系光路側には写真撮影用接眼レンズ２４がそれぞれ
配置されている。
【００３１】本実施例に係る落射蛍光顕微鏡は２つの蛍
光を同時観察する２重励起用のものである。励起フィル
ター１６、ダイクロイックミラー１７及び吸収フィルタ
ー２１の特性を図２に示す。バンドストップフィルター
１３は隣接する狭帯域励起光波長λEA、λEBの間に吸収
帯域を有しており、ダイクロイックミラー１７よりも前
の落射照明光路に対して傾斜可能であるように配置され
ている。このバンドストップフィルター１３は干渉フィ
ルターであり、励起波長λEA、λEBに対して図４（Ａ）
のような特性を備えている。
光を同時観察する２重励起用のものである。励起フィル
ター１６、ダイクロイックミラー１７及び吸収フィルタ
ー２１の特性を図２に示す。バンドストップフィルター
１３は隣接する狭帯域励起光波長λEA、λEBの間に吸収
帯域を有しており、ダイクロイックミラー１７よりも前
の落射照明光路に対して傾斜可能であるように配置され
ている。このバンドストップフィルター１３は干渉フィ
ルターであり、励起波長λEA、λEBに対して図４（Ａ）
のような特性を備えている。
【００３２】前述したように、一般に、干渉フィルター
の干渉条件は、最大透過波長をλ、誘電体の光学的な厚
さ（誘電体の境界で生じる位相差も光路長に換算して含
ませる）をｔ、境界における屈折角をΦとすると、次式
で表すことができる。 ２ｔ・ｃｏｓΦ＝ｍλ ここで、次数ｍを一定とし、かつ、干渉条件を一定とす
ると、波長λはｃｏｓΦに比例する。Φは屈折角である
が、スネルの法則により、入射角と共役なので両者は同
等と考えられる。従って、入射角が大きくなるほど、ｃ
ｏｓΦが減少し、同時に、波長λも減少し、最大透過率
部分は徐々に低波長側にシフトしていく。このため、光
路に垂直な方向の軸から徐々に４５度まで傾斜させてい
くと、図４（Ｂ）のような透過率波長域から図４（Ｃ）
のような透過率波長域まで連続的に透過率波長域をシフ
トさせることができる。
の干渉条件は、最大透過波長をλ、誘電体の光学的な厚
さ（誘電体の境界で生じる位相差も光路長に換算して含
ませる）をｔ、境界における屈折角をΦとすると、次式
で表すことができる。 ２ｔ・ｃｏｓΦ＝ｍλ ここで、次数ｍを一定とし、かつ、干渉条件を一定とす
ると、波長λはｃｏｓΦに比例する。Φは屈折角である
が、スネルの法則により、入射角と共役なので両者は同
等と考えられる。従って、入射角が大きくなるほど、ｃ
ｏｓΦが減少し、同時に、波長λも減少し、最大透過率
部分は徐々に低波長側にシフトしていく。このため、光
路に垂直な方向の軸から徐々に４５度まで傾斜させてい
くと、図４（Ｂ）のような透過率波長域から図４（Ｃ）
のような透過率波長域まで連続的に透過率波長域をシフ
トさせることができる。
【００３３】従って、図４（Ａ）乃至（Ｃ）に示すよう
な特性を有するバンドストップフィルター１３を落射照
明光路に対して垂直な方向（傾斜角度０度）に配置し、
さらに、励起フィルター１６を併用すれば、励起光は図
４（Ｂ）に示した斜線部分となる。同図から明らかであ
るように、励起フィルター１６から得られる励起光のう
ち長波長側の励起光波長帯域λEBではほとんどの帯域が
カットされる。一方、短波長側の励起光波長帯域λEAで
はバンドストップフィルター１３の影響を受けていない
ので、２つの励起光λEA、λEBの強度比が変化してい
る。すなわち、２つの励起光λEA、λEBによって励起さ
れる２種類の蛍光の強度比を変えることができる。
な特性を有するバンドストップフィルター１３を落射照
明光路に対して垂直な方向（傾斜角度０度）に配置し、
さらに、励起フィルター１６を併用すれば、励起光は図
４（Ｂ）に示した斜線部分となる。同図から明らかであ
るように、励起フィルター１６から得られる励起光のう
ち長波長側の励起光波長帯域λEBではほとんどの帯域が
カットされる。一方、短波長側の励起光波長帯域λEAで
はバンドストップフィルター１３の影響を受けていない
ので、２つの励起光λEA、λEBの強度比が変化してい
る。すなわち、２つの励起光λEA、λEBによって励起さ
れる２種類の蛍光の強度比を変えることができる。
【００３４】次に、落射照明光軸に対して４５度傾けて
設定したバンドストップフィルター１３と励起フィルタ
ー１６とを併用すれば、励起光は図４（Ｃ）の斜線部分
となる。この場合には、励起フィルター１６から得られ
る励起光のうち短波長側の励起波長帯域λEAでは、ほと
んどの帯域がカットされる。一方、長波長側の励起波長
帯域λEBでは、バンドストップフィルター１３の影響を
受けていないので、２つの励起光λEA、λEBの強度比が
変化している。すなわち、２つの励起光λEA、λEBによ
って励起される２種類の蛍光の強度比を変えることがで
きる。
設定したバンドストップフィルター１３と励起フィルタ
ー１６とを併用すれば、励起光は図４（Ｃ）の斜線部分
となる。この場合には、励起フィルター１６から得られ
る励起光のうち短波長側の励起波長帯域λEAでは、ほと
んどの帯域がカットされる。一方、長波長側の励起波長
帯域λEBでは、バンドストップフィルター１３の影響を
受けていないので、２つの励起光λEA、λEBの強度比が
変化している。すなわち、２つの励起光λEA、λEBによ
って励起される２種類の蛍光の強度比を変えることがで
きる。
【００３５】さらに、バンドストップフィルター１３の
傾斜角が０度と４５度の２つの状態の間、すなわち、バ
ンドストップフィルター１３を図４（Ｂ）に示す傾き０
度の状態から、図４（Ｃ）に示す傾き４５度の状態に向
かって傾斜させていく間においては、バンドストップフ
ィルター１３による吸収帯域はその傾斜角に応じて短波
長側にシフトしていく。このとき、長波長側の励起波長
帯域λEBではカットされる帯域が徐々に少なくなり、励
起光の強度が増加していく。また、短波長側の励起波長
帯域λEAでは、バンドストップフィルター１３の吸収領
域に重なってくるので、長波長側から徐々にカットされ
る領域が増え、それに伴って、励起光の強度が減少して
いく。
傾斜角が０度と４５度の２つの状態の間、すなわち、バ
ンドストップフィルター１３を図４（Ｂ）に示す傾き０
度の状態から、図４（Ｃ）に示す傾き４５度の状態に向
かって傾斜させていく間においては、バンドストップフ
ィルター１３による吸収帯域はその傾斜角に応じて短波
長側にシフトしていく。このとき、長波長側の励起波長
帯域λEBではカットされる帯域が徐々に少なくなり、励
起光の強度が増加していく。また、短波長側の励起波長
帯域λEAでは、バンドストップフィルター１３の吸収領
域に重なってくるので、長波長側から徐々にカットされ
る領域が増え、それに伴って、励起光の強度が減少して
いく。
【００３６】以上から明らかであるように、本実施例に
おいては、励起光λEA、λEBの強度比を連続的に変化さ
せることができ、これに伴い、励起光λEA、λEBにより
励起される２種類の蛍光の強度比も連続的に変化させる
ことができる。すなわち、バンドストップフィルター１
３の落射照明光路に対する傾斜角を０度と４５度の２つ
の状態の間の任意の角度に設定すれば、図４（Ｄ）のよ
うに励起光λEA、λEBにより励起される２種類の蛍光の
強度の比を調節し、所望の明るさに調節することができ
る。
おいては、励起光λEA、λEBの強度比を連続的に変化さ
せることができ、これに伴い、励起光λEA、λEBにより
励起される２種類の蛍光の強度比も連続的に変化させる
ことができる。すなわち、バンドストップフィルター１
３の落射照明光路に対する傾斜角を０度と４５度の２つ
の状態の間の任意の角度に設定すれば、図４（Ｄ）のよ
うに励起光λEA、λEBにより励起される２種類の蛍光の
強度の比を調節し、所望の明るさに調節することができ
る。
【００３７】〔実施例２〕図５は本発明に係る落射蛍光
顕微鏡の第二実施例の構成図である。本実施例に係る落
射蛍光顕微鏡は３つの蛍光を同時観察する３重励起用の
ものである。本実施例においては、第一実施例における
励起フィルター１６に代えて３重励起フィルター２５、
ダイクロイックミラー１７に代えてダイクロイックミラ
ー２６、吸収フィルター２１に代えて吸収フィルター２
７が各々配置されている。３重励起フィルター２５、ダ
イクロイックミラー２６及び吸収フィルター２７は図３
に示すような特性を有している。
顕微鏡の第二実施例の構成図である。本実施例に係る落
射蛍光顕微鏡は３つの蛍光を同時観察する３重励起用の
ものである。本実施例においては、第一実施例における
励起フィルター１６に代えて３重励起フィルター２５、
ダイクロイックミラー１７に代えてダイクロイックミラ
ー２６、吸収フィルター２１に代えて吸収フィルター２
７が各々配置されている。３重励起フィルター２５、ダ
イクロイックミラー２６及び吸収フィルター２７は図３
に示すような特性を有している。
【００３８】また、本実施例においては、第一実施例に
おけるバンドストップフィルター１３に代えて、隣接す
る狭帯域励起光波長λEC、λEDの間に吸収帯域を有する
バンドストップフィルター２８と、もう一方の隣接する
狭帯域励起光波長λED、λEEの間に吸収帯域を有するバ
ンドストップフィルター２９とが設けられている。バン
ドストップフィルター２８、２９はダイクロイックミラ
ー２６以前の落射照明光路中において、該光路に対して
各々独立して傾斜可能であるように、並べて設けられて
いる。バンドストップフィルター２８、２９は干渉フィ
ルターであり、励起波長λECとλED及びλEEに対して図
６（Ａ）のような特性を有している。バンドストップフ
ィルター２８、２９を落射照明光路に対して０度又は４
５度に傾斜させると、それぞれ図６（Ｂ）又は図６
（Ｃ）に示す特性に変化する。
おけるバンドストップフィルター１３に代えて、隣接す
る狭帯域励起光波長λEC、λEDの間に吸収帯域を有する
バンドストップフィルター２８と、もう一方の隣接する
狭帯域励起光波長λED、λEEの間に吸収帯域を有するバ
ンドストップフィルター２９とが設けられている。バン
ドストップフィルター２８、２９はダイクロイックミラ
ー２６以前の落射照明光路中において、該光路に対して
各々独立して傾斜可能であるように、並べて設けられて
いる。バンドストップフィルター２８、２９は干渉フィ
ルターであり、励起波長λECとλED及びλEEに対して図
６（Ａ）のような特性を有している。バンドストップフ
ィルター２８、２９を落射照明光路に対して０度又は４
５度に傾斜させると、それぞれ図６（Ｂ）又は図６
（Ｃ）に示す特性に変化する。
【００３９】３重励起フィルター２５、ダイクロイック
ミラー２６、吸収フィルター２７、バンドストップフィ
ルター２８、２９以外の構成要素は第一実施例と同じで
あり、このため、第一実施例（図１）と同様の符号をも
って表してある。
ミラー２６、吸収フィルター２７、バンドストップフィ
ルター２８、２９以外の構成要素は第一実施例と同じで
あり、このため、第一実施例（図１）と同様の符号をも
って表してある。
【００４０】本実施例においては、バンドストップフィ
ルター２８、２９と３重励起フィルター２５とを併用し
た場合、バンドストップフィルター２８、２９を落射照
明光軸に対して垂直な方向（傾斜角＝０度）に傾ける
と、励起光は図６（Ｂ）の斜線部分となり、４５度に傾
けると励起光は図６（Ｃ）の斜線部分となる。従って、
バンドストップフィルター２８、２９の各々を０度と４
５度の２つの状態の間の任意の角度に設定すれば、図６
（Ｄ）のように励起光λEC、λED、λEEの強度の比を調
整することができる。また、バンドストップフィルター
２８はλEC、λED以外の帯域では高い透過率を有してい
るので、λEEの励起光をカットすることはない。同様
に、バンドストップフィルター２９もλED、λEE以外の
帯域では高い透過率を有しているので、λECの励起光を
カットすることはない。このように、励起光λECとλED
及びλEEによって励起される３種類の蛍光の強度比を調
節し、所望の明るさを得ることができる。
ルター２８、２９と３重励起フィルター２５とを併用し
た場合、バンドストップフィルター２８、２９を落射照
明光軸に対して垂直な方向（傾斜角＝０度）に傾ける
と、励起光は図６（Ｂ）の斜線部分となり、４５度に傾
けると励起光は図６（Ｃ）の斜線部分となる。従って、
バンドストップフィルター２８、２９の各々を０度と４
５度の２つの状態の間の任意の角度に設定すれば、図６
（Ｄ）のように励起光λEC、λED、λEEの強度の比を調
整することができる。また、バンドストップフィルター
２８はλEC、λED以外の帯域では高い透過率を有してい
るので、λEEの励起光をカットすることはない。同様
に、バンドストップフィルター２９もλED、λEE以外の
帯域では高い透過率を有しているので、λECの励起光を
カットすることはない。このように、励起光λECとλED
及びλEEによって励起される３種類の蛍光の強度比を調
節し、所望の明るさを得ることができる。
【００４１】また、２つのバンドストップフィルター２
８、２９は落射照明光路に対して挿脱自在に設けておく
ことができる。２つの隣接する励起光の強度の比を調節
する必要がなければ、バンドストップフィルター２８、
２９は落射照明光路から外しておけばよい。さらに、４
重励起の蛍光観察の場合でも、狭帯域励起光λEF、
λEG、λEH、λ EIに対して隣接する狭帯域励起光λEF〜
λEG間とλEG〜λEH間及びλEH〜λEI間に、それぞれ吸
収帯域を有する３個のバンドストップフィルターを落射
照明光路に対して独立に傾動可能であるように配置すれ
ば、それぞれの励起光の強度比を調節することができ、
もって、励起される複数の蛍光の強度比を調節すること
ができる。５重以上の場合でも、同様にバンドストップ
フィルターを配置することにより、複数の蛍光の強度比
を調節し、所望の明るさを得ることができる。
８、２９は落射照明光路に対して挿脱自在に設けておく
ことができる。２つの隣接する励起光の強度の比を調節
する必要がなければ、バンドストップフィルター２８、
２９は落射照明光路から外しておけばよい。さらに、４
重励起の蛍光観察の場合でも、狭帯域励起光λEF、
λEG、λEH、λ EIに対して隣接する狭帯域励起光λEF〜
λEG間とλEG〜λEH間及びλEH〜λEI間に、それぞれ吸
収帯域を有する３個のバンドストップフィルターを落射
照明光路に対して独立に傾動可能であるように配置すれ
ば、それぞれの励起光の強度比を調節することができ、
もって、励起される複数の蛍光の強度比を調節すること
ができる。５重以上の場合でも、同様にバンドストップ
フィルターを配置することにより、複数の蛍光の強度比
を調節し、所望の明るさを得ることができる。
【００４２】〔実施例３〕図７は本発明に係る落射蛍光
顕微鏡の第三実施例の構成図である。本実施例に係る落
射蛍光顕微鏡は３つの蛍光を同時観察する３重励起用の
ものであって、第二実施例とは別の構成を有するもので
ある。本実施例においては、第二実施例におけるバンド
ストップフィルター２８、２９に代えて、３重励起フィ
ルター２５の最も短波長側の狭帯域励起光波長λECから
最も長波長側の狭帯域励起光波長λ EEに至るまで高い透
過率を有するバンドパスフィルター３０と、狭帯域励起
光波長λEC〜λED間又はλED〜λEE間の何れか一方に吸
収帯域を有するバンドストップフィルター３１と、狭帯
域励起光波長λEC〜λED間に吸収帯域を有するバンドス
トップフィルター３２とを備えている。これらのバンド
パスフィルター３０及びバンドストップフィルター３
１、３２はダイクロイックミラー２６以前の落射照明光
路中において、該光路に対して各々独立して傾斜可能で
あるように、並べて設けられている。
顕微鏡の第三実施例の構成図である。本実施例に係る落
射蛍光顕微鏡は３つの蛍光を同時観察する３重励起用の
ものであって、第二実施例とは別の構成を有するもので
ある。本実施例においては、第二実施例におけるバンド
ストップフィルター２８、２９に代えて、３重励起フィ
ルター２５の最も短波長側の狭帯域励起光波長λECから
最も長波長側の狭帯域励起光波長λ EEに至るまで高い透
過率を有するバンドパスフィルター３０と、狭帯域励起
光波長λEC〜λED間又はλED〜λEE間の何れか一方に吸
収帯域を有するバンドストップフィルター３１と、狭帯
域励起光波長λEC〜λED間に吸収帯域を有するバンドス
トップフィルター３２とを備えている。これらのバンド
パスフィルター３０及びバンドストップフィルター３
１、３２はダイクロイックミラー２６以前の落射照明光
路中において、該光路に対して各々独立して傾斜可能で
あるように、並べて設けられている。
【００４３】バンドパスフィルター３０及びバンドスト
ップフィルター３１、３２以外の構成要素は第一実施例
又は第二実施例と同じであり、このため、第一実施例
（図１）又は第二実施例（図５）と同様の符号をもって
表してある。バンドパスフィルター３０は干渉フィルタ
ーであり、励起波長λECとλED及びλEEに対して図８
（Ａ）のような特性を有している。このバンドパスフィ
ルター３０を落射照明光路に対して０度又は４５度に傾
斜させると、それぞれ図８（Ｂ）又は図８（Ｃ）に示す
特性に変化する。
ップフィルター３１、３２以外の構成要素は第一実施例
又は第二実施例と同じであり、このため、第一実施例
（図１）又は第二実施例（図５）と同様の符号をもって
表してある。バンドパスフィルター３０は干渉フィルタ
ーであり、励起波長λECとλED及びλEEに対して図８
（Ａ）のような特性を有している。このバンドパスフィ
ルター３０を落射照明光路に対して０度又は４５度に傾
斜させると、それぞれ図８（Ｂ）又は図８（Ｃ）に示す
特性に変化する。
【００４４】本実施例においては、バンドパスフィルタ
ー３０と３重励起フィルター２５とを併用した場合、バ
ンドパスフィルター３０を光軸に対して垂直な方向（傾
斜角＝０度）に傾けると、励起光は図８（Ｂ）の斜線部
分となり、４５度に傾けると励起光は図８（Ｃ）の斜線
部分となる。従って、バンドパスフィルター３０を落射
照明光路に対して０度と４５度の２つの状態の間の任意
の角度に設定すれば、狭帯域励起光の最も短波長側の励
起光λECと最も長波長側の励起光λEEとの強度比を調整
することができる。
ー３０と３重励起フィルター２５とを併用した場合、バ
ンドパスフィルター３０を光軸に対して垂直な方向（傾
斜角＝０度）に傾けると、励起光は図８（Ｂ）の斜線部
分となり、４５度に傾けると励起光は図８（Ｃ）の斜線
部分となる。従って、バンドパスフィルター３０を落射
照明光路に対して０度と４５度の２つの状態の間の任意
の角度に設定すれば、狭帯域励起光の最も短波長側の励
起光λECと最も長波長側の励起光λEEとの強度比を調整
することができる。
【００４５】また、バンドストップフィルター３１を、
例えば、狭帯域励起光波長λED〜λ EE間に吸収帯域を有
するものとした場合、このバンドストップフィルター３
１を落射照明光路に対して０度から４５度まで傾斜させ
ると、狭帯域励起光帯域λEDとλEEの不透過領域がシフ
トし、狭帯域励起光λEDとλEEの強度を調整することが
できる。
例えば、狭帯域励起光波長λED〜λ EE間に吸収帯域を有
するものとした場合、このバンドストップフィルター３
１を落射照明光路に対して０度から４５度まで傾斜させ
ると、狭帯域励起光帯域λEDとλEEの不透過領域がシフ
トし、狭帯域励起光λEDとλEEの強度を調整することが
できる。
【００４６】さらに、狭帯域励起光波長λEC〜λED間に
吸収帯域を有するバンドストップフィルター３２を落射
照明光路に対して０度から４５度まで傾斜させることに
よっても、同様に、吸収帯域がシフトし、狭帯域励起光
λECとλEDの強度を調整することができる。従って、バ
ンドパスフィルター３０とバンドストップフィルター３
１とを独立に任意の角度に傾斜させることにより、図８
（Ｄ）のように３つの励起光λEC、λED、λEEの強度の
比を調整し、それらにより励起された３つの蛍光の強度
比を調整することができ、ひいては、所望の明るさを得
ることができる。
吸収帯域を有するバンドストップフィルター３２を落射
照明光路に対して０度から４５度まで傾斜させることに
よっても、同様に、吸収帯域がシフトし、狭帯域励起光
λECとλEDの強度を調整することができる。従って、バ
ンドパスフィルター３０とバンドストップフィルター３
１とを独立に任意の角度に傾斜させることにより、図８
（Ｄ）のように３つの励起光λEC、λED、λEEの強度の
比を調整し、それらにより励起された３つの蛍光の強度
比を調整することができ、ひいては、所望の明るさを得
ることができる。
【００４７】バンドパスフィルター３０は、励起光λED
では高い透過率を有し、また、バンドストップフィルタ
ー３１、３２はλEC〜λED間とλED〜λEE間以外の帯域
では高い透過率を有するため、他の励起光はカットされ
ない。また、バンドパスフィルター３０及びバンドスト
ップフィルター３１、３２は落射照明光路に対して挿脱
自在に設けておくことができる。励起光の強度の比を調
節する必要がない場合には、それらは落射照明光路から
外しておけばよい。
では高い透過率を有し、また、バンドストップフィルタ
ー３１、３２はλEC〜λED間とλED〜λEE間以外の帯域
では高い透過率を有するため、他の励起光はカットされ
ない。また、バンドパスフィルター３０及びバンドスト
ップフィルター３１、３２は落射照明光路に対して挿脱
自在に設けておくことができる。励起光の強度の比を調
節する必要がない場合には、それらは落射照明光路から
外しておけばよい。
【００４８】さらに、４重励起の場合には、図８（Ｅ）
のように、狭帯域励起光波長λEF、λEG、λEH、λEIの
うち最も短波長側の狭帯域励起光λEFと最も長波長側の
狭帯域励起光λEIまでの間において高い透過率を有する
バンドパスフィルターと、λ EG〜λEH間に吸収帯域を有
する少なくとも１個のバンドストップフィルター又は他
の隣接する狭帯域励起光帯域間に吸収帯域を有する少な
くとも１個のバンドストップフィルターとを落射照明光
路中に独立に傾動可能に配置することにより、３重励起
の場合と同様に、各励起光強度を調整することができ、
ひいては、それらにより励起される蛍光の強度比を調節
することができ、所望の明るさを得ることができる。
のように、狭帯域励起光波長λEF、λEG、λEH、λEIの
うち最も短波長側の狭帯域励起光λEFと最も長波長側の
狭帯域励起光λEIまでの間において高い透過率を有する
バンドパスフィルターと、λ EG〜λEH間に吸収帯域を有
する少なくとも１個のバンドストップフィルター又は他
の隣接する狭帯域励起光帯域間に吸収帯域を有する少な
くとも１個のバンドストップフィルターとを落射照明光
路中に独立に傾動可能に配置することにより、３重励起
の場合と同様に、各励起光強度を調整することができ、
ひいては、それらにより励起される蛍光の強度比を調節
することができ、所望の明るさを得ることができる。
【００４９】同様に、５重以上の励起に対しても、最も
短波長側の励起光から最も長波長側の励起光までの間に
おいて高い透過率を有するバンドパスフィルターと、隣
接する狭帯域励起光帯域間に吸収帯域を有する少なくと
も１個のバンドストップフィルターとをそれぞれ独立し
て傾動可能に配置することにより、５重以上に励起され
た各蛍光強度の比を調節し、所望の明るさを得ることが
できる。
短波長側の励起光から最も長波長側の励起光までの間に
おいて高い透過率を有するバンドパスフィルターと、隣
接する狭帯域励起光帯域間に吸収帯域を有する少なくと
も１個のバンドストップフィルターとをそれぞれ独立し
て傾動可能に配置することにより、５重以上に励起され
た各蛍光強度の比を調節し、所望の明るさを得ることが
できる。
【００５０】以上のように、第一乃至第三実施例におけ
るバンドストップフィルターの吸収帯域幅と透過率及び
透過波長シフト変化量を蛍光強度に応じて設定すること
により、種々の蛍光強度に対応し、励起光を効率的に励
起することが可能になる。加えて、蛍光の強度の比を容
易に調整することができる。また、同様に、第三実施例
において、バンドパスフィルターの透過帯域と透過率及
び透過波長シフト変化量を蛍光強度に応じて設定するこ
とにより、種々の蛍光色素に対応し、励起光を効率的に
励起することができ、さらに、蛍光の強度の比を容易に
調整することができる。
るバンドストップフィルターの吸収帯域幅と透過率及び
透過波長シフト変化量を蛍光強度に応じて設定すること
により、種々の蛍光強度に対応し、励起光を効率的に励
起することが可能になる。加えて、蛍光の強度の比を容
易に調整することができる。また、同様に、第三実施例
において、バンドパスフィルターの透過帯域と透過率及
び透過波長シフト変化量を蛍光強度に応じて設定するこ
とにより、種々の蛍光色素に対応し、励起光を効率的に
励起することができ、さらに、蛍光の強度の比を容易に
調整することができる。
【００５１】〔実施例４〕本実施例は３重励起に対して
前述の実施例とは異なる構成を提供するものである。次
の（１）乃至（４）に示すような特性を有する励起光調
整フィルターを用意する。ＴEC、ＴED、ＴEEは狭帯域励
起光波長λEC、λED、λEEにおける励起光調整フィルタ
ーの透過率である。 （１）ＴEC≦ＴED≦ＴEE（図９（Ａ）に示すような特
性） （２）ＴEC≧ＴED≧ＴEE（図９（Ｂ）に示すような特
性） （３）ＴEC≦ＴED、ＴED≧ＴEE（図９（Ｃ）に示すよう
な特性） （４）ＴEC≧ＴED、ＴED≦ＴEE（図９（Ｄ）に示すよう
な特性）
前述の実施例とは異なる構成を提供するものである。次
の（１）乃至（４）に示すような特性を有する励起光調
整フィルターを用意する。ＴEC、ＴED、ＴEEは狭帯域励
起光波長λEC、λED、λEEにおける励起光調整フィルタ
ーの透過率である。 （１）ＴEC≦ＴED≦ＴEE（図９（Ａ）に示すような特
性） （２）ＴEC≧ＴED≧ＴEE（図９（Ｂ）に示すような特
性） （３）ＴEC≦ＴED、ＴED≧ＴEE（図９（Ｃ）に示すよう
な特性） （４）ＴEC≧ＴED、ＴED≦ＴEE（図９（Ｄ）に示すよう
な特性）
【００５２】３重励起フィルター２５の狭帯域励起光λ
EC、λED、λEEに対して、これらの特性を有する少なく
とも１個の励起光調整フィルターをダイクロイックミラ
ー２６よりも前の位置で落射照明光路中に配置すること
により、３重励起光フィルター２５の狭帯域励起光波長
λEC、λED、λEEにおける透過率を調整することができ
る。
EC、λED、λEEに対して、これらの特性を有する少なく
とも１個の励起光調整フィルターをダイクロイックミラ
ー２６よりも前の位置で落射照明光路中に配置すること
により、３重励起光フィルター２５の狭帯域励起光波長
λEC、λED、λEEにおける透過率を調整することができ
る。
【００５３】例えば、図１０（Ａ）に示すように、３重
励起用の蛍光フィルターセットにより蛍光色素ＤＡＰＩ
を励起する波長λA の励起光と、蛍光色素ＦＩＴＣを励
起する波長λB の励起光と、蛍光色素ＴＲＩＴＣを励起
する波長λC の励起光の３重励起において、ＤＡＰＩの
蛍光Ａ、ＦＩＴＣの蛍光Ｂ及びＴＲＩＴＣの蛍光Ｃの強
度が Ａ＞Ｂ＞Ｃ である場合、図９（Ａ）のような特
性を有する励起光調整フィルターを落射照明光路に配置
することにより、図１０（Ｂ）の斜線部分のように励起
光の強度を調整して各蛍光の強度のバランスをとり、ほ
ぼ同程度の明るさにすることができる。
励起用の蛍光フィルターセットにより蛍光色素ＤＡＰＩ
を励起する波長λA の励起光と、蛍光色素ＦＩＴＣを励
起する波長λB の励起光と、蛍光色素ＴＲＩＴＣを励起
する波長λC の励起光の３重励起において、ＤＡＰＩの
蛍光Ａ、ＦＩＴＣの蛍光Ｂ及びＴＲＩＴＣの蛍光Ｃの強
度が Ａ＞Ｂ＞Ｃ である場合、図９（Ａ）のような特
性を有する励起光調整フィルターを落射照明光路に配置
することにより、図１０（Ｂ）の斜線部分のように励起
光の強度を調整して各蛍光の強度のバランスをとり、ほ
ぼ同程度の明るさにすることができる。
【００５４】同様に、各蛍光の明るさに対して選択的に
種々の励起光調整フィルターを配置することにより、励
起光の強度比を調整し、これにより効率的に励起される
蛍光の強度の比を調整することができる。また、図９
（Ａ）乃至図９（Ｄ）に示す励起光調整フィルターの特
性以外の様々な特性の励起光調整フィルターを用いるこ
とにより、蛍光の明るさを調整することもできる。
種々の励起光調整フィルターを配置することにより、励
起光の強度比を調整し、これにより効率的に励起される
蛍光の強度の比を調整することができる。また、図９
（Ａ）乃至図９（Ｄ）に示す励起光調整フィルターの特
性以外の様々な特性の励起光調整フィルターを用いるこ
とにより、蛍光の明るさを調整することもできる。
【００５５】さらに、４重以上の励起の場合において
も、各狭帯域励起光における透過率が異なる種々の励起
光調整フィルターを少なくとも１個ずつ落射照明光路中
に配置することにより、同様に、各蛍光の強度の比を調
整することができる。この励起光調整フィルターと、落
射照明光路中で傾動可能なバンドストップフィルター又
はバンドパスフィルターとを組み合わせることによって
も、同様に、標本から発する複数の蛍光強度の比を調整
することができる。
も、各狭帯域励起光における透過率が異なる種々の励起
光調整フィルターを少なくとも１個ずつ落射照明光路中
に配置することにより、同様に、各蛍光の強度の比を調
整することができる。この励起光調整フィルターと、落
射照明光路中で傾動可能なバンドストップフィルター又
はバンドパスフィルターとを組み合わせることによって
も、同様に、標本から発する複数の蛍光強度の比を調整
することができる。
【００５６】以上の説明から明らかであるように、本発
明に係る落射蛍光顕微鏡は特許請求の範囲に記載したも
のの他に、以下の（１）乃至（４）のようにも構成する
ことが可能である。
明に係る落射蛍光顕微鏡は特許請求の範囲に記載したも
のの他に、以下の（１）乃至（４）のようにも構成する
ことが可能である。
【００５７】（１）落射照明光源から投射された光束を
３つ以上の狭帯域励起光波長の光に変換する励起フィル
ターと、該励起フィルターにより変換された３つ以上の
複数の狭帯域励起光波長の光を標本に照射し、該標本か
ら発せられる複数種類の蛍光を透過させるダイクロイッ
クミラーと、該ダイクロイックミラーを透過した光から
余分な波長域を吸収し、蛍光像の波長を透過させる吸収
フィルターとを有する落射蛍光顕微鏡において、透過波
長帯域を吸収し、前記３つ以上の狭帯域励起光波長の光
の光量を変えるように少なくとも一つの吸収波長帯域を
有するバンドストップフィルターを前記ダイクロイック
ミラーよりも前の落射照明光路中に少なくとも２個配置
したことを特徴とする落射蛍光顕微鏡。
３つ以上の狭帯域励起光波長の光に変換する励起フィル
ターと、該励起フィルターにより変換された３つ以上の
複数の狭帯域励起光波長の光を標本に照射し、該標本か
ら発せられる複数種類の蛍光を透過させるダイクロイッ
クミラーと、該ダイクロイックミラーを透過した光から
余分な波長域を吸収し、蛍光像の波長を透過させる吸収
フィルターとを有する落射蛍光顕微鏡において、透過波
長帯域を吸収し、前記３つ以上の狭帯域励起光波長の光
の光量を変えるように少なくとも一つの吸収波長帯域を
有するバンドストップフィルターを前記ダイクロイック
ミラーよりも前の落射照明光路中に少なくとも２個配置
したことを特徴とする落射蛍光顕微鏡。
【００５８】このバンドストップフィルターの吸収帯域
が狭帯域励起光波長の一部に存在すると、その狭帯域励
起光の一部が吸収されることにより、その狭帯域励起光
強度が変化する。その他の狭帯域励起光波長では、バン
ドストップフィルターの透過率が高いために、カットさ
れない。さらに、他の１個のバンドストップフィルター
の吸収帯域が他の狭帯域励起光波長の一部に存在する
と、この狭帯域励起光の一部が吸収されることによっ
て、狭帯域励起光の強度が変化する。同様に、この他の
狭帯域励起光波長は、バンドストップフィルターの透過
率が高いためにカットされない。
が狭帯域励起光波長の一部に存在すると、その狭帯域励
起光の一部が吸収されることにより、その狭帯域励起光
強度が変化する。その他の狭帯域励起光波長では、バン
ドストップフィルターの透過率が高いために、カットさ
れない。さらに、他の１個のバンドストップフィルター
の吸収帯域が他の狭帯域励起光波長の一部に存在する
と、この狭帯域励起光の一部が吸収されることによっ
て、狭帯域励起光の強度が変化する。同様に、この他の
狭帯域励起光波長は、バンドストップフィルターの透過
率が高いためにカットされない。
【００５９】従って、このバンドストップフィルターの
吸収帯域と透過率とを変化させることにより複数の狭帯
域励起光の中から吸収する狭帯域励起光波長を選択し、
他の狭帯域励起光をカットせずに、狭帯域励起光強度の
調整を行うことができ、ひいては、複数の蛍光の強度の
比を調整することができる。
吸収帯域と透過率とを変化させることにより複数の狭帯
域励起光の中から吸収する狭帯域励起光波長を選択し、
他の狭帯域励起光をカットせずに、狭帯域励起光強度の
調整を行うことができ、ひいては、複数の蛍光の強度の
比を調整することができる。
【００６０】（２）前記バンドストップフィルターは、
前記複数の狭帯域励起光波長の中の隣接する二つの狭帯
域励起光波長のうち、短波長側の狭帯域励起光波長の領
域をカットし、または、該領域に対して部分的に低い透
過率を有し、かつ、長波長側の狭帯域励起光波長の領域
では高い透過率を有する状態から、短波長側の狭帯域励
起光波長の領域では高い透過率を有し、かつ、長波長側
の狭帯域励起光波長の領域をカットし、または、該領域
に対して部分的に低い透過率を有する状態に変化するよ
うに、前記落射照明光路に対して傾斜させて配置するこ
とにより、透過波長帯域をシフトする干渉フィルターで
あることを特徴とする（１）に記載の落射蛍光顕微鏡。
前記複数の狭帯域励起光波長の中の隣接する二つの狭帯
域励起光波長のうち、短波長側の狭帯域励起光波長の領
域をカットし、または、該領域に対して部分的に低い透
過率を有し、かつ、長波長側の狭帯域励起光波長の領域
では高い透過率を有する状態から、短波長側の狭帯域励
起光波長の領域では高い透過率を有し、かつ、長波長側
の狭帯域励起光波長の領域をカットし、または、該領域
に対して部分的に低い透過率を有する状態に変化するよ
うに、前記落射照明光路に対して傾斜させて配置するこ
とにより、透過波長帯域をシフトする干渉フィルターで
あることを特徴とする（１）に記載の落射蛍光顕微鏡。
【００６１】干渉フィルターからなるバンドストップフ
ィルターを落射照明光路に対して適当な角度に傾斜させ
ることにより、バンドストップフィルターに入射する励
起光の入射角が変化する。
ィルターを落射照明光路に対して適当な角度に傾斜させ
ることにより、バンドストップフィルターに入射する励
起光の入射角が変化する。
【００６２】一般に、干渉フィルターの干渉条件は、最
大透過波長をλ、誘電体の光学的な厚さ（誘電体の境界
で生じる位相差も光路長に換算して含ませる）をｔ、境
界における屈折角をΦとすると、次式で表すことができ
る。 ２ｔ・ｃｏｓΦ＝ｍλ ここで、次数ｍを一定とし、かつ、干渉条件を一定とす
ると、波長λはｃｏｓΦに比例する。Φは屈折角である
が、スネルの法則により、入射角と共役なので両者は同
等と考えられる。従って、上式から明らかであるよう
に、入射角が大きくなるほど、ｃｏｓΦが減少し、同時
に、波長λも減少し、最大透過率部分は徐々に低波長側
にシフトしていく。このため、バンドストップフィルタ
ーを光路に垂直な方向の軸から徐々に４５度まで傾斜さ
せていくと、長波長側から短波長側へシフトしていく。
大透過波長をλ、誘電体の光学的な厚さ（誘電体の境界
で生じる位相差も光路長に換算して含ませる）をｔ、境
界における屈折角をΦとすると、次式で表すことができ
る。 ２ｔ・ｃｏｓΦ＝ｍλ ここで、次数ｍを一定とし、かつ、干渉条件を一定とす
ると、波長λはｃｏｓΦに比例する。Φは屈折角である
が、スネルの法則により、入射角と共役なので両者は同
等と考えられる。従って、上式から明らかであるよう
に、入射角が大きくなるほど、ｃｏｓΦが減少し、同時
に、波長λも減少し、最大透過率部分は徐々に低波長側
にシフトしていく。このため、バンドストップフィルタ
ーを光路に垂直な方向の軸から徐々に４５度まで傾斜さ
せていくと、長波長側から短波長側へシフトしていく。
【００６３】すなわち、入射角を０度（光路に垂直な方
向）に近づけていくと、バンドストップフィルターの吸
収帯域が徐々に長波長側にシフトし、３つ以上の狭帯域
励起光のうち隣接する２つの狭帯域励起光の長波長側の
狭帯域励起光にバンドストップフィルターの吸収帯域が
重なってくるために、長波長側の狭帯域励起光の強度が
弱くなり、バンドストップフィルターの吸収帯域が長波
長側の狭帯域励起光帯域と一致すると長波長側の狭帯域
励起光がカットされる。
向）に近づけていくと、バンドストップフィルターの吸
収帯域が徐々に長波長側にシフトし、３つ以上の狭帯域
励起光のうち隣接する２つの狭帯域励起光の長波長側の
狭帯域励起光にバンドストップフィルターの吸収帯域が
重なってくるために、長波長側の狭帯域励起光の強度が
弱くなり、バンドストップフィルターの吸収帯域が長波
長側の狭帯域励起光帯域と一致すると長波長側の狭帯域
励起光がカットされる。
【００６４】逆に、入射角を４５度に近づけていくと、
バンドストップフィルターの吸収帯域が徐々に短波長側
にシフトし、３つ以上の狭帯域励起光のうち隣接する２
つの狭帯域励起光の短波長側の狭帯域励起光にバンドス
トップフィルターの吸収帯域が重なってくるために、短
波長側の狭帯域励起光の強度が弱くなり、バンドストッ
プフィルターの吸収帯域が短波長側の狭帯域励起光帯域
と一致すると短波長側の狭帯域励起光がカットされる。
バンドストップフィルターの吸収帯域が徐々に短波長側
にシフトし、３つ以上の狭帯域励起光のうち隣接する２
つの狭帯域励起光の短波長側の狭帯域励起光にバンドス
トップフィルターの吸収帯域が重なってくるために、短
波長側の狭帯域励起光の強度が弱くなり、バンドストッ
プフィルターの吸収帯域が短波長側の狭帯域励起光帯域
と一致すると短波長側の狭帯域励起光がカットされる。
【００６５】このバンドストップフィルターは隣接する
２つの狭帯域励起光帯域間にのみ吸収帯域があり、その
他の狭帯域励起光波長では高い透過率を有するので、そ
の他の狭帯域励起光はカットされない。さらに、上記以
外の隣接する狭帯域励起光帯域間に吸収帯域を有するバ
ンドストップフィルターを落射照明光路に対して適当な
角度に傾斜させることによって、その隣接する狭帯域励
起光の強度の比を調整することができる。
２つの狭帯域励起光帯域間にのみ吸収帯域があり、その
他の狭帯域励起光波長では高い透過率を有するので、そ
の他の狭帯域励起光はカットされない。さらに、上記以
外の隣接する狭帯域励起光帯域間に吸収帯域を有するバ
ンドストップフィルターを落射照明光路に対して適当な
角度に傾斜させることによって、その隣接する狭帯域励
起光の強度の比を調整することができる。
【００６６】このように、３つ以上の狭帯域励起光に対
しては、２個のバンドストップフィルターを独立に落射
照明光路に対して傾動可能に配置することにより、それ
ぞれの隣接する２つの狭帯域励起光の強度の比を調整す
ることができ、複数の蛍光の強度の比を効率的に調整す
ることができる。
しては、２個のバンドストップフィルターを独立に落射
照明光路に対して傾動可能に配置することにより、それ
ぞれの隣接する２つの狭帯域励起光の強度の比を調整す
ることができ、複数の蛍光の強度の比を効率的に調整す
ることができる。
【００６７】（３）落射照明光源から投射された光束を
３つ以上の狭帯域励起光波長の光に変換する励起フィル
ターと、該励起フィルターにより変換された３つ以上の
複数の狭帯域励起光波長の光を標本に照射し、該標本か
ら発せられる複数種類の蛍光を透過させるダイクロイッ
クミラーと、該ダイクロイックミラーを透過した光から
余分な波長域を吸収し、蛍光像の波長を透過させる吸収
フィルターとを有する落射蛍光顕微鏡において、狭帯域
励起光波長帯域を吸収し、前記３つ以上の狭帯域励起光
波長の光の光量を変えるように少なくとも一個の励起光
調整フィルターを前記ダイクロイックミラーよりも前の
落射照明光路中に配置したことを特徴とする落射蛍光顕
微鏡。
３つ以上の狭帯域励起光波長の光に変換する励起フィル
ターと、該励起フィルターにより変換された３つ以上の
複数の狭帯域励起光波長の光を標本に照射し、該標本か
ら発せられる複数種類の蛍光を透過させるダイクロイッ
クミラーと、該ダイクロイックミラーを透過した光から
余分な波長域を吸収し、蛍光像の波長を透過させる吸収
フィルターとを有する落射蛍光顕微鏡において、狭帯域
励起光波長帯域を吸収し、前記３つ以上の狭帯域励起光
波長の光の光量を変えるように少なくとも一個の励起光
調整フィルターを前記ダイクロイックミラーよりも前の
落射照明光路中に配置したことを特徴とする落射蛍光顕
微鏡。
【００６８】この励起光調整フィルターは、３つ以上の
狭帯域励起光波長で透過率が異なるので、励起光強度が
変化する。このため、標本から発する３つ以上の蛍光の
強度を調整することができる。すなわち、３つ以上の蛍
光の強度のバランスが悪い場合に、特性の異なる種々の
励起光調整フィルターの中から、各蛍光の強度が明るい
順に、それに対応して狭帯域励起光波長の透過率が低く
なるような励起光調整フィルターを選択し、落射照明光
路に配置することにより、３つ以上の励起光強度を調整
し、標本から発する３つ以上の蛍光の強度を調整するこ
とができる。
狭帯域励起光波長で透過率が異なるので、励起光強度が
変化する。このため、標本から発する３つ以上の蛍光の
強度を調整することができる。すなわち、３つ以上の蛍
光の強度のバランスが悪い場合に、特性の異なる種々の
励起光調整フィルターの中から、各蛍光の強度が明るい
順に、それに対応して狭帯域励起光波長の透過率が低く
なるような励起光調整フィルターを選択し、落射照明光
路に配置することにより、３つ以上の励起光強度を調整
し、標本から発する３つ以上の蛍光の強度を調整するこ
とができる。
【００６９】（４）前記励起光調整フィルターの透過率
を前記３つ以上の狭帯域励起光波長の短波長側から順に
Ｔ1,Ｔ2,Ｔ3 としたとき、次の（ａ）乃至（ｄ）のうち
の何れか一つの特性を有することを特徴とする（３）に
記載の落射蛍光顕微鏡。 （ａ）Ｔ1 ≦Ｔ2 ≦Ｔ3 （ｂ）Ｔ1 ≧Ｔ2 ≧Ｔ3 （ｃ）Ｔ1 ≦Ｔ2,Ｔ2 ≧Ｔ3 （ｄ）Ｔ1 ≧Ｔ2,Ｔ2 ≦Ｔ3
を前記３つ以上の狭帯域励起光波長の短波長側から順に
Ｔ1,Ｔ2,Ｔ3 としたとき、次の（ａ）乃至（ｄ）のうち
の何れか一つの特性を有することを特徴とする（３）に
記載の落射蛍光顕微鏡。 （ａ）Ｔ1 ≦Ｔ2 ≦Ｔ3 （ｂ）Ｔ1 ≧Ｔ2 ≧Ｔ3 （ｃ）Ｔ1 ≦Ｔ2,Ｔ2 ≧Ｔ3 （ｄ）Ｔ1 ≧Ｔ2,Ｔ2 ≦Ｔ3
【００７０】各狭帯域励起光波長を短波長側からλ1 、
λ2 、λ3 とすると、３つの蛍光の強度のうち、例え
ば、λ3 で励起される蛍光が最も明るく、次いで、λ2
で励起される蛍光が明るい場合には、（ｂ）のような特
性を有する励起光調整フィルターを用いて、励起光の強
度を調整する。各蛍光の明るさの大小が異なる場合で
も、（ａ）乃至（ｄ）のうちの何れかの特性を有する励
起光調整フィルターを選択し、励起光を調整することに
より、３つの蛍光の明るさを調整することができる。
λ2 、λ3 とすると、３つの蛍光の強度のうち、例え
ば、λ3 で励起される蛍光が最も明るく、次いで、λ2
で励起される蛍光が明るい場合には、（ｂ）のような特
性を有する励起光調整フィルターを用いて、励起光の強
度を調整する。各蛍光の明るさの大小が異なる場合で
も、（ａ）乃至（ｄ）のうちの何れかの特性を有する励
起光調整フィルターを選択し、励起光を調整することに
より、３つの蛍光の明るさを調整することができる。
【００７１】
【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、少
なくとも１個のバンドストップフィルター又はバンドパ
スフィルターと少なくとも１個のバンドストップフィル
ターとの組み合わせを落射照明光路中に該光路に対して
各々独立に傾動可能に配置するか、あるいは、複数の励
起光波長に対して透過率が異なる種々の励起光調整フィ
ルターを選択的に配置することによって、多重染色蛍光
標本から発する各蛍光色素の励起光量比を容易に調整す
ることが可能になる。このため、各蛍光色素の濃度や明
るさの相違、褪色速度の相違あるいは観察者の必要に応
じて、多重染色の蛍光像の明るさの比を変えることがで
き、観察又は写真撮影に際して、蛍光色素の相違に起因
する蛍光像の明るさの相違を確実に補正し、観察しやす
い蛍光像を得ることができる。
なくとも１個のバンドストップフィルター又はバンドパ
スフィルターと少なくとも１個のバンドストップフィル
ターとの組み合わせを落射照明光路中に該光路に対して
各々独立に傾動可能に配置するか、あるいは、複数の励
起光波長に対して透過率が異なる種々の励起光調整フィ
ルターを選択的に配置することによって、多重染色蛍光
標本から発する各蛍光色素の励起光量比を容易に調整す
ることが可能になる。このため、各蛍光色素の濃度や明
るさの相違、褪色速度の相違あるいは観察者の必要に応
じて、多重染色の蛍光像の明るさの比を変えることがで
き、観察又は写真撮影に際して、蛍光色素の相違に起因
する蛍光像の明るさの相違を確実に補正し、観察しやす
い蛍光像を得ることができる。
【００７２】さらに、本発明に係る落射蛍光顕微鏡の構
成においては、落射照明光路中において励起光を調節す
るので、標本から発して観察光路に導かれる蛍光は調節
フィルターによって強度が弱められることがない。従っ
て、蛍光強度を上げるために、通常よりも多くの励起光
を標本に照射する必要がなく、標本に対して余分なダメ
ージを与えることなく、効率的な励起を行うことができ
る。
成においては、落射照明光路中において励起光を調節す
るので、標本から発して観察光路に導かれる蛍光は調節
フィルターによって強度が弱められることがない。従っ
て、蛍光強度を上げるために、通常よりも多くの励起光
を標本に照射する必要がなく、標本に対して余分なダメ
ージを与えることなく、効率的な励起を行うことができ
る。
【図１】本発明に係る落射蛍光顕微鏡の第一実施例の構
成図である。
成図である。
【図２】２重励起用蛍光フィルターセットにおける波長
と透過率との関係を示すグラフである。
と透過率との関係を示すグラフである。
【図３】３重励起用蛍光フィルターセットにおける波長
と透過率との関係を示すグラフである。
と透過率との関係を示すグラフである。
【図４】（Ａ）乃至（Ｄ）は何れも励起フィルターとバ
ンドストップフィルターにおける波長と透過率との関係
を示すグラフである。
ンドストップフィルターにおける波長と透過率との関係
を示すグラフである。
【図５】本発明に係る落射蛍光顕微鏡の第二実施例の構
成図である。
成図である。
【図６】（Ａ）乃至（Ｄ）は何れも第二実施例に用いら
れている励起フィルターと二つのバンドストップフィル
ターにおける波長と透過率との関係を示すグラフであ
る。
れている励起フィルターと二つのバンドストップフィル
ターにおける波長と透過率との関係を示すグラフであ
る。
【図７】本発明に係る落射蛍光顕微鏡の第三実施例の構
成図である。
成図である。
【図８】（Ａ）乃至（Ｃ）は第三実施例に用いられてい
る励起フィルター及びバンドパスフィルターにおける波
長と透過率との関係を示すグラフ、（Ｄ）は第三実施例
に用いられている励起フィルター、バンドストップフィ
ルター及びバンドパスフィルターにおける波長と透過率
との関係を示すグラフ、（Ｅ）は第三実施例に用いられ
ている４重励起フィルター、バンドストップフィルター
及びバンドパスフィルターにおける波長と透過率との関
係を示すグラフである。
る励起フィルター及びバンドパスフィルターにおける波
長と透過率との関係を示すグラフ、（Ｄ）は第三実施例
に用いられている励起フィルター、バンドストップフィ
ルター及びバンドパスフィルターにおける波長と透過率
との関係を示すグラフ、（Ｅ）は第三実施例に用いられ
ている４重励起フィルター、バンドストップフィルター
及びバンドパスフィルターにおける波長と透過率との関
係を示すグラフである。
【図９】（Ａ）乃至（Ｄ）は何れも第四実施例における
励起フィルターと励起光調整フィルターにおける波長と
透過率との関係を示すグラフである。
励起フィルターと励起光調整フィルターにおける波長と
透過率との関係を示すグラフである。
【図１０】（Ａ）及び（Ｂ）は何れも蛍光色素に用いら
れる蛍光フィルターにおける波長と透過率との関係を示
すグラフである。
れる蛍光フィルターにおける波長と透過率との関係を示
すグラフである。
１１ 光源 １２ コレクターレンズ １３ バンドストップフィルター １４ 開口絞り １５ 視野絞り １６ 励起フィルター １７ ダイクロイックミラー １８ 対物レンズ １９ ステージ ２０ 標本 ２１ 吸収フィルター ２２ ビームスプリッター ２３ 接眼光学系 ２４ 写真撮影用接眼レンズ ２５ 励起フィルター ２６ ダイクロイックミラー ２７ 吸収フィルター ２８，２９，３１，３２ バンドストップフィルター ３０ バンドパスフィルター
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年４月２４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４８】さらに、４重励起の場合には、図８（Ｅ）
のように、狭帯域励起光波長λEF、λEG、λEH、λEIの
うち最も短波長側の狭帯域励起光λEFと最も長波長側の
狭帯域励起光λEIまでの間において高い透過率を有する
バンドパスフィルター３３と、λEG〜λEH間に吸収帯域
を有する少なくとも１個のバンドストップフィルター３
４又は他の隣接する狭帯域励起光帯域間に吸収帯域を有
する少なくとも１個のバンドストップフィルターとを落
射照明光路中に独立に傾動可能に配置することにより、
３重励起の場合と同様に、各励起光強度を調整すること
ができ、ひいては、それらにより励起される蛍光の強度
比を調節することができ、所望の明るさを得ることがで
きる。
のように、狭帯域励起光波長λEF、λEG、λEH、λEIの
うち最も短波長側の狭帯域励起光λEFと最も長波長側の
狭帯域励起光λEIまでの間において高い透過率を有する
バンドパスフィルター３３と、λEG〜λEH間に吸収帯域
を有する少なくとも１個のバンドストップフィルター３
４又は他の隣接する狭帯域励起光帯域間に吸収帯域を有
する少なくとも１個のバンドストップフィルターとを落
射照明光路中に独立に傾動可能に配置することにより、
３重励起の場合と同様に、各励起光強度を調整すること
ができ、ひいては、それらにより励起される蛍光の強度
比を調節することができ、所望の明るさを得ることがで
きる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】符号の説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【符号の説明】 １１ 光源 １２ コレクターレンズ １３ バンドストップフィルター １４ 開口絞り １５ 視野絞り １６ 励起フィルター １７ ダイクロイックミラー １８ 対物レンズ １９ ステージ ２０ 標本 ２１ 吸収フィルター ２２ ビームスプリッター ２３ 接眼光学系 ２４ 写真撮影用接眼レンズ ２５ 励起フィルター ２６ ダイクロイックミラー ２７ 吸収フィルター ２８，２９，３１，３２，３４ バンドストップフィ
ルター ３０，３３ バンドパスフィルター ─────────────────────────────────────────────────────
ルター ３０，３３ バンドパスフィルター ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年４月２４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】
Claims (3)
- 【請求項１】 落射照明光源から投射された光束を複数
の狭帯域励起光波長の光に変換する励起フィルターと、
該励起フィルターによって変換された複数の狭帯域励起
光波長の光を標本に照射し、該標本から発せられる複数
種類の蛍光を透過させるダイクロイックミラーと、該ダ
イクロイックミラーを透過した光から余分な波長域を吸
収し、蛍光像の波長を透過させる吸収フィルターとを有
する落射蛍光顕微鏡において、透過波長帯域を吸収し、
前記複数の狭帯域励起光波長の光の光量を変えるように
少なくとも一つの吸収波長帯域を有するバンドストップ
フィルターを前記ダイクロイックミラーよりも前の落射
照明光路中に少なくとも１個配置したことを特徴とする
落射蛍光顕微鏡。 - 【請求項２】 前記バンドストップフィルターは、 前記複数の狭帯域励起光波長の中の隣接する二つの狭帯
域励起光波長のうち、 短波長側の狭帯域励起光波長の領域をカットし、また
は、該領域に対して部分的に低い透過率を有し、かつ、
長波長側の狭帯域励起光波長の領域では高い透過率を有
する状態から、 短波長側の狭帯域励起光波長の領域では高い透過率を有
し、かつ、長波長側の狭帯域励起光波長の領域をカット
し、または、該領域に対して部分的に低い透過率を有す
る状態に変化するように、 前記落射照明光路に対して傾斜させて配置することによ
り、透過波長帯域をシフトする干渉フィルターであるこ
とを特徴とする請求項１に記載の落射蛍光顕微鏡。 - 【請求項３】 複数の狭帯域励起光波長領域のうち、最
も短い波長側の狭帯域励起光波長領域から最も長い波長
側の狭帯域励起光波長領域の間において高い透過率を有
する１枚の干渉フィルターからなり、 最も短い波長側の狭帯域励起光波長領域をカットし、か
つ、最も長い波長側の狭帯域励起光波長領域では高い透
過率を有する状態から、 最も長い波長側の透過率をカットし、かつ、最も短い波
長側の狭帯域励起光波長領域では高い透過率を有する状
態に変化するように、 前記落射照明光路に対して傾斜させて配置することによ
り、透過波長帯域をシフトするバンドパスフィルターを
前記ダイクロイックミラーよりも前の前記落射照明光路
中に配置したことを特徴とする請求項２に記載の落射蛍
光顕微鏡。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12663695A JP3526489B2 (ja) | 1995-05-25 | 1995-05-25 | 落射蛍光顕微鏡 |
| US08/653,267 US5710663A (en) | 1995-05-25 | 1996-05-24 | Reflecting fluorescence microscope |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12663695A JP3526489B2 (ja) | 1995-05-25 | 1995-05-25 | 落射蛍光顕微鏡 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08320437A true JPH08320437A (ja) | 1996-12-03 |
| JP3526489B2 JP3526489B2 (ja) | 2004-05-17 |
Family
ID=14940107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12663695A Expired - Fee Related JP3526489B2 (ja) | 1995-05-25 | 1995-05-25 | 落射蛍光顕微鏡 |
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|---|---|
| US (1) | US5710663A (ja) |
| JP (1) | JP3526489B2 (ja) |
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