JP2004012702A - 蛍光観察用の落射照明装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
【課題】標本に対する複数の照明光の光量を広い波長域で連続的に調整でき、安価に構成できる蛍光観察用の落射照明装置、および蛍光顕微鏡を提供する。
【解決手段】落射照明光源１１と、複数の狭波長域の光を抽出する励起フィルタ１５と、落射照明光源からの光を励起フィルタに導く照明光学系１４とを備えた蛍光観察用の落射照明装置において、照明光学系の光路中で対物レンズ２１の瞳面と略共役な面に配置された開口絞り部材１２と、開口絞り部材に近接して配置され、前記光路に直交する一方向Ａに沿って分光特性が連続的に変化するフィルタ部材１３と、一方向Ａに沿って開口絞り部材とフィルタ部材とを相対移動させることにより、開口絞り部材およびフィルタ部材を通過した後の光のスペクトルを調整する調整手段１７とを備える。
【選択図】 図１
【解決手段】落射照明光源１１と、複数の狭波長域の光を抽出する励起フィルタ１５と、落射照明光源からの光を励起フィルタに導く照明光学系１４とを備えた蛍光観察用の落射照明装置において、照明光学系の光路中で対物レンズ２１の瞳面と略共役な面に配置された開口絞り部材１２と、開口絞り部材に近接して配置され、前記光路に直交する一方向Ａに沿って分光特性が連続的に変化するフィルタ部材１３と、一方向Ａに沿って開口絞り部材とフィルタ部材とを相対移動させることにより、開口絞り部材およびフィルタ部材を通過した後の光のスペクトルを調整する調整手段１７とを備える。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の蛍光物質で標識された標本を照明する蛍光観察用の落射照明装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、複数の蛍光物質で標識された標本の蛍光観察が蛍光顕微鏡などを用いて行われている。複数の蛍光物質の各々は、標本の中の異なる部位に付着している。このため、各々の蛍光物質から発生する蛍光に基づいて、標本の蛍光像を取り込むことにより、複数の蛍光物質で標識された標本の複数の異なる部位を同時に観察することができる。
【０００３】
ところで、標本の中の各々の蛍光物質から蛍光を発生させるためには、各々の蛍光物質を適切な狭波長域の照明光で励起しなければならず、各々の蛍光物質に対する照明光の適切な狭波長域は一般に異なる。このため、標本の蛍光観察時、複数の蛍光物質で標識された標本には、狭波長域の異なる複数の照明光が照射されることになる。このような複数の照明光は、通常、予め定められた複数の異なる狭波長域で光を透過する励起フィルタにより生成される。
【０００４】
また、各々の蛍光物質は一般に蛍光発生効率（照明光の光量に対する蛍光の光量の比率）が異なるため、標本に照射される複数の照明光（狭波長域が異なる）の光量が互いに等しい場合には、各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量が異なってしまう。
【０００５】
そして、この状況で取り込んだ標本の蛍光像には、蛍光発生効率の高い蛍光物質の付着部位が明るい像として、蛍光発生効率の低い蛍光物質の付着部位が暗い像として現れることになる。このように、標本の蛍光像に明るい像と暗い像が混在してしまうと、標本の何れの部位も非常に観察し辛い。
そこで、標本の各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量を等しくするために、標本に照射される複数の照明光の光量を調整する方法が提案された。例えば特許第３０９３００９号には、光源と励起フィルタとの間に干渉フィルタを配置し、この干渉フィルタへ入射する入射光束の入射角を変えて、複数の照明光の光量を調整する方法が記載されている。なお、干渉フィルタを透過した照明光は、励起フィルタを介した後、狭波長域の異なる複数の照明光となる。
【０００６】
この調整方法では、干渉フィルタの回転角度に応じて、干渉フィルタを透過する照明光のスペクトルがシフトし、励起フィルタに入射する照明光のスペクトルもシフトするため、励起フィルタで生成される複数の照明光の光量を調整することができる。
また、透過波長域の異なる複数の干渉フィルタを予め用意しておき、励起フィルタの狭波長域に応じて、何れか１つの干渉フィルタを選択的に照明光の光路中（光源と励起フィルタとの間）に配置させることで、照明光のスペクトルを変更し、標本に対する複数の照明光の光量を調整する方法も提案されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の干渉フィルタを回転させる方法では、干渉フィルタを透過する照明光のスペクトルのシフト範囲が小さいため、複数の照明光の光量を調整可能な波長域が狭いという問題があった。また、励起フィルタを異なる狭波長域のものに交換したときには、その都度、励起フィルタの狭波長域に適応するシフト範囲を持つ干渉フィルタに交換しなければならず、作業が煩雑化すると共に、コスト高となる。
【０００８】
さらに、上記の干渉フィルタを入れ換える方法では、複数の照明光の光量を連続的に調整することはできず、１つの励起フィルタに対して複数の干渉フィルタが必要なため、コスト高となる。
本発明の目的は、標本に対する複数の照明光の光量を広い波長域で連続的に調整することができると共に安価に構成できる蛍光観察用の落射照明装置、およびそれを備えた蛍光顕微鏡を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載の発明は、落射照明光源と、複数の狭波長域の光を抽出する励起フィルタと、前記落射照明光源からの光を前記励起フィルタに導く照明光学系とを備えた蛍光観察用の落射照明装置において、前記照明光学系の光路中で対物レンズの瞳面と略共役な面に配置された開口絞り部材と、前記開口絞り部材に近接して配置され、前記光路に直交する一方向に沿って分光特性が連続的に変化するフィルタ部材と、前記一方向に沿って前記開口絞り部材と前記フィルタ部材とを相対移動させることにより、前記開口絞り部材および前記フィルタ部材を通過した後の光のスペクトルを調整する調整手段とを備えたものである。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の蛍光観察用の落射照明装置において、前記フィルタ部材は、特定の狭波長域を遮断して残りの波長域を抽出可能なノッチ状の分光特性を有すると共に、前記特定の狭波長域が前記一方向に沿って連続的に変化するものである。
請求項３に記載の発明は、請求項１または請求項２に記載した蛍光観察用の落射照明装置において、前記開口絞り部材は、固定的に配置され、前記調整手段は、前記一方向に沿って前記フィルタ部材を移動させることにより、前記スペクトルを調整するものである。
【００１１】
請求項４に記載の発明は、請求項１から請求項３の何れか１項に記載した蛍光観察用の落射照明装置において、前記開口絞り部材の開口は、前記一方向に関する大きさが可変であり、前記調整手段は、前記開口の前記大きさを変化させることにより、前記スペクトルを調整するものである。
請求項５に記載の発明は、複数の蛍光物質で標識された標本の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡において、請求項１から請求項４の何れか１項に記載した蛍光観察用の落射照明装置と、対物レンズを含み、前記標本からの蛍光を集光して前記標本の蛍光像を形成する結像光学系とを備えたものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。
本実施形態は、請求項１〜請求項３，請求項５に対応する。ここでは、図１に示すように、標本２０の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡１０に組み込まれ、標本２０を照明する落射照明装置（１１〜１７）の例を説明する。
【００１３】
蛍光顕微鏡１０には、蛍光観察用の落射照明装置（１１〜１７）の他に、観察系（２１〜２４）が設けられている。標本２０は、例えば２種類の蛍光物質で標識された生物標本（ＤＮＡや蛋白質など）であり、ステージ１８上に載置されている。そして、標本２０は、落射照明装置（１１〜１７）によって照明されると、四方八方に２種類の蛍光を発生する（詳細は後述する）。
【００１４】
まず初めに、蛍光顕微鏡１０の観察系（２１〜２４）について簡単に説明し、その後で、落射照明装置（１１〜１７）について詳しく説明する。
観察系（２１〜２４）は、光軸２０ａに沿って標本２０側から順に、無限遠系の対物レンズ２１と、蛍光フィルタ２２と、第２対物レンズとして機能する結像レンズ２３と、カメラ２４とが配置された構成となっている。蛍光フィルタ２２は、標本２０から発生する２種類の蛍光の波長域を透過する特性の波長選択フィルタである。
【００１５】
標本２０の蛍光観察時、標本２０から発生した２種類の蛍光は、対物レンズ２１と後述のビームスプリッタ１６と蛍光フィルタ２２と結像レンズ２３を介してカメラ２４の撮影面に集光される。
このとき、カメラ２４の撮影面には、対物レンズ２１と結像レンズ２３の作用によって、２種類の蛍光に基づく標本２０の蛍光像が形成される。撮影面の蛍光像は、カメラ２４によって撮影され、標本２０の蛍光画像として取り込まれる。対物レンズ２１および結像レンズ２３は、請求項の「結像光学系」に対応する。
【００１６】
次に、本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）について説明する。
落射照明装置（１１〜１７）は、光軸１０ａに沿って順に、光源１１と、開口絞り１２と、スペクトル可変フィルタ１３と、リレーレンズ１４と、励起フィルタ１５と、ビームスプリッタ１６とが配置され、かつ、スペクトル可変フィルタ１３に駆動部１７が接続された構成となっている。
【００１７】
また、落射照明装置（１１〜１７）は、光軸１０ａが観察系（２１〜２４）の光軸２０ａに対して直交する向きで、観察系（２１〜２４）の対物レンズ２１と蛍光フィルタ２２との間に組み込まれる。このとき、光軸２０ａ上には、落射照明装置（１１〜１７）のビームスプリッタ１６が配置される。
標本２０の蛍光観察時、光源１１からの照明光は、概略、開口絞り１２とスペクトル可変フィルタ１３とリレーレンズ１４と励起フィルタ１５を透過し、ビームスプリッタ１６で反射して、対物レンズ２１を介して標本２０上に導かれる。
【００１８】
さらに、本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）では、対物レンズ２１の瞳面に共役な基準面がリレーレンズ１４によって規定され、この基準面の近傍に、光源１１と開口絞り１２とスペクトル可変フィルタ１３とが近接して配置されている。なお、対物レンズ２１の瞳面は、入射瞳面または後側焦点面とも言う。リレーレンズ１４は、請求項の「照明光学系」に対応する。
【００１９】
光源１１は、例えば光ガイドに導かれた水銀やキセノンなどの多波長光源などであり、紫外線や可視光線などの照明光を対物レンズ２１側の開口絞り１２に向けて射出する。開口絞り１２は、リレーレンズ１４の光路中に固定的に配置された光学素子である。この開口絞り１２には、落射照明装置（１１〜１７）の光軸１０ａ上に細長いスリット形状（長方形）の開口１２ａが設けられている。開口１２ａの長手方向は、紙面に垂直である。
【００２０】
このため、光源１１からの照明光は、開口絞り１２の開口１２ａを通過することにより、上記した基準面（対物レンズ２１の瞳面に共役な面）の近傍において、開口１２ａに応じた所定の断面となる。この断面は開口１２ａと同形（相似形）である。なお、光源１１は、請求項の「落射照明光源」に対応する。開口絞り１２は「開口絞り部材」に対応する。
【００２１】
開口絞り１２の開口１２ａを通過した照明光は、次に、スペクトル可変フィルタ１３に入射する。このとき、スペクトル可変フィルタ１３の開口絞り１２側の面には、開口絞り１２の開口１２ａの像（以下「スリット像」という）が形成される。開口絞り１２とスペクトル可変フィルタ１３が互いに十分近接しているため、スペクトル可変フィルタ１３上のスリット像は開口１２ａと同形（相似形）であると考えられる。
【００２２】
本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）では、スペクトル可変フィルタ１３に駆動部１７が接続され、この駆動部１７を手動操作することにより、スペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）に沿ってスライドさせることができるようになっている。一方向（Ａ）は、光軸１０ａの方向とスリット像の長手方向との双方に垂直な方向であり、照明光の光路に交差している。駆動部１７は、請求項の「調整手段」に対応する。
【００２３】
駆動部１７を操作してスペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）にスライドさせると、開口絞り１２からの照明光がスペクトル可変フィルタ１３に入射する位置が一方向（Ａ）に沿って相対的に変化する。図２（ａ）〜（ｃ）は、開口絞り１２とスペクトル可変フィルタ１３を光軸１０ａの方向から見た図である。そして、図２（ａ）〜（ｃ）に示すように、スペクトル可変フィルタ１３上のスリット像１２ｂの位置も一方向（Ａ）に沿って相対的に変化することになる。
【００２４】
さて、スペクトル可変フィルタ１３は、スリット像１２ｂを形成する照明光のスペクトルを調整するために設けられた光学素子であり、スペクトル調整後の照明光をリレーレンズ１４側へ透過させる。つまり、スペクトル可変フィルタ１３は、照明光の光路中に配置されている。
また、このスペクトル可変フィルタ１３は、ガラス基板の一方の面（開口絞り１２側の面）にコーティングを付けることにより作製された干渉フィルタである。スペクトル可変フィルタ１３のコーティング領域は、一方向（Ａ）に関して開口絞り１２の開口１２ａ（つまり上記のスリット像１２ｂ）より大きく確保されている。コーティングの厚さは、一方向（Ａ）に沿って徐々に変化させてある。
【００２５】
さらに、スペクトル可変フィルタ１３は、図２（ｄ）に示すように、特定の狭波長域を吸収または反射により遮断して、残りの波長域を透過するノッチ状の分光特性を有すると共に、その特定の狭波長域がコーティング領域内で一方向（Ａ）に沿って連続的に変化するように構成されている。つまり、スペクトル可変フィルタ１３の分光特性は、一方向（Ａ）に沿って連続的に変化する。
【００２６】
図２（ｄ）の“Ａａ”〜“Ａｃ”は、各々、図２（ａ）〜（ｃ）に示すスペクトル可変フィルタ１３の位置Ａａ〜Ａｃにおける分光特性を例示したものである。図２（ａ）〜（ｃ）と図２（ｄ）との対応から分かるように、スペクトル可変フィルタ１３の特定の狭波長域は、スペクトル可変フィルタ１３の一端側から他端側に向けて波長が徐々に長くなるような連続変化を示している。
【００２７】
スペクトル可変フィルタ１３における特定の狭波長域の連続変化の幅は、例えば、短波長（例えば３５０ｎｍ）から長波長（例えば６５０ｎｍ）までの広範囲にわたっている。スペクトル可変フィルタ１３は、請求項の「フィルタ部材」に対応する。
【００２８】
したがって、上述のようにしてスペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）にスライドさせると、スリット像１２ｂがスペクトル可変フィルタ１３の位置Ａａに形成される図２（ａ）の状態では、図２（ｄ）の“Ａａ”の分光特性に応じたスペクトルを持つ照明光Ｌ０がスペクトル可変フィルタ１３から透過することになる。同様に、スリット像１２ｂがスペクトル可変フィルタ１３の位置Ａｂ，Ａｃに形成される図２（ｂ），（ｃ）の状態では、図２（ｄ）の“Ａｂ”，“Ａｃ”の分光特性に応じたスペクトルを持つ照明光Ｌ０がスペクトル可変フィルタ１３から透過することになる。
【００２９】
つまり、スペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）にスライドさせることにより、スペクトル可変フィルタ１３の分光特性（特定の狭波長域）の連続的な分布に応じて、スペクトル可変フィルタ１３を透過する照明光Ｌ０のスペクトルを容易に調整（選択）することができる。なお、スペクトル可変フィルタ１３を透過する照明光Ｌ０のスペクトル幅は、開口絞り１２の開口１２ａの幅に応じて決まっている。
【００３０】
上記のスペクトル可変フィルタ１３を透過してスペクトル調整された照明光Ｌ０は、次に、リレーレンズ１４（図１）に入射する。既に説明したように、リレーレンズ１４は、対物レンズ２１の瞳面に共役な基準面を規定する光学系である。このため、その基準面の近傍に配置されたスペクトル可変フィルタ１３からの照明光Ｌ０は、リレーレンズ１４の作用によって対物レンズ２１の瞳面に集光される。
【００３１】
ただし、リレーレンズ１４を透過した照明光は、観察系（２１〜２４）の光軸２０ａ上に導かれる前に、つまり、落射照明装置（１１〜１７）の光軸１０ａ上を進行している間に、励起フィルタ１５を透過する。この励起フィルタ１５は、図３に示すように、予め定められた２つの異なる狭波長域λ１，λ２で照明光を透過するフィルタである。
【００３２】
ちなみに、励起フィルタ１５の２つの狭波長域λ１，λ２のうち一方は、標本２０の中の一方の蛍光物質を励起するために適切な狭波長域であり、２つの狭波長域λ１，λ２のうち他方は、標本２０の中の他方の蛍光物質を励起するために適切な狭波長域である。
励起フィルタ１５に入射する照明光のスペクトルは、スペクトル可変フィルタ１３を透過した照明光Ｌ０のスペクトルと同じである。つまり、リレーレンズ１４によって照明光のスペクトルが変化することはない。このため、励起フィルタ１５は、照明光Ｌ０の波長域（図２（ｄ）参照）のうち、２つの狭波長域λ１，λ２（図３）のみを同時に抽出する。
【００３３】
したがって、励起フィルタ１５を透過した照明光は、異なる狭波長域λ１，λ２の２つの照明光Ｌ１，Ｌ２を含むものとなる。この２つの照明光Ｌ１，Ｌ２は、励起フィルタ１５に入射する照明光Ｌ０の一部である。そして、２つの照明光Ｌ１，Ｌ２が対物レンズ２１の瞳面に集光され、対物レンズ２１を通過した後、標本２０に照射される。
【００３４】
標本２０の中では、一方の蛍光物質が例えば狭波長域λ１の照明光Ｌ１によって励起され、自身の蛍光発生効率（照明光の光量に対する蛍光の光量の比率）に応じた光量の蛍光を発生する。同様に、他方の蛍光物質は例えば狭波長域λ２の照明光Ｌ２によって励起され、自身の蛍光発生効率に応じた光量の蛍光を発生する。
これら２種類の蛍光は、上記した観察系（２１〜２４）のカメラ２４に導かれ、カメラ２４によって２種類の蛍光に基づく標本２０の蛍光像が撮影され、標本２０の蛍光画像として取り込まれる。このとき、２種類の蛍光の光量が異なってしまうと、標本２０の蛍光画像には明るい像と暗い像が混在することになり、非常に観察し辛い。
【００３５】
次に、標本２０の各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量を等しくするために、本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）を用い、標本２０に照射される２つの照明光Ｌ１，Ｌ２の光量を調整する方法について説明する。
【００３６】
上述したように、本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）では、スペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）にスライドさせることにより、スペクトル可変フィルタ１３を透過する照明光Ｌ０のスペクトルを容易に調整できる。
このため、例えば図４（ａ）に示すように、開口１２ａのスリット像がスペクトル可変フィルタ１３の位置Ａ１に形成される状態のとき、図４（ｂ）の“Ａ１”の分光特性に応じたスペクトルを持つ照明光Ｌ０がスペクトル可変フィルタ１３から透過することになる。
【００３７】
図４（ｂ）の“Ａ１”の分光特性とは、その狭波長域が、励起フィルタ１５の一方の狭波長域λ１と少し重なり、他方の狭波長域λ２とは重ならないような特性である。したがって、励起フィルタ１５を透過する２つの照明光のうち、狭波長域λ１の照明光Ｌ１の光量は、図４（ｂ）の斜線ハッチング部に示すように減量され、狭波長域λ２の照明光Ｌ２の光量は、点ハッチング部に示すように最大光量のまま保たれる。
【００３８】
このような設定は、狭波長域λ１の照明光Ｌ１によって励起可能な一方の蛍光物質の蛍光発生効率と比較して、狭波長域λ２の照明光Ｌ２によって励起可能な他方の蛍光物質の蛍光発生効率が低い場合に有効である。
また、例えば図５（ａ）に示すように、開口１２ａのスリット像がスペクトル可変フィルタ１３の位置Ａ２に形成される状態のとき、図５（ｂ）の“Ａ２”の分光特性に応じたスペクトルを持つ照明光Ｌ０がスペクトル可変フィルタ１３から透過することになる。
【００３９】
図５（ｂ）の“Ａ２”の分光特性とは、その狭波長域が、励起フィルタ１５の他方の狭波長域λ２と少し重なり、他方の狭波長域λ１とは重ならないような特性である。したがって、励起フィルタ１５を透過する２つの照明光のうち、狭波長域λ２の照明光Ｌ２の光量は、図５（ｂ）の斜線ハッチング部に示すように減量され、狭波長域λ１の照明光Ｌ１の光量は、点ハッチング部に示すように最大光量のまま保たれる。
【００４０】
このような設定は、狭波長域λ１の照明光Ｌ１によって励起可能な一方の蛍光物質の蛍光発生効率と比較して、狭波長域λ２の照明光Ｌ２によって励起可能な他方の蛍光物質の蛍光発生効率が高い場合に有効である。
本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）では、スペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）にスライドさせるだけで、標本２０に照射される２つの照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを容易に調整することができ、標本２０の各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量を等しくできる。
【００４１】
その結果、カメラ２４で取り込まれる標本２０の蛍光画像には、標本２０の異なる部位に関する２種類の蛍光像が共に適切な明るさで混在することになり、良好な蛍光観察が可能となる。
さらに、本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）では、スペクトル可変フィルタ１３における特定の狭波長域の連続変化の幅が広範囲にわたっている（例えば３５０ｎｍ〜６５０ｎｍ）ため、スペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）にスライドさせるだけで、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを広い波長域で連続的に調整することができる。
【００４２】
また、励起フィルタ１５を異なる狭波長域のものに交換したときでも、スペクトル可変フィルタ１３を交換する必要がない。つまり、スペクトル可変フィルタ１３を交換しなくても、任意の蛍光物質の組み合わせにも柔軟に対応することができ、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを連続的に調整できる。その結果、作業が簡単化すると共に安価に構成でき、汎用性が向上する。
【００４３】
さらに、本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）では、スペクトル可変フィルタ１３を対物レンズ２１の瞳面に共役な基準面の近傍に配置するため、標本２０の視野における光学特性の劣化（照明ムラなど）が生じることはない。したがって、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを連続的に調整した場合でも、高精度な蛍光観察が可能となる。
【００４４】
なお、上記した実施形態は、開口絞り１２の開口１２ａの幅（一方向（Ａ）に関する大きさ）が一定である例を説明したが、図６（ａ），図７（ａ）に示すように、光軸１０ａを中心として開口１２ａの幅を変化させることもできる。このような変化も、上記の駆動部１７（図１）を用いた手動操作により簡単に行うことができる。
【００４５】
この場合、図６（ｂ），図７（ｂ）に示すように、開口１２ａの幅に応じて、スペクトル可変フィルタ１３を透過する照明光Ｌ０のスペクトル幅を容易に調整することができる。開口１２ａの幅が広いほど、照明光Ｌ０のスペクトル幅も広い。そして、標本２０に照射される２つの照明光Ｌ１，Ｌ２の光量を同時に強くしたり弱くしたりすることができる。
【００４６】
また、上記した実施形態では、対物レンズ２１の瞳面に共役な基準面の近傍に１枚のスペクトル可変フィルタ１３を設けたが、図８に示すように、励起フィルタ３５が３つの異なる狭波長域λ１，λ２，λ３で照明光を透過するように構成されている場合には、２枚のスペクトル可変フィルタ１３（１），１３（２）を設けることもできる。スペクトル可変フィルタ１３（１），１３（２）の分光特性は、上記したスペクトル可変フィルタ１３と同じである（図２参照）。スペクトル可変フィルタ１３（１），１３（２）は、駆動部１７によって独立にスライド可能である。
【００４７】
この場合、スペクトル可変フィルタ１３（１），１３（２）を一方向（Ａ）に独立にスライドさせることにより、例えば、開口絞り１２の開口１２ａのスリット像が、スペクトル可変フィルタ１３（１）の位置Ａ１とスペクトル可変フィルタ１３（２）の位置Ａ２に形成されるような設定とすることができる。
このとき、図８（ｂ）に示すように、スペクトル可変フィルタ１３（１）の“Ａ１”の分光特性（励起フィルタ１５の狭波長域λ２と少し重なる特性）と、スペクトル可変フィルタ１３（２）の“Ａ２”の分光特性（励起フィルタ１５の狭波長域λ３と少し重なる特性）とに応じて、次のような照明状態を得ることができる。
【００４８】
つまり、狭波長域λ２，λ３の照明光Ｌ２，Ｌ３の光量を、図８（ｂ）の斜線ハッチング部に示すように減量し、狭波長域λ１の照明光Ｌ１の光量を、点ハッチング部に示すように最大光量のまま保つことができる。このような構成および設定は、標本２０が３つの蛍光物質で標識され、狭波長域λ１の照明光Ｌ１によって励起可能な蛍光物質の蛍光発生効率と比較して、狭波長域λ２，λ３の照明光Ｌ２，Ｌ３によって励起可能な蛍光物質の蛍光発生効率が高い場合に有効である。
【００４９】
また、４つ以上の蛍光物質で標識された標本２０の蛍光観察を行う場合にも、本発明は適用できる。この場合には上記と同様に、スペクトル可変フィルタの数を増やせばよい。
さらに、上記した実施形態では、特定の狭波長域を遮断して残りの波長域を透過するノッチ状の分光特性を有するスペクトル可変フィルタの例を説明したが、図９に示すように、特定の狭波長域を透過して残りの波長域を遮断するバリア状の分光特性を有するスペクトル可変フィルタ３３（図１０，図１１）を用いることもできる。
【００５０】
このようなバリアフィルタを用いる場合にも、上記のノッチフィルタを用いた場合と同様、スペクトル可変フィルタ３３を一方向（Ａ）にスライドさせるだけで、２つの照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを容易に調整することができ、標本２０の各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量を等しくできる。
さらに、スペクトル可変フィルタ３３における特定の狭波長域の連続変化の幅が広範囲にわたっている（例えば３５０ｎｍ〜６５０ｎｍ）ため、スペクトル可変フィルタ３３を一方向（Ａ）にスライドさせるだけで、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを広い波長域で連続的に調整することができる。
【００５１】
また、励起フィルタ１５を異なる狭波長域のものに交換したときでも、スペクトル可変フィルタ３３を交換する必要がない。つまり、スペクトル可変フィルタ３３を交換しなくても、任意の蛍光物質の組み合わせにも柔軟に対応することができ、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを連続的に調整できる。その結果、作業が簡単化すると共に安価に構成でき、汎用性が向上する。
【００５２】
さらに、スペクトル可変フィルタ３３を対物レンズ２１の瞳面に共役な基準面の近傍に配置するため、標本２０の視野における照明ムラなどが生じることはない。したがって、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを連続的に調整した場合でも、高精度な蛍光観察が可能となる。
また、スペクトル可変フィルタ３３を用いた場合であっも、図１２（ａ），図１３（ａ）に示すように、光軸１０ａを中心として開口１２ａの幅を変化させることで、図１２（ｂ），図１３（ｂ）に示すように、スペクトル可変フィルタ３３を透過する照明光Ｌ０のスペクトル幅を容易に調整することができる。開口１２ａの幅が広いほど、照明光Ｌ０のスペクトル幅も広い。そして、標本２０に照射される２つの照明光Ｌ１，Ｌ２の光量を同時に強くしたり弱くしたりすることができる。
【００５３】
さらに、上記した実施形態では、１枚のスペクトル可変フィルタ３３でバリア状の分光特性（図９参照）を達成する例を説明したが、図１４（ａ）に示すように特定の臨界波長から長波側を透過するスペクトル可変フィルタ３３（１）と、図１４（ｂ）に示すように特定の臨界波長から短波側を透過するスペクトル可変フィルタ３３（２）とを組み合わせることもできる。
【００５４】
なお、スペクトル可変フィルタ３３（１），（２）の臨界波長は、各々、一方向（Ａ）に沿って連続的に変化するように構成されている。また、スペクトル可変フィルタ３３（１），（２）は、駆動部１７によって独立にスライド可能である。この場合にも、上記した１枚のバリアフィルタ（スペクトル可変フィルタ３３）を用いた場合と同様の効果を得ることができる。
【００５５】
さらに、上記した実施形態では、対物レンズ２１の瞳面に共役な基準面の近傍に光源１１と開口絞り１２を配置したが、このような光源手段（１１，１２）に代えて、光ガイドを用いることもできる。この場合、光ガイドの出射端面をスペクトル可変フィルタの近傍に配置することが好ましい。また、光源手段（１１，１２）に代えて、水銀ランプと集光レンズを用いることもできる。この場合、集光レンズによってスペクトル可変フィルタの近傍にアーク像を形成することが好ましい。
【００５６】
また、上記した実施形態では、光源１１，開口絞り１２，スペクトル可変フィルタ１３の順に配置する例を説明したが、開口絞り１２とスペクトル可変フィルタ１３の位置関係は逆でもよい。光源手段（１１，１２）に代えて水銀ランプと集光レンズを用いる場合には、開口絞り１２を省略することもできる。
さらに、上記した実施形態では、開口絞り１２を固定的に配置すると共にスペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）に沿ってスライドさせる構成例を説明したが、本発明はこれに限らない。スペクトル可変フィルタ１３を固定的に配置すると共に開口絞り１２を一方向（Ａ）に沿ってスライドさせてもよいし、スペクトル可変フィルタ１３と開口絞り１２とを一方向（Ａ）に沿って相対的にスライド（移動）させてもよい。
【００５７】
また、上記した実施形態では、落射照明装置（１１〜１７）と観察系（２１〜２４）とが交差する箇所にビームスプリッタ１６を配置したが、これに代えてダイクロイックミラーを配置しても良い。ダイクロイックミラーは、励起フィルタ１５，３５を透過した複数の狭波長域の照明光を反射可能で、標本２０から発生した複数の蛍光を透過可能な分光特性を有する。
【００５８】
さらに、上記した実施形態では、蛍光顕微鏡１０に落射照明装置（１１〜１７）を組み込む例で説明したが、落射照明装置（１１〜１７）は、蛍光顕微鏡だけでなく、他の蛍光測定装置に組み込むこともできる。
【００５９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、標本に対する複数の照明光の光量を広い波長域で連続的に調整することができると共に安価に構成することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光顕微鏡１０および落射照明装置（１１〜１７）の全体構成図である。
【図２】スペクトル可変フィルタ１３の分光特性（ノッチ状）を説明する図である。
【図３】励起フィルタ１５の分光特性を説明する図である。
【図４】落射照明装置（１１〜１７）による光量バランスの調整方法を説明する図である。
【図５】落射照明装置（１１〜１７）による光量バランスの調整方法を説明する図である。
【図６】開口絞り１２の開口１２ａの幅とスペクトル可変フィルタ１３の分光特性との関係を説明する図である。
【図７】開口絞り１２の開口１２ａの幅とスペクトル可変フィルタ１３の分光特性との関係を説明する図である。
【図８】２枚のスペクトル可変フィルタを設けた落射照明装置を説明する図である。
【図９】他のスペクトル可変フィルタの分光特性（バリア状）を説明する図である。
【図１０】ノッチフィルタを用いた落射照明装置による光量バランスの調整方法を説明する図である。
【図１１】ノッチフィルタ（３３）を用いた落射照明装置による光量バランスの調整方法を説明する図である。
【図１２】開口絞り１２の開口１２ａの幅とスペクトル可変フィルタ３３の分光特性との関係を説明する図である。
【図１３】開口絞り１２の開口１２ａの幅とスペクトル可変フィルタ３３の分光特性との関係を説明する図である。
【図１４】他のスペクトル可変フィルタの分光特性（臨界波長型）を説明する図である。
【図１５】図１４の分光特性を有するスペクトル可変フィルタを用いた場合の光量バランスの調整方法を説明する図である。
【符号の説明】
１０ 蛍光顕微鏡
１１ 光源
１２ 開口絞り
１３，３３ スペクトル可変フィルタ
１４ リレーレンズ
１５，３５ 励起フィルタ
１６ ビームスプリッタ
１７ 駆動部
１８ ステージ
２０ 標本
２１ 対物レンズ
２２ 蛍光フィルタ
２３ 結像レンズ
２４ カメラ
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の蛍光物質で標識された標本を照明する蛍光観察用の落射照明装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、複数の蛍光物質で標識された標本の蛍光観察が蛍光顕微鏡などを用いて行われている。複数の蛍光物質の各々は、標本の中の異なる部位に付着している。このため、各々の蛍光物質から発生する蛍光に基づいて、標本の蛍光像を取り込むことにより、複数の蛍光物質で標識された標本の複数の異なる部位を同時に観察することができる。
【０００３】
ところで、標本の中の各々の蛍光物質から蛍光を発生させるためには、各々の蛍光物質を適切な狭波長域の照明光で励起しなければならず、各々の蛍光物質に対する照明光の適切な狭波長域は一般に異なる。このため、標本の蛍光観察時、複数の蛍光物質で標識された標本には、狭波長域の異なる複数の照明光が照射されることになる。このような複数の照明光は、通常、予め定められた複数の異なる狭波長域で光を透過する励起フィルタにより生成される。
【０００４】
また、各々の蛍光物質は一般に蛍光発生効率（照明光の光量に対する蛍光の光量の比率）が異なるため、標本に照射される複数の照明光（狭波長域が異なる）の光量が互いに等しい場合には、各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量が異なってしまう。
【０００５】
そして、この状況で取り込んだ標本の蛍光像には、蛍光発生効率の高い蛍光物質の付着部位が明るい像として、蛍光発生効率の低い蛍光物質の付着部位が暗い像として現れることになる。このように、標本の蛍光像に明るい像と暗い像が混在してしまうと、標本の何れの部位も非常に観察し辛い。
そこで、標本の各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量を等しくするために、標本に照射される複数の照明光の光量を調整する方法が提案された。例えば特許第３０９３００９号には、光源と励起フィルタとの間に干渉フィルタを配置し、この干渉フィルタへ入射する入射光束の入射角を変えて、複数の照明光の光量を調整する方法が記載されている。なお、干渉フィルタを透過した照明光は、励起フィルタを介した後、狭波長域の異なる複数の照明光となる。
【０００６】
この調整方法では、干渉フィルタの回転角度に応じて、干渉フィルタを透過する照明光のスペクトルがシフトし、励起フィルタに入射する照明光のスペクトルもシフトするため、励起フィルタで生成される複数の照明光の光量を調整することができる。
また、透過波長域の異なる複数の干渉フィルタを予め用意しておき、励起フィルタの狭波長域に応じて、何れか１つの干渉フィルタを選択的に照明光の光路中（光源と励起フィルタとの間）に配置させることで、照明光のスペクトルを変更し、標本に対する複数の照明光の光量を調整する方法も提案されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の干渉フィルタを回転させる方法では、干渉フィルタを透過する照明光のスペクトルのシフト範囲が小さいため、複数の照明光の光量を調整可能な波長域が狭いという問題があった。また、励起フィルタを異なる狭波長域のものに交換したときには、その都度、励起フィルタの狭波長域に適応するシフト範囲を持つ干渉フィルタに交換しなければならず、作業が煩雑化すると共に、コスト高となる。
【０００８】
さらに、上記の干渉フィルタを入れ換える方法では、複数の照明光の光量を連続的に調整することはできず、１つの励起フィルタに対して複数の干渉フィルタが必要なため、コスト高となる。
本発明の目的は、標本に対する複数の照明光の光量を広い波長域で連続的に調整することができると共に安価に構成できる蛍光観察用の落射照明装置、およびそれを備えた蛍光顕微鏡を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載の発明は、落射照明光源と、複数の狭波長域の光を抽出する励起フィルタと、前記落射照明光源からの光を前記励起フィルタに導く照明光学系とを備えた蛍光観察用の落射照明装置において、前記照明光学系の光路中で対物レンズの瞳面と略共役な面に配置された開口絞り部材と、前記開口絞り部材に近接して配置され、前記光路に直交する一方向に沿って分光特性が連続的に変化するフィルタ部材と、前記一方向に沿って前記開口絞り部材と前記フィルタ部材とを相対移動させることにより、前記開口絞り部材および前記フィルタ部材を通過した後の光のスペクトルを調整する調整手段とを備えたものである。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の蛍光観察用の落射照明装置において、前記フィルタ部材は、特定の狭波長域を遮断して残りの波長域を抽出可能なノッチ状の分光特性を有すると共に、前記特定の狭波長域が前記一方向に沿って連続的に変化するものである。
請求項３に記載の発明は、請求項１または請求項２に記載した蛍光観察用の落射照明装置において、前記開口絞り部材は、固定的に配置され、前記調整手段は、前記一方向に沿って前記フィルタ部材を移動させることにより、前記スペクトルを調整するものである。
【００１１】
請求項４に記載の発明は、請求項１から請求項３の何れか１項に記載した蛍光観察用の落射照明装置において、前記開口絞り部材の開口は、前記一方向に関する大きさが可変であり、前記調整手段は、前記開口の前記大きさを変化させることにより、前記スペクトルを調整するものである。
請求項５に記載の発明は、複数の蛍光物質で標識された標本の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡において、請求項１から請求項４の何れか１項に記載した蛍光観察用の落射照明装置と、対物レンズを含み、前記標本からの蛍光を集光して前記標本の蛍光像を形成する結像光学系とを備えたものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。
本実施形態は、請求項１〜請求項３，請求項５に対応する。ここでは、図１に示すように、標本２０の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡１０に組み込まれ、標本２０を照明する落射照明装置（１１〜１７）の例を説明する。
【００１３】
蛍光顕微鏡１０には、蛍光観察用の落射照明装置（１１〜１７）の他に、観察系（２１〜２４）が設けられている。標本２０は、例えば２種類の蛍光物質で標識された生物標本（ＤＮＡや蛋白質など）であり、ステージ１８上に載置されている。そして、標本２０は、落射照明装置（１１〜１７）によって照明されると、四方八方に２種類の蛍光を発生する（詳細は後述する）。
【００１４】
まず初めに、蛍光顕微鏡１０の観察系（２１〜２４）について簡単に説明し、その後で、落射照明装置（１１〜１７）について詳しく説明する。
観察系（２１〜２４）は、光軸２０ａに沿って標本２０側から順に、無限遠系の対物レンズ２１と、蛍光フィルタ２２と、第２対物レンズとして機能する結像レンズ２３と、カメラ２４とが配置された構成となっている。蛍光フィルタ２２は、標本２０から発生する２種類の蛍光の波長域を透過する特性の波長選択フィルタである。
【００１５】
標本２０の蛍光観察時、標本２０から発生した２種類の蛍光は、対物レンズ２１と後述のビームスプリッタ１６と蛍光フィルタ２２と結像レンズ２３を介してカメラ２４の撮影面に集光される。
このとき、カメラ２４の撮影面には、対物レンズ２１と結像レンズ２３の作用によって、２種類の蛍光に基づく標本２０の蛍光像が形成される。撮影面の蛍光像は、カメラ２４によって撮影され、標本２０の蛍光画像として取り込まれる。対物レンズ２１および結像レンズ２３は、請求項の「結像光学系」に対応する。
【００１６】
次に、本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）について説明する。
落射照明装置（１１〜１７）は、光軸１０ａに沿って順に、光源１１と、開口絞り１２と、スペクトル可変フィルタ１３と、リレーレンズ１４と、励起フィルタ１５と、ビームスプリッタ１６とが配置され、かつ、スペクトル可変フィルタ１３に駆動部１７が接続された構成となっている。
【００１７】
また、落射照明装置（１１〜１７）は、光軸１０ａが観察系（２１〜２４）の光軸２０ａに対して直交する向きで、観察系（２１〜２４）の対物レンズ２１と蛍光フィルタ２２との間に組み込まれる。このとき、光軸２０ａ上には、落射照明装置（１１〜１７）のビームスプリッタ１６が配置される。
標本２０の蛍光観察時、光源１１からの照明光は、概略、開口絞り１２とスペクトル可変フィルタ１３とリレーレンズ１４と励起フィルタ１５を透過し、ビームスプリッタ１６で反射して、対物レンズ２１を介して標本２０上に導かれる。
【００１８】
さらに、本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）では、対物レンズ２１の瞳面に共役な基準面がリレーレンズ１４によって規定され、この基準面の近傍に、光源１１と開口絞り１２とスペクトル可変フィルタ１３とが近接して配置されている。なお、対物レンズ２１の瞳面は、入射瞳面または後側焦点面とも言う。リレーレンズ１４は、請求項の「照明光学系」に対応する。
【００１９】
光源１１は、例えば光ガイドに導かれた水銀やキセノンなどの多波長光源などであり、紫外線や可視光線などの照明光を対物レンズ２１側の開口絞り１２に向けて射出する。開口絞り１２は、リレーレンズ１４の光路中に固定的に配置された光学素子である。この開口絞り１２には、落射照明装置（１１〜１７）の光軸１０ａ上に細長いスリット形状（長方形）の開口１２ａが設けられている。開口１２ａの長手方向は、紙面に垂直である。
【００２０】
このため、光源１１からの照明光は、開口絞り１２の開口１２ａを通過することにより、上記した基準面（対物レンズ２１の瞳面に共役な面）の近傍において、開口１２ａに応じた所定の断面となる。この断面は開口１２ａと同形（相似形）である。なお、光源１１は、請求項の「落射照明光源」に対応する。開口絞り１２は「開口絞り部材」に対応する。
【００２１】
開口絞り１２の開口１２ａを通過した照明光は、次に、スペクトル可変フィルタ１３に入射する。このとき、スペクトル可変フィルタ１３の開口絞り１２側の面には、開口絞り１２の開口１２ａの像（以下「スリット像」という）が形成される。開口絞り１２とスペクトル可変フィルタ１３が互いに十分近接しているため、スペクトル可変フィルタ１３上のスリット像は開口１２ａと同形（相似形）であると考えられる。
【００２２】
本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）では、スペクトル可変フィルタ１３に駆動部１７が接続され、この駆動部１７を手動操作することにより、スペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）に沿ってスライドさせることができるようになっている。一方向（Ａ）は、光軸１０ａの方向とスリット像の長手方向との双方に垂直な方向であり、照明光の光路に交差している。駆動部１７は、請求項の「調整手段」に対応する。
【００２３】
駆動部１７を操作してスペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）にスライドさせると、開口絞り１２からの照明光がスペクトル可変フィルタ１３に入射する位置が一方向（Ａ）に沿って相対的に変化する。図２（ａ）〜（ｃ）は、開口絞り１２とスペクトル可変フィルタ１３を光軸１０ａの方向から見た図である。そして、図２（ａ）〜（ｃ）に示すように、スペクトル可変フィルタ１３上のスリット像１２ｂの位置も一方向（Ａ）に沿って相対的に変化することになる。
【００２４】
さて、スペクトル可変フィルタ１３は、スリット像１２ｂを形成する照明光のスペクトルを調整するために設けられた光学素子であり、スペクトル調整後の照明光をリレーレンズ１４側へ透過させる。つまり、スペクトル可変フィルタ１３は、照明光の光路中に配置されている。
また、このスペクトル可変フィルタ１３は、ガラス基板の一方の面（開口絞り１２側の面）にコーティングを付けることにより作製された干渉フィルタである。スペクトル可変フィルタ１３のコーティング領域は、一方向（Ａ）に関して開口絞り１２の開口１２ａ（つまり上記のスリット像１２ｂ）より大きく確保されている。コーティングの厚さは、一方向（Ａ）に沿って徐々に変化させてある。
【００２５】
さらに、スペクトル可変フィルタ１３は、図２（ｄ）に示すように、特定の狭波長域を吸収または反射により遮断して、残りの波長域を透過するノッチ状の分光特性を有すると共に、その特定の狭波長域がコーティング領域内で一方向（Ａ）に沿って連続的に変化するように構成されている。つまり、スペクトル可変フィルタ１３の分光特性は、一方向（Ａ）に沿って連続的に変化する。
【００２６】
図２（ｄ）の“Ａａ”〜“Ａｃ”は、各々、図２（ａ）〜（ｃ）に示すスペクトル可変フィルタ１３の位置Ａａ〜Ａｃにおける分光特性を例示したものである。図２（ａ）〜（ｃ）と図２（ｄ）との対応から分かるように、スペクトル可変フィルタ１３の特定の狭波長域は、スペクトル可変フィルタ１３の一端側から他端側に向けて波長が徐々に長くなるような連続変化を示している。
【００２７】
スペクトル可変フィルタ１３における特定の狭波長域の連続変化の幅は、例えば、短波長（例えば３５０ｎｍ）から長波長（例えば６５０ｎｍ）までの広範囲にわたっている。スペクトル可変フィルタ１３は、請求項の「フィルタ部材」に対応する。
【００２８】
したがって、上述のようにしてスペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）にスライドさせると、スリット像１２ｂがスペクトル可変フィルタ１３の位置Ａａに形成される図２（ａ）の状態では、図２（ｄ）の“Ａａ”の分光特性に応じたスペクトルを持つ照明光Ｌ０がスペクトル可変フィルタ１３から透過することになる。同様に、スリット像１２ｂがスペクトル可変フィルタ１３の位置Ａｂ，Ａｃに形成される図２（ｂ），（ｃ）の状態では、図２（ｄ）の“Ａｂ”，“Ａｃ”の分光特性に応じたスペクトルを持つ照明光Ｌ０がスペクトル可変フィルタ１３から透過することになる。
【００２９】
つまり、スペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）にスライドさせることにより、スペクトル可変フィルタ１３の分光特性（特定の狭波長域）の連続的な分布に応じて、スペクトル可変フィルタ１３を透過する照明光Ｌ０のスペクトルを容易に調整（選択）することができる。なお、スペクトル可変フィルタ１３を透過する照明光Ｌ０のスペクトル幅は、開口絞り１２の開口１２ａの幅に応じて決まっている。
【００３０】
上記のスペクトル可変フィルタ１３を透過してスペクトル調整された照明光Ｌ０は、次に、リレーレンズ１４（図１）に入射する。既に説明したように、リレーレンズ１４は、対物レンズ２１の瞳面に共役な基準面を規定する光学系である。このため、その基準面の近傍に配置されたスペクトル可変フィルタ１３からの照明光Ｌ０は、リレーレンズ１４の作用によって対物レンズ２１の瞳面に集光される。
【００３１】
ただし、リレーレンズ１４を透過した照明光は、観察系（２１〜２４）の光軸２０ａ上に導かれる前に、つまり、落射照明装置（１１〜１７）の光軸１０ａ上を進行している間に、励起フィルタ１５を透過する。この励起フィルタ１５は、図３に示すように、予め定められた２つの異なる狭波長域λ１，λ２で照明光を透過するフィルタである。
【００３２】
ちなみに、励起フィルタ１５の２つの狭波長域λ１，λ２のうち一方は、標本２０の中の一方の蛍光物質を励起するために適切な狭波長域であり、２つの狭波長域λ１，λ２のうち他方は、標本２０の中の他方の蛍光物質を励起するために適切な狭波長域である。
励起フィルタ１５に入射する照明光のスペクトルは、スペクトル可変フィルタ１３を透過した照明光Ｌ０のスペクトルと同じである。つまり、リレーレンズ１４によって照明光のスペクトルが変化することはない。このため、励起フィルタ１５は、照明光Ｌ０の波長域（図２（ｄ）参照）のうち、２つの狭波長域λ１，λ２（図３）のみを同時に抽出する。
【００３３】
したがって、励起フィルタ１５を透過した照明光は、異なる狭波長域λ１，λ２の２つの照明光Ｌ１，Ｌ２を含むものとなる。この２つの照明光Ｌ１，Ｌ２は、励起フィルタ１５に入射する照明光Ｌ０の一部である。そして、２つの照明光Ｌ１，Ｌ２が対物レンズ２１の瞳面に集光され、対物レンズ２１を通過した後、標本２０に照射される。
【００３４】
標本２０の中では、一方の蛍光物質が例えば狭波長域λ１の照明光Ｌ１によって励起され、自身の蛍光発生効率（照明光の光量に対する蛍光の光量の比率）に応じた光量の蛍光を発生する。同様に、他方の蛍光物質は例えば狭波長域λ２の照明光Ｌ２によって励起され、自身の蛍光発生効率に応じた光量の蛍光を発生する。
これら２種類の蛍光は、上記した観察系（２１〜２４）のカメラ２４に導かれ、カメラ２４によって２種類の蛍光に基づく標本２０の蛍光像が撮影され、標本２０の蛍光画像として取り込まれる。このとき、２種類の蛍光の光量が異なってしまうと、標本２０の蛍光画像には明るい像と暗い像が混在することになり、非常に観察し辛い。
【００３５】
次に、標本２０の各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量を等しくするために、本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）を用い、標本２０に照射される２つの照明光Ｌ１，Ｌ２の光量を調整する方法について説明する。
【００３６】
上述したように、本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）では、スペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）にスライドさせることにより、スペクトル可変フィルタ１３を透過する照明光Ｌ０のスペクトルを容易に調整できる。
このため、例えば図４（ａ）に示すように、開口１２ａのスリット像がスペクトル可変フィルタ１３の位置Ａ１に形成される状態のとき、図４（ｂ）の“Ａ１”の分光特性に応じたスペクトルを持つ照明光Ｌ０がスペクトル可変フィルタ１３から透過することになる。
【００３７】
図４（ｂ）の“Ａ１”の分光特性とは、その狭波長域が、励起フィルタ１５の一方の狭波長域λ１と少し重なり、他方の狭波長域λ２とは重ならないような特性である。したがって、励起フィルタ１５を透過する２つの照明光のうち、狭波長域λ１の照明光Ｌ１の光量は、図４（ｂ）の斜線ハッチング部に示すように減量され、狭波長域λ２の照明光Ｌ２の光量は、点ハッチング部に示すように最大光量のまま保たれる。
【００３８】
このような設定は、狭波長域λ１の照明光Ｌ１によって励起可能な一方の蛍光物質の蛍光発生効率と比較して、狭波長域λ２の照明光Ｌ２によって励起可能な他方の蛍光物質の蛍光発生効率が低い場合に有効である。
また、例えば図５（ａ）に示すように、開口１２ａのスリット像がスペクトル可変フィルタ１３の位置Ａ２に形成される状態のとき、図５（ｂ）の“Ａ２”の分光特性に応じたスペクトルを持つ照明光Ｌ０がスペクトル可変フィルタ１３から透過することになる。
【００３９】
図５（ｂ）の“Ａ２”の分光特性とは、その狭波長域が、励起フィルタ１５の他方の狭波長域λ２と少し重なり、他方の狭波長域λ１とは重ならないような特性である。したがって、励起フィルタ１５を透過する２つの照明光のうち、狭波長域λ２の照明光Ｌ２の光量は、図５（ｂ）の斜線ハッチング部に示すように減量され、狭波長域λ１の照明光Ｌ１の光量は、点ハッチング部に示すように最大光量のまま保たれる。
【００４０】
このような設定は、狭波長域λ１の照明光Ｌ１によって励起可能な一方の蛍光物質の蛍光発生効率と比較して、狭波長域λ２の照明光Ｌ２によって励起可能な他方の蛍光物質の蛍光発生効率が高い場合に有効である。
本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）では、スペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）にスライドさせるだけで、標本２０に照射される２つの照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを容易に調整することができ、標本２０の各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量を等しくできる。
【００４１】
その結果、カメラ２４で取り込まれる標本２０の蛍光画像には、標本２０の異なる部位に関する２種類の蛍光像が共に適切な明るさで混在することになり、良好な蛍光観察が可能となる。
さらに、本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）では、スペクトル可変フィルタ１３における特定の狭波長域の連続変化の幅が広範囲にわたっている（例えば３５０ｎｍ〜６５０ｎｍ）ため、スペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）にスライドさせるだけで、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを広い波長域で連続的に調整することができる。
【００４２】
また、励起フィルタ１５を異なる狭波長域のものに交換したときでも、スペクトル可変フィルタ１３を交換する必要がない。つまり、スペクトル可変フィルタ１３を交換しなくても、任意の蛍光物質の組み合わせにも柔軟に対応することができ、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを連続的に調整できる。その結果、作業が簡単化すると共に安価に構成でき、汎用性が向上する。
【００４３】
さらに、本実施形態の落射照明装置（１１〜１７）では、スペクトル可変フィルタ１３を対物レンズ２１の瞳面に共役な基準面の近傍に配置するため、標本２０の視野における光学特性の劣化（照明ムラなど）が生じることはない。したがって、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを連続的に調整した場合でも、高精度な蛍光観察が可能となる。
【００４４】
なお、上記した実施形態は、開口絞り１２の開口１２ａの幅（一方向（Ａ）に関する大きさ）が一定である例を説明したが、図６（ａ），図７（ａ）に示すように、光軸１０ａを中心として開口１２ａの幅を変化させることもできる。このような変化も、上記の駆動部１７（図１）を用いた手動操作により簡単に行うことができる。
【００４５】
この場合、図６（ｂ），図７（ｂ）に示すように、開口１２ａの幅に応じて、スペクトル可変フィルタ１３を透過する照明光Ｌ０のスペクトル幅を容易に調整することができる。開口１２ａの幅が広いほど、照明光Ｌ０のスペクトル幅も広い。そして、標本２０に照射される２つの照明光Ｌ１，Ｌ２の光量を同時に強くしたり弱くしたりすることができる。
【００４６】
また、上記した実施形態では、対物レンズ２１の瞳面に共役な基準面の近傍に１枚のスペクトル可変フィルタ１３を設けたが、図８に示すように、励起フィルタ３５が３つの異なる狭波長域λ１，λ２，λ３で照明光を透過するように構成されている場合には、２枚のスペクトル可変フィルタ１３（１），１３（２）を設けることもできる。スペクトル可変フィルタ１３（１），１３（２）の分光特性は、上記したスペクトル可変フィルタ１３と同じである（図２参照）。スペクトル可変フィルタ１３（１），１３（２）は、駆動部１７によって独立にスライド可能である。
【００４７】
この場合、スペクトル可変フィルタ１３（１），１３（２）を一方向（Ａ）に独立にスライドさせることにより、例えば、開口絞り１２の開口１２ａのスリット像が、スペクトル可変フィルタ１３（１）の位置Ａ１とスペクトル可変フィルタ１３（２）の位置Ａ２に形成されるような設定とすることができる。
このとき、図８（ｂ）に示すように、スペクトル可変フィルタ１３（１）の“Ａ１”の分光特性（励起フィルタ１５の狭波長域λ２と少し重なる特性）と、スペクトル可変フィルタ１３（２）の“Ａ２”の分光特性（励起フィルタ１５の狭波長域λ３と少し重なる特性）とに応じて、次のような照明状態を得ることができる。
【００４８】
つまり、狭波長域λ２，λ３の照明光Ｌ２，Ｌ３の光量を、図８（ｂ）の斜線ハッチング部に示すように減量し、狭波長域λ１の照明光Ｌ１の光量を、点ハッチング部に示すように最大光量のまま保つことができる。このような構成および設定は、標本２０が３つの蛍光物質で標識され、狭波長域λ１の照明光Ｌ１によって励起可能な蛍光物質の蛍光発生効率と比較して、狭波長域λ２，λ３の照明光Ｌ２，Ｌ３によって励起可能な蛍光物質の蛍光発生効率が高い場合に有効である。
【００４９】
また、４つ以上の蛍光物質で標識された標本２０の蛍光観察を行う場合にも、本発明は適用できる。この場合には上記と同様に、スペクトル可変フィルタの数を増やせばよい。
さらに、上記した実施形態では、特定の狭波長域を遮断して残りの波長域を透過するノッチ状の分光特性を有するスペクトル可変フィルタの例を説明したが、図９に示すように、特定の狭波長域を透過して残りの波長域を遮断するバリア状の分光特性を有するスペクトル可変フィルタ３３（図１０，図１１）を用いることもできる。
【００５０】
このようなバリアフィルタを用いる場合にも、上記のノッチフィルタを用いた場合と同様、スペクトル可変フィルタ３３を一方向（Ａ）にスライドさせるだけで、２つの照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを容易に調整することができ、標本２０の各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量を等しくできる。
さらに、スペクトル可変フィルタ３３における特定の狭波長域の連続変化の幅が広範囲にわたっている（例えば３５０ｎｍ〜６５０ｎｍ）ため、スペクトル可変フィルタ３３を一方向（Ａ）にスライドさせるだけで、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを広い波長域で連続的に調整することができる。
【００５１】
また、励起フィルタ１５を異なる狭波長域のものに交換したときでも、スペクトル可変フィルタ３３を交換する必要がない。つまり、スペクトル可変フィルタ３３を交換しなくても、任意の蛍光物質の組み合わせにも柔軟に対応することができ、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを連続的に調整できる。その結果、作業が簡単化すると共に安価に構成でき、汎用性が向上する。
【００５２】
さらに、スペクトル可変フィルタ３３を対物レンズ２１の瞳面に共役な基準面の近傍に配置するため、標本２０の視野における照明ムラなどが生じることはない。したがって、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを連続的に調整した場合でも、高精度な蛍光観察が可能となる。
また、スペクトル可変フィルタ３３を用いた場合であっも、図１２（ａ），図１３（ａ）に示すように、光軸１０ａを中心として開口１２ａの幅を変化させることで、図１２（ｂ），図１３（ｂ）に示すように、スペクトル可変フィルタ３３を透過する照明光Ｌ０のスペクトル幅を容易に調整することができる。開口１２ａの幅が広いほど、照明光Ｌ０のスペクトル幅も広い。そして、標本２０に照射される２つの照明光Ｌ１，Ｌ２の光量を同時に強くしたり弱くしたりすることができる。
【００５３】
さらに、上記した実施形態では、１枚のスペクトル可変フィルタ３３でバリア状の分光特性（図９参照）を達成する例を説明したが、図１４（ａ）に示すように特定の臨界波長から長波側を透過するスペクトル可変フィルタ３３（１）と、図１４（ｂ）に示すように特定の臨界波長から短波側を透過するスペクトル可変フィルタ３３（２）とを組み合わせることもできる。
【００５４】
なお、スペクトル可変フィルタ３３（１），（２）の臨界波長は、各々、一方向（Ａ）に沿って連続的に変化するように構成されている。また、スペクトル可変フィルタ３３（１），（２）は、駆動部１７によって独立にスライド可能である。この場合にも、上記した１枚のバリアフィルタ（スペクトル可変フィルタ３３）を用いた場合と同様の効果を得ることができる。
【００５５】
さらに、上記した実施形態では、対物レンズ２１の瞳面に共役な基準面の近傍に光源１１と開口絞り１２を配置したが、このような光源手段（１１，１２）に代えて、光ガイドを用いることもできる。この場合、光ガイドの出射端面をスペクトル可変フィルタの近傍に配置することが好ましい。また、光源手段（１１，１２）に代えて、水銀ランプと集光レンズを用いることもできる。この場合、集光レンズによってスペクトル可変フィルタの近傍にアーク像を形成することが好ましい。
【００５６】
また、上記した実施形態では、光源１１，開口絞り１２，スペクトル可変フィルタ１３の順に配置する例を説明したが、開口絞り１２とスペクトル可変フィルタ１３の位置関係は逆でもよい。光源手段（１１，１２）に代えて水銀ランプと集光レンズを用いる場合には、開口絞り１２を省略することもできる。
さらに、上記した実施形態では、開口絞り１２を固定的に配置すると共にスペクトル可変フィルタ１３を一方向（Ａ）に沿ってスライドさせる構成例を説明したが、本発明はこれに限らない。スペクトル可変フィルタ１３を固定的に配置すると共に開口絞り１２を一方向（Ａ）に沿ってスライドさせてもよいし、スペクトル可変フィルタ１３と開口絞り１２とを一方向（Ａ）に沿って相対的にスライド（移動）させてもよい。
【００５７】
また、上記した実施形態では、落射照明装置（１１〜１７）と観察系（２１〜２４）とが交差する箇所にビームスプリッタ１６を配置したが、これに代えてダイクロイックミラーを配置しても良い。ダイクロイックミラーは、励起フィルタ１５，３５を透過した複数の狭波長域の照明光を反射可能で、標本２０から発生した複数の蛍光を透過可能な分光特性を有する。
【００５８】
さらに、上記した実施形態では、蛍光顕微鏡１０に落射照明装置（１１〜１７）を組み込む例で説明したが、落射照明装置（１１〜１７）は、蛍光顕微鏡だけでなく、他の蛍光測定装置に組み込むこともできる。
【００５９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、標本に対する複数の照明光の光量を広い波長域で連続的に調整することができると共に安価に構成することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光顕微鏡１０および落射照明装置（１１〜１７）の全体構成図である。
【図２】スペクトル可変フィルタ１３の分光特性（ノッチ状）を説明する図である。
【図３】励起フィルタ１５の分光特性を説明する図である。
【図４】落射照明装置（１１〜１７）による光量バランスの調整方法を説明する図である。
【図５】落射照明装置（１１〜１７）による光量バランスの調整方法を説明する図である。
【図６】開口絞り１２の開口１２ａの幅とスペクトル可変フィルタ１３の分光特性との関係を説明する図である。
【図７】開口絞り１２の開口１２ａの幅とスペクトル可変フィルタ１３の分光特性との関係を説明する図である。
【図８】２枚のスペクトル可変フィルタを設けた落射照明装置を説明する図である。
【図９】他のスペクトル可変フィルタの分光特性（バリア状）を説明する図である。
【図１０】ノッチフィルタを用いた落射照明装置による光量バランスの調整方法を説明する図である。
【図１１】ノッチフィルタ（３３）を用いた落射照明装置による光量バランスの調整方法を説明する図である。
【図１２】開口絞り１２の開口１２ａの幅とスペクトル可変フィルタ３３の分光特性との関係を説明する図である。
【図１３】開口絞り１２の開口１２ａの幅とスペクトル可変フィルタ３３の分光特性との関係を説明する図である。
【図１４】他のスペクトル可変フィルタの分光特性（臨界波長型）を説明する図である。
【図１５】図１４の分光特性を有するスペクトル可変フィルタを用いた場合の光量バランスの調整方法を説明する図である。
【符号の説明】
１０ 蛍光顕微鏡
１１ 光源
１２ 開口絞り
１３，３３ スペクトル可変フィルタ
１４ リレーレンズ
１５，３５ 励起フィルタ
１６ ビームスプリッタ
１７ 駆動部
１８ ステージ
２０ 標本
２１ 対物レンズ
２２ 蛍光フィルタ
２３ 結像レンズ
２４ カメラ
Claims (5)
- 落射照明光源と、複数の狭波長域の光を抽出する励起フィルタと、前記落射照明光源からの光を前記励起フィルタに導く照明光学系とを備えた蛍光観察用の落射照明装置において、
前記照明光学系の光路中で対物レンズの瞳面と略共役な面に配置された開口絞り部材と、
前記開口絞り部材に近接して配置され、前記光路に直交する一方向に沿って分光特性が連続的に変化するフィルタ部材と、
前記一方向に沿って前記開口絞り部材と前記フィルタ部材とを相対移動させることにより、前記開口絞り部材および前記フィルタ部材を通過した後の光のスペクトルを調整する調整手段とを備えた
ことを特徴とする蛍光観察用の落射照明装置。 - 請求項１に記載の蛍光観察用の落射照明装置において、
前記フィルタ部材は、特定の狭波長域を遮断して残りの波長域を抽出可能なノッチ状の分光特性を有すると共に、前記特定の狭波長域が前記一方向に沿って連続的に変化する
ことを特徴とする蛍光観察用の落射照明装置。 - 請求項１または請求項２に記載した蛍光観察用の落射照明装置において、
前記開口絞り部材は、固定的に配置され、
前記調整手段は、前記一方向に沿って前記フィルタ部材を移動させることにより、前記スペクトルを調整する
ことを特徴とする蛍光観察用の落射照明装置。 - 請求項１から請求項３の何れか１項に記載した蛍光観察用の落射照明装置において、
前記開口絞り部材の開口は、前記一方向に関する大きさが可変であり、
前記調整手段は、前記開口の前記大きさを変化させることにより、前記スペクトルを調整する
ことを特徴とする蛍光観察用の落射照明装置。 - 複数の蛍光物質で標識された標本の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡において、
請求項１から請求項４の何れか１項に記載した蛍光観察用の落射照明装置と、対物レンズを含み、前記標本からの蛍光を集光して前記標本の蛍光像を形成する結像光学系とを備えた
ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
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