JPH07506373A - プロブコールの可溶性類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロブコールの可溶性類似体 本発明は政府の援助により、承認番号ＨＬ−１４１９７の付与のもとで、国家健 康機関（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）により なされた。

政府は本発明における一定の権利を有する。

発明の背景 本発明は水溶性酸化防止製剤の分野に属する。より詳しくは、本発明は様々な用 途にとってのプロブコール化合物の加水分解性、水溶性誘導体の分野に属する。

プロブコールは有効な酸化防止剤であり、幅広く利用されている食品添加剤、２ ．（３）　−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）及び２， ６−シーｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＩＴ）に化学的に関連す る。プロブコール及び様々な関連化合物は様々な特許、例えば、 Ｗａｎｇの米国特許第３．４８５．８４３号：Ｎａｕｗｏｒｔｈの米国特許第３ ．５７６、８３３号；Ｂａｒｎｈａｒｔらの米国特許第３．８６２．３３２号、 及びＨｅｎｄｌｅｒの米国特許第４．９８５．４６５号に記載されている。その 正式な化学名称は４．４’−（イソプロピリデンチオ）ビス（２，６−シーｔｅ ｒｔ−ブチルフェール）であり、そして以下の構造式を有する。

今日、プロブコールは主に高コレステロール疾患者における血清コレスロール値 を低めるために用いられているが、しかし近年の研究は、それがウィルス及びレ トロウィルス感染症（例えばヒト免疫不全ウィルス（）ＩＩＶ−１感染症）の如 きのその他の病気の処置にも利用できることを示している。プロブコールの抗ウ イルス特性は、あらゆる目的のために引用することで本明細書に組入れる米国特 許第４、９８５．４６５号に記載されている。プロブコールは不整脈を処置する うえで有効であるとも主張されている；　ＭｃＣａｕｇｈａｎの米国特許第４、 ７１９．２３７号を参照のこと。

近年の証拠は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のアテローム発生作用はその酸 化的改質を通じである程度媒介されうることを示唆している。プロブコールは有 効な酸化防止特性を有し、モしてＬＤＬの酸化的改質を阻止することが示されて いる。これらの発見と一致して、プロブコールは、あらゆる目的のために引用す ることで本明細書に組入れるＣａｒｅｗら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４　：　７７２５−７７２９（１９８７）の中に記載 の通り、ＬＤＬレセプター欠損ウサギにおけるアテローム硬化症の進行を事実１ 遅めることが示されている。おそらく、プロブコールは有効であり、その理由は それが非常に脂質可溶性であり、且つリポタンパク質により輸送され、それ故そ れらを酸化的損傷から保護するからである。

残念ながら、プロブコールは水の中ではほぼ不溶性であり、従って静脈内的に注 射することはできない（細胞がインビトロでそれらを取り込むことさえも困難で あり、その理由はバッファー及び細胞培養用培地の中でのその劣った混和性にあ る）。従って、プロブコールは一般に商標名Ｌｏｒｃｌｃｏ　（商標ＸＭａｒｉ ｏｎ　Ｍｅｒｒｅｌｌ　ＤｏｗＰｈａｒｍａｃｅｎｔｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、、 　Ｋａｎｓａｓ　Ｃ１ｔｙ、　ＭＯ）のもとて入手できる錠剤の形状において投 与されている。しかしながら、固形のプロブコールは血液の中に吸収されに（く 、そして実質的に無変化の状態で排せつされる。更に、プロブコールの錠剤形状 は異なる患者によって明らかに異なる速度及び異なる量において吸収される。あ る研究において（ｔ（ｅｅｇら、Ｐｌａｓｍａ　Ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｂ ｕｃｏｌ　ｉｎ　Ｍａｎ　ＡｆｔｅｒＳｉｎｇｌｅ　ａｎｄ　Ｒｅｐｅａｔｅｄ 　０ｒａｌ　Ｄｏｓｅｓ、　Ｌａ　Ｎｏｕｖｅｌｌｅ　Ｐｒｅｓｓｅ　Ｍｅｄｉ ｃａｌｅ。

９　：　２９９０−２９９４　（１９８０乃、血清中のプロブコールのピーク値 は患者間で２０はどの高い係数で異なることが見い出された。別の研究において 、Ｋａｚｕｙａら１．Ｊ、Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、　３２　：　１９７−２０４　 （１９９１）は、上皮細胞を５０μＭのプロブコールと２４ｈインキユベートし たときに約１８２未満のプロブコール／１０１の細胞の取り込みを観察した。

プロブコールの低い水溶解度は別の態様におけるその存用性を制約する。組織に 至る血液の流れが遮断され、そしてその後に回復したとき、フリーラジカル及び その結果としての酸化的障害の発生に大いに起因するいわゆる再潅流損傷が起こ る。毎年、心筋梗塞を有する数千人の患者に、凝塊した冠状動脈の再開口のため に、血栓溶解剤を注射することが試まれでいる。これらの患者は再潅流障害を発 症する高い危険性にある。酸化防止剤は潅流後の障害を制限するようであること が見い出された。事実、いくつかの研究は、ラットにおいて腎動脈をくくる前の 一定時間にわたってプロブコールを経口的に投与することが、腎臓における潅流 後の障害を制限できうろことを示した。従って、有効な酸化防止剤の同時注射は かかる患者の予後を存意に向上せしめうる。残念ながら、経口投与によってプロ ブコール値を増進させるには数日かかり、またある者が心筋梗塞を存するであろ うことを予測することはできない。

上記の所見は、患者によって容易に吸収され、且つ静脈内投与されつるプロブコ ール導入製剤（好ましくは水性溶液）の必要性を示す。残念ながら、既知の水溶 性酸化防止剤は事前酸化が起こるリポタンパク質又はその他の膜の中へと分離さ れない。従って、所望の製剤は脂質含有相へと分離する酸化防止剤も供すべきで ある。

発明の概要 本発明は水溶性プロブコール化合物のクラスを提供する。これらの化合物は構造 的に既知のプロブコール化合物に類似するが、ビス−フェノール上にあるヒドロ キシル基のいづれか又は両方に代わってエステル基を有する。このエステル基は 非常に不溶性なプロブコール化合物にある程度高められた水溶解性を授ける官能 基を有するカルボン酸に由来する。好適なエステルは遊離のプロブコール化合物 をもたらしめるために加水分解性である。

−の観点において、本発明はプロブコール化合物の水溶性誘導体を提供し、それ においては、そのプロブコール化合物の少なくとも−のフェニルヒドロキシル基 が極性又は帯電した官能基を有するエステル基に置き代わっている。加水分解に より、本発明のエステルは遊離プロブコール化合物をもたらしめる。本発明の好 適な組成物は飽和又は不飽和ジカルボン酸、アミノカルボン酸及びアルデヒド含 有カルボン酸のプロブコールエステルである。より好ましくは、本発明のプロブ コールエステル上のカルボン酸は３〜１０個の炭素原子を存する。

特に好適なプロブコール化合物のエステルは下記の式を有する：（式中、Ｒ８及 びＲ７は独立して１〜８個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル又はアリー ル基を表わし：Ｒ２〜Ｒ１は独立して１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル を表わし；そしてＸ及びＹは独立して極性又は帯電官能基を含むアルキル又はア ルケニル基を表わす）。好ましくは、その官能基はカルボン酸、カルボン酸基の 塩、アミン基、アミン基の塩、アミド基、又はアルデヒド基である。

好ましくは、Ｒ２−Ｒ６の少なくとも二つはｔｅｒｔ−ブチルを表わす。より好 ましくは、Ｒ２とＲ４の少なくとも一方及びＲ，とＲ６の少なくとも一方がｔｅ ｒｔ−ブチルを表す。特に好適な態様において、Ｒ，及びＲ２はそれぞれメチル を表わし、そしてＲ３−Ｒ１はそれぞれｔｅｒｔ−ブチルを表わす。

別の好適な態様において、ＸもしくはＹのいづれが、又はＸとＹの両者は独立し て、１〜９個の炭素原子のカルボン酸基又はカルボン酸塩を表わす。典型的な例 にはアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニア、遷移金属、貴金属、重金属 等の塩が含まれる。他方、ＸもしくはＹ、又はＸとＹの両者は独立して１〜９個 の炭素原子のアルキルアミン基又はアルキルアミン塩を表わす。典型的なアミン 塩には塩酸塩及び四級アンモニウム塩が含まれる。別の好適な態様において、Ｘ 及びＹは同一の基、好ましくは−（ＣＨ２）！　Ｃ０ＯＨ又は（ＣＨｚ）ｓｃＯ ＯＩＩの塩を表わす。

本発明の別の観点において、動物は薬理学的に有効な用量のプロブコール化合物 を投与することによって動物の中での酸化を阻害するための方法を提供する。か かる化合物はプロドラッグとして有用でありうる。適切なプロドラッグはプロブ コール化合物のフェニルヒドロキシル基の位置において加水分解性エステル基を 存しうる。

プロトラッグの好適な用量は、処置すべき症状の種類及び重症度に応じて、体重 ｋｇ当り約１〜５０ｍｇである。ある態様においては、この薬理組成物は水性溶 液中で静脈内的に投与する。別の態様においては、それは固体又は水性溶液とし て経口投与する。

更なる別の観点においては、本発明の酸化を受け易い動物の器官に治療的な量の プロブコール化合物を導入するための方法を提供する。この方法は、本発明のプ ロブコール化合物エステルを動物に投与し、次いで酸化を受け易い動物の器官に 輸送せしめることを包括する。最終的に、この水溶性誘導体は加水分解されて遊 離なプロブコール化合物を酸化を受け易い動物の器官に放出せしめる。好ましく は、このプロブコール化合物は酸化を受け易い動物の器官における脂質含有物質 の中へと放出されるであろう。

本発明の更なる理解は下記の説明及び添付図面より得られつる。

特定の態様の詳細 本発明は水溶性化合物のクラスを提供し、これはプロブコール化合物へと容易に 加水分解し、それ故過酸化を防ぐようリポタンパク質又は脂質含有物質によって 取り込まれうる。従って、本発明は投与し易く、且つ治療的に有効であり、脂質 環境において有効な酸化防止剤へと容易に変換するプロブコール誘導体を提供す る。

本明細書で用いている「プロブコール化合物」は酸化防止特性を有するプロブコ ール又はプロブコール類似体を意味する。酸化防止剤は一般に、生物材料にイン ビボ及び／又はインビトロ酸化損傷を及ぼすことのできるフリーラジカルを排除 する化合物である。化学的に、プロブコールは時折り立体障害型フェノール（即 ち、フェノール化合物であって、フェニル環上のヒドロキシル基が別の基、例え ば隣りのフェニル位置のアルキル基によって少なくとも部分的にブロックされて いる化合物）と呼ばれる化合物のクラスの構成員である。数多くのこのような化 合物において、ヒドロキシル基の隣りの環位置の一方又は両方は第三ブチル基に より置換されている。理論に拘束されるわけてはないか、プロブコールの酸化防 止及びコレステロール低下作用自体、化学的に遊離なヒドロキシル基を必要とす るようである。

水溶性プロブコール化合物誘導体の好適な群は下記の式を有する：（式中、Ｒ１ 及びＲ２は独立して１〜８個の炭素原子のアルキル、アルケニル又はアリール基 を表わし：Ｒ１〜Ｒ１は独立して１〜４個の炭素原子の低級アルキルを表わし： そしてＸ及びＹは独立して極性又は帯電官能基を含むアルキル又はアルケニル基 を表わす）。

上記の式において、各フェニル環上のヒドロキシの位置に１の番号を付す。Ｒ４ 及びＲ６は番号２の位置に位置し、Ｒ１及びＲ６は番号６の位置に位置し、そし て硫黄原子は番号４の位置において付加している。本発明の水溶性誘導体へと変 換しうる溶解性の乏しいプロブコール化合物の特定の例は、先に述べたように引 用することて本明細書に組入れたＨｅｎｄｌｅｒの米国特許第４．９８５．４６ ５号において挙げられている。即ち、例えば４．４’−（イソプロピリデンジチ オ）ビス（２−ｔｅｒｔ−ブチル、６−イツブロビルフエノール）の一定の水溶 性誘導体が本発明の化合物のクラスに属する。

好適な態様において、Ｘ及びＹ上の極性又は帯電官能基はカルボン酸基、カルボ ン酸基の塩、アミン基、アミン基の塩、アミド基又はアルデヒド基である。更な る好適な態様において、Ｒ２−Ｒ１の少な（とも二つがｔｅｒｔ−ブチルを表わ す。より好ましくは、Ｒ２とＲ４の少なくとも一方、及びＲ１とＲ６の少なくと も一方がｔｅｒｔ−ブチルを表わす。特定の好適な態様において、Ｒ５とＲ１は それぞれメチルを表わし、そしてＲ２とＲ，はそれぞれｔｅｒｔ−ブチルを表わ す。

別の好適な態様において、ＸもしくはＹのいづれか、又はＸとＹの両者は独立し て、極性又は帯電官能基を有する１〜９個の炭素原子のアルキル又はアルケニル 基を表わす。好適な官能基にはカルボン酸基又はカルボン酸塩が含まれる。典型 的な塩にはアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニア、遷移金属、貴金属、 重金属等の塩が含まれる。他方、ＸもしくはＹ、又はＸとＹの両者は独立して１ 〜９個の炭素原子のアルキルアミン基又はアルギルアミン塩を表わす。典型的な アミン塩には塩酸塩及び四級アンモニウム塩が含まれる。別の特定な態様におい て、ＸとＹは同一の基、好ましくは（Ｃ）１２）３ＣＯＯＨ又は（ＣＨ２）、Ｃ ０ＯＨの塩を表わす。

本発明の特に好適な態様は、ナトリウム又はカリウム塩として溶解しつるプロブ コール化合物のジカルボン酸エステルのクラスである。かかる化合物のエステル 基は容易に加水分解し、生物学的に活性な遊離のプロブコール化合物を発生せし める。例えば、プロブコールのグルタル酸誘導体は、リン酸緩衝食塩水の中で、 又は細胞培養培地であるＨａｍのＦ−１０の中で１〜３時間で加水分解すること が見い出された。

最も好適なプロブコール化合物のジカルボン酸エステルはコハク酸、グルタル酸 、アジピン酸、スバリン酸、セバシン酸、アゼライン酸及びマレイン酸エステル である。これらの化合物はプロブコール化合物のモノ−又はジ−エステルのいづ れかであってよい。通常、このジエステルは合成し易く、そしてより可溶性であ る。従って、それらが一般に好ましい、更に、好適なジカルボン酸エステルはナ トリウム及びカリウム塩の如きの塩に容易に変換しつる。これらの塩を濾過除菌 し、そしてインビトロ及びインビボ用途の両者のために使用できる。それらは有 機溶媒抜きで正確な濃度でプロブコールを調製するうえで特に有用である。

本発明の好適な化合物は水の中で約１ｍｇ／ｍｌより大の溶解度を有するであろ う。より好ましくは、それらは約１０ｍｇ／ｍｌより大、そして最も好ましくは 約２５ｍｇ／ｍｌより大の溶解度を有するであろう。好ましくは、これらの化合 物は生理学的環境の中で脂質可溶性プロブコール化合物へと容易に加水分解され るであろう。かかる化合物はインビトロ又はインビボにおいて、脂質の過酸化又 はその他の酸化的損傷を防ぐうえで有用であろう。

本明細書で用いている「加水分解」とは、エスル（Ｈｈによる）又はその他の化 合物の、水分子の付加による酸及びアルコールへ変換を意味する。通常、加水分 解反応は過剰の酸又は塩基により触媒される。本明細書で用いる「自発的加水分 解」とは、外的要因、例えば触媒の付加抜きで起こる加水分解反応を意味する。

例えば、もしエステルを水に加え、そして対応のカルボン酸及び対応のアルコー ルへと変換せしめるとき、触媒又はその他の外的因子を加えないならその反応は 自発的加水分解である。むろん、もしエステルを既に若干酸性又は塩基性である 培地に加えるとき、その反応を起こらせるために添加剤を必要としないならその 加水分解も自発性である。

別の例において、エステルは、もしそれを生物学的培地に加え、そしてその他の 試薬の添加後きて放置によりその構成酸及びアルコールへと変換するなら、自発 的に加水分解したといえる。従って、例えば、エスルは生理学的条件下で血流の 中で自発的に加水分解しつる。典型的には、自発的加水分解反応は数日以内、そ して好ましくは約４８時間以内で完了するであろう。

本発明の水溶性化合物は生物学的材料（特に脂質含有物質）を酸化的に損傷を受 けるのを防ぐうえで有用である。従って、例えば、動物（例えばヒト）は、その 動物に薬理学的に有効な用量の水溶性プロブコール化合物を投与することによっ て処置されうる。本発明の化合物は水溶性であるため、それらは、伝統的なプロ ブコール化合物に比べ、血流の中で高いレベルでより容易に取り込まれるであろ う。そして、本発明の化合物は加水分解性エステル基を有するため、それらは、 リポタンパク質の如きの脂質含有材料へと分離しつる遊離なプロブコール化合物 へと変換するであろう。そこでこれらのプロブコール化合物の有用な酸化防止剤 として働（であろう。

本発明の組成物はヒトに、好ましくは体重ｋｇ当り約０．Ｏ１〜約１００ｍｇ。

より好ましくは約ｌＯ〜約ｓｏｍｇ／ｋｇの毎日の用量範囲で投与してよい。

最も好適な態様においては、その毎日の用量は約５０ｍｇ／　ｋｇであろう。

しかしながら、この用量は処置すべき患者の症状の重症度及びその症状の種類に 応じて変わりつるであろう。当業者はどれぐらいの用量範囲が処置すべき特定の 症状にとって適当であるかを容易に決定することができるであろう。従って、ア テローム症、潅流後の障害及びウィルス感染の処置にとって様々な好適な範囲が 適切でありうる。更に、その用量は、その組成物を静脈内的、又は口径的に投与 するかによって変わるであろう。両方の投与の経由が特定の病気にとっては有用 であろう。

本発明の組成物は水溶性であるため、それらはバッファー又は血漿の如のきの水 性媒体の中で輸送されつる。従って、静脈内注射により投与したとき、それらは 全身の酸化損傷を受け易い箇所へと迅速に導かれる。これらの化合物は加水分解 して遊離のプロブコール又はプロブコール類似体を放出せしめるため、それらは 、酸化を受け易い領域（例えば原形質膜及びＬＤＬ）を含む、動物における脂質 含有領域に取り込まれる。一定のタイプの刺激により迅速な呼吸燃焼を受ける好 中球及び単球の如きの細胞は、この状況で酸化防止剤に富むときには少なめの量 の酸素ラジカルを産生しうる。従って、白血球は、それらが水溶性プロブコール を取り込んで加水分解せしめたとき、少なめのスーパーオキサイドアニオンラジ カルを発生せしめつる。

本発明の水溶性組成物はインビトロ用途にとっての追加の利点を供する。例えば 、これらの化合物の塩は、臨床及び研究用途の両方において、血漿、細胞培養物 及び組織培養物に関する保存性を担うよう濾過除菌されつる。かかる濾過組成物 は、脂質含有材料における過酸化を防ぐことのできる無菌媒体を供するであろう 。更に、細胞に及はす不溶性プロブコール化合物の作用をより慎重に調べること かできるようになり、その理由は水溶性誘導体のほうが細胞によってより簡単に 取り込まれ、そして水性溶液（例えば生物学的環境）に暴露されたときに溶液か ら沈殿しないからである。

プロブコールの製法は当業界によく知られている。例えば、プロブコールは、２ ．６−シーｔｅｒｔ−ブチル−４−メルカプトエタノール（４７，５ｇ、　０． ２ｍｏｌ）を５０℃に熱したメタノール（５０ｍｌ）の中（こ溶かすことによっ て調製できうる。触媒量の濃塩酸（Ｉｎ＋１）、次ｐｚでアセトン（５，８ｇ　 ；　０．１ｍｏｌｅ）を加える。その混合物の温度を約６０〜６５°Ｃに、１． ５時間にわたって高める。その混合物を冷やし、水及び約１０ｍ１の水性炭酸水 素ナトリウムで希釈し、そしてエーテルで抽出する。そのエーテル抽出物をエバ ボレートし、そして生成物を残漬として獲得し、それをエタノール、次いでイソ プロノくノールから再結晶化させて、約１２５〜１２６°Ｃで溶ける結晶固体と してのプロブコールが得られる。

別の代表的な手順においては、約２．３ｍｏｌｅの２，６−ジーｔｅｒｔ　−ブ チル−４−メルカプトエタノールを窒素雰囲気下で約１７００ｍ１のメタノール の中に溶かす：約１００ｍ１の濃塩酸及び１８０ｍ１のアセトンを加え、そして その混合物を撹拌し、そして約３５〜５０″Ｃの温度に１．５時間保つ。その混 合物を次に室温にまで冷やし、そして濾過し、そして無色の結晶の固形フィルタ ーケーキとしてのプロブコールを集める。その生成物を水及び水性炭酸水素ナト リウムで洗い、そしてメタノールからの再結晶化により精製する。

プロブコール化合物のジカルボン酸誘導体は下記の一般手順に従って調製されう る。プロブコール化合物を過剰量のジカルボン酸無水物及び触媒量の４−ジメチ ル−アミノピリジンにより、そのジカルボン酸無水物か液状であることを保証す るのに十分な温度において処理する。それらの条件のもとでは、無水溶媒は必要 ではなく、なぜなら無水物自体が溶媒として働くからである。反応の進行はクロ マトグラフィーによりモニターする。置換化モノカルボン酸プロブコールエステ ルは同様の手段によって調製されうる。

皿± プロブコールの水溶性グルタル酸誘導体を下記の通りに合成したニブロブコール を、４０倍過剰モルのグルタル酸無水物により、触媒量の４−ジメチル−アミノ ピリジンの存在下で、１３０°Ｃで２４時間処理した。プロブコールジグルタル 酸塩の形成は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）　（ｎ−ヘキサン：ジエチルエ ーテル：酢酸；７０：３０：　１　。

ｖｏｌ／　ｖａｔ／ｖｏｌ）によりモニターした。その生成物を珪酸カラムクロ マトグラフィーにより、増大する量のヘキサン中のエーテルを用いて精製した。

精製した生成物はＴＬＣ上で（ＲｆＯ，１８）　、もとの化合物（ＲｆＯ，６８ ）と区別できる単一スポットを示した。アルカリ加水分解により、その化合物は 遊離のプロブコールをもたらした。その酸形態において、このジグルタル酸塩は 有機溶媒中で可溶性であり、そして溶媒の除去により、それは炭酸水素ナトリウ ム溶液の中で溶ける。得られる溶液を０．４５−μＭのフィルターに通して無菌 性を確実なものとし、且つ任意の遊離プロブコールを除いた。水性溶液中のナト リウム塩はゆっくりと加水分解し、遊離プロブコールをもたらしめた。

別の合成においては、プロブコール（１ｍＭｏｌ）を清浄で乾いた２５ｍ１エー レンマイヤーフラスコの中で秤量した。５μｍＭｏ１の４−ジメチルアミノピリ ジンを触媒として加えた。次に１５ｍＭｏｌのグルタル酸無水物を加え、そして そのフラスコを１７５°Ｃに８時間熱した。

（先行の研究は、このプロブコール、対、無水物の比において、その反応は１時 間で約７５％完了すると示している）。次にこのフラスコを冷やし、そしてその サンプルをｌ０ｍ１のｌ：ｌのヘキサン：ジエチルエーテルの中に溶かした。そ の反応を薄層クロマトグラフィーにより、シリカゲルＩ　Ｂ　−Ｆ　（Ｊ、　Ｔ 、　Ｂａｋｅｒ）及び溶媒系へキサン：エーテル（７０／３０　Ｖ／Ｖ）を用い てチェックした。遊離プロブコールが最大の移動度（０，５〜０．６）を有し、 そしてプロブコールエステルは約０゜１〜０．１５のＲｆでもとの位置の近くに 残った。全反応混合物（濃縮後）をシリカゲルカラム（４０ｃｍＸ　２　ｃｍ） に載せ、そして濃度の上昇するエーテル又はヘキサンで溶離させた。その画分を ＴＬＣによりモニターした。純粋な画分を集め、そして濃縮した。その化合物を ＴＬＣにより再チェックした。反応収率は約７５％であった。

このサンプルは、アルカリでけん化し、そしてエーテル抽出に付したときに遊離 プロブコールを放出した。このため、及びその誘導体が水性炭酸水素ナトリウム の中で可溶性であるため、反応の順序は、 プロブコール＋グルタル酸痛水物→プロブコールジグルタル酸塩ジメチルアミノ ピリジン のようである（ただし、本発明にとっては重要ではない）。

モノエステルがないことは、低めの濃度の無水物においてさえもＴＬＣにおける 中間体のなさにより示唆される。ジメチルアミノピリジンは他の脂質合成におい て、脂肪酸無水物のエステル化における触媒として利用されている。本発明の方 法の重要な特徴は、溶媒として溶融無水物それ自体の使用にあり、これにより無 水溶媒の必要性は回避される。上記の例はプロブコールのグルタル酸誘導体に限 っているが、その他の無水物も所望の誘導体に応じてグルタル酸痛を生成するた めに無水マレイン酸を使用してよい（グルタル酸無水物反応よりはるかに低い温 度で）。

興盈 マクロファージかＬＤＬを酸化する能力に及ぼす、５００ｎｍｏｌ／ｍｌのプロ ブコール（エチルアルコールに添加）とのブレインキュベーションの効果を表１ に示す。マウスの腹膜マクロファージ（６ウエルプレートにおいて、−皿当り３ Ｘ１０’の細胞）を、５ｍｇ／ｍｌのリポタンパク質欠損血清を含む１ｍｌのＤ ＭＥの中で５００ｎｍｏｌのプロブコールで処理した。プロブコールはｌＯμｌ のエタノールの中に加えておいた。４８時間後、細胞を３ｍｌのＨａｍＦ−１０ で３回洗い、次いで２ｍｌのＨａｍＦ−１０の中で２０時間、　”’　Ｉ−ＬＤ Ｌ（１１００μｇ／ｍｌ）とのインキュベーションに付した。ＴＢＡＲ３及びそ の後のマクロファージ分解を決定した。その結果は代表的な組の三重測定値から 平均したものである。

表１ プロブコール自体は非常に限られた溶解度を有し、そしてこれらの研究における その媒体はひどく乳白状である。ＨａｍＦ−１０で数回洗った後、それらの細胞 を２ｍｌのｌ（ａｍＦ−１０の中の２００Ｍｇの”’Ｉ−ＬＤＬと２４時間イン キュベートした。表においてわかる通り、プロブフールは、ＬＤＬとインキュベ ートした細胞を、プロブコールで予備処理していないコントロール細胞はど改質 せしめない。このことは、細胞の酸化防止剤富化が、細胞触媒化酸化に対するＬ ＤＬの追加的保護を担いうることを示唆した。しかしながら、プロブコールな明 らかに溶液中にはなくても、洗浄の後でさえも細胞表層に吸着し続けていること があるため、細胞表層上の残留プロブコールが第２インキユベーシヨンの際の見 かけ上の保護を担っている、即ち、細胞表層由来のプロブコールが第２インキユ ベーシヨンの初期の際にＬＤＬに輸送されうろことが考えられる。この可能性を 排除するため、例１の通りに合成した水溶性プロブコール類似体、ジグルタリル ブロブコールを研究のために調製した。

ＬＤＬの酸化改質は非常に低濃度のジグルタリルプロプコールにおいてさえても 強く阻害されたが（２，５μＭで５０％より大）、ジグルタリルブロブコールは ２４時間のインキュベーションの際にほぼ完全に加水分解された。即ち、その媒 体はインキュベーションの終了時にもっばらプロブコール自身を含んでいること が見い出される。従って、観察された阻害が、一方では、細胞の中へのジグルタ リルブロブコールの取り込みに、そして他方では、インキュベーションの際のジ グルタリル誘導体の加水分解により生じた遊離プロブコールの作用に、どの程度 反映しているかを決定することができない。類似の実験を、銅誘発型酸化を用い 行い、類似の結果が得られた（データーは示さない）。

次の一連の研究において、上皮細胞（ＥＣ）及びマウスの腹膜マクロファージ（ Ｍφ）を、ジグルタリルブロブコール（＋−）リウム塩）又はプロブコール（エ タノール中）と、はんのわずかな時間（３７°Ｃで３時間）インキュベートして 自発的加水分解の程度を制限した。

次に細胞を徹底的に洗って全ての細胞外インヒビターを除去した。

詳しくは、それらを３ｍｌの１０％の胎児牛血清含有Ｆ−１０で３回洗い、次い てラベル化ＬＤＬと更に２４時間インキュベートした。表２に示す通り、事前処 理した細胞は、チオバルビッール酸反応性材料により、又は生物学的改質（即ち 、マクロファージとの５時間のインキュベーションにおけるその後のＬＤＬの分 解速度の上昇）により測定して、ＬＤＬの酸化を誘発するその能力について強く 阻害された。１０８Ｍはどの低い濃度でジグルタリルブロプコールはその改質を 完全に阻害した。示す値は３以上の独立の実験由来の典型的な実験値である。

表２ 上皮細胞及びマクロファージによるプロブコールグルタル酸塩の取り込みを１４ ０−ラベル化水溶性誘導体を用いて調べた。１４Ｃ−ジグルタリルブロブコール のナトリウム塩を特定の濃度において洗浄細胞に加え、そして１ｍｌのＤＭＥ培 地の中で３７°Ｃで３時間インキュベートシた。次にそれらの細胞をＤＭＥで３ 回洗った。（最後の洗浄後の培地は放射活性を全く含まなかった）。これらの細 胞を、放射活性の決定の前に１ｍｌの０．０１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００に 溶かした。マクロファージに関する値は、２本の別々のバイアルのうちの１本か らの二重測定値の平均を示している。上皮細胞に関する値は、４本の別々の細胞 インキュベーションに由来する。

９６％以上のラベル化誘導体がナトリウム塩として溶液の中に入り込み、そして マクロファージとインキュベートしたとき、細胞に効率的に取り込まれた。加え た放射活性（２，５〜６．５ｒ＋ｍｏｌのプロブコール／−４０μｇの細胞タン パク質）の約２５〜３０％が２時間で細胞に結合した（表３）、６０分目に、放 射活性と結合した細胞の約半分は前駆体、プロブコールグルタル酸塩の形態にあ った。

表３ ３時間のインキュベーションの際に発生した、又は細胞中での加水分解により発 生した遊離プロブコールがＬＤＬ粒子の中に入り込んてその培地の中で酸化防止 剤として働きうる可能性をまだ考慮する必要がある。従って、上皮細胞を２５ｎ ｍｏ　ｌの１４Ｃ−ラベル化ジグルタリルプロプコールと３時間インキュベート し、そしてその後新鮮な培地で洗い、そしてＬＤＬを加えた。培地から回収した ＬＤＬは酸化のなさを示したか、５μＭの銅の存在下で、その後のインキュベー ションにより容易に改質された。しかしながら、５０〜２００ｎｍｏｌの高めの 濃度のジグルタリルブロブコールを上皮細胞とインキュベートしたとき、リポタ ンパク質欠損培地を含む培地による数回の洗浄の後てさえも培地の中への遊離プ ロブコールのかなりの放出が認められた。にもかかわらず、１００μｇ／ｍｌの ＬＤＬで２４時間づつの２回のその後のインキュベーションの後、一体化した放 射活性の３０〜４５％がまだ細胞に結合していた。これらの実験において、１５ ｎｍｏ１以上のプロブコールが細胞の中に一体化し、その約７ｎｍｏｌがＬＤＬ との２４時間のインキュベーションの際に培地の中へと放出されたことに注目す べきである。かかるインキュベーションから回収したＬＤＬはその後の５μＭの 銅とのインキュベーションによる改質に耐性を示した。

従って、プロブコールに富む細胞は、培地の中に酸化防止剤も放出し、これは酸 化に対する追加の保護を授けることができつる。細胞からのプロブコールの放出 速度はこれらの研究においては続けながった。

ＬＤＬの中のプロブコールの存在は、ＬＤＬ粒子内での比較的非特異的な酸化防 止剤として作用することにより、酸化的改質に対してそれをある程度明らかに保 護するが、本結果は、プロブコールのインビボ作用に関係しうる追加の作用態様 を示唆する。培地中の細胞の中へのプロブコールの侵入速度は遅いが、薬剤で慢 性的に処置した動物の細胞はその代謝が変化するほど、もっと詳しくは、ＬＤＬ を酸化的に改変せしめる能力が変化するほどにそれを取り込んでしまいうる。プ ロブコールは血漿よりも高い濃度でいくつかの組織の中に蓄積することが報告さ れている。その他の研究は、ＬＤＬの酸化改質におけるリポキシゲナーゼを包含 する。リポキシゲナーゼは主に、その後にＬＤＬへと移されつる脂肪酸のヒドロ キシペルオキシドを発生させるよう、細胞脂質上で主に働く。細胞内のプロブコ ールはかかるリボ過酸化物の発生を、リポキシゲナーゼ系に直接働くことにより 、又は細胞膜内での増殖反応を制限することにより防ぎつる。

細胞は、貯蔵プロブコールを細胞外培地に放出せしめることもあり、これにより 脂質の過酸化を制限する。これらの発見は、ＬＤＬの酸化的改質の阻害について の更なる別の手法、即ち、細胞の中に化合物を導入してＬＤＬ酸化を誘発せしめ るその能力を阻害することを示唆する。ＬＤＬ分子内の酸化防止剤と細胞内のイ ンヒビターの存在との組合せは付加的でありうる。従って、プロブコールの抗ア テローム症作用はかかる二またの作用態様に非常に依存しつる。

まとめると、本発明のプロブコール化合物誘導体は、細胞により効率的に取り込 まれ、且つ加水分解により遊離プロブコールを放出するプロドラッグを導入せし める好都合な水溶性、濾過除菌可能な手段を提供する。

以上の説明は本発明の一定の好適な態様に焦点をあてているが、様々な組成物及 び方法の変更が当業者にとって明らかであろう。例えば、本発明のプロブコール 製剤はヒト以外の様々な哺乳動物における症状を処置するのに採用できうる。更 に、本発明の化合物は無水物及びプロブコール化合物反応体を溶解することので きる無水溶媒を用いて調製できつる。これら及びその他の改良は本発明の範囲に 含まれるものとする。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ 、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ 、ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ。

ＳＫ、　ＵＡ、　ＵＳ

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．一組のフェニルヒドロキシ基を有する溶解性の乏しいプロブコール化合物の 水溶性誘導体を含んで成る物質の組成物であって、この水溶性誘導体がそのフェ ニルヒドロキシル基のいづれか又は両方においてエステル置換基を有し、前記水 溶性誘導体が加水分解に基づいてプロブコール化合物をもたらしめる、組成物。
2. ２．前記エステル基のカルボン酸部分が極性官能基を有する、請求項１記載の組 成物。
3. ３．前記水溶性誘導体が、１〜１０個の炭素原子のジカルボン酸エステル、１〜 １０個の炭素原子のアミノカルボン酸エステル、及びアルデヒド官能基を有する １〜１０個の炭素原子のカルボン酸エステルより成る群から選ばれる、請求項１ 記載の組成物。
4. ４．前記水溶性誘導体が、コハク酸エステル、グルタル酸エステル、アジピン酸 エステル、スベリン酸エステル、セバシン酸エステル、アゼライン酸エステル及 びマレイン酸エステルより成る群から選ばれる、請求項１記載の組成物。
5. ５．前記水溶性誘導体がカルボン酸塩である、請求項１記載の組成物。
6. ６．前記誘導体が、ジカルボン酸でエステル化されたプロブコール化合物の塩で ある、請求項５記載の組成物。
7. ７．前記プロブコールの水溶性誘導体が血流の中で生理学的条件のもとで、自発 的に加水分解する、請求項１記載の組成物。
8. ８．前記プロブコールの水溶性誘導体が約１ｍｇ／ｍｌより大の水溶解度を有す る、請求項１記載の組成物。
9. ９．酸化防止特性を有するタイプの改良プロブコール化合物であって、その改良 が、この化合物の少なくとも一のフェニルヒドロキシル基が極性官能基を有する エステル基に置き換えられていることによってこのプロブコール化合物が水溶性 にされていることを含んで成る、化合物。
10. １０．前記改良プロブコール化合物が、プロブコール化合物の１〜１０個の炭素 原子のジカルボン酸エステル、プロブコール化合物の１〜１０個の炭素原子のア ミノカルボン酸エステル、及びプロブコール化合物の１〜１０個の炭素原子のア ルデヒド含有カルボン酸エステルより成る群から選ばれる、請求項９記載の化合 物。
11. １１．前記改良プロブコール化合物が塩である、請求項９記載の化合物。
12. １２．次式を有する物質の組成物： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、１〜８個の炭素原子のアルキル、アルケニル 又はアリールを表わし；Ｒ３〜Ｒ６独立して１〜４個の炭素原子の低級アルキル を表わし；そしてＸ及びＹは独立して、カルボン酸基、カルボン酸基の塩、アミ ン基、アミン基の塩、アミド基及びアルデヒド基より成る群から選ばれる官能基 を含むアルキル又はアルケニル基を表わす）。
13. １３．基Ｒ３〜Ｒ６の少なくとも二つがｔｅｒｔ−ブチル基を表わす、請求項１ ２記載の組成物。
14. １４．Ｒ３とＲ４の少なくとも一方がｔｅｒｔ−ブチルを表わし、そしてＲ５と Ｒ６の少なくとも一方がｔｅｒｔ−ブチル基を表わす、請求項１３記載の組成物 。
15. １５．Ｒ１及びＲ２が独立してメチル又はエチル基を表わす、請求項１２記載の 組成物。
16. １６．Ｒ１及びＲ２がそれぞれメチルを表わし、そしてＲ３〜Ｒ６がそれぞれｔ ｅｒｔ−ブチルを表わす、請求項１２記載の組成物。
17. １７．Ｘ及びＹが独立して、１〜９個の炭素原子のカルボン酸基を表わす、請求 項１２記載の組成物。
18. １８．Ｘ及びＹが独立して、１〜９個の炭素原子の置換化アミン基を表わす、請 求項１２記載の組成物。
19. １９．Ｘ及びＹが同じ基を表わす、請求項１２記載の組成物。
20. ２０．Ｘ及びＹが共に（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ又は（ＣＨ２）３ＣＯＯＨの塩を表 わす、請求項１２記載の組成物。
21. ２１．動物に薬理学的な用量のプロブコール化合物プロドラッグを投与せしめる ことにより動物における酸化に関連する症状を処置するための方法であって、前 記プロドラッグがプロブコール化合物のフェニルヒドロキシル基のいづれか又は 両者において加水分解性置換基を有する、方法。
22. ２２．前記プロドラッグを、動物の体重キログラム当り約０．０１〜約５０ミリ グラムの用量で投与する、請求項２１記載の方法。
23. ２３．前記プロドラッグを水性溶液中で静脈内的に投与する、請求項２１記載の 方法。
24. ２４．前記プロドラッグを経口的に投与する、請求項２１記載の方法。
25. ２５．動物器官に治療的に有効な量のプロブコール又はプロブコール類似体を導 入する方法であって、ここで前記器官は酸化を受け易いものであり、ここで前記 方法は、 前記動物にプロブコール又はプロブコール類似体の水溶性エステルを投与する； そして 前記エステルを加水分解して遊離なプロブコール又はプロブコール類似体を放出 させる、ここで前記加水分解性用は酸化され易い前記動物の器官で生ずるもので ある、 ことを含んで成る方法。
26. ２６．前記プロブコール又はプロブコール類似体が、脂質含有材料へと放出され ることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
27. ２７．プロブコール化合物の水溶性誘導体を調製する方法であって、 プロブコール化合物と、極性又は帯電官能基を含むカルボン酸無水物との溶液を 調製する；そして 前記溶液にこのプロブコール化合物のエステル化反応のための触媒を加える、 ことを含んで成る方法。
28. ２８．前記カルボン酸無水物が、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン 酸無水物、スベリン酸無水物、セバシン酸無水物、アゼライン酸無水物及びマレ イン酸無水物より成る群から選ばれる、請求項２７記載の方法。
29. ２９．前記触媒がジメチルアミノピリジンである、請求項２７記載の方法。