JPH0722507B2 - ６−ヒドロキシニコチン酸を製造する微生物 - Google Patents
６−ヒドロキシニコチン酸を製造する微生物Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ニコチン酸から６−ヒ
ドロキシニコチン酸を製造する能力を有する微生物に関
する。
ドロキシニコチン酸を製造する能力を有する微生物に関
する。
【０００２】
【従来の技術】有機合成法による６−ヒドロキシニコチ
ン酸の製造法は多く知られており、ヒドロキシ芳香族の
コルベーシュミット・カルボキシル化によって、６−ヒ
ドロキシニコチン酸が２−ピロリドンから得られる。
他の合成法は、リンゴ酸またはイソシンコメロン酸から
出発するものである〔Briancourtら，J. Chim. Ther．
（１９７３年)８（２），２２６〜２３２；Quarroz，ス
イス特許出願 ７７３１／８０〕。
ン酸の製造法は多く知られており、ヒドロキシ芳香族の
コルベーシュミット・カルボキシル化によって、６−ヒ
ドロキシニコチン酸が２−ピロリドンから得られる。
他の合成法は、リンゴ酸またはイソシンコメロン酸から
出発するものである〔Briancourtら，J. Chim. Ther．
（１９７３年)８（２），２２６〜２３２；Quarroz，ス
イス特許出願 ７７３１／８０〕。
【０００３】これら既知の製造法は、いずれも、純粋な
６−ヒドロキシニコチン酸の簡単で費用がかからず、し
かも環境的に問題のない製造を可能にするものではな
い。これらの方法は置換反応が定量的でないとか、反応
に伴って望ましくない副生物が生成するとかの欠点を有
している。 副生物は夾雑物となり、反応終了後に反応
生成物から除去しなければならない。
６−ヒドロキシニコチン酸の簡単で費用がかからず、し
かも環境的に問題のない製造を可能にするものではな
い。これらの方法は置換反応が定量的でないとか、反応
に伴って望ましくない副生物が生成するとかの欠点を有
している。 副生物は夾雑物となり、反応終了後に反応
生成物から除去しなければならない。
【０００４】バチルス属（Bacillus）、シュードモナス
属（Pseudomonas）、クロストリジウム属（Clostridiu
m）およびミコバクテリウム属（Mycobacterium）の微生
物がニコチン酸上で増殖すること、およびこれらの微生
物がこの基質を炭素源、窒素源およびエネルギー源とし
て利用することも知られている〔Allinson M. J. C.:
J. Biol, Chem.（１９４３年）１４７，７８５；Behrma
n E. J., Stanier R.V., J. Biol, Chem.（１９５７
年）２２８，９２３〕。
属（Pseudomonas）、クロストリジウム属（Clostridiu
m）およびミコバクテリウム属（Mycobacterium）の微生
物がニコチン酸上で増殖すること、およびこれらの微生
物がこの基質を炭素源、窒素源およびエネルギー源とし
て利用することも知られている〔Allinson M. J. C.:
J. Biol, Chem.（１９４３年）１４７，７８５；Behrma
n E. J., Stanier R.V., J. Biol, Chem.（１９５７
年）２２８，９２３〕。
【０００５】ニコチン酸は、すべての被検細菌によっ
て、一次分解段階で６−ヒドロキシニコチン酸に酸化さ
れる。 ６−ヒドロキシニコチン酸は直ちに、あまり高
い濃度になることなくさらに転換して、好気性細菌の場
合には、水、二酸化炭素およびアンモニアまでになる。
て、一次分解段階で６−ヒドロキシニコチン酸に酸化さ
れる。 ６−ヒドロキシニコチン酸は直ちに、あまり高
い濃度になることなくさらに転換して、好気性細菌の場
合には、水、二酸化炭素およびアンモニアまでになる。
【０００６】いくらか純粋な形でニコチン酸ヒドロキシ
ラーゼを単離することは、微生物の分解によって可能で
あった〔Hunt A. L., Biochem. J.（１９５８年）７
２，１〜７〕。 ニコチン酸ヒドロキシラーゼは、約４
００，０００ダルトンの大分子である。 これはフラビ
ン補因子、多くの金属原子（Ｆｅ，Ｍｏ）、無機イオウ
および若干の場合にはセレンも含んでいる。 ニコチン
酸ヒドロキシラーゼは、適当な電子転移系（たとえばチ
トクロム、フラビン、ＮＡＤＰ＋その他）の存在下にお
いてのみ活性である。
ラーゼを単離することは、微生物の分解によって可能で
あった〔Hunt A. L., Biochem. J.（１９５８年）７
２，１〜７〕。 ニコチン酸ヒドロキシラーゼは、約４
００，０００ダルトンの大分子である。 これはフラビ
ン補因子、多くの金属原子（Ｆｅ，Ｍｏ）、無機イオウ
および若干の場合にはセレンも含んでいる。 ニコチン
酸ヒドロキシラーゼは、適当な電子転移系（たとえばチ
トクロム、フラビン、ＮＡＤＰ＋その他）の存在下にお
いてのみ活性である。
【０００７】細胞抽出液からニコチン酸ヒドロキシラー
ゼを単離し、この酵素製剤をニコチン酸のヒドロキシル
化に用いることも可能である。 これを実施して、少量
の６−ヒドロキシニコチン酸が実際に得られた〔Behrma
nおよびStanier, J. Biol, Chem.（１９５７年）２２
８，９２３〕。 酵素を単離する費用が高く、酵素が不
安定であるにもかかわらず、補因子および電子転移系の
再生のために、ニコチン酸ヒドロキシラーゼを求めなけ
ればならない。
ゼを単離し、この酵素製剤をニコチン酸のヒドロキシル
化に用いることも可能である。 これを実施して、少量
の６−ヒドロキシニコチン酸が実際に得られた〔Behrma
nおよびStanier, J. Biol, Chem.（１９５７年）２２
８，９２３〕。 酵素を単離する費用が高く、酵素が不
安定であるにもかかわらず、補因子および電子転移系の
再生のために、ニコチン酸ヒドロキシラーゼを求めなけ
ればならない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、この
欠点を克服し、経済的な方法でニコチン酸から６−ヒド
ロキシニコチン酸を、高純度かつ高収率で、微生物学的
に製造することを可能にする微生物を提供することにあ
る。
欠点を克服し、経済的な方法でニコチン酸から６−ヒド
ロキシニコチン酸を、高純度かつ高収率で、微生物学的
に製造することを可能にする微生物を提供することにあ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成する微
生物は、請求項に記載の、ニコチン酸を６−ヒドロキシ
ニコチン酸へ特異的に酵素的にヒドロキシル化する能力
を有するアクロモバクター属の微生物である。
生物は、請求項に記載の、ニコチン酸を６−ヒドロキシ
ニコチン酸へ特異的に酵素的にヒドロキシル化する能力
を有するアクロモバクター属の微生物である。
【００１０】好ましい微生物は、アクロモバクター・キ
シロースオキシダンスの新しい菌株ＤＳＭ２７８３であ
る。 名称：アクロモバクター・キシロースオキシダンス Ｄ
ＳＭ２７８３ 単離源：ニコチン酸母液 （Ａ）形態 栄養肉汁中で培養 （１）細胞形態：桿状、長さ２〜３．５μｍ、幅０．６
μｍ （２）配置：孤立 （３）運動性：非常に活発、繊毛によって運動 （４）内生胞子：厳密に好気性 （５）グラム：陰性 （６）オキシダーゼ：陽性 （７）カタラーゼ：陽性 この菌株は、検査したすべての特徴において、アクロモ
バクター・キシロースオキシダンスの代表的な菌株（Ｄ
ＳＭ２４０２）と一致する（例外：アセトアシドの加水
分解）。
シロースオキシダンスの新しい菌株ＤＳＭ２７８３であ
る。 名称：アクロモバクター・キシロースオキシダンス Ｄ
ＳＭ２７８３ 単離源：ニコチン酸母液 （Ａ）形態 栄養肉汁中で培養 （１）細胞形態：桿状、長さ２〜３．５μｍ、幅０．６
μｍ （２）配置：孤立 （３）運動性：非常に活発、繊毛によって運動 （４）内生胞子：厳密に好気性 （５）グラム：陰性 （６）オキシダーゼ：陽性 （７）カタラーゼ：陽性 この菌株は、検査したすべての特徴において、アクロモ
バクター・キシロースオキシダンスの代表的な菌株（Ｄ
ＳＭ２４０２）と一致する（例外：アセトアシドの加水
分解）。
【００１１】上記菌株は、バイオテクノロジー研究所の
西ドイツ微生物コレクション（ＤＳＭ)〔ドイツのゲッ
ティンゲン ４３００ グリーゼバッハシュトラーセ
８〕に、No．ＤＳＭ２４０２として寄託されている。
西ドイツ微生物コレクション（ＤＳＭ)〔ドイツのゲッ
ティンゲン ４３００ グリーゼバッハシュトラーセ
８〕に、No．ＤＳＭ２４０２として寄託されている。
【００１２】新しい菌株であるＤＳＭ２７８３は、上述
の寄託所に１９８３年１１月１８日に寄託された。
の寄託所に１９８３年１１月１８日に寄託された。
【００１３】
【作用】前記菌株は、唯一の炭素源、窒素源およびエネ
ルギー源としてのニコチン酸によって増殖する。 前記
微生物の培養は、この種類の菌株に対して既知の方法に
従って行なうことができる。 たとえば、リン酸塩緩衝
液(５０mm)ｐＨ７．０、痕跡元素（mg／ｌ）として ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２０ ＭｎＳＯ4 １０ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．１ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．１ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ ＮａＭ0Ｏ4・２Ｈ2Ｏ ０．１ および、増殖を促進させるための少量の酵母エキス（Me
rck）（０．０５重量％）を含有する、希薄な殺菌した
ニコチン酸溶液（０．０５〜０．５重量％）中におい
て、好気性条件下で、３０℃において、菌株ＤＳＭ２７
８３を２４〜４８時間発酵させる。 増殖したバイオマ
ス（水分約１０ｇ／ｌ）は、ニコチン酸ヒドロキシラー
ゼを多く含有している。 細胞を遠心分離し、直ちに、
または−２０℃に保存した後に直接、すなわち酵素回収
または精製することなく、ニコチン酸のヒドロキシル化
に用いることができる。
ルギー源としてのニコチン酸によって増殖する。 前記
微生物の培養は、この種類の菌株に対して既知の方法に
従って行なうことができる。 たとえば、リン酸塩緩衝
液(５０mm)ｐＨ７．０、痕跡元素（mg／ｌ）として ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２０ ＭｎＳＯ4 １０ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．１ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．１ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ ＮａＭ0Ｏ4・２Ｈ2Ｏ ０．１ および、増殖を促進させるための少量の酵母エキス（Me
rck）（０．０５重量％）を含有する、希薄な殺菌した
ニコチン酸溶液（０．０５〜０．５重量％）中におい
て、好気性条件下で、３０℃において、菌株ＤＳＭ２７
８３を２４〜４８時間発酵させる。 増殖したバイオマ
ス（水分約１０ｇ／ｌ）は、ニコチン酸ヒドロキシラー
ゼを多く含有している。 細胞を遠心分離し、直ちに、
または−２０℃に保存した後に直接、すなわち酵素回収
または精製することなく、ニコチン酸のヒドロキシル化
に用いることができる。
【００１４】ニコチン酸のヒドロキシル化を実現する場
合に、一次段階すなわち６−ヒドロキシニコチン酸への
ヒドロキシル化のあいだ、ニコチン酸の分離が生じない
ことが望ましい。 この産生段階では、収率を犠牲にし
て微生物の増殖が行われる。
合に、一次段階すなわち６−ヒドロキシニコチン酸への
ヒドロキシル化のあいだ、ニコチン酸の分離が生じない
ことが望ましい。 この産生段階では、収率を犠牲にし
て微生物の増殖が行われる。
【００１５】ニコチン酸のヒドロキシル化の経済にとっ
て重要な、次のパラメータが満たされなければならな
い： （ａ）細胞はもはや増殖してはならない（ニコチン酸の
消費）。 （ｂ）ニコチン酸ヒドロキシラーゼは活性でなければな
らない。 （ｃ）ニコチン酸の分解系路は、６−ヒドロキシニコチ
ン酸の段階で停止すべきである。 （ｄ）生成物（６−ヒドロキシニコチン酸）を細胞から
分離すべきである。
て重要な、次のパラメータが満たされなければならな
い： （ａ）細胞はもはや増殖してはならない（ニコチン酸の
消費）。 （ｂ）ニコチン酸ヒドロキシラーゼは活性でなければな
らない。 （ｃ）ニコチン酸の分解系路は、６−ヒドロキシニコチ
ン酸の段階で停止すべきである。 （ｄ）生成物（６−ヒドロキシニコチン酸）を細胞から
分離すべきである。
【００１６】ニコチン酸の濃度を高めると、意外にも、
これらのパラメータが同時に満たされることが発見され
た。 ６−ヒドロキシニコチン酸の製造に都合のよいこ
の性質は、微生物代謝に広く及んでいるように思われ
る。 生成酵素（６−ヒドロキシニコチン酸ヒドロキシ
ラーゼ）が、高いニコチン酸濃度によって阻害されるこ
とが考えられる。
これらのパラメータが同時に満たされることが発見され
た。 ６−ヒドロキシニコチン酸の製造に都合のよいこ
の性質は、微生物代謝に広く及んでいるように思われ
る。 生成酵素（６−ヒドロキシニコチン酸ヒドロキシ
ラーゼ）が、高いニコチン酸濃度によって阻害されるこ
とが考えられる。
【００１７】上述のように、菌株ＤＳＭ２７８３は希薄
な溶液（０．０５〜０．５重量％）中でとくに増殖し、
その際に存在するニコチン酸を完全に消費する。 ニコ
チン酸の濃度が上昇すると細胞増殖が阻害され、２重量
％以上のニコチン酸濃度では、もはや増殖が観察されな
い。 しかし、細胞内のニコチン酸ヒドロキシラーゼの
活性は変化しない。
な溶液（０．０５〜０．５重量％）中でとくに増殖し、
その際に存在するニコチン酸を完全に消費する。 ニコ
チン酸の濃度が上昇すると細胞増殖が阻害され、２重量
％以上のニコチン酸濃度では、もはや増殖が観察されな
い。 しかし、細胞内のニコチン酸ヒドロキシラーゼの
活性は変化しない。
【００１８】酵素的ヒドロキシル化反応は、好気性条件
下で、２０〜４０℃の温度および５．５〜９．０のｐＨ
において、有利に進行する。
下で、２０〜４０℃の温度および５．５〜９．０のｐＨ
において、有利に進行する。
【００１９】０．１重量％から飽和まで、好ましくは
０．５〜１０重量％のニコチン酸溶液を用いるのが有利
である。 ニコチン酸は、アルカリ塩溶液としても用い
ることができる。 異化分解はヒドロキシル化段階後に
停止する。 このため、副反応および随伴反応は排除さ
れて、６−ヒドロキシニコチン酸の純度および収率が非
常に高くなる。
０．５〜１０重量％のニコチン酸溶液を用いるのが有利
である。 ニコチン酸は、アルカリ塩溶液としても用い
ることができる。 異化分解はヒドロキシル化段階後に
停止する。 このため、副反応および随伴反応は排除さ
れて、６−ヒドロキシニコチン酸の純度および収率が非
常に高くなる。
【００２０】被検微生物のそのほかの有利な性質は、こ
れらの微生物が、ヒドロキシル化の生成物である６−ヒ
ドロキシニコチン酸を溶液中に析出させることである。
これによって、生成物の単離がかなり簡単になる。
れらの微生物が、ヒドロキシル化の生成物である６−ヒ
ドロキシニコチン酸を溶液中に析出させることである。
これによって、生成物の単離がかなり簡単になる。
【００２１】反応肉汁から細胞を遠心分離またはミクロ
ろ過によって分離した後に、透明な溶液を酸性化する。
このときに析出した白色の６−ヒドロキシニコチン酸
をろ過し、乾燥する。
ろ過によって分離した後に、透明な溶液を酸性化する。
このときに析出した白色の６−ヒドロキシニコチン酸
をろ過し、乾燥する。
【００２２】
【実施例】１モル量の６−ヒドロキシニコチン酸の実験
室規模の製造を、実用的な考察のため、２段階に分けて
実施した。
室規模の製造を、実用的な考察のため、２段階に分けて
実施した。
【００２３】段階１：ニコチン酸ヒドロキシラーゼ活性
の高い生物量の製造 段階２：ニコチン酸の酵素によるヒドロキシル化 これらの両段階を、いわゆるバッチ方法に結合させるこ
とは、当然直ちに可能である。
の高い生物量の製造 段階２：ニコチン酸の酵素によるヒドロキシル化 これらの両段階を、いわゆるバッチ方法に結合させるこ
とは、当然直ちに可能である。
【００２４】（段階１） アクロモバクター・キシロー
スオキシダンス ＤＳＭ２７８３バイオマスの製造 Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ：５１.９ｇ、ＫＨ2ＰＯ4：２
０．０ｇ、酵母エキス：２．５ｇおよびニコチン酸：１
０ｇを水４７５０ml中に含有する栄養溶液を発酵器に満
たし、１２０℃において２０分間殺菌した。 ３０℃に
冷却した後に、発酵器に出発培養物５００mlを接種し、
３０℃、ｐＨ７．０において空気を通風しながら、２４
時間発酵させた。 ２４時間後に、ニコチン酸１０ｇと
酵母エキス２.５gを水に溶かした溶液２００mlを無菌状
態で加え、再び発酵を行なった。４２時間後に培養物を
回収し、アクロモバクター属細胞を遠心分離（１５，０
００Ｇにおいて３０分間)によって分離した。 湿った
生物量３８.３が得られた。
スオキシダンス ＤＳＭ２７８３バイオマスの製造 Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ：５１.９ｇ、ＫＨ2ＰＯ4：２
０．０ｇ、酵母エキス：２．５ｇおよびニコチン酸：１
０ｇを水４７５０ml中に含有する栄養溶液を発酵器に満
たし、１２０℃において２０分間殺菌した。 ３０℃に
冷却した後に、発酵器に出発培養物５００mlを接種し、
３０℃、ｐＨ７．０において空気を通風しながら、２４
時間発酵させた。 ２４時間後に、ニコチン酸１０ｇと
酵母エキス２.５gを水に溶かした溶液２００mlを無菌状
態で加え、再び発酵を行なった。４２時間後に培養物を
回収し、アクロモバクター属細胞を遠心分離（１５，０
００Ｇにおいて３０分間)によって分離した。 湿った
生物量３８.３が得られた。
【００２５】（段階２） ニコチン酸のヒドロキシル化 ３ｌ反応器に５％ニコチン酸ナトリウム溶液(ｐＨ６．
５)を充填し、３０℃まで加熱した。 ＤＳＭ２７８３
細胞を水１２０mlに懸濁させた懸濁水を添加し、反応混
合物を充分に撹拌しながら、反応混合物に強く通風し
た。 反応混合物のｐＨ、温度および酸素濃度を連続的
に測定して調節した。
５)を充填し、３０℃まで加熱した。 ＤＳＭ２７８３
細胞を水１２０mlに懸濁させた懸濁水を添加し、反応混
合物を充分に撹拌しながら、反応混合物に強く通風し
た。 反応混合物のｐＨ、温度および酸素濃度を連続的
に測定して調節した。
【００２６】７時間後に、溶解した酸素濃度が上昇し
た。 この時点までに、反応は終了した。 反応懸濁液
をろ過し、沈降物中の細胞は次の装入に用いた。
た。 この時点までに、反応は終了した。 反応懸濁液
をろ過し、沈降物中の細胞は次の装入に用いた。
【００２７】透明な上澄みを濃硫酸でｐＨ１．５にし、
析出した６−ヒドロキシニコチン酸を吸引ろ過して乾燥
した。
析出した６−ヒドロキシニコチン酸を吸引ろ過して乾燥
した。
【００２８】白色生成物１２１ｇが得られ、これはＨＰ
ＬＣ分析によって、９８．６％の６−ヒドロキシニコチ
ン酸を含有していることがわかった。 上記の生成量
は、ニコチン酸使用量にもとづいて算出すると、９３．
７％の６−ヒドロキシニコチン酸収率に相当する。
ＬＣ分析によって、９８．６％の６−ヒドロキシニコチ
ン酸を含有していることがわかった。 上記の生成量
は、ニコチン酸使用量にもとづいて算出すると、９３．
７％の６−ヒドロキシニコチン酸収率に相当する。
【００２９】
【発明の効果】本発明の微生物は、ニコチン酸を特異的
に６−ヒドロキシニコチン酸にヒドロキシル化する能力
を有し、化学合成では達成できなかった高い純度の目的
物を、高収率で経済的に製造することを可能にする。
に６−ヒドロキシニコチン酸にヒドロキシル化する能力
を有し、化学合成では達成できなかった高い純度の目的
物を、高収率で経済的に製造することを可能にする。
Claims (2)
- 【請求項１】 ニコチン酸を６−ヒドロキシニコチン酸
へ特異的に酵素的にヒドロキシル化する能力を有する微
生物アクロモバクター・キシロースオキシダンス。 - 【請求項２】 アクロモバクター・キシロースオキシダ
ンスＤＳＭ２７８３である請求項１の微生物。
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