KR20070010527A - 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는미생물 및 이를 이용한 수산화된 6환 질소함유 화합물의제조방법 - Google Patents

6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는미생물 및 이를 이용한 수산화된 6환 질소함유 화합물의제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20070010527A
KR20070010527A KR1020050065198A KR20050065198A KR20070010527A KR 20070010527 A KR20070010527 A KR 20070010527A KR 1020050065198 A KR1020050065198 A KR 1020050065198A KR 20050065198 A KR20050065198 A KR 20050065198A KR 20070010527 A KR20070010527 A KR 20070010527A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
group
formula
microorganism
carboxyl
compound represented
Prior art date
Application number
KR1020050065198A
Other languages
English (en)
Inventor
박오진
조준형
이상현
이주원
박시재
Original Assignee
주식회사 엘지화학
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 엘지화학 filed Critical 주식회사 엘지화학
Priority to KR1020050065198A priority Critical patent/KR20070010527A/ko
Priority to PCT/KR2006/002823 priority patent/WO2007011156A1/en
Publication of KR20070010527A publication Critical patent/KR20070010527A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/165—Heterorings having nitrogen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/05—Alcaligenes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 니코틴산(nicotinic acid), 피라진카르복실산(pyrazine carboxylic acid) 및 피콜린산(picolinic acid)을 포함하는 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는 신규한 알카리게네스 속 미생물 및 상기 미생물을 이용한 수산화된 6환 질소화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 미생물인 알칼리게네스 페칼리스 LGNA2는 니코틴산, 피라진카르복실산, 피콜린산과 같은 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는데 효과적인 미생물로서, 6환 질소함유 화합물의 전환 효율이 높아 대량으로 니코틴, 피라진 유도체를 합성하는데 광범위하게 이용될 수 있다.
니코틴산, 6-히드록시 니코틴산, 위치 선택적 수산화 반응, 피라진카르복실산, 피콜린산, 생촉매

Description

6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는 미생물 및 이를 이용한 수산화된 6환 질소함유 화합물의 제조방법{Novel Microorganism Catalyzing Regioselective Hydroxylation of 6 Cyclic Compound Containing Nitrogen and Method for Producing Hydroxylated 6 Cyclic Compound Containing Nitrogen Using the Same}
도 1은 본 발명에서 분리된 신규한 미생물인 알카리게네스 페칼리스 LGNA2의 균체 지방산 분석(MIDI)에 의한 동정 결과이다.
도 2는 상단으로부터 각각 알칼리게네스 페칼리스 LGNA2를 이용한 니코틴산 전환반응 0시간 후 , 63시간 후 생성물 및 표준물질 6-hydroxynicotinic acid의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3a는 6-히드록시 니코틴산 표준물질의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내고, 도 3b는 알칼리게네스 페칼리스 LGNA2를 이용한 니코틴산 전환반응 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4a는 6-히드록시 니코틴산 표준물질의 질량분석(MS) 스펙트럼을 나타내고, 도 4b는 알칼리게네스 페칼리스 LGNA2를 이용한 니코틴산 전환반응 생성물의 질량분석(MS) 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 알칼리게네스 페칼리스 LGNA2를 이용한 피라진카르복실산 전환반응 생성물의 HPLC 크로마토그램으로, 상단으로부터 각각 반응 0시간 후, 4시간 후 및 20시간 후 HPLC 결과를 나타낸다.
도 6은 알카리게네스 페칼리스 LGNA2에 의한 피라진카르복실산의 전환반응의 1H-NMR 스펙트럼으로, 도 6a는 반응물인 피라진카르복실산의 1H-NMR 스펙트럼을, 도 6b는 반응생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 알카리게네스 페칼리스 LGNA2에 의한 피라진카르복실산의 전환반응 생성물의 질량분석(MS) 스펙트럼으로, 상단으로부터 각각 LC-MS 스펙트럼, 피크 1의 MS 스펙트럼 및 피크 2의 MS 스펙트럼을 나타낸다. 피크 1은 히드록시피라진 카르복실산의 분자량과 일치하고, 피크 2는 미량의 이량체(dimmer)의 MS 스펙트럼이다.
발명의 분야
본 발명은 니코틴산(nicotinic acid), 피라진카르복실산(pyrazine carboxylic acid) 및 피콜린산(picolinic acid)을 포함하는 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는 신규한 알카리게네스 속 미생물 및 상기 미생물을 이용한 수산화된 6환 질소함유 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
발명의 배경
살충제로 사용되는 이미다클로프리드(imidacloprid) 및 관련 화합물은 유기인계, 카바메이트계(carbamate), 파리레스로이드계(pyrethroid) 등의 기존의 살충제와는 그 구조 및 기능상 많은 차이를 보인다. 이미다클로프리드가 속하는 니코티노이드계(nicotinoid) 화합물에 공통으로 존재하는 구성 물질에는 6-히드록시 니코틴산(6-hydroxy nicotinic acid)이 있다. 6-히드록시 니코틴산을 합성하는 방법으로 Kolbe-Schmitt 반응이 사용되고 있으나, 이 방법은 수율이 45% 정도에 그치고, 높은 압력(130atm)의 이산화탄소 대기와 고온(250℃)의 반응조건을 필요로 하는 단점이 있어, 이를 보완할 수 있도록 보다 더 온화한 조건에서 높은 수율로 6-히드록시 니코틴산을 제조하는 공정에 대한 필요성이 제기되어 왔다.
미생물 생촉매를 이용하여 니코틴산으로부터 6-히드록시 니코틴산을 제조하는 공정에 대한 보고가 있었으나, 주로 미생물의 질소원과 탄소원으로 사용되는 니코틴산 분해산물의 대사과정에서 6-히드록시 니코틴산을 축적하는 방식이었다. 예로서, 니코틴산 분해과정의 첫 산물인 6-히드록시 니코틴산을 축적하는 미생물이 분리된 바 있는데, 주로 농화(enrichment) 과정을 통하여 분리되었다. 분리된 미생물로는 아크로모박터 자일로속시단스 LK1(Achromobacter xylosoxidans LK1)(Kulla, H., Chimia, 45:81, 1991,), 슈도모나스 플루오레슨스 TN5(Pseudomomas fluorescens TN5)(Nagasawa et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58:665, 1994,), 세라티아 마르세센스 IFO 12648(Serratia marcescens IFO 12648)(Hurh et al., J. Ferment. Technol., 77:382, 1994) 등이 있다.
한편, 니코틴산의 카르복실기의 탈탄산을 수반하는 수산화반응을 촉매하여 3-히드록시 니코틴산을 제조할 수 있는 세라티아 속 미생물(JP 공개 제1998-262691호) 및 3-시안 피리딘을 6-히드록시 니코틴산으로 변환시킬 수 있는 아그로박테리움 속 미생물(JP 등록 제3220210호)이 개시된 바 있다.
그러나 니코틴산의 직접 위치 선택적 수산화반응을 촉매하여 6-히드록시 니코틴산을 제조할 뿐만 아니라, 다른 종류의 6환 질소함유 화합물인 파라진카르복실산, 피콜린산 등에 대해 모두 위치선택적으로 수산화반응을 촉매하는 미생물에 대해서는 지금까지 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 6환 질소함유 화합물의 위치선택적 수산화반응을 촉매하는 미생물을 분리하고자 예의 노력한 결과, 니트릴(nitrile) 화합물(e.g. 3-hydroxypropionitrile, 3-cyanopyridine 등)의 분해과정에서 분리된 미생물의 니코틴산 전환반응을 검토함으로써, 6-히드록시 니코틴산을 효율적으로 생성할 수 있는 신규한 미생물인 알카리게네스 페칼리스 LGNA2(Alcaligenes faecalis LGNA2)를 분리하고, 이 미생물이 니코틴산을 6-히드록시 니코틴산으로 전환시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
결국 본 발명의 주된 목적은 니코틴산의 위치 선택적 반응을 촉매하여 6-히드록시 니코틴산을 고효율로 생산할 뿐만 아니라, 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화 반응을 촉매하는 신규한 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용한 수산화된 6환 질소함유 화합물의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는 알칼리게네스(Alcaligenes) 속 미생물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112005038970994-PAT00001
여기서, R은 탄소원자 또는 질소원자이고, R1과 R2는 독립적으로 수소, 카르복실기, 카바모일기, 시아노기, 포르밀기, 탄소수 1~5의 히드록시 알킬기, 탄소수 2~6의 알콕시 카르보닐기, 카르복실 비닐기, 카복시메틸기 또는 옥심기임; 단, R1과 R2 중 하나는 반드시 카르복실기임.
본 발명은 또한, 알칼리게네스 속 미생물을 이용한, 화학식 1로 표시되는 화 합물의 선택적 수산화반응을 통해 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 방법을 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112005038970994-PAT00002
여기서, R은 탄소원자 또는 질소원자이고, R1과 R2는 독립적으로 수소, 카르복실기, 카바모일기, 시아노기, 포르밀기, 탄소수 1~5의 히드록시 알킬기, 탄소수 2~6의 알콕시 카르보닐기, 카르복실 비닐기, 카복시메틸기 또는 옥심기임; 단, R1과 R2 중 하나는 반드시 카르복실기임.
본 발명은 또한, 상기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는, 화학식 1로 표시되는 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는 효소의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 효소 또는 상기 효소를 함유하는 미생물의 파쇄물 또는 분획물을 이용한, 화학식 1로 표시되는 화합물의 선택적 수산화반응을 통해 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 알칼리게네스 속 미생물은 알칼리게네스 페칼리스(Alcaligenes faecalis)인 것을 특징으로 할 수 있고, 서열번호 1의 염기서열과 99%이상의 상동성을 가지는 16S rRNA를 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 구체적으로는, 알칼리게네스 페칼리스 LGNA2(Alcaligenes faecalis LGNA2) (KCTC 10779BP)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 니코틴산, 피라진카르복실산 및 피콜린산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 니코틴산의 분해를 통하여 6-히드록시 니코틴산을 생산하는 미생물을 분리하는 방법을 사용하지 않고, 니트릴 화합물의 분해과정에서 미생물을 분리하는 방법을 사용하여 신규한 미생물인 알칼리게네스 속의 알카리게네스 페칼리스 LGNA2를 수득하고, 이 미생물이 니코틴산을 6-히드록시 니코틴산으로 고효율로 전환시키는 것을 확인하였다.
본 발명에서 수득한 미생물을 이용하면 화학식 1로 표시되는 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하여 화학식 2로 표시되는 수산화물을 직접 제조할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112005038970994-PAT00003
[화학식 2]
Figure 112005038970994-PAT00004
여기서, R은 탄소원자 또는 질소원자이고, R1과 R2는 독립적으로 수소, 카르복실기, 카바모일기, 시아노기, 포르밀기, 탄소수 1~5의 히드록시 알킬기, 탄소수 2~6의 알콕시 카르보닐기, 카르복실 비닐기, 카복시메틸기 또는 옥심기임; 단, R1과 R2 중 하나는 반드시 카르복실기임.
예를 들면, 니코틴산의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하여 6-히드록시 니코틴산을 생성할 수 있을 뿐만 아니라, 피라진 카르복실산(2-pyrazinecarboxylic acid) 및 피콜린산(picolinic acid)을 각각 5-히드록시 피라진-2-카르복실산(5-hydroxy pyrazine-2- carboxylic acid) 및 6-히드록시 피콜린산(6-hydroxypicolinic acid)으로 전환할 수 있다.
본 발명에서 "파쇄물"이라 함은 미생물을 배양한 배양물을 그라인더 등을 사용하여 파쇄하여 얻은 것으로, 본 발명에 따른 6환 질소함유 화합물의 수산화 반응을 촉매할 수 있는 효소를 포함하고 있는 것을 의미하고, "분획물"이라 함은, 상기 파쇄물로부터 효소를 부분 정제한 것으로 본 발명에 따른 6환 질소함유 화합물의 수산화 반응을 촉매할 수 있는 효소를 포함하고 있는 것을 의미한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예 1: 니코틴산으로부터 6-히드록시 니코틴산으로 전환하는 미생물의 분리
우선 토양원을 배양하여 3-히드록시프로피오니트릴(3-hydroxypropionitrile)을 분해하고, 이를 유일한 탄소원으로 이용하는 미생물을 분리하였다.
미생물 분리용 액체 배지로 GHPN 배지와 HPN 배지를 제조하여 사용하였다. 먼저 GHPN 배지는 표 1과 표 2에 명시되어 있는 성분을 포함하는 최소 배지에 5g/L의 포도당과 질소원으로 20g/L의 3-히드록시프로피오니트릴을 첨가하여 제조하였다. HPN 배지는 3-히드록시프로피오니트릴을 유일한 탄소원과 질소원으로 사용하기 위한 배지로서, 표 1과 2에 명시된 성분을 포함하는 최소배지에 3-히드록시프로피오니트릴을 20g/L 농도로 첨가하여 제조하여 사용하였다. 고체 배양 시에는 LB 평판 배지와 최소배지에 탄소원으로 포도당(10g/L)을, 질소원으로 3-히드록시프로피오니트릴(5g/L)을 첨가하여 제조한 고체배지(HPN agar)를 제조하여 사용하였다.
니트릴을 분해하는 미생물을 탐색하기 위해 5ml의 액체배지(GHPN 배지 및 HPN 배지)에 1g 토양 미생물원을 넣고 진탕 배양기에서 200rpm, 30℃ 조건으로 3일 동안 농화 배양을 하였다. 다음으로, 상기 배양액 1ml를 미생물원으로 사용하여 상기와 동일한 액체 배지에 다시 접종하여 상기와 동일한 조건으로 농화 배양을 하였 다. 이를 3회 반복한 후 배양액을 HPN 아가 고체 배지에 도말하고, 이를 배양하여 생성된 단일 콜로니로부터의 미생물을 다시 HPN 최소배지에서 배양하여 니트릴 분해능을 검증하였다. 성장을 보인 배양액을 고체배지에 도말하고 30℃ 조건으로 배양하여 미생물을 순수 분리하였다.
최소배지의 성분
성분 함량(/L)
K2HPO4 7g
KH2PO4 3g
NaCl 0.5g
MgSO4 0.5g
비타민 용액 10ml
금속 용액(0.1g/L) 10ml
금속용액과 비타민 용액의 성분
트레이스 금속 용액 (Trace metal solution) 비타민 용액
성분 함량(/L) 성분 함량(/L)
Na2B4O7·10H2O 100mg Thiamin.HCl 4mg
CoCl2·6H2O 20mg Riboflavin 2mg
CuSO4·6H2O 10mg Pantothenic acid 4mg
NiCl·H2O 10mg Pyridoxin·HCl 4mg
Na2MoO4·2H2O 10mg p-aminobenzoicc acid 4mg
CaCl·2H20 10mg Nicotinic acid 4mg
MnSO4·5H2O 100mg Inositol 20mg
FeSO4·7H2O 200mg Biotin(0.02%sol.) 100ul
실시예 2: 분리한 LGNA2 미생물의 동정
실시예 1에서 분리된 미생물을 동정하기 위하여, 세포벽 지방산 분석방법인 MIDI법을 수행하였고, 보다 정확한 분석을 위하여 16S rRNA의 염기서열 분석을 실시하였다.
MIDI 분석결과, 상기 미생물은 알칼리게네스 페칼리스와 0.735의 상동성 지수(similartity index)를 보였다(도 1).
16S rRNA의 염기서열을 결정하기 위하여, 상기 미생물과 알칼리게네스 페칼리스의 표준 균주로 알려진 알칼리게네스 페칼리스 KCTC 2678 균주의 염색체를 염색체 분리정제 시약을 이용하여 분리 정제한 후, 이를 주형으로 하고, 다음 서열번호 2 및 3의 프라이머(Wilson et al., Appl. Environ. Microbiol., 71:290, 2005)를 이용하여 16S rRNA를 증폭하였다.
서열번호 2(전 방향 용 AF16S rRNAF):
5-TTG GAT CCA GAG TTT GAT CMT GGC TCA G-3
서열번호 3(후 방향 용 AF16S rRNAR):
5-GTT GGA TCC ACG GYT ACC TTG TTA CGA YT-3
상기 미생물의 16S rRNA의 염기서열(서열번호 1) 중 500개의 염기서열을 결정하였고, 이를 바탕으로 Clustal X 프로그램을 이용하여 알칼리게네스 페칼리스 KCTC 2678 균주와 99%이상의 유연관계를 보이는 것을 확인하였다.
상기 분석 결과를 바탕으로 실시예 1에서 분리된 미생물을 알칼리게네스 페칼리스 LGNA2(Alcaligenes faecalis LGNA2)라 명명하고, 한국생명공학연구원 유전자은행 (KCTC)에 2005년 2월 15일자로 기탁하였다(KCTC 10779BP).
실시예 3: 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응
본 발명에 따른 신규 균주 알칼리게네스 페칼리스 LGNA2에 의한 6환 질소함유 화합물 니코틴산 및 피라진카르복실산의 위치 선택적 수산화반응을 일으킨 다음, 그 수산화 반응을 검증하기 위하여, 생성물의 구조를 결정하였다.
1. 니코틴산의 수산화
알칼리게네스 페칼리스 LGNA2를 3mL의 YEPD(yeast extract 10g/L, Bacto peptone 20g/L, glucose 20g/L)에서 16시간 배양한 다음, 동일한 YEPD 배지 50mL에 수산화반응을 촉매하는 효소를 유도하기 위하여, 니코틴산을 (최종농도 20g/L) 첨가하고 39시간 배양하였다(OD600= 1.73).
원심분리하여 균주를 얻고 50mM Tris-HCl 완충용액 (pH 7.0)으로 씻은 뒤, 2.8mL의 동일한 완충용액에 현탁하였다. 미생물 현탁액 0.5mL, 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.0) 3.5mL, 및 니코틴산 (최종농도: 20g/L)을 첨가하고 진탕 배양기에서 200rpm, 30℃ 조건으로 반응시킨 다음, 니코틴산과 생성물을 HPLC로 검출하였다. HPLC 용매로는 메탄올과 물이 각각 29:60의 부피비를 가진 혼합액을 사용하였다. Capcellpak C18 컬럼에서 용매의 유속(flow rate)은 1ml/분으로 유지하고 UV 230nm에서 검출하였다. 도 2에는 상단으로부터 각각 반응 0시간 후, 반응 63시간 후 및 표준물질 6-hydroxynicotinic acid의 HPLC 크로마토그램을 나타내었다. 상기 결과로부터 63시간 후에 10.5g/L의 6-히드록시 니코틴산이 생성된 것을 확인할 수 있었다.
5일 반응 후, 원심분리하여 미생물 균체를 제거하고, 6N HCl로 pH를 1.8로 맞춘 뒤 침전물을 얻고, pH 1.8의 물로 세척한 다음, 30℃에서 건조하였다(52% 수득율). 상기 건조된 침전물을 DMSO-d6 용매에 녹인 다음, 1H NMR과 MS 분석을 실시하였다(도 3 및 도 4).
도 3은 알카리게네스 페칼리스 LGNA2에 의한 니코틴산 전환반응 생성물의 1H-NMR 스펙트럼으로, 도 3a는 6-히드록시 니코틴산 표준물질을 나타내고, 도 3b는 알칼리게네스 페칼리스 LGNA2를 이용한 니코틴산 전환반응 생성물을 나타낸다. 또한, 도 4는 알카리게네스 페칼리스 LGNA2에 의한 니코틴산 전환반응 생성물의 질량분석(MS) 스펙트럼으로, 도 4a는 6-히드록시 니코틴산 표준물질을 나타내고, 도 4b는 전환반응 생성물을 나타낸다.
상기 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 상기 반응 생성물은 6-히드록시 니코틴산 표준물질과 1H-NMR 스펙트럼 및 MS 스펙트럼이 일치하는 것을 확인할 수 있었다
2. 피라진카르복실산의 수산화
알칼리게네스 페칼리스 LGNA2를 YEPD(yeast extract 10g/L, Bacto peptone 20g/L, glucose 20g/L) 액체배지 2mL에 접종하고, 진탕배양기에서 200rpm, 30℃에서 16시간 배양한 후, 이를 100mL의 동일배지에 니코틴산 (최종농도 5g/L)을 첨가하고 20시간 배양하였다(20시간에 니코틴산의 50%가 6-히드록시니코틴산으로 전환). 상기 배양물의 원심분리를 통해 미생물 균체 분획물을 얻고, 이를 50mM 인산 칼륨 완충용액으로 세척한 뒤, 8mL의 동일 완충용액에 현탁하였다. 상기 미생물 현탁액 1mL에 피라진카르복실산 용액(6.21g/L) 2mL을 첨가하고(최종농도 4.14g/L), 반응을 시켰다.
상기 반응물을 분석하기 위하여, HPLC 용매로 아세토니트릴과 물이 4:96 (H3PO4로 pH 2.5로 조절)의 부피비를 가진 혼합액을 사용하고, Capcellpak C18 컬럼에서 용매의 유속(flow rate)은 1ml/분으로 유지하고 UV 230nm에서 HPLC 검출하였다. 도 5는 상단으로부터 각각 반응 0시간 후, 4시간 후 및 20시간 후의 상기 HPLC 결과를 나타낸 것이다. 상기 결과로부터 반응 20시간 만에 100%의 피라진 카르복실산이 전환되었다는 것을 확인할 수 있었다.
원심분리하여 상기 반응물로부터 미생물 균체를 제거한 다음, 6N HCl로 pH를 1.2로 맞춘 뒤 침전물을 얻고 pH 1.2의 물로 세척한 뒤 30℃에서 건조하였다(52% 수득율). 상기 건조물을 DMSO-d6 용매에 녹인 후 1H NMR과 MS 분석을 실시하였다(도 6 및 도 7).
도 6은 알카리게네스 페칼리스 LGNA2에 의한 피라진카르복실산의 전환반응 생성물의 1H-NMR 스펙트럼으로, 도 6a는 반응물인 피라진카르복실산의 1H-NMR 스펙트럼이고, 도 6b는 반응생성물의 1H-NMR 스펙트럼이다. 또한, 도 7은 알카리게네스 페칼리스 LGNA2에 의한 피라진카르복실산의 전환반응 생성물의 질량분석(MS) 스펙트럼으로, 상단으로부터 각각 LC-MS 스펙트럼, 피크 1(히드록시피라진 카르복실산)의 MS 스펙트럼 및 피크 2(히드록시피라진 카르복실산 이량체)의 MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 6와 도 7에 나타난 바와 같이, 상기 반응 생성물은 5-히드록시피라진-2-카르복실산 이라는 것을 확인할 수 있었다(질량분석 139=[M-H]-, 253=[M+CF3COO-]). 다만, 부산물로 미량의 이량체(dimmer)가 생성되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 니코틴산, 피라진카르복실산, 피콜린산과 같은 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는데 효과적인 미생물 (알칼리게네스 페칼리스 LGNA2) 및 상기 미생물을 이용한 수산화된 6환 질소함유 화합물의 제조방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 미생물을 이용하면, 직접적인 전환반응을 촉매하기 때문에 최종반응 후 부산물이 전혀 없거나, 거의 없어서 생산물의 분리정제가 용이할 뿐만 아니라, 전환 효율이 높아 대량으로 니코틴, 피라진 유도체를 합성하는데 광범위하게 이용될 수 있다.
<110> LG Chemical Ltd. <120> Novel Microorganism Catalyzing Regioselective Hydroxylation of 6 Cyclic Compound Containing Nitrogen and Method for Producing Hydroxylated 6 Cyclic Compound Containing Nitrogen Using the Same <130> P05-B146 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 789 <212> DNA <213> Alcaligenes faecalis <400> 1 gggtagcgcc ctccttacgg ttaggctacc tacttctggt gaaacccact cccatggtgt 60 gacgggcggt gtgtacaaga cccgggaacg tattcaccgc gacattctga tccgcgatta 120 ctagcgattc cgacttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccggacta cgatcgggtt 180 tctgagattg gctccccctc gcgggttggc gaccctctgt cccgaccatt gtatgacgtg 240 tgaagcccta cccataaggg ccatgaggac ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300 tcaccggcag tctcattaga gtgctcttgc gtagcaacta atgacaaggg ttgcgctcgt 360 tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtgt 420 tccggttctc ttgcgagcac tgccaaatct cttcggcatt ccagacatgt caagggtagg 480 taaggttttt cgcgttgcat cgaattaatc cacatcatcc accgcttgtg cgggtccccg 540 tcaattcctt tgagttttaa tcttgcgacc gtactcccca ggcggtcaac ttcacgcgtt 600 agctgcgcta ctaaggccta acggccccaa cagctagttg acatcgttta gggcgtggac 660 taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgt gtctgagcgt cagtattatc 720 ccagggggct gccttcgcca tcggtattcc tccacatatc tacgcatttc actgctacac 780 gtggaattc 789 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward AF16S rRNAF primer <400> 2 ttggatccag agtttgatcm tggctcag 28 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse AF16S rRNAR primer <400> 3 gttggatcca cggytacctt gttacgayt 29

Claims (12)

  1. 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는 알칼리게네스(Alcaligenes) 속 미생물:
    [화학식 1]
    Figure 112005038970994-PAT00005
    여기서, R은 탄소원자 또는 질소원자이고, R1과 R2는 독립적으로 수소, 카르복실기, 카바모일기, 시아노기, 포르밀기, 탄소수 1~5의 히드록시 알킬기, 탄소수 2~6의 알콕시 카르보닐기, 카르복실 비닐기, 카복시메틸기 또는 옥심기임; 단, R1과 R2 중 하나는 반드시 카르복실기임.
  2. 제1항에 있어서, 알칼리게네스 페칼리스(Alcaligenes faecalis)인 것을 특징으로 하는 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열과 99%이상의 상동성을 가지는 16S rRNA를 가지는 것을 특징으로 하는 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 알칼리게네스 페칼리스 LGNA2(Alcaligenes faecalis LGNA2) (KCTC 10779BP)인 것을 특징으로 하는 미생물.
  5. 알칼리게네스 속 미생물을 이용한, 화학식 1로 표시되는 화합물의 선택적 수산화반응을 통해 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112005038970994-PAT00006
    [화학식 2]
    Figure 112005038970994-PAT00007
    여기서, R은 탄소원자 또는 질소원자이고, R1과 R2는 독립적으로 수소, 카르복실기, 카바모일기, 시아노기, 포르밀기, 탄소수 1~5의 히드록시 알킬기, 탄소수 2~6의 알콕시 카르보닐기, 카르복실 비닐기, 카복시메틸기 또는 옥심기임; 단, R1 과 R2 중 하나는 반드시 카르복실기임.
  6. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 알칼리게네스 페칼리스(Alcaligenes faecalis)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 서열번호 1의 염기서열과 99% 이상의 상동성을 보이는 16S rRNA를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 알칼리게네스 페칼리스 LGNA2(Alcaligenes faecalis LGNA2) (KCTC 10779BP)인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 니코틴산, 피라진카르복실산 및 피콜린산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는, 화학식 1로 표시되는 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는 효소의 제조방법.
  11. 제10항의 방법에 의해 제조된 효소 또는 상기 효소를 함유하는 미생물의 파쇄물 또는 분획물을 이용한, 화학식 1로 표시되는 화합물의 선택적 수산화반응을 통해 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112005038970994-PAT00008
    [화학식 2]
    Figure 112005038970994-PAT00009
    여기서, R은 탄소원자 또는 질소원자이고, R1과 R2는 독립적으로 수소, 카르복실기, 카바모일기, 시아노기, 포르밀기, 탄소수 1~5의 히드록시 알킬기, 탄소수 2~6의 알콕시 카르보닐기, 카르복실 비닐기, 카복시메틸기 또는 옥심기임; 단, R1과 R2 중 하나는 반드시 카르복실기임.
  12. 제11항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 니코틴산, 피라진카르복실산 및 피콜린산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020050065198A 2005-07-19 2005-07-19 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는미생물 및 이를 이용한 수산화된 6환 질소함유 화합물의제조방법 KR20070010527A (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050065198A KR20070010527A (ko) 2005-07-19 2005-07-19 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는미생물 및 이를 이용한 수산화된 6환 질소함유 화합물의제조방법
PCT/KR2006/002823 WO2007011156A1 (en) 2005-07-19 2006-07-19 Novel microorganism catalyzing regioselective hydroxylation of 6 cyclic compound containing nitrogen and method for producing hydroxylated 6 cyclic compound containing nitrogen using the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050065198A KR20070010527A (ko) 2005-07-19 2005-07-19 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는미생물 및 이를 이용한 수산화된 6환 질소함유 화합물의제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070010527A true KR20070010527A (ko) 2007-01-24

Family

ID=37669007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050065198A KR20070010527A (ko) 2005-07-19 2005-07-19 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는미생물 및 이를 이용한 수산화된 6환 질소함유 화합물의제조방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20070010527A (ko)
WO (1) WO2007011156A1 (ko)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH658866A5 (de) * 1984-02-21 1986-12-15 Lonza Ag Verfahren zur herstellung von 6-hydroxynikotinsaeure.
KR100233330B1 (ko) * 1991-02-04 1999-12-01 하인즈 모제르 6-히드록시피콜린산을 제조하기 위한 미생물학적 방법
FI922125A (fi) * 1991-06-21 1992-12-22 Lonza Ag Mikrobidogiskt foerfarande foer framstaellning av 5-hydroxipyrazinkarboxylsyra
MX9206934A (es) * 1991-12-05 1993-07-01 Lonza Ag Procedimiento microbiologico para la preparacion de acidos carboxilicos hidroxi-heterociclicos

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007011156A1 (en) 2007-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0833938A1 (en) Reduction of ketone groups
US20040209337A1 (en) Synthesis of 1,2,3,4-tetrahydroxybenzenes from biomass-derived carbon
EP2031052B1 (en) A bacillus pumilus strain for high yield of tetramethylpyrazine
JPH04365494A (ja) ヒドロキシル化されたピラジン誘導体を製造するための微生物学的方法
EP0975738A1 (en) A new microorganism streptomyces exfoliatus yj-118 and a method for producing pravastatin sodium by using the strain
CN1329520C (zh) 制备(3r,5s)－(e)－7－[2－环丙基－4－(4－氟苯基)－喹啉－3－基]－3,5－二羟基庚－6－烯酸酯的方法
CZ279492B6 (cs) Mikrobiologický způsob výroby kyseliny 6-hydroxypikolinové
US5422256A (en) Production of anthranilic acid by a strain of Bacillus subtillis resistant to sulfaguanidine and fluorotryptophan
KR20070010527A (ko) 6환 질소함유 화합물의 위치 선택적 수산화반응을 촉매하는미생물 및 이를 이용한 수산화된 6환 질소함유 화합물의제조방법
EP0982406B1 (en) Microbial production of actinol
CN1293069C (zh) 制备新的刺糖多孢菌素衍生物的方法
CN1159448C (zh) 制备HMG-CoA还原酶抑制剂的方法
KR100542565B1 (ko) 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈의 생산방법
EP2551351A1 (en) Process for production of optically active (R)-(-)-1-(2,4-dichloro-phenyl)-2-imidazole-1-yl-ethanol
JP3754785B2 (ja) ３−ヒドロキシ含窒素六員環化合物の製造方法
US7579485B2 (en) Process for producing lactone
WO2006131933A1 (en) Enzymatic reduction of keto groups in 3-keto-propionic acid derivatives
KR101651239B1 (ko) 신규 슈도모나스 종 균주 및 이를 이용한 6-아미노카프로산의 탈아민 방법
JP4197778B2 (ja) 光学活性なα−メルカプトカルボン酸の製造方法
JP2002017386A (ja) インドール−３−カルボン酸誘導体の製造法
US5955328A (en) Fermentative preparation of 2,5-dihydroxyphenylacetic acid with Beauveria
JP3843692B2 (ja) 光学活性ｅｎｄｏ−ノルボルネオールの製造法
JP2021166505A (ja) メイタンシノールの生産方法
JP5126707B2 (ja) α−ヒドロキシアシルピリジンの製造方法
JP2003093046A (ja) 有用変換微生物

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application