JPH05507201A

JPH05507201A - 新規な化学的生成物

Info

Publication number: JPH05507201A
Application number: JP91510382A
Authority: JP
Inventors: ビユルセル，グンナー; ブレツクベルイ，ラース; カールソン，ペーテル; エネルベツク，スヴエン; ヘルネル，オツレ; ニルソン，イエアネツテ; オリヴエクローナ，トーマス
Original assignee: アクチエボラゲツト・アストラ
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1991-05-30
Publication date: 1993-10-21
Also published as: YU95191A; RU2140983C1; CN1326782A; IS1751B; PT97836A; EP0535048B1; AU651979B2; KR100212411B1; CN1075113C; EP0535048A1; TW221712B; NO924528D0; ZA913778B; DE69125489D1; SE9001985D0; DK0535048T3; SK164491A3; LT4020B; IE911844A1; HK62497A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規な化学的生成物発明の分野本発明は、新規なりＮＡ配列、このようなりＮＡ配列によってコードされる新規な蛋白質およびこの蛋白質の以下に述べるような使用に関する。本発明はまた、このＤＮＡ配列から構成され、所望の酵素を発現できるプラスミド構築体のようなベクターも包含する。本発明はまた、この構築体でトランスフェクトされた宿主生物、たとえば細菌、酵母、哺乳動物細胞およびトランスジェニック動物も包含する。本発明はまた、本発明の新規な生成物の製造方法を包含する。本発明の新規な蛋白質は、と（にヒト胆汁酸塩刺激リパーゼとして知られている酵素に関連するものである。

発明の背景ヒトの授乳中乳腺は、胆汁酸塩刺激リパーゼ（Ｂ５５Ｌ）を合成し乳汁とともに分泌する〔１〕。これは、−次胆汁酸塩によって特異的に活性化されＣ２，５７，５８］、母乳で補育される乳児の腸内脂肪消化の内因性能力に寄与することになる〔３〜５〕。総乳蛋白質のほぼ１％に達する［６〕この酵素は非特異的リパーゼであって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、トリー、ジーおよびモノアシルグリセロールのみでなく、コレステリル−およびレチニルエステル、ならびにリゾホスファチジルグリセロールも加水分解する〔７〜１０〕。しかも、その活性は乳化された基質に限定されず、ミセル化および可溶性基質も類似の速度で加水分解される〔１１〕。

Ｂ５５Ｌは乳汁とともに胃内を通過する間は分解されることなく、十二指腸内容物中では、胆汁酸塩によって、膵臓プロテアーゼたとえばトリプシンおよびキモトリプシンによる不活性化から保護される［２　、１１１゜しかしながら、乳汁がたとえば６２．５℃に３０分加熱されて滅菌された場合には不活性化される〔１２〕。ｉｎ　ｖＨｒｏにおけるモデル実験では、トリアジルグリセロール消化の最終産物はＢ５５Ｌが存在すると異なることが示唆されている（５，７）。

新生児期には管腔内胆汁酸塩濃度が低いので（１３，１４）、これは生成物の吸収に有利と考えられる（５．１５）。

ヒト膵液のカルボン酸エステルヒドラーゼ（ＣＥＨ）　［１６）はＢ５５Ｌと機能的に同一であるかまたは少なくともきわめて類似しているものと思われる〔６〕。これらはまた、共通のエピトープを有し［８，１７］　、同一のＮ末端アミノ酸配列をもっていて［１７］、セリンエステラーゼインヒビター、たとえばエセリンおよびジイソプロピルフルオロホスフェートによって阻害される（６　、８　、１６）。２つの酵素は同一遺伝子の産物であると仮定されている〔１８゜１９〕。観察される分子サイズの差［８、１９］は、最近示唆されているように、グリコシレージョンパターンの差によって説明できるものと思われる〔１７〕。

食物からの脂質は重要なエネルギー源である。エネルギーに富むトリアジルグリセロールがこれらの脂質の９５％以上を構成している。脂質の一部、たとえばある種の脂肪酸および脂溶性ビタミンは必須の食物成分である。

胃腸から吸収する前に、トリアジルグリセロールならびに微量成分すなわちエステル化脂溶性ビタミンおよびコレステロール、さらにはジアシルホスファチジルグリセロールは、エステル結合が加水分解されて疎水性の低い吸収性の生成物を生じる必要がある。これらの反応はリパーゼと呼ばれる特定の群の酵素によって触媒される。

ヒト成人では、関連する必須のリパーゼとしては胃リパーゼ、膵コリパーゼ依存性リパーゼ（トリーおよびジアシルグリセロール加水分解）、膵ホスホリパーゼ１２（ジアシルホスファチジルグリセロール）およびカルボン酸エステルヒドロラーゼ（コレステリル−および脂溶性ビタミンエステル）が考えられる。母乳で噛育されている新生児の胆汁酸塩刺激リパーゼは、上述の脂質のいくつかの加水分解に必須の役割を果たしている。胆汁酸塩とともに脂質消化の生成物は混合ミセルを形成し、これから吸収が起こる〔３〜５〕。

脂質の吸収不良、したがって栄養不良に共通の原因は、膵コリパーゼ依存性リパーゼおよび／または胆汁酸塩の管腔内レベルの低下である。このようなリパーゼ欠乏の典型的な例には、患者のほぼ８０％に終生の欠乏を生じる共通の遺伝的障害、嚢胞性線維症患者および多（の場合慢性アルコール症による慢性膵炎がある。

出産時には、とくに満期前出産児の場合、膵臓および肝臓機能は完全には発達していない。生理学的理由による脂肪の吸収不良はよくみられる所見であって、管腔内膵コリパーゼ依存性リパーゼおよび胆汁酸塩の低濃度によって生じるものと考えられる［３．４．１３〜１５〕。しかしながら、Ｂ５５Ｌにより、このような吸収不良は、母乳で噛育されている乳児の方が乳児用製品の滅菌人乳を与えられた乳児よりも、はるかに少ない〔３〜５　、１２．５９．６０．６１１゜自身の母親の乳汁での噛育が不可能な新生児とくに満期前出産児は、他の母親の非滅菌乳汁で晴育すべきと言われる一つの理由はここにある〔１２〕。

膵リパーゼ欠乏に罹患している患者の現在の治療は、ブタ膵臓酵素の粗製剤の著しい大用量の経口投与である。

コリパーゼ依存性膵リパーゼは低ｐｔ［で不活性化される。

このような条件は胃内に通常認められ、したがって経口的に投与された膵リパーゼは胃を通過して腸に達する際に事実上完全に不活性されてしまう。すなわち、この影響は大用量の酵素を使用しても克服することはできない。

大用量の投与は大部分の患者に不適切であり、しかも製剤は不純で口当りが悪い。胃の酸性領域は通過し、比較的アルカリ性環境の空隔でのみ酵素を放出するある種の錠剤も処方されている。しかしながら、膵臓障害に罹患している患者の多（では、空隔は異常な酸性を示し、このような錠剤も酵素の放出は果せず、したがって無効である。しかも、現在市販されている製剤はヒト起源のものではないので、患者に有害な結果や治療効果の低下を引き起こす可能性がある免疫反応の危険がある。現在の製剤のもつ他の欠点には、コリパーゼ依存性リパーゼ以外の他の脂質分解活性成分が表示されていないことがある。実際、大部分の製剤は、きわめて低レベルのＣＥＨ／Ｂ５５Ｉ、−活性しか含んでいない。これが、嚢胞性線維症罹患患者の多くは、補給療法にもかかわらず、脂溶性ビタミンおよび必須脂肪酸の欠乏を起こしている一つの理由である。

したがって、ヒトリパーゼ由来の性質と構造および広い基質特異性を有し、膵臓脂質分解酵素の１種もしくは数種の欠乏症患者に経口投与できる製品の大きな必要性があったのである。本発明の製品は、それ自体で、または他のリパーゼ含有製剤と組み合わせて、この要求を満たすものである。さらに、慣用の乳児用ミルク製品またはいわゆるミルクバンクがらの滅菌ヒト乳汁の脂肪の利用を改善するために、一部の乳児におけるその必要性は自明である。

Ｂ５５Ｌは、それを置換または補給療法に最適とする独特の、いくつかの性質を有する。それは本来、軽口投与用に設計されている。すなわち、それは胃の通過に抵抗し、小腸の内容物中で活性化される。その特異的な活性化機構が、貯蔵時またはその作用部位への通過時における食品または組織脂質の有害な脂質分解を防止することになる。その広い基質特異性により、独自で、脂溶性ビタミンエステルを包含する大部分の食物中脂質の完全な消化を仲介する能力を有する。

Ｂ５５Ｌは、長鎖多不飽和脂肪酸を含むエステル結合の加水分解には、膵臓コリパーゼ依存性リパーゼより優れていると思われる。胃リパーゼの存在下およびコリパーゼ依存性リパーゼの不存在下またはその低レベル下には、Ｂ５５Ｌは、新生児の場合のように胆汁酸塩レベルが低くても、ｉｎ　ｖｆｔｒｏにおいても完全なトリアジルグリセロール消化を達成できる。Ｂ５５Ｌの存在下には、トリアジルグリセロール消化の最終生成物は、他の２種のリパーゼによって生成する遊離脂肪酸とモノアシルグリセロールではなくて、遊離脂肪酸と遊離グリセロールになる〔５〕。

これは、とくに管腔内胆汁酸塩レベルが低い場合、生成物の吸収に有利である（３　、１５）。歴史的にみて、乳児用調合孔は、その組成を可能な限り人乳の組成に近づけなければならないという考え方で開発され、改良されてきた。このような調合孔への補給が望ましい。

胆汁酸塩刺激リパーゼ゛（Ｂ５５Ｌ）またはＢ５５Ｌの必須機能をもつ蛋白質の、補給、置換または治療のための利用には、しかしながら、大きな技術的規模での大量の生成物の獲得が必要である。出発原料を工業的規模でたとえば乳汁のような天然原料に頼ることは不可能である。滅菌時におけるＢ５５Ｌの不活性化についての上述の問題に加えて、天然からの材料には、ウィルスたとえばＨＩＶウィルスおよびＣＸＶのような感染源による汚染の危険がある。

したがって、Ｂ５５Ｌの性質をもつ生成物を大規模に獲得する方法がめられている。本発明はこのような生成物およびその製造方法を提供するものである。

従来技術に関しての引用文献は本明細書の末尾に掲げる。

発明本発明は、ヒト乳腺由来のＢ５５ＬをコードするｃＤＮＡのクローニングに基づくものである。本発明者らはまた、ヒト膵臓から、ＣＥＨをコードする部分ｃＤＮ＾を単離した。ヒトｃＤＮ＾から帰納されたアミノ酸配列および他の種からのＣＥＨとの比較の結果、Ｂ５５ＬとＣＥＨは同一であるとの解釈が支持された。

以下にさらに詳述するように、ｃＤＮ＾ＤＮＡ配列納された蛋白質の構造は、驚くべきことに、他のリパーゼの構造とは全く異なることが見出されたのである。

その構造は、予期に反して、典型的なエステラーゼ、たとえばコリンエステラーゼの構造にむしろ類似することが明らかにされた。

図２および図７を参照して、本発明の生成物は、ａ）図７のアミノ酸配列１〜７２２によって定義される蛋白質、ｂ）図７のアミノ酸配列１〜５３５によって定義される蛋白質、Ｃ）図７のアミノ酸配列１〜２７８によって定義される蛋白質、ｄ）図７のアミノ酸配列１〜３４１によって定義される蛋白質、ｅ）図７のアミノ酸配列１〜４０９によって定義される蛋白質、ｆ）図７のアミノ酸配列１〜４７４によって定義される蛋白質、ｇ）　ｂ）〜ｆ）に定義された蛋白質たとえば位置１〜２７８．２７９〜３４１．２７９〜４０９．２７９〜４７４．３４２〜４０９．３４２〜４７４および５３６〜７２２のアミノ酸配列によって定義される蛋白質の混合物、ｈ）　ｂ）〜ｇ）に定義された蛋白質を図５のリピートの１個または２個以上と組み合わせた蛋白質の混合物、ｉ）　さらにＮ末端アミノ酸、すなわちメチオニンを有するａ）〜ｈ）で定義される蛋白質、ならびに上記ａ）〜ｉ）で定義された蛋白質の機能均等変異体および突然変異体である。

上記ａ、ｂ１ｃ、ｄ、ｅ、ｆＳｈおよびｉの蛋白質は天然に存在するＢ５５Ｌとはすべての点で同一ではないが天然のＢ５５Ｌに必須の機能の１つまたは２以上を表すものであることに留意すべきである。必須な機能は以下に示す。

ｊ）上記ａ、ｂ、ｃ、ｄＸｅＳｆＳｈおよびｉに定義される蛋白質をコードするＤＮＡ配列、ｋ）図２において以下のヌクレオチド番号で定義される図２のＤＮＡ配列、すなわち、ａ）図７のアミノ酸配列１〜７２２で定義される蛋白質をコードする図２のＤＮＡ配列１５１〜２３１６、ｂ）５Ｕ７のアミノ酸配列１〜５３５で定義される蛋白質をコードする図２のＤＮＡ配列１５１〜１７５５、Ｃ）図７のアミノ酸配列１〜２７８で定義される蛋白質をコードする図２のＤＮＡ配列１５１〜９８５、ｄ）図７のアミノ酸配列１〜３４１で定義される蛋白質をコードする図２のＤＮＡ配列１５１〜１１７２、ｅ）図７のアミノ酸配列１〜４０９で定義される蛋白質をコードする図２のＤＮＡ配列１５１〜１３７６、ｆ）図７のアミノ酸配列１〜４７４で定義される蛋白質をコードする図２のＤＮＡ配列１５１〜１５７４、ｇ）図７のアミノ酸配列２７９〜３４１によって定義される蛋白質をコードする図２のＤＮＡ配列９８６〜１１７２、ｈ）ｆｆ１７のアミノ酸配列２７９〜４０９によって定義される蛋白質をコードする図２のＤＮＡ配列９８６〜１３７６、ｉ）図７のアミノ酸配列２７９〜４７４によって定義される蛋白質をコードする図２のＤＮＡ配列９８６〜１５７４、ｊ）図７のアミノ酸配列３４２〜４０９によって定義される蛋白質をコードする図２のＤＮＡ配列１１７３〜１３７６、ｋ）図７のアミノ酸配列３４２〜４７４によって定義される蛋白質をコードする図２のＤＮＡ配列１１７３〜１５７４である。

本発明の蛋白質の重要な機能は、ａ）経口投与に対する適性、ｂ）特定の胆汁酸塩による活性化、Ｃ）小腸の内容物中における非特異的リパーゼとしての作用。その化学的構造および物理的状態（乳化、ミセル化、可溶性）に比較的無関係に脂質を加水分解する能力、ｄ）様々な鎖長および様々な不飽和度の脂肪酸を有するトリアジルグリセロールの加水分解能、ｅ）　ジアシルグリセロール、モノアシルグリセローノペコレステリルエステル、リゾホスファチジルアシルグリセロール、ならびにレチニルおよび他の脂溶性ビタミンエステルをも加水分解する能力、ｆ）トリアジルグリセロールにおける５ｎ−１（３）エステル結合のみでなく　、　５ｎ−２エステル結合も加水分解する能力、ｇ）−次胆汁酸塩のみでなく二次胆汁酸塩とも相互作用する能力、ｈ）至適活性の胆汁酸塩に対する依存性、ｉ）胃内容物はその触媒効率に実質的な程度は作用しない安定性、ｊ）胆汁酸塩が存在する限り、膵臓プロテアーゼたとえばトリプシンによる不活性化に対する安定性、ｋ）ヘパリンおよびヘパリン誘導体たとえばヘパリン硫酸への結合能、 ■）脂質〜水界面への結合能、ｍ）　凍結乾燥が可能な安定性、ｎ）人乳または調合孔のような食品成分と混合した場合の安定性である。

補給、置換または治療に必須の機能は、上述のａ）、Ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｉ）、ｊ）およびｌ）である。他の目的においては必須機能のすべては必ずしも必要ではない。

上述の蛋白質の発現には、上述の適当なりＮＡ配列を適当なベクター中に挿入し、ついでこれを適当な宿主生物に導入する。上記ベクターはまた、所望の蛋白質を生物が発現できるように、適当なシグナルおよび他の配列を含有しなければならない。

適当な発現生物体：組換えＤＮＡ技術によれば、様々な原核および真核宿主生物体中に興味ある蛋白質をクローニングして発現させることができる。使用可能な発現生物体は、バクテリア、単純真核生物（酵母）、動物培養細胞、昆虫培養細胞、植物培養細胞、植物およびトランスジェニック動物がある。それぞれの各県にはそれ自体に特有の利点と欠点がある。率直な結論としては、発現される各遺伝子は独特の問題点があって、標準的な解決法があるわけではない。

一般に使用されるバクテリア系はＥ、　Ｃｏ１１．　ＢａｃｉｌｌｕｓＳｕｂｔｉｌｉｓ、　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓである。一般に使用される酵母は５ａｃｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓおよびＰＬｃｈｉａ　Ｐａ５ｔｏｒｉｓである。一般に使用される動物細胞はＣＩＯ細胞およびＣＯ３細胞である。一般に使用される昆虫培養細胞はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来の細胞である。一般に使用される植物はタバコ植物である。使用できるトランスジェニック動物にはヤギおよびウシがある。

使用できるバクテリアベクターの例にはｐＵＣおよびプロティンＡ−ベクターがある。使用できる酵母ベクターの例にはｐＭ＾　９１がある。使用できる昆虫ベクターはＢａｃｕｌｏ−ウィルスから誘導される。使用できる動物細胞ベクターはＳＶ／　４０から誘導される。使用できる植物ベクターはＴｉ−リブラスミドから誘導される。いずれの系でも、天然および合成の両プロモーターおよびターミネータ−が使用できる。

発現系の選択に応じて、発現される蛋白質は、付加的なＮ末端アミノ酸（メチオニン）を含有し、数個の余分のアミノ酸を含有し、また異種蛋白質（たとえばプロティンＡ）に融合し、また天然に存在する蛋白質とはグリコレ−ジョンに関して異なる場合があることを理解すべきである。さらに、ベクターには、蛋白質を周辺質または培養培地に放出させるためにシグナル配列を含有させることもできる。

したがって、本発明は他の態様として、ａ）上に特定した蛋白質をコードするＤＮＡ配列からなるベクター、ｂ）上に特定したＤＮＡ配列からなる宿主生物体、Ｃ）上記ａ）に特定したベクターを含有する宿主生物体を増殖させ、その蛋白質を単離することによる、上に特定した蛋白質の製造方法を包含する。

製造方法は、引用文献６の記載のように、使用された発現系（たとえばプロティンＡ／ＴｇＧ）および／または天然に存在する酵素の精製に用いられた方法に基づくものである。

本発明のさらに他の態様は、一上に特定した蛋白質からなる医薬組成物、−外分泌膵不全に関連した病態の治療用医薬の製造のための上に特定した蛋白質の使用、 −嚢胞性線維症の治療用医薬の製造のための上に特定した蛋白質の使用、一小児用調合食品への添加物としての上に特定した蛋白質の使用、一慢性膵炎の治療用医薬の製造のための上に特定した蛋白質の使用、一任意の病因による脂肪吸収不全の治療用医薬の製造のための上に特定した蛋白質の使用、 −脂溶性ビタミンの吸収不全の治療用医薬の製造のための上に特定した蛋白質の使用、一生理的理由によるたとえば新生児における脂肪吸収不全の治療用医薬の製造のための上に特定した蛋白質の使用である。

図２の位置１５１から位置２３１６を含めてまでのＤＮＡ配列は全蛋白質をコードする配列である。位置２３１７から位置２４１５を含めてまでの配列は蛋白質には翻訳されないが、以下の表２に示すエキソンｄに包含される。

本発明の一実施態様においては、上記ａ）〜ｉ）の各項に定義された蛋白質が単離型および／または実質的に純粋な型で提供される。

上記ａ）〜ｋ）の各項に定義されたＤＮＡ配列は、本発明の一実施態様において、単離型および／または実質的に純粋な型で提供される。

ａａ、アミノ酸、　ｂｐ、塩基対；　Ｂ５５Ｌ、胆汁酸塩刺激リパーゼ：Ｃ−へＭＰ、環状アデノシンモノホスフェート、　ＣＥＨ。

カルボン酸エステルヒドロラーゼ；Ｄａ、ダルトン；Ｃ’ＧＴＰ、７−ジアザ− ２−ブオキシグアノシン５′トリホスフエートｒ　ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸、　ｋｂ、キロベース；　ＭＯＰＳ、３−　Ｎ　−４ルホリノーブロバンスルホン酸；　ｎｔ、ヌクレオチド；　ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、　ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；　ＳＳＣ，ＮａＣｌクエン酸塩、　ｘＧａｌ、　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド。

酵素胆汁酸塩刺激リパーゼＥＣ３，１，１，３カルボン酸エステルヒドロラーゼＥＣ３，１，１，１材料および方法Ａ、　酵素および抗体の調製Ｂ５５Ｌはすでに記載された方法により〔６〕、ヒト乳汁から精製した。抗体産生に使用する場合には、酵素５Ｏ３−ＰＡＧＥでさらに精製した。リパーゼに相当する蛋白バンドは、クーマシーブリリアントブルーで染色後に、ゲルから電気溶出した。精製酵素２５ａｙを等容量のフロイント完全アジュバントとともに、最初のｉ、ｃ、注射に使用し、同量の酵素と不完全アジュバントを以後の１月おきのブースター注射に使用した。各ブースター投与から約２週後にウサギから採血して血清を調製し、−２０℃で保存した。

Ｂ、）リブシン分解フラグメントの調製およびアミノ酸配列分析精製Ｂ５５Ｌ　３冨すを１１の、６Ｍグアニジニウム塩酸塩および２ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ緩衝液、ｐＨ８，５ｉ：溶解した。３７℃で２時間インキュベートしたのち、５０ｍＭヨードアセテート３００μｌを加えた。暗所、２５℃で９０分間インキュベートしたのち、還元され、カルボキシメチル化された酵素を、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム平衡化５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ −２５カラム上で脱塩した。トシル−し−フェニルアラニンクロロメタン処理ウシトリプシン（ｌｌｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｓｙｓｔｅｍ　Ｉｎｃ、、　Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、　ＮＪ。

ＵＳＡ）３０μ９を加えたのち、凍結乾燥した。凍結乾燥蛋白質を４冨ｌの０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムに溶解し、さらに９０μ９のトリプシンを添加した。

３７℃で５時間インキュベートしたのち、蛋白質を再び凍結乾燥した。トリプシン消化物を０．１％トリフルオロ酢酸（２ｓｇ／ｉ＋／）に溶解した。

トリプシン処理Ｂ５５Ｌ　３００μすをＣ−１８逆相カラムを用い、０．１％トリフルオロ酢酸中０〜５ｏ％アセトニトリルの勾配で溶出するＨＰＬＣでクロマトグラフィーに付した。ペプチドの収集は２１５ｎｍｌこおける吸収の連続記録によってモニタリングした。配列決定するペプチドは同一カラムと調整勾配を用いる再クロマトグラフィーによってさらに精製した。配列決定するペプチドフラグメントのサンプルは窒素下に乾燥してアセトニトリルを除き、シクエンサーに適用した。Ｎ末端配列分析のためには、ネイティブなりＳＳＬを０．１％酢酸に溶解した。配列分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、の４７７Ａ型パルス液相シクエンサーおよびオンラインＰＴＨ１２０Ａアナライザーにより、製造業者からの標準サイクルプログラムおよび化学試薬を用いて実施した。配列決定標準蛋白、β−ラクトグロブリンから計算し、た初期および反復収率はそれぞれ４７および９７％であった。

Ｃ，ＲＮＡの単離ヒト膵臓アジポースおよび授乳中の乳腺組織は外科的に採取し、直ちにグアニジニウムチオシアネート（５０＊１中１〜５ｇ）中に入れた。総ＲＮＡはＣｈｉｒｇｖｆｎの記載〔２ｏ〕ニ従って抽出した。ポリ（Ａ）　−ＲＮＡはオリゴーデオキシチミジレートー（オリゴ（ＤＴ））−セルロースカラム上クロマトグラフィーによって調製した〔２１〕。

Ｄ、ｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクリーニングヒト膵臓からのポリアデニル化ＲＮＡ約１５μ９を水酸化メチル水銀で変性し〔２２〕、オリゴ（ｄＴ）　１□〜１８プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）でプライミングし、標準操作〔２３〕を用いて逆転写した。第二の鎖の合成は、ＤＮＡリガーゼとβ−ＮＡＤを省略し、反応温度は１５℃にセットしたほかは、Ｇｕｂｌｅｒ　＆　ｔ！ｏｆｆｍａｎ［２４］に従ッテ実施した。過剰のＲＮＡをＲＮアーゼＡ（５０μｇ／厘Ｉりで消化し、二本鎖ｃＤＮ＾はＥｃｏＲＩメチラーゼで処理した〔２５〕。末端はフレノウ酵素でプラント化した。ＥｃｏＲＩリンカ−へのリゲーンａンおよびＥｃｏＲＩでの切断後、ｃＤＮＡを５ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｃｌカラム上で分画化した。空隙容量分画をエタノールで沈殿させ、ｃＤＮＡをホスファターゼ処理ｇｔｌｌベクターのＥｃｏＲＩ部位にリゲートさせた〔２６〕。ｉｎ　ｖｉｔｒｏバッキングにより７　Ｘ　１０’個以上の組換え体が生成した。

妊娠８力月の女性より得た組織由来のヒト乳腺からのｃＤＮ＾ライブラリーはＣ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、（Ｐａｌ。

Ａｌｔｏ、　ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。

ｃＤＮＡライブラリーからのファージを１２０−ａｍディツシュあたり５Ｘ１０ ’プラ一ク形成単位の割合でブレーティングした。抗血清は１：３２００の比に希釈し、Ｙｏｕｎｇ　＆Ｄａｖｉ、５（２７）の方法に従ってスクリーニングを実施した。

第二の抗体としてはアルカリホスファターゼ接合ヤギ−抗ウサギ抗体を使用した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ、　ＵＳＡ）。

ｍＲＮＡの５′末端に相当するクローンの単離には、免疫陽性クローンの一つからのサブクローン化フラグメントをプローブとして用い、標準条件下に〔２３〕核酸ハイブリダイゼーシゴンを行った。

Ｅ、ＲＮＡ分析電気泳動は、グリオキザールおよびジメチルスルホキシドによる変性後、４ｈＭ　ＭＯＰＳ緩衝液ａｌ１７．０中１％アガロースゲルを用いて実施した〔２８〕。グリオキザール化総ＲＮ＾をついでニトロセルロース濾紙に移した〔２９〕。

プロットはオリゴ標識法〔３０〕で標識したＢ５５ＬおよびＣＥＢ組換え体のサブクローンで検出した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは５０％ホルムアミド中４６℃で行った〔２３〕。ハイブリダイゼーション後の洗浄は高緊縮条件（０，１％ＳＤＳおよび０．１　ｘ　ＳＳＣ，６０℃）で実施した（　１　ｘｓｓｃ、　０．１．５Ｍ　ＮａＣＡ’、　０．００＋、５Ｍクエン酸三ナトリウム、　ｐＨ７，６）。

Ｆ、　ヌクレオチド配列Ｂ５５ＬおよびＣＥＨ組換え体からのｃＤＮＡ挿入体は超音波処理およびサイズ分割後直接Ｍ　３　ｍｐ１８およびａｐ１９にクローン化するか、その一部はＰｓｔ　Ｉ　、　ＢｓｔＸＩ、　Ｎａｒ　Ｉ　、Ｓｍａ　Ｉおよび＾ｈａｌＩで消化したのちさらにｐＴＺ１９Ｒ中にサブクローン化した。ヌクレオチド配列はジデオキシチェーンターミネーション法〔３１〕で決定した。ＧＣに富むリピート（下記参照）の配列もＴａｑ　Ｉポリメラーゼおよびｄｃ”ＧＴＰを用いて決定した。両鏡について配列を決定した。配列情報はオートラジオグラムから、ＳｊＱｂｅｒｇら〔５５〕によって報告されたソフトウェア、ＭＳ−ＥｄＳｅｑを用いて検索した。

Ｇ、　アミノ酸配列の予測とホモロジーｃＤＮＡ挿入体の相当するアミノ酸配列を予測するためには、各読み取り枠のコドン利用を５ｔａｄｅｎに従って比較し、一つの読み取り枠を与えた〔３２〕。ホモロジーはＵＷＧＣＧ　ソフトウェアパッケージのプログラムを用いて調べた〔３３〕。

結果および考察Ａ、Ｂ５５Ｌのトリプシン分解フラグメントおよびＮ末端の配列精製Ｂ５５Ｌのトリプシン消化では、１ｌＰＬｃ−クロマトグラフィ一時に得られたピーク数（図１）から判断して、約５０個のフラグメントが生成した。ピークを集め、高い精製状態で十分な量が単離できた指定のピークについて、配列決定を行った。得られた配列を表１に示す。さらに、３０個の大部分のＮ末端残基について配列を決定しく図２）、ＡｂｏｕａｋＨら〔１７〕によって以前に報告されている配列（３０残基）が確認された。

ｒａｎｇ　＆Ｊｏｈｎｓｏｎ［３４）によって報告された２２残基長のＮ末端配列は、我々の記録ではグリシンであり、ｆａｎｇ　＆Ｊｏｈｎｓｏｎの記録ではリジンである。

Ｂ、Ｂ５５Ｌのヌクレオチド配列 λｇｔｌｌ　ｃＤＮ＾ライブラリーの構築にはヒト膵臓からのポリアデニル化ＲＮ＾を使用した。最初に４個の免疫陽性クローンが単離され、ついでこの膵臓発現ｃＤＮ＾ライブラリーをＢ５５Ｌに対する抗血清でスクリーニングした。４個のクローンのヌクレオチド配列のヌクレオチド配列分析から、それらは完全に一致し、閣ＲＮ＾の３′末端に相当することが明らかにされた。それらはすべてポリＡテールに始まり、長さのみが相違する。最長の挿入体は＾ＣＥＨと命名され、９９６ｂｐに及ぶ。

ヒト乳腺からのｃＤＮＡライブラリーは、抗血清により、また膵臓クローン＾ＣＥＨをプローブとしてスクリーニングした。両スクリーニングから陽性クローンが単離され、それらはすべて３′末端に由来する。最長の乳腺クローンはＡＢＳＳＬと命名され、２１００ｂｐ上流に達する。それは４個の配列決定されたトリプシン分解フラグメントを含有する（図２）が、Ｎ末端アミノ酸配列は包含されていない。

配列を翻訳開始部を越えて延長するために、ＡＢＳＳＬの５′最近位部から誘導された１１８塩基長のプローブで乳腺ｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングした。さらに３２８ヌクレオチド上流を接続する１個のクローンが単離された。

それはＮ末端アミノ酸配列に合致し、残りのトリプシン分解フラグメントを含有する。図２に示すように、ｃＤＮＡは２４２８ヌクレオチド長で、最初の＾ＴＧコドンから８１塩基上流を含有する。ポリアデニル化シグナルの＾ＡＴ＾＾＾はポリＡテールから１３ヌクレオチド上流に位置し、ターミネーシコンコドンＴＡＧはヌクレオチド２３１７に見出され、続いて１１２ｂ９の３′非翻訳領域が続いた。３３塩基の１６リビートからなるＧＣに富んだ領域は塩基１７５６と２２８３の間の配列の３′末端に見出された。図３に示すヌクレオチド配列の反復は、数回の重複後に生じたと考えられる様々な数の置換をもつ１０個の反復によって囲まれた６個の同一の反復から構成される装置換数が低いことはこれらの反復が進化の後期に現れたものであることを示唆している。

Ｃ１発現の組織分布授乳中のヒト乳腺、膵臓、脂肪組織からおよびヒト肝癌細胞系（ＨｅｐＧ２）からのＲＮＡをノザンブロッティングで分析した。メツセンジャーのサイズはζ授乳中乳腺および膵臓のいずれにおいても、約２．５ｋｂと測定された。

ＢｅｐＧ２または脂肪組織から抽出されたＲＮＡのレーンにはシグナルは検出できなかった（図４）。乳腺ライブラリーに使用したｍＲＮＡは妊娠８力月の女性から得られたので、これは分娩前におけるＢ５５Ｌの分泌の従前の所見〔３５〕に一致して、Ｂ５５Ｌ遺伝子の転写および多分翻訳は分娩前に始まっていたことが明白である。図４参照。

Ｄ、Ｂ５５Ｌのアミノ酸配列５Ｏ３−ＰＡＧＥで評価して分子量は１０７〜１２５ｋＤａ（８、３６３、分析超遠心によって１０５ｋＤａ（３７）と報告されている。ｃＤＮＡから帰納された酵素は７２２個のアミノ酸残基からなり（図２）、分子量は７６、２７１Ｄａとなるが、これはこの酵素が少なくとも１５〜２０％の炭水化物を含むことを示している。

リーダー配列は２３残基長である。活性部位と考えられるセリン残基はセリン− ２１７に位置する（図５）。このセリンの周囲の配列はセリンヒドロラーゼのコンセンサス活性部位配列〔３８〕に合翠する。最近、活性部位セリンの近傍に見出される塩基性残基がリパーゼによるアシルグリセロールのエステル結合の切断に関与する可能性が提案されている〔３９〕。Ｂ５５Ｌにはこのような残基が存在しないことは興味深い。Ｎ−グリコジル化部位と考えられるものはセリンから７つの残基にただ１個あるにすぎない。

グリコジル化の程度（６，１６）はこの酵素が〇一連結炭水化物を含むことを示唆している。このようなグリコジル化が起こりつる部位は多数ある。精製酵素に基づくアミノ酸組成はプロリン残基の高含量を示している〔６〕。

ｃＤＮＡから得られたアミノ酸配列でもこれが確認されている。しかもプロリン残基の大部分は、この酵素のＣ末端側の半分の主要部を構成する各１１残基の１６個のリピート中に存在する。

Ｅ、　乳腺（ＢＳＳＬ）および膵臓（ＣＥＨ）における酵素の比較ヒト乳汁のＢ５５Ｌおよびヒト膵ＣＥ■は以前に、同一ではないにしても類似していることが示されている。このデータは、この２つの酵素が同じ遺伝子の産物であることを強く示唆するものである。ｃＤＮ＾クローンのヌクレオチド配列は、膵臓クローン八ＣＥＨが乳腺クローン＾Ｂ５５Ｌと、ポリＡテールから５′末端方向に９９６塩基が同一であることを示していて、ここにはプロリンに富んだリピートが含まれている。膵臓および授乳中乳腺からのＲＮＡのノザンプロットでは２．５ｋｂの単一のバンドが得られた（図４）。

ゲノムのサザンプロットによりさらに、ただ１つの遺伝子がＢ５５ＬおよびＣＥＦＩをコードしているとの考え方を支持している。５ＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＢ５５ＬとＣＥｆｌの移動度の差は、グリコシレージョンの差またはスプライシングの差の結果として説明できる。

Ｂ５５Ｌのラットおよびウシ酵素に対する類似性（下記参照）およびゲノムのプロットからの結果の類似性は、スプライシングの差で移動度の差を説明できる可能性を支持しない。Ｃ末端配列は蛋白質のレベルで確認されていないことから、Ｃ末端における蛋白分解によってＣＥＨがプロセッシングを受けている可能性も小さいように思われる。

我々の知る限りでは、明らかにＣＥＨに相当する膵臓酵素は多くの場合、種およびそれぞれの活性の測定に用いられた特定の基質に因んで命名されてきた。たとえば、リゾホスホリパーゼ、コレステリルエステラーゼ、ステロールエステルヒドロラーゼ、非特異的リパーゼ、カルボン酸エステルリパーゼおよびコレステリルエステルヒドロラーゼのようにである。現存のデータは、これらの記述された活性のすべてが一つの同じ機能実体に由来するとの考え方と矛盾しないＣ４２，４３］。これは、広い基質特異性とそれらの非特異的リパーゼとしての命名の関係によ７て例示される。ヒ１−ＢＳＳＬ／ＣＥＩＩの配列をラット膵臓からのりゾホスホリバーゼ〔４０〕およびウシ膵臓からのコレステロールエステラーゼ〔４１〕の配列と比較すると、Ｎ末端から約５３０残基に及ぶ広範囲の類似性が認められる（図５）が、リピートが生じる分子部分ではそれらは異なっている。ラット酵素は４個のリピートしかもたないし、ウシの場合は３個しかない。従って、ヒト酵素はもつとかなり長いペプチドである。

さらに、Ｂ５５Ｌと多数の典型的なエステラーゼ、たとえばヒトおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａを含めた数種からのアセチルコリンエステラーゼ、ならびにカルボキシルエステラーゼの間には著しい類似性が見出された（図６）。これらの類似性は、活性部位候補のセリン残基を含めたＢ５５ＬのＮ末端３００残基に限定されていた。アセチルコリンエステラーゼに対する類似性は、Ｂ５５Ｌが典型的なコリンエステラーゼインヒビターによって阻害される事実から予想されていた（６．８．１６）。多分ラット肝カルボキシルエステラーゼの場合の例外〔４５〕を除いて、これらの類似酵素のどれにもＢ５５Ｌと同じ胆汁酸塩依存性をもつことは示されていない。これはこの性質の構造的基盤はその蛋白質のＣ末端部分にあることを示唆している。しかも、Ｂ５５Ｌは乳化された基質を効率的に攻撃することが可能で、これは類似のエステラーゼには知られていない性質である。この活性には胆汁酸塩は先行条件として欠（ことができない。

ヒトＢ５５Ｌについて予測された配列が、性質がよく解っている他の哺乳動物のリパーゼと比較された。活性部位セリンの周囲のコンセンサス配列（Ｇ−Ｘ−３ −Ｘ−Ｇ）を除いて、他の明白な類似性は認められなかった〔４４〕。

他の酵素との類似性に加えて、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍからの１種のＣＡＭＰ依存性プロティン［４６］ならびに数種からのサイログロブリン（図６）［４７〜４９〕に対する有意な類似性もみられる。活性部位領域を包含するが活性部位自体ではないＢ５５Ｌとサイログロブリンの間の類似性は、これらの高度に保存されたアミノ酸領域は、エステラーゼの酵素活性の単なる支持ではなく、もっと一般的な重要性にかかっていることを示している。

結論として、ヒト乳汁Ｂ５５Ｌは７２２個のアミノ酸残基から構成される。これまでに得られたデータは、そのペプチド鎖が膵臓のＣＥＨの場合と同一であり、それらは同一の遺伝子によってコードされていることを示している。

最も強力な証拠は、それらの３′末末端ヌクレオチド列およびそれらのＮ末端アミノ酸配列が同一なことである。

ラット膵臓リゾホスホリパーゼとウシ膵臓コレステロールエステラーゼの間の顕著なホモロジーは、これらの酵素も機能的に同一であるとの仮説を支持する。しかしながら、これまで示唆されてきたように、種の間に認められる分子サイズの差は単にグリコジル化の差によるものではなく、１１個のアミノ酸リピートの数の変動を反映するものである。これらのエステラーゼの間の活性部位配列の類似性は、これらの蛋白質が共通の祖先遺伝子に由来するものであることを示唆する。

以下に図１〜７について説明する。

図１　：　Ｂ５５Ｌのトリプシン消化物のｌ’１ＰＬｃによる分離材料および方法の項に記載したようにして、精製Ｂ５５Ｌをトリプシンで処理し、■ＰＬｃ上クロマトグラフィーに付した。指示したピークを集め、再クロマトグラフィーによってさらに精製し、それらのアミノ酸配列を決定した。

ｃＤＮＡは２４２８塩基長である。ＡＴＧに始まるＮ末端２３コドンの配列（ｎｔ　８２〜１５０）は、成熟蛋白質のＮ末端アミノ酸配列がコドン２４（ｎｔ　１５１　Ａｌａ）に始まることから、リーダーペプチドと解釈される。リーダーペプチドには下線を付す。＊の印はエキソンの開始点を示す。＃の印は反復部分の開始点を示す。

置換は＊印によって示す。

図４：ノザンブロットハイブリダイゼーションヒトの授乳中乳腺、膵臓、脂肪組織およびヒト肝癌細胞系（ＨｅｐＧ２）から単離された総ＲＮＡのノザンプロット分析。授乳中乳腺（レーンＡ）、膵臓（レーンＢ）、脂肪組織（レーンＣ）およびＨｅｐＧ２　（レーンＤ）からの総ＲＮＡ（１ｈ９）を、１Ｍグリオキザール、５０％ジメチルスルホキシドおよび４０ｍＭ　ＭＯＰＳ中でｌ？ＮＡを変性したのち、４０ｍＭＭ０ＰＳ緩衝液ｐｆ１７．０中１％アガロースゲルで電気泳動した。

グリオキザール化１？ＮＡをついでニトロセルロース濾紙に移し、（３２ｐ）標識Ｂ５５Ｌ　ｃＤＮＡ（ＡＢＳＳＬ）とハイブリダイズさく　Ｒａｔ　１　ｐｉ）　［４０）およびウシ膵臓コレステロールエステラーゼ（Ｂｏｖｃｅｈ）　（４１〕からの推定アミノ酸配列の比較活性部位に包含されるセリン残基は＊印で示し、＃印はその蛋白質の単一の可能性あるＮ−グリコシレージョンシグナルを示す。アミノ酸配列の直接リピートは箱で囲む。マツチした配列は大文字で、２種の酵素間でマツチした配列は小文字で、ミスマツチは点で示す。

図５　：　Ｂ５５Ｌと、他のエステラーゼ、サイログロブリンおよびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕａ＋　ｄｉｓｃｏｔｄｅｕｍからの１種のｃＡＭＰ依存性酵素の一次構造の比較Ｂ５５Ｌ　：ヒトからの胆汁酸塩刺激リパーゼ、Ｃｈｅｓｈｕｍ　：ヒト胎児組織からのコリンエステラーゼ（５０１、Ｔｏｒｐａｃｅ：Ｔｏｒｐｅｄｏ　ｍａｒｍｏｒａｔａからのアセチルコリンエステラーゼ〔５］〕、Ｄｒｏｓｃｅｈ　：　Ｄｒｏｓｏｐｌｉｉｌａ　ｍｅｌａｏｇａｓｔｅｒからのカルボン酸エステルヒドロラーゼ〔５２〕、Ｉ？ａｔｌｉｖｃｅ　：ラット肝がらのカルボキシルエステラーゼ〔５３〕、Ｄｒｏｓａｃｅ　：　Ｄｒｏｓｏ−ｐｈＨａ　ｍｅｌａｏｇａｓｔｅｒからのアセチルコリンエステラーゼ〔５４〕、ＴｈｙｒｈｕＩｌｌ：ヒトからのサイログロブリン〔４９〕、およびＤｉｃｔ、　Ｄｉ　：　Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕａ＋　ｄｆｓｃｏｉｄｅｕｍからのｃＡＭＰ依存性酵素〔４６〕。酵素間で類似性を示す７つの異なるドメインがある。同一の残基は箱で囲む。コンセンサス配列中の小文字は１つを除き他の全酵素間で同一の残基を示す。点はミスマツチを示す。活性部位に含まれるセリン残基は＊印で示す。右隅の図はドメインの配置の仕方を全蛋白質のアミノ酸配列１〜７２２（−文字コード）を掲げ、エキソンａ１ｂ１ｃおよびｄを示す。＃印は反復部分の開始点を示している。

表　１ＢＳＳＬペプチドのアミノ酸配列干渉ピークにより、ペプチド番号２６の場合は、配列決定のサイクル１および２における残基の明確な同定はできなかった。ペプチド番号は図１のピークを指す。

トリプシン分解フラグメントＴＰ１６　：　ＬｙｓＶａｌＴｈｒＧ１ｕＧ１ｕＡｓｐＰｈｅＴｙｒＬｙｓＴＰ２０　：　ＬｅｕＶａｌＳｅｒＧ１ｕＰｈｅＴｈｒ１１ｅＴｈｒＬｙｓＴＰ２４　：　ＴｈｒＴｙｒＡｌ、ａＴｙｒＬｅｕＰｈｅＳｅｒ■ｉｓＰｒｏＳｅｒＡｒｇＴＰ２６　：　ＰｈｅＡｓｐＶａｌＴｙｒＴｈｒＧｌｕＳｅｒＴｒｐＡｌａＧＩｎＡｓｐＰｒｏＳｅｒＧｌ　ｎＧ１ｕＡｓｎＬｙｓ表　２ａ９８６〜１１７２　２７９〜３４１ｂ　１１７３〜１３７６　３４２〜４０９Ｃ１３７７〜１５７４　４１０〜４７４ｄ　１５７５〜２４１５　４７５〜７２２全蛋白質　１５１〜２３１６　１〜７２２反復領域を除＜１５１〜１７５５　１〜５３５全蛋白質引用文献１、ＢＢｌｌｌｃｋｂｅｒ、　Ｌ、、　Ｘｎｇｑｕｉｓｔ、　Ｋ、Ａ、　ｇｔ　Ｈｅｒｎｅｌｌ、　Ｏ。

（１９８７）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２１７．３７−４１．。

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０ｉｉｖｅｃｒｏｎａ、１９８１．　Ｂ１１ｅ　ｓａｌｔ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　１ｉｐａｓｅｆｎ　ｈｕｍａｎ　ｍ１ｌｋ　ａｎｄ　１ｉｐｉｄ　ｄｆｇｅｓｔｉｏｎ　ｆｎ　ｔｈｅｎｅｏｎａｔａｌ　ｐｅｒｉｏｄ、　Ｉｎ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ−ｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　ｆｎ　１ｎｆａｎｃｙ、　Ｅ、　Ｌｅｂｅｎｔｈａｌ。

ｅｄｆｔｏｒ、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　４（ｉ５− ４７１゜５、Ｂｅｒｎｂｌｉｃｋ、　Ｓ、、　Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ、　Ｌ、＆　Ｈｅｒｎｅｌｌ、　０゜（１９９０）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　２２１−２２６（１９９０）。

６、Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ、　Ｌ、＆　Ｈｅｒｎｅｌｌ、　Ｏ，（１９８１）　Ｅｕｒ、　Ｊ。

ＢｉｏｃｈｅＩＩ＋１１６．２２１−２２５゜７、Ｈｅｒｎｅｌｌ、　０．　＆　Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ、　Ｌ、　（１９８２）　Ｐｅｄｉａｔｒ。

Ｒｅｓ、　１．６．８８２−８８５゜８、Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ、　Ｌ、　Ｌｏｍｂａｒｄｏ、　Ｄ、、　Ｈｅｒｎｅｌｌ、　Ｏ，、Ｇｕｙ。

０、＆　０１ｉｖｅｃｒｏｎａ、　Ｔ、（１９８１）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１３６．２８４＝２８８゜９、Ｆｒｅｄｒｉｋｚｏｎ、Ｂ、、ｌ１ｅｒｎｅｌｌ、０．、Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ、Ｌ、＆０１ｉｖｅｃｒｏｎａ、Ｔ、（１９７８）Ｐｅｄｉａｔｒ、Ｒｅｓ、１２．　１０４８−１０５２゜１．０．　ｌｆａｎｇ、Ｃ，−Ｓ、、Ｈａｒｔｓｕｃｋ、Ｊ、＾、＆　Ｄｏｖｎｓ、Ｄ、（１９８ｇ）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７．４８３４−４８４０゜１１、Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ、Ｌ、＆　Ｈｅｒｎｅｌｌ、０．（１９８３）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ。

１５７、　３３７−３４１゜１２、ＢｊＱｒｋｓｔｅｎ、Ｂ、、Ｂｕｒｍａｎ、Ｌ、Ｇ、、ｄｅＣｈａｔｅａｕ、Ｐ、。

Ｆｒｅｄｒｉｋｚｏｎ、Ｂ、、Ｇｏｔｈｅｆｏｒｓ、Ｌ、＆　Ｈｅｒｎｅｌｌ、Ｏ。

（１９８０）Ｂｒ、Ｗｅｄ、Ｊ、２０１，２６７−２７２゜１３、Ｂｒｕｅｔｏｎ、Ｍ、Ｊ、、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｈ，１１，、Ｂｒｏｗｎ、Ｇ、Ａ、。

＾ｂｌｉｔｔ、Ｌ、、Ｉｙａｎｇｋａｒａｎ、Ｎ、＆　１ｆｈａｒｔｏｎ　Ｂ、Ａ。

（１９７８）Ｇｕｔ　１９，９５−９８゜１４、Ｍｕｒｐｈｙ、Ｇ、１１．　＆　Ｓｉｇｎｅｒ、Ｅ、（１９７５）　Ｇｕｔ　１５．　１５１−１６３゜１５、Ｂｅｒｎｅｌｌ、０．、Ｓｔａｇｇｅｒｓ、Ｊ、Ｅ、＆　Ｃａｒｅｙ、ＬＣ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（１９９０）、２９：２０４１−２０５６゜１６、Ｌｏｍｂａｒｄｏ、Ｄ、、Ｇｕｙ、’　Ｏ，＆　Ｆｉｇａｒｅｌｌａ、Ｃ，（１９７８）Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　５２７．　１４２−１４９゜１７、Ａｂｏｕａｋｉｌ、Ｎ、、Ｒｏｇａｌｓｋａ、Ｅ、、Ｂｏｎｆｃｅｌ、Ｊ、＆−Ｌｏｍｂａｒｄｏ、Ｄ、（１９８８）　Ｂｆｏｃｈｉｍ、Ｂｊｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　９６１゜２９９−３０８゜１．８．Ｈｅｒｎｅｌｌ、Ｏ，、Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ、Ｌ、＆　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、Ｔ。

（１９８８）　ｉｎ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄＮｕｔｒｔｔｉｏｎ　ｉｎ　１ｎｆａｎｃｙ（Ｌｅｂｅｎｔｈａｌ、　Ｅ、編）　ｐｐ、　２０９−２１７．　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ０１９、Ｗａｎｇ、Ｃ，−Ｓ、（１９８８）　Ｂｔｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｗ。

１５５．９５０−９５５゜２０、Ｃｈｉｒｇｗｆｎ、Ｊ、１１．Ｐｒｚｙｂｙｌａ、Ａ、Ｅ、、ＭａｃＤｏｎａｌｄ　Ｒ，Ｊ。

＆　Ｒｕｔｔｅｒ、１１ｊ、（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１ｇ、５２９４−５２９９゜２１、＾ｖｉｖ、Ｈ，＆　Ｌｅｄｅｒ、Ｐ、（１９７９）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９．５２０１−５２０５゜２２、Ｂａ１ｌｅｙ、Ｊ、１１．　＆　Ｄａｖｉｄｓｏｎ、Ｎ、（１９７６）Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｔ　７０．　７５−８５゜２３．１ｌａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ。

（１９８２）：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｆｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｌ１ａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ０２４、Ｇｕｂｌｅｒ、Ｕ、＆　■ｏｆｆｍａｎ、Ｂ、Ｊ、（１９８３）Ｇｅｎｅ　２５゜２６３−２６９゜２５、Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、、Ｈａｌｄｉｓｏｎ、Ｒ，Ｃ，、Ｌａｃｙ、Ｅ、、Ｌａｕｅｒ。

Ｊ、、Ｏ’Ｃｏｎｅ１１．Ｃ，＆　Ｑｖｏｎ、Ｄ、（１９７８）Ｃｅｌｌ　１５゜６８７−７０１゜２６、Ｙｏｕｎｇ、Ｒ，Ａ、＆　Ｄａｖｉｓ、Ｒ，Ｗ、（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２２゜７７８−７８２゜２７、Ｙｏｕｒ＋ｇ、Ｒ，Ａ、＆　Ｄａｖｉｓ、Ｒ１１，（１９８３）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　８０．１１９４−１１９８゜２８、ＭｃＭａｓｔｅｒ、Ｇ、に、＆　Ｃｈａｒｍｉｃｈａｅｌ、Ｇ、Ｇ、（１９７７）　Ｐｒａｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、ＵＳＡ７４．　４８３５３−４８３５８゜２９、Ｔｈｏｍａｓ、ｐＨ９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　７７゜５２０１−５２０５゜３０、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、Ａ、Ｐ、＆　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ｂ、（１９８３）＾ｎａｌｙｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３２．６−１３゜３１、Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、＆　Ｃｏｕｌｓｏｎ、＾、　Ｒ，（１９７７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４．　５４６３−５４６７゜３２．５ｔａｄｅｎ、Ｒ，（１９８４）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２．５５１５６７゜３３、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ、、Ｈａｅｂｅｒｌｉ、Ｐ、＆　Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ、０゜（１９８４）　ＮｕｃＬ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２．　３８７−３９５゜３４、ｌｌａｎｇ、Ｃ，−Ｓ、＆　Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｌ（１９８３）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１３３、　４．５７−４６１゜３５、Ｈａｗｏｓｈ、Ｍ、（１９８６）ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｍｉｌｋ　ＩｎｆａｎｔＮｕｔｒｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉ？ｅａｌｔｈ（Ｈｏｙｅｌｌ、Ｒ，Ｒ，Ｍｏｒｒｉｓｓ、Ｆ、Ｈ。

＆　Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ、　Ｌ、ｌ［、編）　ｐｐ、　６６−９７．　Ｃｈａｒｌｅｓ、　Ｃ。

Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ。

３６、ｆａｎｇ、Ｃ，−３，（１９８０）Ａｎａｌ、Ｂｆｏｃｈｅ組　１０５．　３９８−４０２゜３７、ｌｌａｎｇ、Ｃ，−３＆　Ｌｅｅ、’　Ｄ、Ｍ、（１９８５）　Ｊ、Ｌｉｐｉｄ、Ｒｅｓ。

２６．８２４−８３０゜３ｇ、Ｂｒｅｎｎｅｒ、Ｓ、（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３４．　５２８− ５３０゜３９、Ｙａｎｇ、Ｃ，−Ｙ、、Ｇｕ、Ｚ、−買、、Ｙａｎｇ、Ｈ，−４１，、Ｒｏｈｄｅ、Ｍ。

Ｆ、、Ｇｏｔｔｏ、Ｊｒ、、Ａ、Ｍ、＆　Ｐｏｗｎａｌｌ、Ｈ，Ｊ、（１９８９）　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ　２６５．　１６８２２−１６８２７゜４０、Ｈａｎ、Ｊ、Ｂ、、Ｓｔｒａｔｏｗａ、Ｃ，、＆　Ｒｕｔｔｅｒ、ＷＪ、（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６．１６１７−１６２５゜４１、Ｋｙｇｅｒ、Ｅ、、ｌｉｅｇａｎｄ、Ｒ，、＆　Ｌａｎｇｅ、Ｌ、（１９８９）Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｗ　１６４．　１３０２−１３０９゜４２、Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ、Ｌ、（１９８１）　Ｆａｔ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｉｎ　ｎｅｗｂｏｒｎｉｎｆａｎｔ、Ｕｍｅａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ＤｆｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｓＮｅｗ　５ｅｒｔｅｓ　Ｎｏ　７１゜４３、Ｒｕｄｄ、Ｅ、Ａ、＆　Ｂｒｏｃｌａ＋ａｎ、Ｈ，Ｌ、（１９８４）　ｉｎ　Ｌｉｐａｓｅｓ（ＢｏｒｇｓｔｒＯｍ、　Ｂ　＆　Ｂｒｏｃｋｍａｎ、　ｔｌ、Ｌ、編）ｐｐ、　１８４−２０４゜Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ０４４、Ｍｉｃｋｅｌ、Ｓ、、Ｗｅｆｄｅｎｂａｃｈ、Ｆ、、Ｓｗａｒｏｖｓｋｙ、Ｂ、。

ＬａＦｏｒｇｅ、Ｓ、＆　５ｃｈｅｅｌｅ、Ｇ、（１９８９）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ。

２６４．１２８９５−１２９０１゜４５、Ｃａｍ＋＊ｕｌｌｉ、Ｅ、Ｄ、、Ｌｉｎｋｅ、ｋｌ−Ｊ、、Ｂｒｏｃｋｍａｎ、Ｂ、Ｌ、＆Ｈｕｔ、Ｄ、Ｙ、（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｉｓ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　１００５゜１７７−１８２゜４６、　蓋ａｎｎ、Ｓ、に、０．　＆　Ｆｉｒｔｅｌ、Ｒ，Ａ、（１９８７）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．　７．　４５８−４６９゜４７、Ｍｅｒｃｋｅｎ、Ｌ、、Ｓｉａ＋ｏｎｓ、Ｍ、Ｊ、、５ｗ１ｌｌｅｎｓ、Ｓ、。

Ｍａｓｓｅｒ、Ｍ、＆　Ｖａｓｓａｒｔ、Ｇ、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１６゜６４７−６５１゜４８、Ｌａｕｒｏ、Ｒ，，０ｂｉｃｉ、Ｓ、Ｃｏｎｄｌｉｆｆｅ、Ｄ、、［Ｊｒｓｉｎｉ、Ｖ。

Ｍ、、Ｍｕｓｔｉ、＾、、Ｍｏ５ｃａｔｅｌｌｉ、Ｃ，＆　Ａｖｖｅｄｉｍｅｎｔｏ。

Ｖ、Ｅ、（１９８５）　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４８．　７−１１゜４９、Ｍａｌｔｈｉｅｒｙ、Ｙ、＆　Ｌｉ５ｓｉｔｚｋｙ、Ｓ、（１９８７）Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６５．４９１−４９８゜５０、Ｐｒｏｄｙ、Ｃ，、Ｚｅｖｆｎ−Ｓｏｎｋｉｎ、Ｄ、、Ｇｎａｔｔ、＾、。

Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、０．、＆　５ｏｒｅｑ、Ｈ，（１９８７）Ｐｒｏｃ、ＮａｔＬ。

＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４．　３５５５−３５５９゜５１．５ｉｋｏｒａｖ、Ｊ−Ｌ、、［ｒｅｊｃｔ、Ｅ、＆　Ｍａｓｓｏｕｌｉｅ’、Ｊ。

（１９８７）ＥＩＢＯＪ、６．　１８６５−１８７３゜５２．０ａｋｅｓｈｏｔｔ、Ｊ、Ｇ、Ｃｏ１１ｅｔ、Ｃ，、Ｐｈ１ｌｌｉｓ、Ｒｊ、。

Ｎ１ｅｌｓｅｎ、Ｋ、１１．、Ｒｕ５ｓｅｌ、Ｒ，Ｊ、、Ｃａｍｂｅｒｓ、Ｇ、に、。

Ｒｏｓｓ、Ｖ、＆　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｒ，Ｃ，（１９８７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４．３３５９−３３６３゜５３、Ｌｏｎｇ、Ｒ，，５ａｔｈｏ、Ｈ，、Ｍａｒｔｉｎ、Ｂ、、Ｋｉａ＋ｕｒａ、Ｓ、。

Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｆ、＆　Ｐｏｈｌ、Ｌ、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ５ｔ　１５６．８６６−８７３゜５４、■ａｌｌ、Ｌ、Ｍ、Ｃ，＆　５ｐｉｅｒｅｒ、Ｐ、（１９８６）　ＥｉｌＢＯＪ、５゜２９４９−２９５４゜５５、ＳｊＱｂｅｒｇ、ｓ、＋　Ｃａｒｌｓｓｏｎ、Ｐ、、Ｅｎｅｒｂａｃｋ、Ｓ、、＆Ｂｊｕｒｓｅ１１．Ｇ、（１９８９）ＣＡＢＩＯ３５，４１−４６゜５６、ＥＰ−＾−３１．７３５５゜５７、Ｈｅｒｎｅｌｌ、Ｏ，、ａｎｄ　Ｔ、　０１ｉｖｅｃｒｏｎａ、１９７４．　ＨｕｍａｎＭＨｋ　１ｉｐａｓｅｓ　Ｈ，Ｂ１１ｅ　ｓａｌｔ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　１ｉｐａｓａ。

Ｂｉｏｃｈｉｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　３６９：２３４−２４４゜５ｇ、Ｈｅｒｎｅｌｌ、０．、Ｌ、Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ、ａｎｄ　Ｔ、０１ｉｖｅｃｒｏｎａ。

１９８１、Ｈｕｍａｎ　ｍ１ｌｋ　１ｉｐａｓａｓ、Ｉｎ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　ｉｎ　１ｎｆａｎｃｙ、Ｅ。

Ｌｅｂｅｎｔｈａｌ　ｉｉ　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、３４７−３５４゜５９、＾ｔｋｆｎｓｏｎ、Ｓ、Ａ、、Ｍ、Ｈ，Ｂｒｙａｎ、ａｎｄ　Ｇ、■、　＾ｎｄｅｒｓｓｏｎ。

１９８１、Ｈｕｍａｎ　ｍｆｌｋ　ｆｅｅｄｉｎｇ　ｉｎ　ｐｒｅｍａｔｕｒｅ　１ｎｆａｎｔｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ、　ｆａｔ　ａｎｄ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｂａｌａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅｆｆｒｓｔ　ｔｗｏ　ｗｅｅｋｓ　ｏｆ　１ｉｆｅ、Ｊ、Ｐｅｄｆａｔｒ、９９：６１７−６２４゜６０、Ｃｈａｐｐｅｌｌ、Ｊ、Ｅ、、Ｍ、Ｔ、Ｃ１ａｎｄｔｎｆｎ、Ｃ，ｉ［ｅａｒｎｅｙ−Ｖｏｌｐｅ、Ｂ、Ｒｅ１ｃｈｓａｎ　ａｎｄ　Ｐ、Ｗ、Ｓｗｙｅｒ、１９８６゜Ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｂａｌａｎｃｅ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ　ｐｒｅｍａｔｕｒｅｉｎｆａｎｔｓ　ｆｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｍ１ｌｋ　ｏｒ　ｆｏｒｍｕｌａ：　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆｃａｌｃｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｊ、Ｐｅｄｉａｔｒ、１０８：４３８−４４７゜６１、ｆｆｌｌｉａｍｓｏｎ、Ｓ、、Ｅ、Ｆｉｎｕｃａｎｅ、Ｈ，Ｅｌｌｉｓ、ａｎｄ　Ｈ，Ｒ。

Ｇａｍ５ｕ、１９７８．　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｅａｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｕｍａｎｍｉｌｋ　ｏｎ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ、ｆａｔ、ｓｏｄｉｕｍ。

ｃａｌｃｉｕｍ　ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｂｙ　ｐｒｅｔｅｒｍ　１ｎｆａｎｔｓ。

＾ｒｃｈ、Ｄｉｓ、Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ　５３：５５５−５６３゜アセトニトリル　％（−−−１べ　２１５・ｍにおける吸収（−）（ＴＧ　ＣＣＧ　ＣＣＣＡＣＧ　Ｇ７ｒ　ＧＡＣπ℃α℃α℃α：ｃ　ａｃｅ　ｃ’ｉ　ｃｃｃα：ＣＡ缶ＧＧｒ　２０７９αニスπテｎｕα：Ｃ：つコ℃ＡＡＴλ＜αｒ　ＣＡＴＡＣＣＣＣｒＡ　ＮいＡυＡＭ函Ｍ　２４２８置換数ＧＧＧＧＣＣＣＣＣＣＣＣｃＴＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＧＧＴＧＡＣＴＣＣコンセンサス配ダ１◇３．０ぐ１５、、セフｆ７．配列、、、、ｇｒ１．．．．１９１ｔＣＣ１ａａａａＭＫＬＧａＶＹＴＥＧＧＦＶＥＧＶＮ）ＣＭシＬＷ、ＤＳコンセンサス配列ＶＤＩＦＫＧ工ＰＦＡａ、、ＫａＬＥｎＰｑｒＨＰＧＷＱＧＴＬＸＡｋ、Ｆ’ＫＫＲＣＬＱＡＴｉＴＱＣ）ＳＴＹＧコンセンサス配列　、　ＥＤＣＬＹＬＮＩＷＶＰＱＧＲＫｑＶＳ　ｈ　ＤＬＰＶＭ　ｉ　Ｗ　ｒ　ＹＧＧＡ　Ｆ　ＬＭに　ｇｑｑＧＡＮ　Ｆ fＬ、　ＮＹ　ＬＹＤコンセンサス配列　Ｇ　ＫＫＩ　ＡＴＲ９ＮＶ　Ｘ　ＶＶＴ　ＦＮＹＲＶＧ　Ｐ　ＬＧ　ＦＬＳＴＧ　Ｄａ　Ｎ　ＬＰＧＮＹＧ　Ｌｌ”　Ｄp用４Ａ　Ｘ　Ａｋ ’ＶＫＲコンセンサス配列　Ｎ工ａＡＦＧＣＤＰＤＮ工ＴＬＦＧＥＳＡにＧＡｓＶＳＬＱＴＬＳＰＹＮＫ（：Ｌ工ｒＲａｒｓＱｓＧＶａＬｓＰコンセンサス配列　Ｗａ工Ｑ、ｎＰＬＦＷＡＫ、１ＡＫＫＶＧＣＰｖ、ＤｔａｋＭＡｇＣＩＫｉＴＤＰ部山ＴＬｊαｋｌＰＬ、ｓコンセンサス配列　、ＥＹＰ、１ＨＹ１．ＦｖＰＶｉＤＧＤＦ工ＰｄＤＰｉＮＬＹａ−ＮＡＡＤｉＤＹｉＡＧｔＮｄＭＤＧＨＩＦａ。

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国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．図７に示した位置１から位置７２２までの蛋白質。
２．図７に示した位置１から位置５３５までの蛋白質。
３．図７に示した位置１から位置２７８までの蛋白質。
４．図７に示した位置１から位置３４１までの蛋白質。
５．図７に示した位置１から位置４０９までの蛋白質。
６．図７に示した位置１から位置４７４までの蛋白質。
７．図７に示した位置１から位置２７８まで、位置２７９から位置３４１、位置２７９から位置４０９まで、位置２７９から位置４７４まで、位置３４２から位置４０９まで、位置３４２から位置４７４まで、または位置５３６から位置７２２までの蛋白質。
８．図５の反復配列１個または２個以上と組み合わせた請求項１〜７のいずれかに記載の蛋白質。
９．さらにＮ末端アミノ酸としてメチオニンを有する請求項１〜８のいずれかに記載の蛋白質。
１０．天然に存在する胆汁酸塩刺激リパーゼの必須機能の１または２以上を示す請求項１〜９のいずれかに記載の蛋白質。
１１．請求項１〜９のいずれかに記載の蛋白質の機能的均等変異体または突然変異体。
１２．請求項１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列。
１３．請求項２記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列。
１４．請求項３〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列。
１５．図２において以下のヌクレオチド番号：１５１〜２３１６１５１〜１７５５１５１〜９８５１５１〜１１７２１５１〜１３７６１５１〜１５７４９８６〜１１７２９８６〜１３７６９８６〜１５７４１１７３〜１３７６１１７３〜１５７４によって定義されるＤＮＡ配列。
１６．請求項１〜１１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列からなるベクター。
１７．請求項１２〜１５に記載のＤＮＡ配列からなるベクター。
１８．請求項１６または１７に記載のベクターで形質転換された宿主生物。
１９．請求項１６または１７に記載のベクターを含有する宿主生物を増殖させ、その蛋白質を単離することによる請求項１〜１１に記載の蛋白質の製造方法。
２０．請求項１〜１１のいずれかに記載の蛋白質からなる医薬組成物。
２１．請求項１〜１１のいずれかに記載の蛋白質をリパーゼまたはリパーゼ含有製剤と配合してなる医薬組成物。
２２．膵外分泌不全に関連する病的状態の治療用医薬を製造するための請求項１〜１１のいずれかに記載の蛋白質の使用。
２３．膵嚢胞性線維症の治療用医薬を製造するための請求項１〜１１のいずれかに記載の蛋白質の使用。
２４．小児用調合食品への添加物としての請求項１〜１１のいずれかに記載の蛋白質の使用。
２５．慢性膵炎の治療用医薬を製造するための請求項１〜１１のいずれかに記載の蛋白質の使用。
２６．脂肪吸収不全の治療用医薬の製造のための請求項１〜１１のいずれかに記載の蛋白質の使用。
２７．脂溶性ビタミン吸収不全の治療用医薬の製造のための請求項１〜１１のいずれかに記載の蛋白質の使用。
２８．生理学的原因による脂肪吸収不全の治療用医薬の製造のための請求項１〜Ｈのいずれかに記載の蛋白質の使用。
２９．１種もしくは２種以上のリパーゼまたは１種もしくは２種以上のリパーゼを含有する製剤と請求項１〜１１のいずれかに記載の蛋白質との配合物の請求項２２〜２８のいずれかに記載の使用。
３０．請求項１〜１１のいずれかに記載の蛋白質を補給した小児用調合食品。
３１．実質的に純粋な形態の請求項１〜１１記載の蛋白質。
３２．単離された形態の請求項１〜１１記載の蛋白質。
３３．実質的に純粋な形態の請求項１２〜１５記載のＤＮＡ配列。
３４．単離された形態の請求項１２〜１５記載のＤＮＡ配列。
３５．請求項１〜１１、３１または３２に記載の蛋白質を医薬的に許容される担体中に配合することによる請求項２０または２１に記載の医薬組成物の製造方法。
３６．経口投与用医薬組成物を製造する請求項３５記載の方法。
３７．小児用調合食品に請求項１〜１１、３１または３２に記載の蛋白質を補給することによる請求項３０記載の小児用調合食品の製造方法。