BG61165B1

BG61165B1 - Производни на човешка, стимулирана от жлъчните соли, липаза и фармацевтични състави на тяхна основа

Info

Publication number: BG61165B1
Application number: BG97123A
Authority: BG
Inventors: Gunnar Bjursell; Lars Blaeckberg; Peter Carlsson; Sven Enerbaeck; Olle Hernell; Jeanette Nilsson; Thomas Olivecrona
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1992-11-26
Publication date: 1997-01-31
Also published as: YU95191A; RU2140983C1; CN1326782A; IS1751B; PT97836A; EP0535048B1; AU651979B2; KR100212411B1; CN1075113C; EP0535048A1; TW221712B; NO924528D0; ZA913778B; DE69125489D1; SE9001985D0; DK0535048T3; SK164491A3; LT4020B; IE911844A1; HK62497A

Abstract

Изобретението се отнася до нова ДНК последователност, нови протеини, кодирани от нея, и тяхното приложение. Изобретението се отнася до вектори като плазмидни конструкции, съдържащи ДНК последователности, които са способни да експресират желания ензим, и до гостоприемников организъм, трансфектиран с тези конструкции, например бактерии, дрожди, клетки на бозайници и трансгенни организми. Изобретението се отнася и до метод за получаване на нови продукти. Новите протеини се отнасят до ензим, известен като стимулирана от жлъчните соли липаза.

Description

Човешката лактираща млечна жлеза синтезира и секретира с млякото стимулирана от жлъчните соли липаза / BSSL//1 /, така че след специфичното активиране от първичните жлъчни соли /2,57,58/, осигурява ендогенен капацитет за интестинално асимилиране на мазнините у кърмачетата /3-5/. Този ензим, който представлява приблизително 1 % от общия млечен протеин /6/, е неспецифична липаза; ин витро тя хидролизира не само три-, ди- и моноацилглицеролите, но също и холестерили ретинил естери и лизофосфатидилглицеролите /7-10/. Нещо повече, нейната активност не се ограничава до емулгиране на субстратите, но мицеларните и разтворими субстрати се хидролизират в еднаква степен /11/.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

BSSL не се разграждат при преминаването си с млякото през стомаха и дуоденалното пространство се предпазва чрез жлъчните соли от инактивация с панкреатични протеази като трипсин и химотрипсин /2,11/. Инактивира се обаче при пастьоризация на млякото, т.е. при нагряване до 62,5°С за 30 min /12/. Моделни експерименти ин витро водят до предположението, че крайните продукти от асимилирането на триацилглицерола са различни в присъствие на BSSL /5,7/. Благодарение на ниското съдържание на жлъчни соли в интралуминалното пространство по време на неонаталното развитие /13, 14/ това е може би полезно за протичане на абсорбцията на продукта /5,15/.

Карбоксилният естер на хидролизата /СЕН/ от човешки панкреатичен сок /16/ изглежда функционално идентичен или най-малкото много близък до BSSL /8/. Те също показват общи епитопи /8,17/, имат идентични N-крайни аминокиселинни последователности /17/ и се инхибират от инхибиторитс на ссрин естеразите, т.е. есерин и диизопропилфлуоро фосфат /6,8,16/. Предполага се, че двата ензима са продукти на един и същ ген /18,19/. Наблюдаваната разлика в молекулярния размер /8,19/ може да бъде обяснена с различните начини на гликозилиране, както се предполага напоследък /17/.

Хранителните липиди са важен източник на енергия. Богатите на енергия триацилглицероли осигуряват повече от 95% от тези липиди. Някои от липидите, т.е. мастните киселини и мастно разтворимите витамини, са важни хранителни съставки. Преди гастро-интестинална абсорбция на триацилглицеролите както и по-малкото компоненти, например естерифицирани мастно разтворими витамини и холестерол и диацилфосфатидилглицероли, изискват хидролиза на естерните връзки, за да се даде възможност на по-малко хидрофобните, абсорбтивни продукти. Тези реакции се катализират от специфичната група ензими, наричани липази.

Като есенциални липази за възрастните хора се считат гастрична липаза, панкреатична колипазазависима липаза /три- и диацилглицеролхидролиза/, панкреатична фосфолипаза А₂/ диацилфосфатидилглицероли и хидролазите на карбоксил естери/ холестерил и мастно разтворими естери на витамините/. У новородените кърмачета стимулираната от жлъчните соли липаза играе важна роля в хидролизата на някои от посочените по-горе липиди. Заедно с жлъчните соли продуктите от асимилацията на липиди образуват смесени мицели, от които се осъществява абсорбция /3-5/.

Обща причина за малабсорбция на липидите и следователно недохранване, са редуцираното ниво на панкреатична колипазазависима липаза и/или жлъчни соли. Типични примери за такава липазна недостатъчност са пациентите, страдащи от циститна фиброза, общо генетично разстройство с резултат доживотна недостатъчност за 80% от пациентите, или хронични панкреатити, често в резултат от хроничен алкохолизъм.

Панкреатичната и чернодробната функции не са напълно развити при раждането, в по-значителна степен при децата, родени преди термина. Мастната малабсорбция, по физиологични причини, е общо установена и е резултат от ниското съдържание на интралуминалната панкреатична колипазазависима липаза и концентрацията на жлъчните соли /3,4,133

15/. Въпреки това поради BSSL, такава малабсорбция е много по-рядко срещана у кърмачетата, отколкото у бебета, изхранвани с пастьоризирано човешко мляко /3-5,12,59,60,61/. Това е една от причините, поради която се защитава тезата, че новородените, и по-специално тези родени преди термина, които не могат да бъдат хранени от собствените им майки, следва да бъдат хранени с непастьоризирано мляко от други майки /12/.

Настоящото третиране на пациенти, страдащи от недостатъчност на пакреатична липаза, е орално въвеждане на много големи дози сурови свински панкреатични ензими. Колипазазависимата панкреатична липаза се инактивира при ниско pH. Такива условия съществуват в стомаха и в резултат на оралното приложение панкреатичната липаза е фактически напълно инактивирана при преминаване през стомаха към червата. Поради това, този ефект не може да бъде напълно избегнат чрез използване на големи дози ензим. Въведените големи дози са неподходящи за повечето пациенти, а препаратите не са пречистени и не са вкусни. Някои таблетки са изготвени с оглед да преминат през киселите области на стомаха и да освобождават ензима чак в относително алкална среда на йеюнума. Но много пациенти, страдащи от панкреатични разстройства имат нетипична киселинност на йеюнума и такива таблетки може да не освободят ензима и да са неефективни. Нещо повече, докато намиращите се понастоящем на пазара препарати са със животински произход, налице е риск от имунни реакции, които да причинят вреден ефект върху пациентите или редуциран терапевтичен ефект.

Друг недостатък на наличните препарати е, че съдържанието им на други липолитични активности, освен колипазазависима липаза, са непотвърдени. Фактически повечето от тях имат ниска степен на CEH/BSSL-активност. Това може би е една от причините, поради която много пациенти, страдащи от циститна фиброза, независимо от допълнителната терапия, страдат от недостиг на мастноразтворими витамини и есенциални мастни киселини.

Така, налице е голяма нужда от продукти със свойства и структура, получена от човешки липази и с широка субстратна специфичност, които да могат да бъдат въведени у пациентите, страдащи от недостиг на един или няколко от панкреатичните липолитични ензими. Продуктите на настоящото изобретение реализират тази нужда сами по себе си или в комбинация с други липази или в комбинация с продукти, съдържащи други липази. Още повече, за някои бебета е задължително да се подобри оползотворяването на мазнините от храната за бебета или от пастьоризирано човешко мляко от т.нар. млечни банки.

BSSL има някой уникални свойства, които го правят идеално подходящ за заместител или допълнителна терапия: конструиран е от природен източник за орално приложение, устойчив е при преминаване през стомаха и се активира в съдържимото на тънките черва. Този специфичен активационен механизъм следва да предпази от случайна липолиза на храната или на тъканните липиди по време на съхранение и преминаване до момента на действие. Благодарение на широката му субстратна специфичност има потенционалната възможност сам по себе си да медиира пълна асимилация на повечето хранителни липиди, включително мастно разтворими естери на витамини.

BSSL може да превъзхожда панкреатичната колипазазависима липаза при хидролиза на съдържащи дълговерижни полиненаситени мастни киселини естерни връзки. В присъствието на стомашна липаза и в отсъствието на или при ниски нива на колипазазависима липаза BSSL може да се установи пълно триглицеролна асимилация ин витро, дори ако нивото на жлъчните соли е ниско както при новородените бебета. В присъствието на BSSL крайните продукти от асимилацията на триглицероли са свободни мастни киселини и свободен глицерол вместо свободни мастни киселини и моноацилглицерол, образуван от другите две липази /5/. Това може да улесни абсорбцията на продуктите, по-специално когато интралуминалното ниво на жлъчните соли е ниското /3, 15/.

От историческа гледна точка формите, предназначени за кърмачета са претърпели развитие и са подобрени, от гледна точка на това, че техният състав следва да бъде аналогичен на човешкото мляко.

Използването като добавка, заместител или за терапия на стимулирани от жлъчните соли липази /BSSL/ или на протеини с есенциалните функции на BSSL изисква нараст4 ване на продуктите в широк обхват. Невъзможно е в промишлен мащаб да се разчита на природни ресурси като мляко като изходен материал. Освен посочените по-горе проблеми с инактивацията на BSSL по време на пастьоризацията, налице е допълнителен риск от замърсяване на материалите от природен източник с инфекциозни агенти като HIV и CMV вируси. Съобразно с това, налице е необходимост от широк обхват продукти, имащи BSSL свойства. Настоящото изобретение осигурява такива продукти и методи за тяхното получаване.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението се основава на клониране на сДНК, кодираща BSSL, получена от човешка млечна жлеза. Изолирана е също сДНК от човешки панкреас, кодираща СЕН. Изведените аминокиселинни последователности от човешка сДНК и сравняването им със СЕН от други последователности от други видове подкрепят интерпретацията, че BSSL и СЕН са идентични.

Както ще бъде обяснено по-подробно, изненадващо е установено, че структурата на протеина, както е изведена от сДНК последователността, е твърде различна от структурата на други липази. Структурата неочаквано показва аналогия със структурата на типичните естерази, такива като холинестеразата.

Съобразно с фигура 11 и фигура VII продуктите на изобретението са:

а) протеин, както е определен от аминокиселинна последователност 1-722 на фиг. VII;

Ь/ протеин, както е определен от аминокиселинна последователност 1-535 на фиг. VII;

с/ протеин, както е определен от аминокиселинна последователност 1-278 на фиг. VII;

d/ протеин, както е определен от аминокиселинна последователност 1-341 на фиг. VII;

е/ протеин, както е определен от аминокиселинна последователност 1-409 на фиг. VII;

f/ протеин, както е определен от аминокиселинна последователност 1-474 на фиг. VII;

g/ комбинации от протеини, определени по т. b-f, т.е. както са определени от аминокиселинна последователност в позиция 1278, 279-341, 279-409, 279-474, 342-409, 342474 и 536-722;

Ь/ комбинации от протеини, определени по т. b-g в комбинация с един или повече от повторените съгл. фиг. V;

i/ протеин, както е определен съгласно аh, има допълнителна N-крайна аминокиселина, а именно метионин и функционално еквивалентни варианти и мутанти на протеините, определени в a-i по-горе.

Следва да се отбележи, че протеините по т. a,b,c,d,e,f,h и i по-горе не са идентични във всяко едно отношение с природния BSSL, но те проявяват една или повече от критичните функции на природно срещания BSSL. Критичните функции са изложени по-долу.

j/ ДНК последователност, кодираща протеини, определени по т. a,b,c,d,e,f,h и i погоре;

к/ ДНК последователност съгл. фиг. II, определена съгласно следните нуклеотидни номера на фиг. II;

а/ ДНК последователност 151-2316 съгл. фиг. II, кодираща протеин дефиниран от аминокиселинна последователност 1-722 на фиг. VII;

Ь/ ДНК последователност 151-1755 съгл. фиг. II, кодираща протеин, дефиниран от аминокиселинна последователност 1-535 на фиг. VI;

с/ ДНК последователност 151-985 съгл. фиг. II, кодираща протеин, дефиниран от аминокиселинна последователност 1-278 на фиг. VII;

d/ ДНК последователност 151-1172 съгл. фиг. II, кодираща протеин, дефиниран от аминокиселинна последователност 1-341 на фиг. VII;

е/ ДНК последователност 151-1376 съгл. фиг. II, кодираща протеин, дефиниран от аминокиселинна последователност 1-409 на фиг. VII;

f/ ДНК последователност 151-1574 съгласно фиг. II, кодираща протеин, дефиниран от аминокиселинната последователност 1-474 на фиг. VII;

g/ ДНК последователност 986-1172 съгласно фиг. II, кодираща протеин, дефиниран от аминокиселинна последователност 279-341 на фиг. VII;

Ь/ ДНК последователност 986-1376 съгласно фиг. II, кодираща протеин, дефиниран от аминокиселинна последователност 279-409 на фиг. VI;

i/ ДНК последователност 986-1574 съгласно фиг. II, кодираща протеин, дефиниран от аминокиселинна последователност 279-474 на фиг. VII;

j/ ДНК последователност 1173-1376 съгл.фиг. II, кодираща протеин, дефиниран от аминокиселинна последователност 342-409 на фиг. VII;

к/ ДНК последователност 1173-1574 съгласно фиг. II, кодираща протеин, дефиниран от аминокиселинна последователност 342-474 на фиг. VII;

Значимите функции на протеините съгласно изобретението са, че те са:

а/ подходящи са за орална употреба;

б/ активират се от специфични жлъчни соли;

с/ действат като неспецифична липаза в съдържимото на тънките черва, които са способни да хидролизират липиди, независимо от тяхната химична структура и физично състояние /емулгирано, мицеларно, разтворено/ d/ способност да хидролизират триацилглицеролите с мастни киселини с различна дължина на веригата и различна степен на ненаситеност;

е/ способност да хидролизират също и диацилглицеролите, моноацилглицеролите, холестериловите естери, лизофосфатидилацилацилглицеролите и ретинил или други мастно разтворими естери на витамините;

f/ способност да хидролизират не само sn-Ι (3) естерните връзки в триацилглицерола, но също и sn-2 естерната връзка;

g/ способност да взаимодейства не само с първични, но и с вторични жлъчни соли;

h/ зависимост от жлъчните соли за оптималната активност;

i/ стабилност така, че стомашното съдържимо да не влияе върху каталитичната активност в съществена степен;

}/ стабилност срещу инактивация от панкреатични протеази като трипсин, в присъствие на жлъчните соли;

к/ способност за свързване към хепарин и хепаринови производни като например хепарин сулфат;

1/ способност за свързване към липидноводни интерфази;

ш/ стабилност, позволяваща лиофилизация;

п/ стабилност при смесване с хранителни компоненти, такива съдържащи се както в човешкото мляко, така и млечни препарати.

Критичните функции за добавяне, заместване или терапия са тези, съгл. a, с, d, е, f, i, j и 1. За други цели могат да бъдат използвани не само тези критични функции.

За експресия на посочените по-горе протеини, подходящите ДНК последователности, които също са отбелязани по-горе, следва да се инсерират в подходящ вектор, който след това се въвежда в подходящ организъмгостоприемник. Този вектор следва също да включва подходящи сигнална и други последователности, позволяващи на гостоприемника да експресира желания протеин.

Подходящи организми за експресия:

С рекомбинантната ДНК техника е възможно да се клонира и експресира интересуващия ни протеин в различни прокариотни и еукариотни гостоприемници. Възможно експресионни организми са бактерии, прости еукариоти /дрожди/, животински клетъчни култури, клетъчни култури от насекоми, растителни клетъчни култури, растения и транегенетични животни. Всяка индивидуална система има свои специфични преимущества и недостатъци. Простото заключение е, че за експресиране на всеки ген е необходимо да бъде решен отделен уникален проблем и няма стандартно решение за това.

Общоприети бактериални системи са тези на E.coli, Bac.subtilis Streptomyces. Общоприети дрожди са Saccharomyces и Pichia Pastoris. Общоприети животински клетки са СНО клетки и COS клетки. Общоприети клетъчни култури от насекоми са клетките на Drosophila.

Общоприето растение е тютюна. Възможни транегенетични организми са козата и кравата.

Възможни бактериални вектори са дадените като пример pUC и протеин А-векторите.

Възможен дрождев вектор е представен от рМА 91.

Възможни вектори от насекоми са представени от Васию-вирус.

Възможните животински клетъчни вектори са получени от SV/40.

Възможните растителни вектори са получени от Ti-плазмид.

Във всяка система могат да бъдат използвани както природни, така и синтетични промотори и терминатори.

Разбира се че в зависимост от избора на експресионната система, експресираният протеин може да съдържа допълнителна N6 крайна аминокиселина /мстионин/, да съдържа няколко допълнителни аминокиселини или да бъде слят с хетероложен протеин /като протеин А/ или да се различава от природно срещания протеин по отношение на гликозилирането.

Освен това, векторите могат също да съдържат сигнални последователности с цел да се изнася протеинът в периплазмата или в културалната среда.

Следователно други аспекти на изобретението са:

а/ вектор, включващ ДНК последователност, кодираща протеин както е определен погоре;

Ь/ организъм-гостоприемник, включващ ДНК последователност както е посочена погоре;

с/ метод за получаване на протеин както е определен по-горе, посредством култивиране на гостоприемник, съдържащ вектор, както е посочено вай изолиране на протеина.

Методите за пречистване са основани на използваните експресионни системи /например протеин А/IgG/ и/или на методите за пречистване, използвани за пречистване на природно срещащия се ензим, както е описано в литературен източник /6/.

Допълнителни аспекти на изобретението са:

- фармацевтичен състав, включващ протеин както е определен по-горе;

- използването на протеин, както е определен по-горе за производство на лекарствени средства за лечение на патологични състояния, свързани с екзокринна панкреатична недостатъчност;

- използването на протеин, както е определен по-горе, за получаване на лекарствени средства за лечение на циститна фиброза;

- използването на протеин, както е определен по-горе като добавка в храната за кърмачета;

- използването на протеин, както е определен по-горе, за производство на лекарствени средства за лечение на хронични панкреатити;

- използване на протеин, както е определен по-горе, за производство на лекарствени средства, за лечение на малабсорбция на мазнини от различна етиология;

- използването на протеин, както е оп ределен по-горе, за получаване на лекарствени средства за лечение на малабсорбцията на мастно разтворими витамини;

- използването на протеин, както е определен по-горе, за производство на лекарствени средства за лечение на малабсорбция от мазнини, дължаща се на физиологични причини, напр. у новородени.

ДНК последователността на фиг. 11, от позиция 151 до позиция 2316 включително, е последователност, кодираща цялостния протеин. Последователността от позиция 2317 до 2415 включително не се транслира в протеин, но се включва в екзон d, идентифициран на табл. 2 по-долу.

В един от вариантите на изобретението, протеинът, както е дефиниран в точки a-i погоре, се осигурява в изолирана форма и/или в чист вид.

ДНК последователностите, както са дефинирани в точки а-к по-горе, са при един от вариантите на изобретението, осигурени в изолирана и/или чиста форма.

ОПИСАНИЕ НА ПРИМЕРИТЕ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ

Експериментална част

В описанието се използват следните съкращения:

аа, аминокиселини; Ьр, базова двойка, BSSL - стимулирана от жлъчните соли липаза; С-АМР, цикличен аденозин монофосфат; СЕН, карбоксилестераза; Da, далтон; c’GTP, 7-деазо-2-дезоксигуанозин 5'трифосфат; EDTA, етилен диамин тетраацетат; kb, килобази; MOPS, З-М-морфолино-пропансулфанова киселина; nt, нуклеотид; PAGE, полиакриламидна гел електрофореза; SDS, натриев додецил сулфат; SSC, NaCl цитрат, xGal, 5-бромо-4хлоро-З-индолил-Р-О-галактопиранозид.

Ензими

Стимулирана от жлъчните соли липаза ЕС 3.1.1.3

Карбоксилестераза ЕС 3.1.1.1

Материал и методи

А. Изготвяне на ензима и антитялото

BSSL се пречиства от човешкото мляко както е описано в /6/. За получаване на антитялото ензимът по-нататък се пречиства чрез SDS-PAGE. Протеиновата ивица съответстваща на липазата, се електроелуира от гела след престояване с Comassi Brilliant blue. Двадесет и пет pg от пречистения ензим, заедно с еднакъв обем от пълен аджувант на Фройнд, се използват за първата подкожна инжекция и същото количество от ензима с непълен аджувант за следващите месечни поддържащи инжекции. От зайците се взима кръв около две седмици след всяка поддържаща инжекция и серумите, които се изготвят се съхраняват при -20°С.

В. Изготвяне на триптични фрагменти и анализ на аминокиселинните последователности

Три mg пречистени BSSL се разтварят в 1 ml 0,1 М Трис-С1 буфер рН 8,5, съдържащ 6М гуанидин хидрохлорид и 2 мМ EDTA. Добавя се дитиоеритритол до 5 тМ. След инкубация на 37°С за 2 h, се добавят 300 pl 50 тМ йодоацетат. След инкубация за 90 min при 25°С на тъмно, редуцираният и карбоксиметилиран ензим се подлага на процедура за отделяне на солите в Sephadex G-25 колона, калибрира се с 0,5 М амониев бикарбонат. Тридесет mg от тозил-Lфенилаланинов хлорометан-третиран говежди трипсин /Worthington diagnostics system Inc., Freehold, NJ, USA/ се добавят преди лиофилизацията. Лиофилизираният протеин се разтваря в 4 ml 0,1 М амониев бикарбонат и се добавя допълнително количество от 90 μg трипсин. След 5 h инкубация на 37°С протеинът отново се подлага на лиофилизация. Триптичният фрагмент се разтваря в 0,1% трифлуороцетна киселина /2 mg/ml/. Триста pg обработен с трипсин BSSL се подлагат на хроматографиране върху HPLC, използвайки С-18 обратно фазова колона и се елюира с градиент от 0-50% ацетонитрил в 0,1 % трифлуороцетна киселина. Отделеният пептид се наблюдава чрез продължителна регистрация на абсорбцията при 215 nm. По-нататък пептидите се подлагат на рехроматография с помощта на същата колона при подходящи градиенти.

Проби от пептидните фрагменти се изсушават в присъствие на азот за отстраняване на ацетонитрила и се подлагат на определяне аминокиселинните остатъци в секвенатор. За анализ на N-крайните аминокиселинни последователности природна BSSL се разтваря в 0,1 % оцетна киселина. Анализът на секвенциите се провежда в Applied ed Biosyst. Inc. 477A пулсационен течно-фазов секвенатор и on-line РНТ 120 А анализатор с циклични програми и химикали от промишлеността. Началният и следващите добиви, пресметнато спрямо стан дартен протеин β-лактоглобулин, са 47% и 97% съответно.

С. Изолиране на РНК

Проби от човешка панкреатична адипозна тъкан и тъкани от лактираща млечна жлеза се получават по хирургичен път и незабавно се поставят в гуанидин тиофосфат /1-5 g в 50 ml/. Общото количество РНК се екстрахира по описан от Chirgwin /20/. Поли(А)-РНК се изготвя чрез хроматография върху олиго-дезокситимидилат-/олиго(ОТ) /-целулозна колона /21/.

Д. Конструиране и скрининг на сДНК банки

Приблизително 15 pg поли-аденилирана РНК от човешки панкреас се денатурира с метил живачен хидроксид /22/ и се подлага на въздействието на олиго/dT/ 12-18 праймери /Pharmacia, Uppsala, Sweden/, и се подлага на обратна транскрипция с помощта на стандартни процедури /23/. Синтезата на втората верига се провежда съгласно Gubler и Hoffman /24/, с изключение на това, че ДНК лигазата и β-NAD се пропускат и реакционната температура се установява на 15°С. Излишъкът от РНК се усвоява с РНКаза А /50 pg/ml/ и двойноверижната сДНК се третира с EcoRI метилаза /25/. Образуват се топли краища с помощта на ензима на Klenow. След лигиране към EcoRI линкери и скъсване с EcoRI, сДНК се фракционира на Sepharose 4В-С1 колона. Пробата, не съдържа сДНК фракция, се преципитира с етанол и сДНК се лигира към EcoRI сайта на третирания с фосфатаза gtll вектор /26/. Ин витро се получават повече от 7.10’ рекомбинанти.

сДНК банка от човешка млечна жлеза, получена от жена, бременна в осмия месец, е закупена от Clontech Lab., Inc., Palo Alto, CA, USA.

Фаги от сДНК банката се поставят на 5.10“ плаки, формиращи единици на 120 mm блюда. Антисерумът се разрежда до съотношение от 1:3200 ши се скринира съгласно методиката на Young и Davis /27/. Алкално-фосфатазните конюгати на кози-анти-заешки антитела се използват като вторични антитела /Bio-Rad, Richmond, СА, USA/. За изолиране на клонове, съответстващи на 5'-края на тРНК, се провежда хибридизация на нуклеинови киселини при стандартни условия /23/ с помощта на субклониран фрагмент от един от имунопозитивните клонове като проба, (матрица).

E. РНК анализ

Електрофорезата се провежда върху 1 % агарозен гел в 40 mM MOPS буфер с pH 7,0 след денатурация с глиоксал и диметилсулфоксид /28/. Глиоксилираното общо количество РНК след това се прехвърля върху нитроцелулозни филтри /29/ и се оставя да хибридизира със субклонове на BSSL и СЕН рекомбинанти, белязани по олиго-маркираща техника /30/. Прехибридизацията и хибридизацията се провеждат с 50% формамид при 46°С ИМ. Постхибридизационното промиване се провежда при строго специфични условия (0,1% SDS и 0,1 х SSC при 60°С). 1 х SSC, 0,15М NaCl, 0.0015М Na₃ цитрат, pH 7,6/.

F. Нуклеотидна последователност сДНК инсерти от BSSL и СЕН рекомби- нантите или директно се клонират в М3тр18 и тр19 след въздействие с ултразвук фракциониране по размер или някои от тях по-нататък се субклонират в pTZ19R след смилане с PstI, BstXI, Narl, Smal и Ahall. Нуклеотидната последователност се определя по дидезокси метод с терминатор на веригата /31/. Богатите на GC-повтори /вж. по-долу/ също са секвентирани с Tag I полимераза и de ⁷GTP. Двете вериги се секвенират. Информацията от секвенирането се извежда от авторадиограмите с помощта на софтуер MS-EdSeq, както е описано от Sjoberg и др. /55/.

G. Предсказване на аминокиселинните последователности и хомоложност

За предсказване на съответната аминокиселинна последователност на сДНК инсертите, използването на кодони от различни рамки на разчитане се сравнява по Staden и дава отворена рамка на разчитане /32/. Хомоложностите се откриват с помощта на програми от UWGCG софтуерен продукт /33/.

Резултати и обсъждане

А. Последователности на трипсиновите фрагменти и N-края на BSSL

При смилане с трипсин на пречистена BSSL се получават приблизително 50 фрагмента, според броя на пиковете, получени по време на HPLC-хроматографията /фиг. 1/. Пиковете се събират и посочените пикове, които биха могли да бъдат изолирани във високо пречистено състояние и в разумни количества, се подлагат на секвениране. Получените после дователности са показани на табл. I. В допълнение 30-те най N-крайни последователности се подлагат на секвениране за определяне на аминокиселинната последователност /фиг. II/, с което се потвърждава докладваната по-рано последователност от abouakil et al/17/. Nкрайната последователност, с дължина 22 остатъка, докладвана от Wang и Johnson /34/ е глицин в нашия доклад и лизин в Wang и Johnson’s.

В. Нуклеотидна последователност на BSSL

За конструиране на Xgtll с сДНК-банка се използва полиаденилирана РНК от човешки панкреас. Като начало се изолират четири имунопозитивни клона и след това тази експресионна сДНК банкааа от панкреас се скринира с антисерум срещу BSSL. Нуклеотидният секвенционен анализ на четирите клона показа, че съответстват на 3'- края на тРНК. Всички те започват с поли А опашка и се различават само по дължина. Най-дългият инсерт, означен като АСЕН, е с размер на 996 Ьр.

сДНК банката от човешка млечна жлеза се скринира с антисерум и панкреатичният клон АСЕН като проба (матрица). Позитивните клонове от двете скринирания се изолират, като всички произтичат от 3'-края. Най-дългият клон от млечна жлеза, означен като ABSSL, достига 2100 Ьр в посока upstream. Той съдържа четири от секвенираните трипсинови фрагмента /фиг. II/, но не включва N-крайната аминокиселинна последователност. За да се разшири последователността извън началото на транслацията, сДНК банката от млечна жлеза се скринира отново със 118-базова проба (матрица) от най-проксималния 4'-край на ABSSL. Изолира се един клон, който продължава с 328 нуклеотида в посока upstream. Той съответства на N-крайната аминокиселинна последователност и съдържа и оставащия триптичен фрагмент. Както е показано на фиг. II, сДНК е дълга 2428 нуклеотида и съдържа 81 бази в посока upstream от първия ATG кодон. Сигналът за полиаденилация ААТААА е локализиран 13 нуклеотида в посока upstream от поли А опашката, а терминалният кодон TAG е открит при нуклеотид 2317, следван от 3'нетранслирана област от 112 Ьр.

Богата на GC област, състояща се от 16 повтора на 33 бази бе открита на 3'-края от последователността между базите 1756 и 2283.

Нуклеотидната последователност на повторите, показана на фиг. III, се състои от шест идентични повтора, заобиколени от десет повтора с различен брой замествания, които вероятно са се появили след няколко дупликации. Малкият брой от замествания предполагат, че тези повтори са се появили по-късно по време на еволюцията.

С. Разпределение на експресията в тъканта.

РНК от човешка лактираща млечна жлеза, от панкреас, адипозна тъкан и от човешка хепатитна клетъчна линия /HepG2/ се подлагат на Northern blotk анализ. Размерът на транспортната РНК се определя като приблизително 2,5 b както в лактиращата тъкан, така и в панкреаса. Не е възможно да се определят сигнали в линиите с РНК, екстрахирана от HepG2 или адипозна тъкан /фиг. 4/.

Тъй като тРНК, използвана за банката от млечна жлеза е получена от жена с осеммесечна бременност, очевидно е, че транскрибцията и вероятно транслацията на BSSL гена започва преди раждането, в съгласие с предишните постановки за BSSL секрецията преди раждането /35/. Виж фиг. IV.

Д. Аминокиселинна последователност на BSSL.

Определена чрез SDS-PAGE, молекулната маса възлиза на 107-125 kDa /8,36/, а чрез аналитично ултрацентрофугиране - 105 kDa /ЪЦ. Ензимът, както може да се заключи от сДНК, се състои от 722 аминокиселинни остатъка /фиг. II/, което давайки молекулна маса от 76, 271 Da, сочи че ензимът съдържа наймалко 15-20% въглехидрати. Водещата последователност е с дължина 23 остатъка. Експериментално активният сайт серинов остатък е локализиран в серин - 217 /фиг. V/. Последователността около този серин предоставя активно сайтова последователност за серинови хидролази /38/. Както напоследък се предполага, базичните последователности, намерени в близост до активния серинов сайт, могат да бъдат включени в скъсването на естерните връзки в ацилглицеролите отлипазите /39/. Интересно е да се отбележи, че такива остатъци не присъстват в BSSL. Единичният експериментален N-гликозилационен сайт е локализиран само на седем остатъка от серина. Степента на гликозилация /6,16/ предполага, че ензимът съдържа 0-свързан въглехидрат. Налице са дос30 та сайтове, където може да се срещне подобна гликозилация. Аминокиселинният състав, основан на пречистения ензим показва високо съдържание на пролинови остатъци /6/. Ами5 нокиселинната последователност, получена от сДНК, потвърждава това. Нещо повече, повечето от пролиновите остатъци са локализирани в 16-те повтора, по 11 остатъка всеки, съставлявайки основната част от С-крайната 10 половина на ензима.

Е. Сравнение на ензимите от млечна жлеза /BSSL/ и от панкреас /СЕН/

По-рано е показано, че BSSL от човешко мляко и от човешки панкреас СЕН са 15 аналогични, ако не и идентични. Настоящите данни строго предполагат, че двата ензима са продукт на един и същи ген. Нуклеотидната последователност на сДНК клоновете показва, че панкреатичният клон АСЕН е идентичен 20 на клона от млечната жлеза ABSSL от поли-А опашката и 996 бази откъм 5'-края, включително последователността, кодираща пролиновите повтори. Northern blot анализът дава единична ивица от 2,5 kb в РНК от панкреас 25 и лактиращата млечна жлеза /фиг. 4/. Геномният Southern blot анализ по-нататък потвърждава идеята, че само един ген кодира BSSL и СЕН. Разликата в мобилността върху SDSPAGE между BSSL и СЕН може да бъде обяснена като следствие от различно гликозилиране или диференциално снаждане.

Аналогията на BSSL с плъши и телешки ензими /вж. по-долу/ и резултатите от геномните blot изследвания поддържат вероятността диференциалното снаждане да не влияе върху различията в мобилността. Докато С-крайната последователност не е потвърдена на нивото на протеина, налице е по-малка вероятност СЕН да бъде получен чрез протеолитично очистване на С-терминалния край.

Доколкото ни е известно, панкреатичните ензими, които очевидно съответствуват на СЕН, често са именувани според вида и отделните субстрати, използвани за определяне на съответната им активност: лизофосфолипаза, холестеролестераза, стерол естерна хидролаза, неспецифична липаза, карбокси естерна липаза и холестерил естерна хидролаза. Наличните данни са съвместими с виждането, че всички описани активности произтичат от една и съща функционална основа /42, 43/. Това илюстрира широката субстратна специ10 фичност и зависимостта, заради която са означени като неспецифични липази. Когато се сравняват последователностите на лизофосфолипазата от панкреас /40/ и холестеролестеразата от телешки панкреас /41/, установени са аналогии, възлизащи на около 530 остатъка от N-края /фиг. V/; но те се различават в тази част на молекулата, където се появяват повторите. Плъшият ензим има само четири повтора, а говеждият - три. Следователно човешкият ензим е значително по-дълъг пептид.

Нещо повече, открити са удивителни аналогии между BSSL и някои типични естерази, напр. ацетилхолин естерази от различни видове, включително човек и Drosophila, и карбоксиестеразите /фиг. VI/. Тези аналогии са ограничени до N-крайните 300 остатъка от BSSL, които включват временния активен сайт серинов остатък. Аналогия с ацетилхолин естеразата е предсказана от факта, че BSSL се инхибира от типични холинестеразни инхибитори /6,8,16/. С възможното изключение на чернодробна карбоксилестераза от плъх /45/, нито един от тези аналогични ензими не показват подобна жлъчно-солева зависимост като BSSL; това предполага, че структурната основа на тези свойства се крие в С-термминалната част на протеина. Нещо повече, BSSL може ефективно да атакува емулгирани субстрати, което е непозната характеристика на подобните ензими /естерази/. За тази активност жлъчните соли са особено необходими.

Предсказаната последователност за човешката BSSL е сравнена с други добре характеризирани липази от бозайници. Освен последователността около активния серинов сайт /G-X-S-X-С/ не са намерени явни аналогии /44/.

В допълнение към аналогиите с други ензими налице е също значително подобие с един с-АМР зависим протеин от Dictiostelium discoideum /46/, както с тироглобулин от някои видове /фиг. VI/ /47-49/. Аналогиите между BSSL и тироглобулина, които включват областта на активния сайт, но не и самия активен сайт сам по себе си, показват, че тези високо консервативни участъци от аминокиселини са от по-обща значимост от поддържане на ензимната активност на естеразите.

В заключение, BSSL от човешко мляко се състои от 722 аминокиселинни остатъка. Наличните данни строго показват, че нейната пептидна верига е идентична на тази от панкреатичната СЕН и те са кодирани от същия ген. Най-силното доказателство е, че нуклеотидните последователности от техните 3'-крайни и техните N-крайни аминокиселинни последователности са идентични. Удивителната хомоложност, установена с лизофосфолипаза от плъх и с говежда панкреатична холестеролестераза подкрепят хипотезата, че само тези ензими са функционално идентични. Но както е предположено, различните молекулни размери, установени между видовете не се дължат на различията в гликозилацията; вместо това те отразяват променливия брой от единадесет аминокиселинни повтора. Аналогията в последователността на активния сайт между тези естерази предполага, че тези протеини произхождат от общ родоначален ген.

ОПИСАНИЕ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ ФИГУРИ

По отношение на фигури от I и VII са дадени следните обяснения:

Фигура I. Отделяне чрез HPLC (високоефективна течна хроматография) на скъсани с трипсин фрагменти от BSSL

Пречистен BSSL се третира с трипсин и се хроматографира върху HPLC както е описано в материали и методи. Посочените пикове се събират и пречистват с рехроматограф и се определя тяхната аминокиселинна последователност.

Фигура II. сДНК нуклеотидната последователност и изведената аминокиселинна последователност за стимулирана от жлътните соли човешка липаза.

сДНК е дълга 2428 бази. N-крайната 23кодонна последователност /nt82-150/ започва с ATG-n се счита за водещ пептид, докато Nтерминалната аминокиселинна последователност на зрелия протеин започва при кодон 24 /nt 151, Ala/. Водещият пептид е подчертан. Знакът * посочва началната точка на екзона. Знакът # посочва началната точка на частта с повтори.

Фигура III. Нуклеотидната последователност на богат на GC-повтори С-край у стимулирана от жлъчните соли липаза.

Заместванията са означени с ♦.

Фигура IV. Northern blot хибридизация. Northern blot анализ на общото количест11 во РНК, изолирано от лактиращ млечна жлеза, панкреас, мастна тъкан и човешка хспатомна клетъчна линия (Hep G2/. Общо количество TNA /10 pg/ от лактираща млечна жлеза /линия А/, панкреас /линия В/, мастна тъкан /ли- 5 ния С/ и Hep G2/ /линия D/ се подлага на електрофореза в 1 % агарозен гел в присъствие на 40 mM MOPS буфер при рН 7,0 след денатуриране на РНК в 1М глиоксал, 50% диметилсулфоксид и 40 mM MOPS. След това глиокси- 10 лирантата РНК се прехвърля върху нитроцелулозна хартия за хибридизация с ³²Р белязана сДНК на BSSL /ABSSL/.

Фигура V. Сравняване на изведената аминокиселинна последователност от BSSL от чо- 15 вешко мляко, плъша панкреатична лизофосфолипаза /40/ Ratlpl/ и говежда панкреатична холестеролестераза /41/.

Сериновите остатъци, включени в активния сайт, са означени с *, а с # се означава 20 единичния N-гликозилационен сигнал на протеина. Правите повтори на аминокиселинни последователности са ограничени. Свързващите последователности са отбелязани с главни букви, свързващите последователности между два ен- 25 зима са означени с малки букви, а несъвпаденията - с точка.

Фигура VI. Сравняване на първичната структура на BSSL с други естерази, тироглобулин и с един с-АМР зависим ензим от 30 Doctyostelium discoideum

BSSL: стимулирана от жлъчните соли липаза от човек, Cheshum: холинестераза от зародишна човешка тъкан /50/, Тограсе: ацетилхолинестераза от Torpedo marmorata /51/, 35 Drosceh: хидролаза на карбоксилен естер от Drosophila melanogaster /52/, Ratlivce: карбоксилестераза от плъши черен дроб /53/, Drosace:

ацетилхолинестераза от Drosophila melanogaster /54/, Thyrhum: тироглобулин от човек /49/ и Diet.Di с-АМР зависим ензим от Dictyostelium discoideum /46/. Налице са 7 различни домена, които показват аналогии между ензимите. В загражденията са очертани идентичните остатъци, а малките букви в консенсус индикират идентичните остатъци във всички ензими освен за един. Точките обозначават несъвпадения. Сериновият остатък, включен в активния сайт, е означен със *. Фигурата в десния ъгъл показва как са ориентирани домените.

Фигура VII.

Дава аминокиселинна последователност 1-722 за целия протеин /еднобуквен код/ и обозначава екзоните a,b, end. Знакът # обозначава началната точка на частта с повтори.

Таблица 1.

Аминокиселинна последователност на BSSL пептиди

Поради интерференцията на пиковете не може да бъде положително идентифициран остатъка в циклите 1 и 2 на секвенирането при пептиден номер 26. Пептидните номера съответстват на пиковете от фигура I.

Трипсинови фрагменти

ТР16: LysValThrGluGluAspPheTyrLys ТР 19: GlylleProPheAlaAlaProThrLys ТР20: LeuValSerGluPheThrlleThrLys ТР24: ThrTyrAlaTyrLeuPheSerHisProSerArg ТР26: PheAspValTyrThrGluSerTrpAlaGlnAsp ProSerGlnGluAsnLys

Таблица 2.

Идентификация на екзоните a, b, с и d, номерирани както на фиг. П и VII

Екзон	Локализация
Между нуклеотиден номер	Между аминокиселинен номер
а	986-1172	279-341
ь	1173-1376	342-409
с	1377-1574	410-474
d	1575-2415	475-722

целият
протеин	151-2316	1-722
целият протеин
без повтори	151-1755	1-535

Патентни претенции мулирана от жлъчните соли липаза, включ-

Claims

Патентни претенции мулирана от жлъчните соли липаза, включващ следната аминокиселинна последовател1. Протеин, производен на човешка сти- ност от позиция 1 до 722

10 3050

AKLGAVYTEGGFVEGVNKKLGLLGDSVDIFKGIPFAAPTKALENPQPHPGWQGTLKAKNF

70 90110

KKRCLQATITQDSTYGDEDCLYLNIWVPQGRKQVSRDLPVMIWIYGGAFLMGSGHGA.NFL

130 150170

XXYLYDGEEIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDANLPGNYGLRDQHMAIAWVKRNIAA

190 210230

FGGDPNNITLFCESAGGASVSLQTLSPYNKGLIRRAISQSGVALSPWVIQKNPLFWAKKV

250 270290

AEKVGCPVGDAARMAQCLKVTDPRALTLAYKVPLAGLEYPMLHYVGFVPVIDGDFIPADP

-----------exon а---310 330350

INLYANAADIDYIAGTNNMDGHIFASIDMPAINKGNKKVTEEDFYKLVSEFTITKGLRGA

370 390410

KTTFDVYTESWAQDPSQENKKKTWDFETDVLFLVPTEIALAQHRANAKSAKTYAYLFSH --------------------ехоп-Ь ..........

430 450470

PSRMPVYPKWVGADHADDIQYVFGKPFATPTGYRPQDRTVSKAMIAYWTNFAKTGDPNMG -------------------------ехол с---------490 510530

DSAVPrHWEPYTTENSGYLEITKKMGSSSMKRSLRTNFLRYWTLTYLALPTVTDQEATPV

—..... exon d................... ., II —

550 570590

PPTGDSEATPVPPTGDSETAPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGD

610 630650

SGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDAGPPPVPPTGDSGAPP

670 690710

VPPTGDSGAPPVTPTGDSETAPVPPTGDSCAPPVPPTGDSEAAPVPPTDDSKEAQMPAVI

RF
2. Протеин, включващ следната аминоки- сслинна последователност от позиция 1 до 535

10 3050

AKLGAVYTEGGFVEGVNKKLGLLGDSVDIFKGIPFAAPTKALENPQPHPGWQGTLKAKNF

70 90110

KKRCLQATITQDSTYGDEDCLYLNIWVPQGRKQVSRDLPVMIVIYGGAFLMGSGHGANFL

130 150170

NNYLYDGEEIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDANLPGNYGLRDQHMAIAWVKRNIAA

190 210230

FGGDPNNITLFGESAGGASVSLQTLSPYNKGLIRRAISQSGVALSPWVIQKNPLFWAKKV

250 270290

AEKVGCPVGDAARMAQCLKVTDPRALTLAYKVPLAGLEYPMLHYVGFVPVIDGDFIPADP ' ------------exon a----310 330350

INLYANAADIDYIAGTNNMDGHIFASIDMPAINKGNKKVTEEDFYKLVSEFTITKGLRGA

370 390410

KTTFDVYTESWAQDPSQENKKKTWDFETDVLFLVPTEIALAQHRANAKSAKTYAYLFSH

......—' - exon-b ....... 430 450470

PSRMPVYPKWVGADHADDIQYVFGKPFATPTGYRPQDRTVSKAMIAYWTNFAKTGDPNMG -------------------------exon c —— —ί—

490 510530

DS AVPTHWEPYTTENSGYLEITKKMGS S SMKRSLRTNFLRYWTLTYLALPTVTDQEATP V ——————— exon d ....... #-
3. Протеин, включващ следната аминокиселинна последователност от позиция 1 до 278

10 3050

AKLGAVYTEGGFVEGVNKKLGLLGDSVDIFKGIPFAAPTKALENPQPHPGWQGTLKAKNF

70 90110 kkrclqatitOdstygdedclylniwvpqgrkqvsrdlpvmiwiyggaflmgsghganfl

130 150170 xxylydgeeiatrgnviwtfnyrvgplgflstgdanlpgnygerdqhmaiawvkrnlaa

190 210230 fggdpnnitlfgesaggasvslqtlspynkglirraisqsgvalspwviqknplfwakkv

250 270290 aekvgcpvgdaarmaqclkvtdpraltlaykvplagleypmlhyvgfvpvidcdfipadp
4. Протеин, включващ следната амино- киселинна последователност от позиция 1 до 341

10 3050

AKLGAVYTEGGFVEGVNKKLGLLGDSVDIFKGIPFAAPTKALENPQPHPGWQGTLKAKNF

70 90110

KKRCLQATITQDSTYGDEDCLYLNIWVPQGRKQVSRDLPVMIWIYGGAFLMGSGHGANFL

130 150170

XNYLYDGEEIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDANLPGNYGLRDQHMAIAWVKRNIAA

190 210230

FGGDPNNITLFGESAGGASVSLQTLSPYNKGLIRRAISQSGVALSPWVIQKNPLFWAKKV

250 270290

AEKVGCPVGDAARMAQCLKVTDPRALTLAYKVPLAGLEYPMLHYVGFVPVIDGDFIPADP

-----------exon a---310 330350

INLYANAADIDYIAGTNNMDGHIFASIDMPAINKGNKKVTEEDFYXLVSEFTITKGLRGA
5. Протеин, включващ следната амино- киселинна последователност от позиция 1 до 409

10 3050 aklgavyteggfvegvnkklgllgdsvdifkgipfaaptkalenpqphpgwqgtlkaknf

70 90110 kkrclqatitQdstygdedclylniwvpqgrxqvsrdlpvmiwiyggaflmgsghganfl

130 150170 nnylydgeeiatrgnviwtfnyrvgplgflstgdanlpgnyglrdqhmaiawvkrniaa

190 210230

FGGDPNNITLFGESAGGASVSLQTLSPYNKGLIRRAISQSGVALSPWVIQKNPLFWAKKV

250 270290

AEKVGCPVGDAARMAQCLKVTDPRALTLAYKVPLAGLEYPMLHYVGFVPVIDGDFIPADP ’ ------------exon a----310 330350

INLYANAADIDYIAGTNNMDGHIFASIDMPAINKGNKKVTEEDFYXLVSEFTITXGLRGA

370 390410

KTTFDVYTESWAQDPSQENKKKTWDFETDVLFLVPTEIALAQHRANAKSAKTYAYLFSH ———————— exon-b..... — — .....
6. Протеин, включващ следната амино- киселинна последователност от позиция 1 до 474

10 3050 aklgavyteggfvegvnkklgllgdsvdifkgipfaaptkalenpqphpgwqgtlkaknf

70 90110 kkrclqatitQdstygdedclylniwvpqgrkqvsrdlpvmiwiyggaflmgsghganfl

130 150170

XNYLYDGEEIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDANLPGNYGLRDQHMAIAWVKRNIAA

190 210230

FGGDPNNITLFGESAGGASVSLQTLSPYNKGLIRRAISQSGVALSPWVIQKNPLFWAKKV

250 270290

AEKVGCPVGDAARMAQCLKVTDPRALTLAYKVPLAGLEYPMLHYVGFVPVIDGDFIPADP ------------exon a----310 330350

INLYANAADIDYIAGTNNMDGHIFASIDMPAINKGNKKVTEEDFYKLVSEFTITKGLRGA

370 390410

KTTFDVYTESWAQDPSQENKKKTWDFETDVLFLVPTEIALAQHRANAKSAKTYAYLFSH ——————---exon-b --—

430 450470

PSRMPVYPKWVGADHADDIQYVFGKPFATPTGYRPQDRTVSKAMIAYWTNFAKTGDPNMG

------------------------exon c--------------------------490 510530

DSAVPTHWEPYTTENSGYLEITKXMGSSSMKRSLRTNFLRYWTLTYLALPTVTDQEATPV

..... —- ι ' exon d -# ——

550 570590

PPTGDSEATPVPPTGDSETAPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGD

610 630650

SGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDAGPPPVPPTGDSGAPP

670 690710

VPPTGDSGAPPVTPTGDSETAPVPPTGDSGAPPVPPTGDSEAAPVPPTDDSKEAQKPAVI
7. Протеин, включващ следната аминокиселина последователност от позиция 1 до 278, от позиция 279 до 341, от позиция 279 до 409, от позиция 279 до 474, от позиция 342 до 409, от позиция 342 до позиция 474 или от позиция 536 до 722.

10 3050 aklgavyteggfvegvnkklgllgdsvdifkgipfaaptkalenpqphpgwqgtlkaknf

70 90110 mCLQATITQDSTYGDEDCLYLNIWVPQGRKQVSRDLPVMIWIYGGAFLMGSGHGANFL

130 150170 xxylydgeeiatrgnviwtfnyrvgplgflstgdanlpgxyglrdqhmaiawvkrniaa

190 210230 fggdpnnitlfgesaggasvslqtlspynkglirraisqsgvalspwviqknplfwakkv

250 270290 aekvgcpvgdaarmaqclkvtdpraltlaykvplagleypmlhyvgfvpvidgdfipadp -----------exon a---310 330350 inlyanaadidyiagtnnmdghifasidmpainkgnkkvteedfyklvseftitkglrga

370 390410

KTTFDVYTESWAQDPSQENKKKTWDFETDVLFLVPTEIALAQHRANAKSAKTYAYLFSH exon-b , . ......- ... .и430 450470 psrmpvypkwvgadhaddiqyvfgkpfatptgyrpqdrtvskamiaywtnfaktgdpnmg

--------------------------------exon c - .........

490 510530

DSAVPTHWEPYTrENSGYLEITKKMGSSSMKRSLRTNFLRYVTLTYLALPTVTDQEATPV .......^. ............ exon d..... - * -¹9 —

550 570590

PPTGDSEATPVPPTGDSETAPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGD

610 630650

SGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDAGPPPVPPTGDSGAPP

670 690710

VPPTGDSGAPPVTPTGDSETAPVPPTGDSGAPPVPPTGDSEAAPVPPTDDSKEAQMPAVI

RF

8. Протеин съгласно коЯто и да е от претенции 1-7 в комбинация с един или повече повтори от следната последователност:

Bssl Ratlpl Bovceh 50 MLTMGRLQLWLGLTCCWAVASAAKLGAVYTEGGFVEGVNKKLGLLG. DS . . .MGRLEVLFLGLTCCLAAACAAKLGALYTEGGFVEGVNKKLSLLGGDS ....MLGASRLGPSPGCLAVASAAKLGSVYTEGGFVEGVNKKLSLFG.DS Консенсус .... grl....lgltcclaaaaAAKLGavYTEGGFVEGVNKKLsLlG.DS 100 Bssl Ratlpl Bovech VDIFKGIPFAAPTKALENPQPHPGWQGTLKAKNFKKRCLQATITQDSTYG VDIFKGIPFA.TAKTLENPQRHPGWQGTLKATQFKKRCLQATITQDDTYG VDIFKGIPFAAAPKALEKPKRHPGWQGTLKAKSFKKRCLQATLTQDSTYG Консенсус VDIFKGIPFAa..KaLEnPqrHPGWQGTLKAk.FKKRCLQATiTQDsTYG 150 Bssl Ratlpl Bovceh DEDCLYLNIWVPQGRKQVSRDLPVMIWIYGGAFLMGSGBGANFLNNYLYD QEDCLYLNIWVPQGRKQVSHDLPVMVWIYGGAFLMGSGQGANFLKNYLYD NEDCLYLNIWVPQGRKEVSHDLPVMIWIYGGAFLMGASQGANFLSNYLYD Консенсус .EDCLYLNIWVPQGRKqVShDLPVMiWIYGGAFLMGsgqGANFL. NYLYD 200 Bssl Ratlpl Bovech GKKIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDANLPGNYGLRDQHMAIAWVKR GKKIATRANVIWTFNYRVGPLGFLSTGDANLPGNFGLRDQHMAIAWVKR GKKIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDSN’LPGNYGLWDQHMAIAWVKR Консенсус GKKIATRgNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDaNLPGNyGLrDQHMAIAWVKR * * 250 Bssl Ratlpl Bovceh NIAAFGGDPNNITLFGESAGGASVSLQTLSPYNKGLIRRAISQSGVALSP NIAAFGGDPNNITIFGESAGGAIVSLQTLSPYNKGLIRRAISQSGVALSP NIEAFGGDPDNITLFGESAGGASVSLQTLSPYNKGL1KRGISQSGVGLCP Консенсус NIaAFGCDPDNITLFGESAGGAsVSLQTLSPYNKGLIrRaISQSGVaLsP 300 Bssl Ratlpl Bovech WVIQKNPLFWAKKVAKKVGCPVGDAARMAQCLKVTDPRALTLAYKVPLAG WAIQENPLFWAKTIAKKVGCPTEDTAKMAGCLKITDPRALTLAYRLPLKS WAIQQDPLFWAKRIAKKVGCPVDDTSKMAGCAKITDPRALTLAYKLPLGS Консенсус WalQ.nPLFWAK.iAKKVGCPv.DtakMAgClKiTDPRALTLAYklPL.s Bssl Ratlpl Bovceh 350 LEYPMLHYVGFVPVIDGDFIPADPINLYANAADIDYIAGTNNMDGHIFAS QEYPIVEYLAFIPWDGDFIPDDPINLYDNAADIDYLAGINDMDGHLFAT TEYPKLHYLSFVPVIDGDFIPDDPVNLYANAADVDYIAGTNDHDGHLFVG Консенсус . ΕΥΡ.1HY1.FvPViDGDFIPdDPiNLYaNAADiDYiAGtNdMDGHlFa.

4 ОС fessl IDMPAINKGNKKVTEEDFYKLVSEFTITKGLRGAKTTFDVYTESWAQDPS Ratlpl VDVPAIDKAKQDVTEEDFYRLVSGHTVAKGLKGTQATFDIYTESWAQDPS Bovech MDVPAINSNKQDVTEEDFYKLVSGLTVTKGLRGANATYEVYTEPWAQDSS

Консенсус . DvPAInk.kqdVTEEDFYkLVSg.TvtKGLrGa.aTfdvYTEsWAQDpS

Bssl

Ratlpl Bovceh

45C

QENKKKTWDFETDVLFLVPTEIALAQHRANAKSAKTYAYLFSHPSRMPY

QENMKKTWAFETDILFLIPTEMALAQHRAHAKSAKTYSYLFSHPSRNP’ QETRKKTMVDLETDILFLIPTKIAVAQHKSHAKSANTYTYLFSQPSRNPI

Консенсус

QEn . KKTWdfETDiLFLiPTeiAlAQHrahAKSAkTY . YLFShPSRMPi

Bssl Ratlpl Bovech

500

YPKWVGADHADDIQYVFGKPFATPTGYRPQDRTVSKAMIAYWTNFAKTGD YPKWMGADHADDLQYVFGKPFATPLGYRAQDRTVSKAMIAYWTNFAKSGD YPKWMGADHADDLQYVFGKPFATPLGYRAQDRTVSKAMIAYWTNFARTGD

Консенсус

YPKWmGADHADDlQYVFGKPFATPlGYRaQDRTVSKAMIAYWTNFAktGD

550

Bssl

PNMGDSAVPTHWEPYTTENSGYLEITKKMGSSSMKRSLRTNFLRYWTLTY

Ratlpl Bovceh

PNMGNSPVPTHWYPYTMENGNYLDINKKITSTSMKEHLREKFLKFWAVTF PNTGHSTVPANWDPYTLEDDNYLEINKQMDSNSMKLRTLTNYLQFWTQTY

Консенсус pNnG.S.VPthW.PYT.Kn.nYlelnKkm.S.SMK.hLRtnfL.fWt.Ty

596

Bssl Ratlpl Bovech

LALPTVTDQ EMLPTV...

QALPTVTSA

EATPVPPTGDS VGDHTPPKDDS GASLLPPEDNS

EATPVPPTGDSIETAPVPPTGDS j GAPP EAAPVPPTDDS jDGGPVPPTDDSIQTTP QASPVPPADNSIGAPTEPSAGDSI . . . .

Консенсус .aLPTVt....a...PP.ddS.eA.PVPPtddS....pvPptgDS...,p

642

Bssl Ratlpl Bovceh VPPTGDS VPPTDNS GAPPVPPTGDS QA......... GAPPVPPTGDS|GAPPVPPTGDS|GAPPVP ...........i...........|...... ...........j...........:..... Консенсус ......s . a.........

Bssl

Rarlpl Bovech

Консенсус

6S9 PTGDSIGAPPVPPTGDS .....1........... GAPPVPPTGDS | GPPPVTPTGDS ; GAPPVPPTG 1 1 ; ...........1........... .........

735

Bssl

Ratlpl Bovceh

DS I GAPPVTPTGDS | ETAPVPPTGDS I GAPPVPPTGD sIeAAPVPPTDDS

I

GDS

Консенсус

Bssl KE.AQMPAVIRF Ratlpl VE.AQMPGPIGF Bovech . EVAQMPWIGF

Консенсус .e.AQMP.vIgF

9. Протеин съгласно която и да е претенция от 1 до 8, съдържащ метионин като допълнителна N-крайна аминокиселина.
10. Протеин съгласно която и да е от претенции от 1 до 9, проявяващ един или повече от критичните функции на природно срещана стимулирана от жлъчните соли липаза.
11. Функционално еквивалентни варианти или мутанти на протеин съгласно която и да е от претенции от 1 до 9.
12. ДНК последователност, кодираща протеин с аминокиселина последователност съг- ласно претенция 1.
13. ДНК последователност, кодираща протеин с аминокиселинна последователност съгласно претенция 2.

5
14. ДНК последователност, кодираща протеин с аминокиселинна последователност съгласно коя и да е претенция от 3 до 11.

15. ДНК последователност, дефинирана от нуклеотиди със следните номера 15110 2316; 151-1755; 151-985; 151-1172; 151-1376; 151-1574; 986-1172; 986-1376; 986-1574; 11731376; 1173-1574, както следва

АССГГС1СТА ТСАСТТААСТ GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TAATCCAAAG 60

АСТТТАТГСА TCCAGAGGCT G ATG СТС ACC ATC GGG CGC СТС CAA СТС GTT Met Leu Thr Met Glv Ara Leu Gin Leu Val 111 1 5 10 GTG TIG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG ACT GCC GOG AAG CTG 159 Val Leu Glv Leu Thr Cvs Cvs Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu 15 20 25 GGC GCC CTG TAC ACA GAA GCT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG 20’ Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Fhe ValyGlu Glv Val Asn Lys L\-s 30 35 40 CTC GGC CTC CIG GCT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC 255 Leu Gly Leu leu Gly Asp Ser Val Asp He Phe Lys Gly He Pro Phe 45 50 55 GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTC GAA AAT CCI CAG CCA CAT ССГ GGC TGC- 301 Ala Ala .Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gin Pro His Pro Glv Trp 60 65 70 CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CIG CAG GCC 351 Gin Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cl’s Leu Gin Ala 75 80 ⁸⁵ 90 ACC ATC ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CIG TAC CTC 399 Thr He Thr Gin Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu T>t Leu 95 100 101 AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA GTC TCC CGG GAC CIG CCC 447 Asn lie Trp Val Pro Gin Gly Arg Lys Gin Val Ser Arg Asp Leu Pro 110 115 120 GTT ATC ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT 495 Val Met He Trp lie Tyr Gly Gly Ala Fhe Leu Met Gly Ser Gly His 125 130 135 GGG GCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC 543 Gly Ala Asn Fhe leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu He Ala 140 145 150 ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CCT GTC GGC CCC 591 Thr Arg Gly Asn Val He Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pre 155 160 165 170 CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTC CCA GCT AAC TAT GGC 639 Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly 175 180 185

CIT OGG GAT CAC- CAC ATC GCC Met Ala ATI He GCT TCG GTC AAG AGG AAT ATC GOG Ala 687 Leu Arg Asp Gin His Ala 195 Trp Vai Lys Arg Asn 200 He 190 GCC TIC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TIC GGG GAG TCT GCT 735 Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn He Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala 205 210 215 GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC AAG GGC 783 Gly Gly Ala Ser Vai Ser Leu Gin Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly 220 225 230 CTC ATC OGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTC GCC CTG ACT CCC TCG 831 Leu He Arg Arg Ala He Ser Gin Ser Gly Vai Ala Leu Ser Pro Trp 235 240 245 250 GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TCG GCC AAA AAG GTC GCT GAG AAG 879 Vai lie Gin Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Vai Ala Glu Lys 255 260 265 GTG GGT TGC CCT GTG GCT GAT GCC GCC AGG ATC GCC CAG TCT CTC AAG 927 Vai Gly Cys Pro Vai Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gin Cys Leu Lys 270 275 280 ctt ACT GAT CCC CGA GCC CTC AOG CTC GCC TAT AAG GTC CCG CTG GCA 97 5 Vai Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Vai Pro Leu Ala 285 * 290 295 GGC CIG GAG TAC CCC ATG CTC CAC TAT GTC GGC TTC GIC CCT GTC ATI 1023 Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Vai Gly Phe Vai Pro Vai He 300 305 310 GAT GGA GAC TIC ATC CCC GCT GAC COG ATC AAC CTG TAC GCC AAC GCC 1071 Asp Gly Asp Fhe He Pro Ala Asp Pro He Asn Leu Tyr Ala Asn Ala 315 320 325 330 GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATC GAC GGC CAC ATC 1119 Ala Asp He Asp Tyr He Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His He 335 340 345 TTC GCC AGC ATC GAC ATC OCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG AAA GIC 1167 Phe Ala Ser He Asp Met Pro Ala He Asn Lys Gly Asn Lys Lys Vai jr 350 355 360 AOG GAG GAG GAC TTC TAC AAG CTC GIC ACT GAG TTC ACA ATC ACC AAC- 1215 Thr Glu Glu Asp Phe туг Lys Leu Vai Ser Glu Phe Thr He Thr Lys 365 370 375 GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG ACC ΊΤΓ GAT GTC TAC ACC GAG TCC TCG 1263 Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Vai туг Thr Glu Ser Trp 380 385 390

GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG AAT AAG AAG AAG ACT GTC GTC GAC TIT Ala Gin Asp Pro Ser Gin Glu Asn Lys Lys Lys Thr Vai Vai Asp Phe 1311 395 400 405 410 GAG ACC ' GAT CTC CTC ТГС CIG CTG CCC ACC GAG ΑΊΤ GCC CTA GCC CAG 1359 Glu Thr Asp Vai Leu Phe Leu Vai Pro Ihr Glu He Ala Leu Ala Gin 415 w 420 425 CAC AGA GCC AAT GCC AAG ACT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG ΊΤΤ TCC 140 His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser 430 V, f * 435 440 - CAT CCC TCT OGG ATG CCC GTC TAC CCC AAA TGG CTG GGG GCC GAC CAT 1455 His Pro Ser Arg Met Pro Vai Tyr Pro Lys Trp Vai Gly Ala Asp His 445 450 455 GCA GAT GAC AIT CAG TAC GTT TIC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG 1503 Ala Asp Asp lie Gin Tyr Vai Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr 460 465 470 GGC TAC OGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC 1551 Gly Tyr Arg Pro Gin Asp Arg Thr Vai Ser Lys Ala Met lie Ala Tyr 475 480 485 490 TGG ACC AAC ΊΤΓ GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC GAC TCG GCT 1599 Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala 495 500 505 CTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC GGC TAC CTG 1647 Vai Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu 510 515 520 GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG AGC CIG AGA 1695 Glu He Ihr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg 525 530 535 ACC AAC TIC CIG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG CIG CCC ACA 1743 Thr Asn Fhe Leu Arg Tyr Trp ihr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr 540 545 550 GIG ACC GAC CAG GAG GCC ACC OCT CTG CCC CCC ACA GGG GAC TCC GAG 1791 Vai Ihr Asp Gin Glu Ala Thr Pro Vai Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu 555 560 565 570 GCC ACT CCC GIG CCC CCC ACG GCT GAC TCC GAG ACC GCC CCC CTG CCC- 1839 Ala Ihr Pro Vai Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Vai Pro 575 580 585 ccc ACG GCT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTC CCG CCC ACG GGT GAC TCC 1887 Pro Ihr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Vai Pro Pro Thr Gly Asp Ser

590 595 600

16. Вектор, включващ ДНК последователност, кодираща протеин съгласно претенции от 1 до 11.
17. Вектор, включващ ДНК последователност съгласно претенции от 12 до 15.
18. Организъм-гостоприемник, трансформиран с вектор съгласно претенции 16 или 17.
19. Метод за получаване на протеин съгласно претенции 1-11, характеризиращ се с това, че се култивира гостоприемник, включващ вектор съгласно претенции 16 или 17 и полученият протеин се изолира.
20. Фармацевтичен състав, включващ протеин съгласно която и да е от претенции от 1 до 11.
21. Фармацевтичен състав, включващ протеин съгласно която и да е от претенции от 1 до 11 в комбинация с липаза или в комбинация с препарати, съдържащи липаза.
22. Използване на протеин съгласно която и да е от претенции от 1 до 11 за производство на лекарствени средства за лечение на патологии, отнасящи се до екзокринна панкреатична недостатъчност.
23. Използване на протеин съгласно която и да е от претенции от 1 до 11 за производство на препарат за лечение на циститен фиброзис.
24. Използване на протеин съгласно коя и да е от претенции от 1 до 11 като добавка в храната на кърмачета.
25. Използване на протеин съгласно коя и да е от претенции от 1 до 11 за производство на препарат за лечение на хроничен панкреатитис.
26. Използване на протеин съгласно която и да е от претенции от 1 до 11 за производство на препарат за лечение на мастна малабсорбция.
27. Използване на протеин съгласно коя и да е от претенции от 1 до 11 за производство на препарат за лечение на малабсорбция от мастно разтворими витамини.
28. Използване на протеин съгласно коя и да е от претенции от 1 до 11 за производство на препарат за лечение на мастна малабсорбция, причинена от физиологични предпоставки.
29. Използване съгласно претенции 2228 на протеин съгласно коя да е от претенции от 1 до 11 в комбинация с липаза или липази или с препарати, съдържащи липаза или липази.
30. Храна за кърмачета, допълнена с протеин съгласно коя и да е от претенции от 1 до 11.
31. Протеин съгласно коя и да е от претенции от 1 до 11 в чист вид.
32. Протеин съгласно коя и да е от претенции от 1 до 11 в изолиран вид.
33. ДНК последователност съгласно коя и да е от претенции от 12 до 15 в чиста форма.
34. ДНК последователност съгласно претенции от 12 до 15 в изолирана форма.
35. Метод за получаване на фармацевтичен състав съгласно претенция 20 или 21, характеризиращ се с това, че въвежда протеин съгласно претенции 1-11, 31 или 32 във фармацевтично подходящ носител.
36. Метод съгласно претенция 35 за получаване на фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че се използва за орално приложение.
37. Метод за получаване на храна за кърмачета съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че се използва за допълване на храната за кърмачета с протеин съгласно претенции 1-11, 31 или 32.