CZ164491A3 - Nové chemické produkty - Google Patents

Description

Nové chemické produkty

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nových DNA sekvencí, nových proteinů kódovaných takovými sekvencemi DNA a použití těchto proteinů. Vynález také zahrnuje vektory^jako jsou plasmidové konstrukty, obsahující takové DNA sekvence, které jsou schopny exprese požadovaného enzymu. Vynález také zahrnuje hostitelské organismy transfektované takovými konstrukty, např. bakterie, kvasinky, savčí buňky a transgenní živočichy. Vynález dále zahrnuje způsoby přípravy nových produktů podle vynálezu. Nové proteiny podle vynálezu jsou vztaženy k enzymu známému i.a. jako lidská lipáza stimulovaná žlučovou solí.

Dosavadní stav techniky

Lidská laktující mléčná žláza syntetizuje a sekretuje s mlékem žlučovou solí stimulovanou lipázu /BSŠL - bile . salt stimulated lipase//Bl\fickberg L., Angquist K.A a Hernell ’ —O./1987/-FEBS-Letti217,“37-41/<'pO”specifické^-aktivacÍ“ pri'-’“ “ márními Žlučovými solemi /Hernell O./1975/ Eur.J.Clin.Invest.

5, 267-272; Hernell O, a T.Qlive^erona.1974*Human milk lipases II.Bile salt-stimulated lipase.Biochám.Biophys.^Áčta 369:234-244» Hernell 0.,L,HlSckberg a T.Olivecrona.1981.

Humen milk Lipases.In Textbook of gastroeňterology and nutritioň in infancy.E.Lebenthal, vyd.Baven Press, New York. 347-354/, která se podílí u kojených dětí na endogenní kapacitě intestinálního štěpení tuku /Hernell 0., BlSckberg L . a BernbSck S./1988/ v Periňatal nutřition /Lindblad B.S. ed./ Bristol-Myers Nutřition symposia sv.6, str.259272, Academie Press,New York; Hernell 0., BlSckberg L., B.Fredrikzon i

*'· i

i !

i ' . .

! a T.Olivecrona. l981.Bile^: salt-stimulated lipase in humen ; milk and lipid digestion in the neonatal period. V Textbook í of gastroenterology and nutrition in infancy.E.Lebenthal, i vyd.Baven Press, New York, 465-471; BernbSck S., BISckberg | L. a Hernell 0. /1990/ J.Clin.Invest.J.Clin.Invest. 221226 /1990//. Tento enzym, který činí přibližně 1 % celkového mléčného proteinu /SLSckberg L. a Hernell 0./1981/

Eur.J.Biochem 116,221-225/, je nespecifickou lipázou; in • f vitro hydrolyzuje nejen tri-, di- a monoacylglyceroly,

I ale také cholesteryl- a retinylestery a lysofosfatidylglyceroly /Hernell 0. a BISckberg L. /1982/ Pediatr.Hes.16, 882-885; BISckberg L., Eombardo D., Hernell 0., Guy 0. a Olivecrona T./1981/ FEBS Lett. 136, 284-288; Fredrikzon Β., ; . Hernell 0., BISckberg; L, a Olivecrona T./1978/ Pediatr.

Res.12, 1048-1052; Wang C.-S., Hartsuck J.A. a Downs D.

/1988/ Biochemistry 27, 4834-4840/. Navíc její aktivita není omezena na emulgované substráty, ale stejnými rychlostmi jsou hydrolyzovány micelární a rozpustné substráty /BISckberg L. a Hernell 0. /1983/ FEBS Lett. 157, 337-341/.

i ! BSSL není degradována během průchodu mléka žaludkem a v duodenélním obsahu je chráněna žlučovými solemi před inaktivací pankreatickými proteázami jako je trypsin a chymotrypsin /Hernell 0. /1975/ Eur.J.Clin.Invest.5, 267-272;

\ BISckberg L. a Hernell Ο./1983/ FEBS Lett.157, 337-341/.

Nicméně je inaktivována při pasteuraci mléka např, zahřátím na 62,5 °C, 30 min /BjSrksten Β., Burman L.G., deChateau P., fredrikzon Β., Gothefors L. a Hernell 0./1980/ Br. Med.J.201, 267-272/. Modelové pokusy in vitro potvrzují, že i* konečné produkty štěpení triacylglycerolu se za přítomnosti BSSL /BernbSck S., BISckberg L. a Hernell 0. /1990/, J. Clin.Invest.J.Clin.Invest,221-226/1990/; Hernell 0. a BlSck] berg L. /1982/ Pediatr.Hes.16, 882-885/ liší. Vzhledem k ’ větším intraluminálním koncentracím Žlučové sole během neonai tálního období /Brueton M.J., Berger H.M., Brown G.A., Ablitt L._} Iyangkaran N. a ^wharton B.A. /1978/ Gut 19, 95-98;

-3Murphy G.M. a Signer E./1975/ Gut 15, 151-163/ může být zlepšena absorpce produktů /Bernbáck S., BlSckberg L. a Hernell 0. /1990/ J.Clin.Invest.J.Clin.Invest.221-226 /1990//.

Karboxyester-hydroláza /CEH/ lidské pankreatické šíávy /Lombardo D., Guy 0. Figarella C./1978/ Biochim. Biophys.Acta 527, 142-149/ se funkčně jeví jako identická • ·.» V < nebo alespoň velmi podobná BSSL /BlSckberg L., Lombardo D., i Hernell 0., Guy 0. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136,

284-288/. Obsahuje také obvyklé epitopy /BlSckberg L., Lombardo D., Hernell 0., Guy 0. a Olivecrona T./1981/

I FEBS Lett. 136, 284-288; Abouakil N., Rogalska E., Bonicel J, a Lombardo D./1988/ Biochim.Biophys.Acta 961, 299f

308/, mají identické N-terminální aminokyselinové sekvence /Abouakil Ν., Rogalska Ε., Bonicel J. a Lombardo D./1988/ i Biochim.Biophys.Acta'961 , 299-308/ a jsou inhibovény inhi’ bitory serin-esteráz, např. eserinem a diisopropylfluorefosfátem /BlSckberg L. a Hernell 0./1981/ Eur.J.Biochem 116, 221-225; BlSckberg L., Lombardo D., Hernell 0., Guy O.

í a Olivecrona T./1981/ FEBS Lett. 136, 284-288; Lombardo

D., Guy 0. a Figarella C. /1978/ Biochim. Biophys.Acta i

> .527, 142-149/· Eýlo předpokládáno, že dva enzymy jsou pro: dukty stejného genu /Hernell 0., BlSckberg L. a Lindberg

T./1988/ v Textbook of Gastroenterology and Nutrition in infancy/Lebenthal E.,ed/ str. 209-217, Haven Press, New York/. Pozorovaný rozdíl v molekulové velikosti /BlSckberg L.-, Lombardo- D., Hernell 0», Guy O. a- Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284-288; -^redrikzon B., Hernell 0., BlSckberg.L. a Olivecrona T./1978/ Pediatr.Hes.12, 1048-1052/ by mohly být vysvětlen rozdílnými různými stupni glykosylace, jak bylo v poslední době potvrzeno /Abouakil N., Roí galska Ε., Bonicel J. a Lomberdo D./1988/ Biochim.Biophys.

? Acta 961, 299-308/.

í

I i

t · li i

I

-4j 'letní lipidy jsou důležitými zdrojem energie. Eneri geticky bohaté triacylglyceroly tvoří více než 95 % těch! to lipidů. Některé z těchto lipidů, např. určité mastné kyseliny a vitaminy rozpustné v tucích, jsou podstatnými dietními složkami. Před gastrointestinální absorpcí triacylglyceroly jakož i minoritní složky, tj. esterifikova’ ·; né v tucích rozpustné vitaminy a cholesterol a diacyl| fosfatidylglyceroly, vyžadují hydrolýzu esterových vazeb pro získání hydrofobnějších, absorbovatelných produktů. Tyto reakce jsou katalyzovány specifickou skupinou enzymů ‘ nazývaných lipázy.

t t

I U dospělého člověka jsou za podstatné lipázy, považoi, vány gastrická lipéza, pankreatická colipáza-dependentní ‘ lipáza /hydrolýza tri- a diacylglycerolu/, pankreatická i .fosfolipáza AZ /diacylfosfatidylglyceroly/ a karboxyesterhydroláza /cholesterylestery a estery v tucích rozpustných i vitaminů/. U kojených novorozenců hraje žlučovou solí stij mulovaná lipáza důležitou úlohu při hydrolýze- některých výše uvedených lipidů. Spolu se žlučovými solemi produktu.

Štěpení lipidu tvoří směsné micely, ze kterých dochází k absorpci /Hernell 0., BISckberg L. a BernbSck S./1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad 3.S.,ed./Bristol-Myers Nutrition symposia sv.6,str. 259272, Academie Press,New York; Hernell 0., L.BlSckberg, B.Frederikzon a T. Olivecrona. 1981. Bile salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neonatal period. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy.E.Lebenthal, editor. Baven Press, New York. 465-471; Berjibšck S., BISckberg L. a Hernell 0. /1990/ J.Clin.Invest.J.Clin.Invest.221-226/1 990/.

J í

Obvyklé případy lipidové malabsorpce a tudíž podvýf | živy jsou snížené intraluminální hladiny pankreatická co| lipáza-dependentní lipázy a/nebo žlučových solí. Typickými j

i i

i

-5příklady takové ďeficience lipázy jsou pacienti, trpící cystickou fibrozou, běžnými genetickými poruchami, vedoucími u asi 80 % pacientů ke zkrácení délky života, a chronickou pankreatitidou, často způsobenou chronickým alkoholismem.

Funkce pankreatu a jater nejsou plně při narození vyvinuty, zejména ne u předčasně narozených dětí. Obvykle je zjištěna tuková malabsorpce z fyziologických příčin a předpokládá se, že vzniká z nízkých intraluminálních koncentrací pankreatické colipáza-dependentní lipázy a žlučové soli /Hernell 0., Blfickberg L, a Bernbfick S. /1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B.S, ed/, Bristol Myers Nutrition symposia sv.6, str,259272, Academie Press, New York; Hernell »

0., Blfickberg L., Frederikzon B, a Olivecrona T. 1981.. Bile salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neonatál period. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E.Lebenthál, vyd.Raven Press, New York; Brueton M.J., Berger H.M., Brown G.A., Ablitt L., Iyangkaran N. a Wharton B.A, /1978/ Gut 19, 95-98; Murphy

G.M. a Signer E. /1975/ Gut 15, 151-163; Hernell 0., Staggers J.E. a Carey M.C. Biochemistry /1990/, 29:2041-2056/. Nicméně kvůli BSSL je taková malabsorpce méně častá u kojených dětí než u dětí krmených pasteurovaným lidským mlékem vhodným pro děti /Hernell 0., Blfickberg L. a Bernbfick S./1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B.S, ed/ Bristol-Myers Nutrition symposia sv.6, str. 259272, Academie Press, New York; Hernell 0., Blfickberg Ií», Frederikzon B. á Olivecrona T, 1981. Bíle salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neonatal period. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E.Lebenthál, vyd.Raven Press, New lork; 465-471; Bernbfick S., Blfickberg L. a Hernell 0. /1990/ J.Clin.Invest.J.Clin.Invest.221-226 /1990/; Bjfirkstěn B., Burman L.G., deChateáu P., Fredrikzon B,, Gothefors L. a Hernell 0, /1980/ Br.Med.J. 201, 267-272; Atkinson S.A., M.H.Bryan a G.H.Andersson, 1981. Human milk feeding in preίΛ· ’.· -a' í’·

-6mature infanta: protein, fat and carbohydratee balance in the first two weeks of life. J.Pediatr. 99:617-624; Chappell J.E,, M.T.Clandininj C.Kearney-Volpe, .B.Reichman a P.W,

Swyer. 1986. Fatty acid balance studies. in premature infantá fed human milk or formula: effect of calcium supplementation. J.Fediatr.108:438-447f Williamson S., E.Finucane, H.Ellis a

H.R.Gamsu.1978. Effect of heat treatment of human milk on absorption of nitrogen, fat, sodium, calcium anď phosphorus by preterm infants.Arch.Dis.Childhooď 53:555-563/.

Toto je jedna z příčin, proč je předkládána teorie, že novorozenci, zejména předčasně narozené děti, které nemohou být krmeny mateřským mlékem svých matek by měly být krmeny nepasteurováným mlékem jiných matek /Bjdrksten B,, Burman L.G., deChateau, P^Fredrikzon B., Gothe-fors< L. a Hernell 0. /1980/ Br.Med;J.201, 267-272/.

Léčení pacientů postižených deficitem pankreatické lipázy zahrnuje podání velmi velkých dávek surového přípravku vepřových pankreatických enzymů. Colipáza-dependentní pankreatické lipáza je při nízkém pH inaktivována. Takové podmínky převládají v žaludku což způsobuje, že orálně podávaná pankreatické lipáza je skutečně zcela inaktivována průchodem Žaludkem do střeva. Tento efekt nemůže být úplně překonán použitím velkých dávek enzymu. Velké podávané dávky jsou neadekvátní u mnoha pacientů a přípravky nejsou čisté a chutné. Některé tablety byly formulovány tak, že procházejí kyselými oblastmi žaludku a uvolňují enzym pouze v relativně alkalickém prostředí jejuna. Nicméně mnoho pacientů postižených pankreatickými poruchami má abnormálně kyselé jejunum a takové tablety pak neuvolňují a mohou být proto neúčinné. Navíc jelikož dostupné přípravky jsou z nehumánního zdroje, je zde nebezpečí imunoreakcí, které mohou mít nebezpečný vliv na pacienta nebo vedou ke sníženému účinku léčby. Další nevýhodou existujících přípravků je, že jejich obsah dalších lipolytických aktivit než coli-

-7páza-dependentní lipáza není stanoven. Ve skutečnosti většina z nich obsahuje velmi nízké hladiny CEH/BSSL aktivity. Toto může být jedna z příčin, proč mnoho pacientů, trpících cystickou fibrozou přes doplňkovou léčbu, trpí deficitem vitaminů rozpustných v tucích a esenciálních mastných kyselin.

Existuje značná potřeba produktů s vlastnostmi a strukturou odvozenou od lidských lipáz a se širokou substrátovou specifitou, které by mohly být orálně podávány pacientům, trpícím nedostatkem jednoho nebo několika pankreatických lipolytických enzymů. Produkty podle předloženého vynálezu splňují tuto potřebu jako takové nebo v kombinaci s dalšími lipázami nebo v kombinaci s přípravky, obsahuj jícími další lipázy. Dále pro některé děti je zde potřeba zlepšení využití tuku z běžných dětských přípravků nebo pasteurovaného lidského mléka z tak zvaných mléčných bank.

BSSL má některé jedinečné vlastnosti, přo které je ideálně vhodná pro substituční a doplňkovou terapii. Svým charakterem je určena pro orální podání. Je rezistentní při průchodu žaludkem a je aktivována v obsahu tenkého střeva. Její specifický aktivační mechanismus- by měl bránit nebezpečné lipolýze potravy nebo tkáňových lipidů během zdržení a průchodu na místo jejího působeni. Vzhledem ke své široké substrátové specifitě je schopna kompletního Štěpe, ní většiny dietních lipidů včetně esterů v tucích rozpustných vitaminů.

BSSL může být vynikající s pankreatickou colipázadependentní lipázou pro hydrolýzu esterových vazeb, obsahujících polynenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem.

Za přítomnosti gastrické lipázy a za nepřítomnosti nebo při nízkých hladinách colipáza-dependentní lipázy BSSL

8i · . ' ' ' i ' '. '

T . ' ί

je možno zjistit úplné in vitro štěpení triacylglycerolu i ; když hladiny žlučových solí jsou tak nízké jako u novorozenců. 2a přítomnosti BSSL konečné produkty štěpení triacylglycerolu tvoří volné mastné kyseliny a volný glycerol spíše než volné mastné kyseliny a monoacylglycerol, získané jinými dvěma lipázami /Bernbáck S., Bláckberg L. a Hernell 0. /1990/ J.Clin.Invest.221-226/1990//. Mohou podporovat i absorpci produktu zejména, když jsou intraluminální hladiny žlučových solí nízké /Hernell 0., BlSckberg L. a 3ernb8ck

S./1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B.S.,ed./BristolMyers Nutrition symposia sv.6, str. '259271, Academie Press; Hernell 0., Staggers J.E* a Carey M.C. Biochemistry /1990/, i 29:2041-2056/.

/ .

: Podle dřívějšího přístupu byla dětská výživa vyvíjena a zlepšována podle tak, aby její složení bylo co nejpodobnější lidskému mléku. Takovou potravu je žádoucí doI* plnit.

ř i

ί Použití žlučovou solí stimulovaných lipáz,/BSSL/ nebo l· ’ proteinů s podstatnými funkcemi BSSL pro doplnění, substituci nebo terapii nicméně vyžaduje přístup ke značně velkým množstvím produktu. V průmyslovém měřítku není možno využívat přirozených zdrojů jako je mléko jako výchozí suroviny. Mimo problému uvedeného výše s inaktivací BSSL během pasterizace je zde další nebezpečí kontaminace materiálu z přirozeného zdroje infekčními činidly, např. viry ja_e ko je HIV virus a CMV,Proto existuje potřeba dostupnosti produktů, majících BSSL vlastnosti ve velkém měřítku. Předložený vynález poskytuje takové produkty a způsoby jejich přípravy. .. ...

, £·,·£ ·_: : '· •i.·· • -A ,.1.1

I

-9Podstata vynálezu

Předložený, vynález je založen na klonování cDNA kódující BSSL odvozenou z lidské mléčné žlázy. Eýla také izolována, z lidského pankreatu, parciální cDNA kódující CEH. Odvozené aminokyselinové sekvence od lidských cDNA a srovnání s CEH jiných druhů podporují výklad, ’že BSSL a CEH jsou identické.

Jak bude dále detailně popsáno, bylo s překvapením zjištěno, že struktura proteinu odvozeného od cDNA sekvence je zcela rozdílná od struktury jiných lipáz. Struktura se neočekávaně jeví být podobnější struktuře typických este- * ráz jako je cholinesteráza.

S odkazem na obr.II a obr.VII, produkty podle vynálezu jsou:

a/ protein definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-722 na obr.VII, b/ protein definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-535 na obr.VII, c/ protein definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-278 na obr.VII, d/ protein definovaný aminokyselinovou sekvencí 1—341 na obr.VII, , .

e/ protein definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-409 na obr.VII, »

,f/ protein definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-474 na obr.VII,

..· ' ‘íť’· 5

·. ·.· -:/---.· /·.···· · i ' (¹¾ i?,·.

-10g/ kombinace proteinů definovaných pod b/ - f/ např. definovaných aminokyselinovou sekvencí v polohách 1-27θ,

279-341, 279-409, 279-474, 342-474 a 536-722, h/ kombinace proteinů definovaných pod b/ až g/ v kombinaci s jedním nebo více opakováními podle obr.V, i/ protein definovaný pod a/ až h/, mající další N-termi- , nální aminokyselinu, zejména methionin a funkčně ekvivalentní varianty a mutanty proteinů definovaných pod a/ až i/ výše.

Je třeba uvést, že proteiny pod a, b, c, d, e, f, h a i výše nebudou ve všech hlediscích identické s přirozeně se vyskytující BSSL, ále budou vykazovat jednu nebo více podstatných funkcí přirozeně se vyskytující BSSL. Podé statné funkce jsou uvedeny dále.

j/ DNA sekvence kódující proteiny definované pod a, b, c,' d, e, f, ha i výše.

k/ DNA sekvence podle obr.IX definovaná následujícími nukleotidy na obr. II:

a/ DNA sekvence 151-2316 podle obr. II, kódující protein definovaný sekvencí aminokyselin 1-722 na obr. VII, b/ DNE sekvence 151-1755 podle obr.II, kódující protein definovaný sekvencí aminokyselin 1-535 na obr.VII, c/ DNA sekvence 151-985 podle obr.II, kódující protein de- * finovaný sekvencí aminokyselin 1-278 na obr.VII, d/ DNA sekvence 151-1172 podle obr.II, kódující protein definovaný sekvencí aminokyselin 1-341 na obr.VII, e/ DNA sekvence 151-1376 podle obr.II, kódující protein definovaný sekvencí aminokyselin 1-409 na obr.VII,

£/ DNA sekvence 151-1574 podle obr,II, kódující protein definovaný sekvencí aminokyselin 1-474 na obr. VII, g/ DNA sekvence 986-1172 podle obr. II, kódující protein definovaný sekvencí aminokyselin 279-341 na obr.VII, h/ DNA sekvence 986-1376 podle obr.II, kódující protein defi novaný sekvencí aminokyselin 279-409 ha obr. VII, i/ DNA sekvence 986-1574 podle obr.II, kódující protein definovaný sekvencí aminokyselin 279-474 na obr. VII, j/ DNA sekvence 1173-1376 podle obr.II, kódující protein definovaný sekvencí aminokyselin 342-409 na obr. VII, k/ DNA sekvence 1173-1574 podle obr.II, kódující protein definovaný sekvencí aminokyselin 342-474 na obr. VII.

Významné funkce'proteinů podle vynálezu jsou a/ vhodnost pro orální podání, b/ jsou aktivovány specifickými žlučovými solemi, c/ působí jako nespecifická lipáza v obsahu tenkého střeva a jsou tak schopny hydrolyzovat lipidy relativně nezávisle na jejich chemické struktuře a fyzikálním stavu . /emulgované, micelární, rozpuštěné/, d/ schopnost hydrolyzovať triacylglyceroly mastných kyselin o různé délce řetězce a různém stupni nenasycení, e/ schopnost hydrolyzovat také diacylglycerol, cholesterylestery, monoacylglycerol, lysofosfatidylacylglycerol a retifiyl a jiné estery vitaminů rozpustných v tucích, f/ schopnost hydrolyzovat nejen sn-1/3/ esterové vazby v triacylglycerolu, ale také sn-2 esterovou vazbu, g/ schopnost být ovlivňovány nejen primárními, ale také sekundárními žlučovými solemi,

h/ závislost optimální aktivity na žlučových solích, i/ taková stabilita, že obsah Žaludku neovlivňuje katalytickou účinnost v žádném podstatném stupni, j/ stabilita vůči inaktivaci pankreatickými proteázami, např. trypsinem za podmínky, že jsou přítomny žlučové sole, k/ schopnost vázat heparin a jeho deriváty, např. heparansulfát,

1/ schopnost vazby na rozhraní lipid-voda, m/ stabilita při lyofilizaci, n/ stabilita při smísení se složkami potravy jako je mléko nebo mléčné přípravky.

Kritické funkce pro doplňky, náhrady nebo léčbu jsou uvedeny pod a, c, d, e, f, i, j a 1. Pro jiné účely nejsou nezbytné všechny kritické funkce.

Pro expresi výše uvedených proteinů budou příslušné LNA sekvence uvedené výše inzertovány do vhodného vektoru, který je pak zaveden do vhodného fiostitelského organismu. Uvedený vektor bude obsahovat příslušné signální a další sekvence, umožňující organismu exprimovat požadovaný protein.

Vhodné Organismy pro expresi:

Technikami rekombinace DNA je možné klonovat a exprimovat požadovaný protein v různých prokaryotických a euka/,/ /ty,·:·

..· -f·· * ' n :'?^:v ' Á· ·úí ť* J ' .>?

ryotických hostitelských organismech. Možnými organismy pro expresi jsou bakterie, jednoduché eukaryoty /kvasinky/, kultury živočišných buněk, kultury hmyzích buněk, kultury j rostlinných buněk, rostliny a transgenní živočichové. Kaž, dý jednotlivý systém má sám o sobě určité výhody a nevýhody. Je možno učinit jednoduchý závěr,, že každý gen, který má být exprimován, je zvláštním případem a je vhodné nestán, #' ί dardní řešení.

j

Obvykle užívanými bakteriálními systémy jsou E.coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Obvykle používanými kvasinkami jsou ^accharomyces a Pichia pastoris. Obvykle použíj vánými živočišnými buňkami jsou CHO buňky a COS buňky. Ob* vykle používanými kulturami hmyzích buněk jsou buňky získané z Drosophila.,

Obvykle užívanou rostlinou je tabáková rostlina. Moži nými transgenními živočichy jsou koza a kráva.

í Příklady možných bakteriálních vektorů jsou pUC a ΐ

i protein A-vektory.

I

Příkladem možného kvasinkového vektoru je pMA91.

Možné hmyzí vektory jsou odvozeny od Baculoviru.

i *

i Možné vektory živočišných buněk jsou odvozeny oď ' . SV/40.

Možné rostlinné vektory jsou odvozeny od Ti-plasί midu.

t 'í j .

j V každém systému mohou být použity přirozené a syn| tetické promotory a terminátory.

V závislosti na výběru expresního systému může exprimovaný protein obsahovat další N-terminální aminokyselinu /methionin/, obsahovat málo zvláštních aminokyselin, nebo být fixován s heterologním proteinem /např. proteinem A/, nebo se lišit od proteinu z přirozeného zdroje glykosylací. Dále, vektory mohou také obsahovat signální sekvence za účelem přemístění proteinu do periplasmy nebo do kultivačního media.

^alšími aspekty vynálezu tak jsou . a/ vektor, obsahující DNA sekvenci, kódující výše specifikovaný protein, ·' b/ hostitelský organismus, obsahující DNA sekvenci specifikovanou výše, c/ způsob přípravy proteinu specifikovaného výše, kultivací hostitelského organismu, obsahujícího vektor specifikovaný výše pod a/ a izolací proteinu.

•4·

Způsoby čištění jsou závislé na použitém expresním systému /např. protein A/IgG/ a/nebo na metodách použitých při čištění enzymu přirozeného původu jak je popsáno v práci Blfickberg L. a Hernell 0. /1981/ Eur.J.Biochem. 116, 22T225.

Dalšími aspekty vynálezu jsou:

- farmaceutická kompozice, obsahující výše specifikovaný protein,

- použití výše specifikovaného proteinu pro výrobu léčiva pro léčení patologických stavů spojených s exokrinní pankreatickou insuficiencí,

, ;· λ/· 'Ť?': v' -i - '· -5'· ' '/'-v

-15- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení cystické fibrosy,

- použití proteinu specifikovaného výše jako doplňku přípravků dětské výživy,

- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení chronické pankreatitidy,

- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení tukové malabsorpce jakékoliv etiologie,

- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva ' pro léčení malabsorpce vitaminů rozpustných v tucích,

- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení tukové malabsorpce vyvolané fyziologickými příčinami, např. novorozenců.

DNA sekvence na obr.II od polohy 151 až do a včetně po lohy 2316 je sekvencí, kódující celý protein. Sekvence od polohy 2317 až do a včetně polohy 2415 není translatována do proteinu, ale je zahrnuta v exonu d identifikovaném v tabulce 2 dále.

V jednom provedení vynálezu, protein definovaný v odstavcích a/ - i/ je poskytnut v izolované formě a/nebo v podstatě čisté formě.

DNA sekvence definované v odstavcích a/ - k/ jsou v jednom provedení vynálezu poskytnuty v izolované formě a/nebo v podstatě čisté formě.

Bříklady provedení vynálezu

Zkratky:

aa - aminokyselina, bp - pár bází, BSSL -žlučovou solí stimulovaná lipáza, c-AMP - cyklický adenosim&onofosfát, CEHkarboxyester-hydroláza, a - dalton, c GTP. - 7-deaza-2deoxyguanosin-5*-trifosfát, EDTA - ethylendiamintetraacetát, kb - kilobáze, MOPS -3-N-morfolinopropansulfonová kyselina, nt -nukleotid, PAGE - elektroforéza na polyakrylamidovém gelu, SDS -dodecylsulfát sodný, SSC_T NaCl citrát, Χθβΐ, 5-brom4-chlor-3-indolyl- β -D-galaktopyranosid.

Enzymy .

žlučovou solí stimulovaná lipáza EC 3*1»1.3 karboxyester-hydroláza EC 3.1.1.1

Materiála a metody

A, Příprava enzymu a protilátek

BSŠL byla čištěna z lidského mléka, jak bylo dříve popsáno /Bláckberg L. a Hernell 0. /1981/ Eur.J.Biochem 116, 221-225/. Při použití pro přípravu protilátky byl enzym dále čištěn pomocí SDS-PAGE. Proteinový pruh odpovídající lipáže byl po vybarvení pomocí Coomassie Briliant modři, z gelu elektroeluován. ^vacet pět /Ug čištěného enzymu, spolu se stejným objemem ÍÝeudova kompletního adjuvanťa, bylo použito pro první s.c. injekci a stejné množství enzymu s nekompletním adjuvans pro následující měsíční booster injekce. Králíci byli vykrváceni asi dva týdny po každém boosteru a byla připravena sera a uchovávána při -20 °C.

B. Příprava tryptických fragmentů a analýza aminokyselinové sekvence

Λ,·.»

-.v:

-17Tři mg Čištěné BSSL byly rozpuštěny v 1 ml 0,1M ^ris-Cl pufru, pH 8,5_t obsahujícím 6M guanidinium hydrochlorid a 2 mM EDTA. Dithioerythritol byl přidán do koncentrace 5mM. Po inkubaci při 37 °C po dobu 2 hodin bylo přidáno 300 y-ul 50 mM jodacetátu. Po 90 minutové inkubaci při 25 °C za nepřístupu světla byl redukovaný a karboxyme.thylovaný enzym odsolen na koloně Sephadexu G-25, ekvilibrované 0,5M hydrogenuhličitanem amonným. Před lyofilizací bylo přidáno třicet /ug tosyl-L-fenylalanin chlormethanem zpracovaného hovězího trypsinu /Worthington diagnistic systém lne., Freehol, NJjUSA/. Lyofilizovaný protein byl rozpuštěn ve 4 ml 0,1-M hydrogenuhličitanu amonného a dále bylo přidáno 90 /Ug trypsinu. Po 5 hodinové inkubaci při 37 °C byl protein opět lyofilizován. Tpyptický digest byl rozpuštěn v 0,1% trifluoroctové kyselině /2 mg/ml/, Třista ^ug trypsinem zpracované BSSL bylo chromatografováno na HPLC za použití C-18 kolony s reverzní fází a eluováno gradientem 0-50 % acetonitrilu v 0,1% trifluoroctové kyselině. Odebírání peptidů bylo sledováno kontinuálně měřením absorbánce při 215 nm* Peptidy, které -> mají být sekvenovány byly dále čištěny rechromatografií za použití téže kolony s upravenými gradienty. Vzorky peptidových fragmentů pro sekvenování byly sušeny pod dusíkem pro odstranění acetonitrilu a aplikovány na sekvenátor. Pro Nterminální sekvenční analýzu byla nativní BSSL rozpuštěna v 0,1% kyselině octové. Sekvenční analýza byla provedena na App-r lied Biosystems lne. 477A pulzním sekvenátoru v kapalné fázi a on-line PTH 120A analyzátoru s regulovanými programy cyklů a chemikáliemi od výrobce. Počáteční a opakované výsledky, počítáno ze sekvenovaného standardního proteinu, /3 -laktoglobulinu, byly 47 a 97 %.

C. Izolace RNA

Vzorky lidské pankreatické adiposy a tkáně Taktující

18* . v i

(

I i

mléčné žlázy/ byly získány chirurgicky a ihned ponořeny do guanidiumthiokyanátu /1-5 g v 50 ml/. Celková RNA byla extrahována jak je popsáno v práci Chirwina J.M., Przybyla, A.E. , MacDonalda R.J. a Ruttera W.J. /1979/ Biochemistryz 18, 52945299. Poly/A/-RNA byla připravena chromatografií na oligodeoxythymidilát/oligo/DT//-celulozové koloně /Aviv H. a Leder P./1979/ Proč.Nati.Acad.Sci USA 69, 5201-5205/.

D. Konstrukce a screening cDNA knihoven

Přibližně 15 /ug polyadenylované RNA z lidského pankreatu bylo denaturováno methylmerkur^hydroxidem /Bailey J.M. a avidson N./1976/Anal.Biochem.70, 75-85/ a primovány/ s oligo /^dT/i2-i8 P^rimery /Pharmacia, Uppsala, Švédsko/ a reverzně transkribovány za použití standardních postupů /Maniatis T., řritsch E.F. a Šambrook J./1982/: Molecular Cloning.A Laborator.y Manual.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Barbor, New York/. Syntéža druhého řetězce byla provedena podle práce Gublera U. a Hoffmana B.J. /1983/ Gene 25, 263-269, s tím rozdílem, že DNA ligáza a Λ-NAD byly vynechány a reakč- . ní teplota byla 15 °C. Přebytek RNA byl štěpen RNAzou A /50 /Ug/ml/ a dvojretězcová cDNA byla zpracována s EcoRI methylázou /Maniatis T., Haldison R.C a Lacy Ε., Lauer J.,0*Conell C. a Qvon D./1978/ Cell 15, 687-7Φ1/. Konce byly zarovnány pomocí Klenow enzymu. Po ligaci k EcoRI linkerům a štěpení EcoRI,cDNA byla frakcionována na koloně Sepharose 4B-CÍ.

Frakce byly vysráženy ethanolem a cDNA ligována do EcoRI místa fosfatázou zpracovaného gtll vektoru /Young R.A. a Davis R.W /1983/ Proč.Nati.Acad.Sci, USA 80,1194-1198/. In 5 vitro provedení poskytlo více než 7 x 10 rekombinantů.

cDNA knihovna z lidské, mléčné žlázy, získaná z tkáně? ženy v osmém měsíci těhotenství, byla získána od Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA, USA.

... í ‘ ·

Z:;/

V: · ¹

I ·./··

I -19Fágy z cDNA knihoven byly umístěny na plotnu v koncentraci 5 x 10⁴ plakdtvorných jednotek na 120mm misku. Antisérum bylo zředěno v poměru 1 :3200 a screening byl proveden podle Younga R.A. a Davise R.W./1983/ Proč.Nati.Acad.

Sci, USA 80, 1194-1198/. Alkalickou fosfatázou konjugované kozí-anti-králičí protilátky byly použity jako druhé proí tilátky /3io-Rad, Richmond, CA USA/. Pro izolaci klonů odpoj vídajících 5* konci mRNA, byla hybridizace nukleových kyselin ’ > provedena za standardních podmínek /Maniatis T., Pritsch E.F.

a Sambrook J./1982/: Molecular Cloning.A Laboratory Manual.

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York/ za použití subklonovaných fragmentů z jednoho z imunopozitivj nich klonů jako sondy.

i [

ί E. RNA analýza

Elektroforéza byla provedena na 1% agarozovém gelu i v 40mM MOPS pufru o pH 7,0 po denaturaci glyoxalem a dimethylj . sulfoxidem /McMaster G.K. a Charmichael G.G./1977/ Proč.

S Nati.Acad.Sci.USA 74, 48 353- 48 358/. Glyoxalátovaná celková ί RNA pak byla transferována na nitrocelulozové filtry /Thomas P./1980/ Proč. Nati.Acad.Sci. USA 77, 5201-5205/. Sloty byly sondovány subklony rekombinantů BSSL a CEH, které byly ΐ radioaktivně značeny oligo-radioaktivní technikou /Fein; berg A.P. a Vogelstein B./1983/ Anályt.Biochem. 132,6x13/.

Preh.ybridizace a hybridizace byly provedeny s 50% formamidem ^! při 46 °C /Maniatis T., Fritsch E.F, a Sambrook J. /1982/:

Molecular Cloning.A.Laboratory Manuel. Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, New York/. Posthybridizační promytí byla prováděna s velkou přesností /0,1% SDS a G,1x SSC při 60 °C/./1xSSC, 0,15M NaCl, 0,0015M Na-^citrát, pH,7ý6/.

-20P. Nukleotidová sekvence cBNA inzerty z BSSL a CEK rekombinantů byly bu3 přímo klonovány do M3mp18 a mp19 po sonifikaci a frakcionaci podle velikosti nebo některé z nich byly dále subklonovány do pTZ19R po Štěpeních pomocí Pstl, BstXI, Narl, Smál a Ahall. Nukleotidová sekvence byla stanovena dideoxy terminační metodou /Sanger F,, Nicklen S. a Coulson A.R./1977/ Proč.Nati. A_cad.Sci.USA 74, 5463-5467/. GC-bohaté podíly /viz dále/ byly také sekvenovány s Taql polymérázou a dc GTP. Oba řetězce byly sekvenovány. Sekvenční informace? byly získány z autoradiogramů za použití softwaru MS-EdSeq jak je popsáno v práci Sjdberga? S., Carlssona P., Enerbácka S., a Bjursella G./1989/ CABIOS 5, 41-46.

Ch Předpovědi aminokyselinových sekvencí a homologií

K předpovědi odpovídající aminokyselinové sekvence cDNA inzertů, kodon použitý v různých čtecích rámečcích byl porovnán podle Stadena a poskytl jeden otevřený čtecí rámeček /Staden R.,/1934/ Nucl.Acids Res.12,551-567/. Homologie byly zkoušeny s programy UWGCG softwaru /Devereux J., Haeberli P. a Smithies 0./1984/ Nucl.Acids Res. 12, 387-395/.

Výsledky a diskuse

A. Sekvence tryptických fragmentů a N-konce BSSL

Trypsinové štěpení čištěné BSSL poskytlo přibližně 50 fragmentů podle píků získaných HPLC chromatografií /obr. 1/. Píky byly odděleny a označené píky, které by mohly? být izolovány ve vysoce Čistém stavu a v přiměřených množstvích, byly sekvenovány. Výsledné sekvence jsou uvedeny v tabulce

I. Bále bylo sekvenováno 30 N-koncových zbytků /obr.2/ a potvrzují dříve uvedenou sekvenci podle Abouakila K.,Rogalske^s v;' -21-.

E.,Bonicela J. a Lombarda D./1988/ Biochim.Biophys.Acta 961, 299-308, /30 zbytků/.

zbytků dlouhá N-terminální sekvence uváděná v práci WangaC.-S. a Johnsona K./1983/ Anal.3iochem.133, 457-461 je glycin v této práci a lysin podle uvedených autorů.

B. Nukleotidová sekvence BSSL

Pro konstrukci Agtll cDNA knihovny byla použita polyadenylováná PNA z lidského' pankreatu. Nejprve byly izolovány čtyři imunopositivní klony a pak tato pankreatická cDNA knihovna bylá prohledána antisérem proti BSSL. Nukleotidová sekvenční analýza čtyř klonů ukázala, že jsou v dokonalém souladu a odpovídají 3*-konci mRNA. Všechny začínají póly A koncem a liší se pouze v délceJ nejdelší inzert, označený ÁCEH, měří 996 bp.

cDNA knihovna z lidské mléčné žlázy byla prohledána antisérem, a pankreatickým klonem ACEH jako sondou. Pozitivní klony byly izolovány z obou screeningů,všechny z nich začíi nají od 3*-konce. Nejdelší klon lidské mléčné žlázy, označený ABSSL, měří 2100 bp v protisměru. Obsahuje čtyři sekvenované tryptické fragmenty /obr.II/, ale nezahrnuje N-terminál_t ní aminokyselinovou sekvenci. K prodloužení sekvence dále od počátku translace¹, byla cDNA knihovna lidské mléčné žlázy rescreenovéna sondou o délce 118 bází získanou z nejčastějších 5 'proximálních částí ABSSL. Byl izolován jeden klon, který pokračuje dále 328 nukleotidy protisměru. Tvoří N-terminální aminokyselinovou sekvenci a obsahuje zbývající tryptický fragment. Jak je uvedeno na obr.II, cDNA je 2428 nukleo tidů dlouhé a obsahuje 81 bází v protisměru odi prvního ATG kodonu. Polyaďenylační signál, AATAAA je umístěn 13 nukleotidů v protisměru od póly A chvostu“ a jako terminační kodon

TAG byl nalezen nukleotid 2317 následovaný 3'-netranslatovanou ohlastí 112 bp. GC bohatá oblast obsahující 16 opakování 33 bází byla nalezena na 3'-konci sekvence mezi bází 1756 a 2283, Nukleotidová sekvence opakování, uvedená na obr.III, obsahuje šest identických opakování, obklopených deseti opakováními s různým počtem substitucí, které pravděpodobně vznikly po několika duplikacích. Nízký počet substitucí potvrzuje, že * tato opakování se objevila později během vývoje.

« C. Tkáňová distribuce exprese

RNA z lidské laktující mléčné žlázy, pankreatu, adipozové tkáně a z lidské hepatomové buněčné linie /HepG2/ byla analyzována Nothern .blottingem. Velikost messengeru byla stanovena přibližně 2,5 kb jak v'laktující mléčné žláza, tak v pankreatu. Žádný signál nebyl detegován v drahách s RNA extrahovanou z HepG2 nebo adipozové tkáně /obr.IV/.

Vzhledem k tomu, že mRNA použitá pro knihovnu mléčné žlázy byla získána od žena v 8.měsíci těhotenství, je evidentní, že transkripce a pravděpodobně translace? BSSL genu je provedena před porodem,v souladu s předcházejícími nálezy BSSL sekrece před porodem /Hamosh' M./1986/ v .Human Milk InfantNutrition and Health /Howell, R.R., Morriss F.ff. a Pickering L.K, eds,/ str.66-97, Charles C.Thomas, Springfielď/ /viz

I obr.IV/.

D, Aminokyselinová sekvence BSSL

Podle SDS-PAGE byla uvedena molekulová hmotnost 107— 125 kDa /BISckberg L., Lombardo D., Hernell 0., Guy O* a Olivecrona Τ./198Ϊ/ FE3S Lett.136, 284-288; Wang C.-S./1980/ Anal.Biochem. 105,398-402/ a podle?analytické ultracentrifugace 105 kDa /^wáng C.-S. a Lee D.M./1985/ J.Lipid.Res.26, 824830/, Enzym jak je předpovězeno z cDNA, obsahuje 722 amino-23kyselinových zbytků /obr.II/ které, při molekulové hmotnosti 76,271 Da, indikují, že enzym obsahuje nejméně 15 - 20 % \ karbohydrátu. Leader sekvence je 23 zbytků dlouhá.. Zkmusmé aktivní místo serinového zbytku je lokalizováno k serinu-217 /obr.V/. Sekvence okolo tohoto šeřinu jsou v souladu se sekvencí aktivního místa serin-hydroláz /Brenner S./1988/ Nátuře 334, 528-530/· V poslední době se předpokládá, že zbytky bází nalezené těsně u serinového aktivního místa mohou být zahrnuty ve štěpení esterových vazeb v acylglycerolech lipázami /Yang C.Y.,Gu Z.-W,, Yang H.-H., Rohde M.F., Gotto Jr.

A.M. a Pownall H.J./1988/ J.Biol.Chem. 265, 16822-16827/.

Je zajímavé, že takové zbytky nejsou v BSSL přítomny. Jedi-‘ né zkušební N-glykosylační místo je lokalizováno pouze sedm zbytků od šeřinu. Stupeň glykosylace /BlSckberg L. a Hernell 0. /1981/ Eur.J.Biochem 116,221-225; Lombardo D., Guy O. &, Figarella C. /1978/ Biochim.Biophys.Acta 527, 142-149/ potvrzuje, že enzym obsahuje 0-vázané karbohydráty. Existuje mnoho míst, kde by se mohla taková glykosylace objevit. Aminokyselinové složení čištěného enzymu prokázalo vysoký obsah prolinových zbytků /BlSckberg L. a Hernell Ο./1981/ Eur.J.Biochem 116, 221-225/. Aminokyselinová sekvence získaná z cDNA toto potvrzuje. Nejvíce prolinových zbytků je lokalizováno v 16 opakováních 11 zbytků, tvořících hlavní část Cterminální poloviny enzymu.

E. Porovnání enzymů v mléčné žláze /BSSLú a pankreatu /CEH/

BSSL lidského mléka a lidská pankreatická CEH se projevují jako podobné, ačkoliv identické nejsou. Předložené údaje potvrzují, že dva enzymy jsou produkty téhož genu. Nukleotidovú sekvence cDNA klonů ukazuje, že pankreatický klon ACEH je identický s klonem ABSSL lidské mléčné žlázy od póly A “chvostu a 996 bází směrem k 5'-konci, včetně sekvence kódující pro opakování bohatá na prolin. Nojtheřn blot prokážu-24jediný pruh 2,5 kb v RNA z pankreatu a laktující mléčné žlázy /obr.IV/. Genomický Southern blot dále podporuje myšlenku, že pouze jeden gen kóduje pro BSSL a CEH. Rozdíly v mobilitě na SDS-PAGE mezi BSSL a CEH mohou být vyloženy jako následek různé glykosylace nebo rozdílného spojení.

Podobnost BSSL krysím a hovězím enzymům /viz dále/ a výsledky z genomických blotů podporují možnost, že rozdílné spojení nemůže objasnit rozdíl v mobilitě. Jelikož C-terminální sekvence nebyla v proteinu potvrzena je méně pravděpodobná možnost, že CEH může být získávána proteolytickým štěpením na C-terminálním konci.

Tak dlouho, jak jsou známy pankreatické enzymy, které zřejmě odpovídají CEH, jsou tyto často pojmenovávány po druzích a zejména substrátech, používaných pro stanovení jejich aktivit: lisofosfolipáza, cholesterylesteráza, sterolester-hydroláza, nespecifická lipáza, karboxyester-lipáza a cholesterylester-hydroláza. Dostupné údaje jsou kompatibilní is názorem, že všechny tyto aktivity, které jsou popsány, vycházejí z jedné a té samé funkční entity /BlSckberg L./1981/ Pat digestion in newborn infant.Umeů University Medical Dissertations New Series No 71} Rudd E.A, a trockman H.L./1984/ v Lipases /Borgstrflm B. a BrockmairH.L. eds/ str. 184-204, Elsevier, Amsterodam/. Ilustruje to širokou substrátovou specifitu a relevantnost jejich označení jako nespecifické lipázy. Jestliže se sekvence lidské BSSL/CEH porovná se sekvencí lysofosfolipázy z tuku pankreatu /Han J.H., Stratowa C. a Rutter W.J./1987/ Biochemistry 26, 1617-1625/ a cholesterolesterázy z hovězího pankreatu /Kyger Ε., Wiegand R., a Lange L./1989/ Biochim.Biophys.Pes.Com 164, 1302-1309/ byly nalezeny intenzivní podobnosti v prodloužení asi 530 zbytků od N-konce /obr.V/, ale liší se v části molekuly, kde se vyskytují opakování. Krysí enzym má pouze Čtyři opakování a hovězí tři.Proto je lidský enzym značně delší peptid.

Navíc byly nalezeny neobyčejné podobnosti mezi BSSL a množstvím typických esteráz, např. acetylcholinesterázami různých druhů včetně lidí a Drosophila a karboxyl-esterázami /obr.VI/. Tyto podobnosti byly omezeny na N- koncových 300 zbytků BSSL, které zahrnují hypotetické aktivní místo serinového zbytku. Podobnost s acetylcholinesterázou.byla predpovězena ze skutečnosti, že BSSL je inhibována typickými inhibitory cholin-esterázy /BISckberg L. a Hernell 0./1981/ Eur.J.Biochem 116,221-225;BISckberg

L, , Lombardo D.,Hernell 0., Guy 0. a Olivecrona T./1981/

FE3S Lett.136,284-288; Lombardo D., Guy 0. a Figarella C. /1978/ Biochim Biophys.Acta 527, 142-149/. S možnou výjimkou karbox.yl-esterézy krysích jater /Cammulli E.D., Linke

M. J., Brockman H.L a Hui D.Y./1989/ Biochim.Biophys.Acta 1005, 177-182/, žádný z těchto enzymů nevykazoval stejnou závislost na žlučové soli jako BSSL; to potvrzuje, še strukturní báze těchto vlastností jsou-umístěny v C-terminální části proteinu. Navíc BSSL může účinně atakovat eraulgované substráty, což není charakteristické pro podobné esterázy. Pro tuto aktivitu je žlučová sůl základním předpokladem.

Předpovězená sekvence lidské BSSL byla porovnána s jinými dobře charakterizovanými savčími lipázami. Nehledě na shodnou sekvenci poblíž aktivního místa šeřinu /G-X-S-X-G/, nebyly nalezeny žádné zřejmé podobnosti /Mickel S,, Wěidenbach F., Swarovsky B., LaForge S. a Scheele G./1989/ J.Biol.Chem.264, 12895-12901/.

Navíc k podobnostem s jinými enzymy zde jsou také výrazné podobnosti s jedním c-AMP závislým proteinem z Dyctyostellium discoideum /Mann S.K.O. a Firtel R.A./1987/ Mol.Cell.Biol. 7,458-469/, jakož i s thyroglobulinem z některých druhů /obr.VI/ /Mercken L., Simons M.J., Swillensr S.', Masser M, a Vassart G./1985/ Nátuře 316,647-651 ;Lauro . ' /’ . . . -26- \

R., Obici S., Condliffe D., Ursini V.M., Musti A., Moscatelli C. a Avvedimento V,E./1985/ Eur.J.Biochem.148,7-11 i Malthiery Y. a Lissitzky S./1987/ Eur.J.Biochem. 165, 491498/. Podobnosti mezi BSSL a thyroglobulinem, které zahrnují oblast aktivního místa, ale ne aktivní místo samotné indikují, že tyto vysocekonzervované řetězce aminokyselin jsou důlěžitější, než pouze při podpoře enzymatické aktivity esteráz.

Jako závěr- lidská mléčná BSSL obsahuje 722 zbytků aminokyselin. Dostupné údaje jasně ukazují, že její peptidový řetězec je identický s tímtéž řetězcem pankreatické CEH a že jsou kódovány tímtéž genem. Nejzřejmější je,že nukleotidové sekvence na jejich 3-koncích a jejich N-terminálních aminokyselinových sekvencích jsou identické. Neobyčejné homologie nalezené u krysí pankreatické lysofosfolipázy a hovězí pankreatické cholesterol-esterázy podporují hypotézu, že tyto enzymy jsou funkčně identické. Nicméně, jak bylo potvrzeno, rozdílné molekulové velikosti, zjištěné mezi druhy, nejsou způsobeny rozdíly pouze v gl,ykosylacij odrážejí různý počet opakování jedenácti aminokyselin. Podobnost sekvence aktivního místa mezi těmito esterézami potvrzuje, že tyto proteiny jsou získány z běžného zděděného genu.

Na obr. I - VII jsou uvedeny následující údaje.

•v fh Obr.l: Separace tryptického digestu BSSL pomocí HPLC • l

Čištěná BSSL byla zpracována s trypsinem a chromatografována HPLC jak je popsáno v části Materiály a metody. Označené píky byly odebrány a Čištěny dále rechromatograficky a byla stanovena jejich aminokyselinová sekvence.

-27Obr.II: cDNA nukleotidová sekvence a předpovězená aminokyselinová sekvence pro lidskou žlučovou solí stimulovanou lipázu cDNA je 2428 bází dlouhá. N-terminální 23-kodonová sekvence /nt82-150/ vycházející z ATG, je interpretována jako leader peptid, jelikož N-terminální aminokyselinová sekvence maturovaného proteinu začíná u kodonu 24 /nt 151, Ala/. Leader peptid je podtržen. Označení * označuje počáteční bod exonu. Označení znamená počáteční bod opakující se části.

Obr.III: Nukleotidová sekvence C-terminálních Gc-bohatých opakování v lipáze stimolované žlučovou solí u

Substituce jsou označeny .

Obr.IV: Northern blot hybridizace

Analýza Northert blot celkové RNA izolované z lidské laktující mléčné žlázy, pankreatu, adipozové tkáně a lidské hepatomové buněčné linie /HepG2/. Celková TNA /10 ^ug/ z laktující mléčné žlázy /dráha A/, pankreatu /dráha B/, adipozové tkáně /dráha 0/ a HepG2 /dráha D/, byly zpracovány elektroforézou na 1% agarosovém gelu ve 40 mM MOPS pufru při pH 7,0 po denaturaci RNA v 1M glyoxalu, 50% dimethylsulfoxidu a 40 mM MOPS. Glyoxalátovaná RNA byla pak přenesena na nítrocelulozový papír pro hybridizaci s /^J P/ značenou BSSL cDNA /ABSSL/.

Obr.V: Porovnání předpovezené aminokyselinové sekvence z

BSSL z lidského mléka, krysí pankreatické lysofosfolipázy /Ratlpl/ /Han J.H., Stratowa C. a Rutter W.J. /1987/ Biocheraistry 26, 1617-1625/, a hovězí pankreatické cholesterol-esterázy /Bovceh//Kyger E., Wiegand R. a Lange L. /1989/ Biochim.Biophys.Res.Com .·** v:

-28164,1302-1309/:

Serinové zbytky obsažené v aktivním místě jsou označeny * a označuje jednotlivý možný N-glykosylační signál proteinu. Přímá opakování sekvencí aminokyselin jsou v rámečcích. Protější sekvence jsou označeny velkými * písmeny, protější sekvence mezi dvěma enzymy jsou označeny malými písmeny a nesrovnalosti tečkou.

Obr.VI: Porovnání primární struktury BSSL s jinými esterázami, thyroglobulinem a jedním c-AMP dependentním enzymem z Dictyostelium discoideum:'

BSSL: lidská žlučovou solí stimulované lipáza, Cheshum: cholinesteráza z fatální .lidské tkáně /Prody C., ZevinSonkin D., Gnatt A., Goldberg O,, a Soreg H./1987/ Proč.

Nati.Acad.Sci.USA 84, 355-3559/, Torpace :acet,ylcholinesteráza z Torpédo marmorata /Sikorav J-L., Krejci Ξ. a Massoulie’J. /1987/ EMBO J. 6,1865-1873/, Drosceh: karboxyesterhydroláza z Drosophila melaogaster /Oakeshott J.G.,Collet

C., Phillis R.W., Nielsen K.M., Russel R.J., Cambers G.K., fíoss. V. a Richmond R.C. /1987/ Proč.Nati.Acad.Sci.USA 84, 3359-3363/, Hatlivce: karboxylesteráza z krysích jater /Long R., Satho H., Martin B., Kimura S., Gonzales F. a Pohl L.

> /1988/Biochem.Biophys.Res.Comm, 156, 866-873/, Drosace:

*^? acetylch olinesteráza z Drosophila melaogaster /Halí L.M.

C. a Spierer P. /1986/ EMBO J. 5, 2949-2954/, Thyrhum: thyroglobulin lidský /Malthiery Y. a Li_ssitzky S. /1987/

Eur, J.Biochem.165, 491-498/ a Dict.Di: c-AMP dependentní enzym z Dictyostelium discoideum /Mann,S.K.O. a. Firtel R.A. . /1987/ Mol.Cell Biol.7, 458-469/. Existuje zde 7 různých domén, které ukazují podobnosti mezi enzymy. Rámečky uzavírají zbytky, které jsou identické a malá písniena ve shodné /consensus/ sekvenci označují identické zbytky ve všech enzymech s výjimkou jednoho. Tečky označují nesrovnalosti.

; \ ·. -29- . ·

Serinový zbytek obsažený v aktivním místě je označen *♦. Obrázek v pravém rohu ukazuje, jak jsou domény orientovány.

Obr.VII:

poskytuje aminokyselinovou sekvenci 1-722 pro celý protein /jednopísmenový kod/ a indikuje exony a, b, ca d. Označení ψ indikuje výchozí bod opakující se části.

f '¹ ' CÓiC! C,' '4.·*^*·* y·¹/ · ·\ xa&a.'··

.....·’-·« i'. · · ·* .·

Tabulka 1 ' ..· _

Aminokyselinová_; sekvence BSSL.peptidů.

Z důvodů interferujících píků- nemohla být u peptidu Č.26 provedena pozitivní identifikace zbytku v cyklech sekvenovéní i a 2. Čísla peptidů odpovídají pikům na obr.I.

Tryptické fragmenty

TP16:LysValThrGluGluAspFheTyrLys ·

TPt9:GlyIleProPheAlaAlaProThrLys TF20:LeuValSerGluPheThrIleThrLys TP24:ThrTyrAlaTyrLéuPheSerHisProSerArg TP26:PheAspValTyrThrGluSerTrpAlaGlnAsp

ProSerGlnGluAsnLys

. Tabulka· 2 · ' · \ ;<'?· ? ' . ·. ’ ' .Identifikace.exonů a, b,c'ád číslovaných’jako na . obr. II a VII ;^;' 7—/···.' v-. ' ·' ,· , ěxon umístění ______’ - ___________ mezi nukleotidy číslo mezi aminokyselinami číslo

a 986-1172 b 1173-1376 c 1377-1574 d 1575-2415	279-341 342-409 410-474 475-722
celý
protein 151-2316	1-722
celý T51-1755 protein s výjimkou opakování

: Vrt ; '•Vtek

v.> ¢♦ ·,,,/ '/'Ll w,.

r, *i/**L· u/'«

-32JUDr. Ivan KOREČEK Advokát

T15 04 PRAHA t Žitná 23

Claims (32)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. . ^rroteín uvedený na obr. VII od polohy 1 do.polohy 722.
2. 2. Protein uvedený na obr. VII od polohy 1 do polohy 535.
3. 3. Protein uvedený na obr 278.
4. 4. ^rotein uvedený na obr hy 341.
5. 5. Protein uvedený na obr hy 409.
6. 6. Protein uvedený na obr hy 474.

   VII od polohy 1

   VII od polohy 1

   Vil od polohy 1

   VII od polohy 1 do polohy do polodo polodo polo
7. 7. Protein uvedený na obr.VII od polohy 1 do polohy 278, polohy 279 do polohy 341, polohy 279 do polohy 409, pol hy 279 do polohy 474, polohy 342 do polohy 409, polohy 342 do polohy 474, nebo polohy 536 do polohy 722.
8. 8. Protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 v kombinaci. s jedním nebo více .opakováními podle obr.V.
9. 9. Protein podle kteréhokoliv ž nároků 1 až 8, mající methionin jako daláí N-terminální aminokyselinu.
10. 10. Protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyka ý zující. jednu nebo několik' podstatných funkcí, žlučovou .solí stimulované?lipázy z přirozeného zdroje;
11. 11. Funkčně ekvivalentní varianta nebo mutant proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9.
12. 12. DNA sekvence kódující pro protein s aminokyselinovou sekvencí podle nároku 1.
13. 13. DNA sekvence kódující pro protein s aminokyselinovou sekvencí podle nároku 2,
14. 14. . DNA sekvence kódující pro protein s aminokyselinovou sekvencí podle kteréhokoliv z nároků 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 a 11.
15. 15. DNA sekvence definovaná následujícími nukleotidy označenými na obr.II čísly:

    151-2316

    151-1755

    151-965

    151-1172

    J

    151-1376 151-1574 986-1172 986-1376 986-1574 1173-1376

    1173-1574
16. 16. . Vektor,obsahující DNA sekvenci kódující pro protein podle nároků 1 až 1 1 .
17. 17. Vektor, obsahující .DNA, sekvenci, podlé, nároků 1.2. až 15.

    1.8. . Hostitelský organismus transformovaný vektorem podle nároků 16 nebo 17.

    i.,, .!? U^: '>·Λ- . ·ψλ,. . ^·$·. s-i < MW& '* '/fAA.í^A í J· ‘’ί’ Λ =M.· ,V5>'4 w

    '•I 'φ,ΐ^:

    ‘V.

    -3419. Způsob přípravy proteinu podle nároků 1 až 11 kultivací hostitelského organismu, obsahujícího vektor podle nároků 16 nebo 17, a izolací proteinu.
18. 20. Farmaceutická kompozice, obsahující protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11.
19. 21. Farmaceutická kompozice, obsahující protein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 v kombinaci s lípázou nebo v kombinaci s přípravky, obsahujícími lipézu.
20. 22. Použití proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 pro výrobu léčiva pro ošetření patologických podmínek způsobených exokrinní pankreatickou insuficiencí.
21. 23. F_oužit;[ proteinu podle kteréhokoliv z nároků ¹ až 11 pro výrobu léčiva pro ošetřování cystické fibrosy.
22. 24. Použití proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 jako doplňku přípravků dětské výživy.
23. 25. Použití proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 pro výrobu léčiva pro ošetřování chronické pankreatitidy.
24. 26. Použití proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 pro výrobu léčiva pro ošetřování tukové malabsorpce.
25. 27. Použití proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 pro výrobu léčiva pro ošetřování malabsorpce vitaminů rozpustných v tucích.
26. 28. Použití proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11 pro výrobu léčiva pró ošetřování tukové malabsorpce způsobené fyziologickými příčinami.

    'v,.

    '
27. 29. Použitípodle nároků. 2 2'.až 28,'proteinu .podle. ·” .kteréhokoliv z nároků 1 až 11 v kombinaci’s;lipázou nebo ‘ - lipázami nebo v kombinaci s přípravky, obsahujícími lipózu nebo lipézy.
28. 30. Přípravek pro dětskou výživu, doplněný proteinem podle kteréhokoliv z nároků 1 az Ií.
29. 31. Protein podle nároků 1 až 11 v podstatě v čisté formě'.
30. 32. Protein podle nároků 1 až 1 1 v- izolované formě.
31. 33. ONA sekvence podle nároků 12 až 15 v podstatě v ' čisté formě.
32. 34. ONA sekvence podle nároků 12 až 15 v izolované formě.