SK281089B6

SK281089B6 - Dna sekvencie a proteíny vzťahujúce sa na lipázu stimulovanú žlčovou soľou, spôsob výroby proteínov, farmaceutické kompozície s ich obsahom a ich použitie

Info

Publication number: SK281089B6
Application number: SK1644-91A
Authority: SK
Inventors: Gunnar Bjursell; Lars Bl�Ckberg; Peter Carlsson; Sven Enerb�Ck; Olle Hernell; Jeanette Nilsson; Thomas Olivecrona
Original assignee: Aktiebolaget Astra
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1991-05-31
Publication date: 2000-11-07
Also published as: BG61165B1; GR3023618T3; AU651979B2; ZA913778B; HU9203774D0; CN1326782A; IL98273A; HU215258B; IS3710A7; HK62497A; CZ164491A3; YU95191A; SE9001985D0; IL98273A0; PH30761A; JO1694B1; JPH05507201A; PT97836A; ES2099159T3; SG48078A1

Abstract

Predložený vynález sa týka DNA sekvencií, proteínov kódovaných takými DNA sekvenciami a použitia takých proteínov. Vynález tiež zahŕňa vektory, ako sú plazmidové konštrukcie, obsahujúce také DNA sekvencie, ktoré sú schopné expresie požadovaného enzýmu. Vynález tiež zahŕňa hostiteľské organizmy transfektované takými konštrukciami, napr. baktérie, kvasinky, cicavčie bunky a transgénne zvieratá. Vynález taktiež zahŕňa spôsoby prípravy produktov podľa vynálezu. Proteíny podľa vynálezu sú príbuzné enzýmu známemu ako ľudská lipáza stimulovaná žlčovou soľou.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka DNA sekvencií, proteínov kódovaných takými sekvenciami DNA a použitia týchto proteínov. Vynález tiež zahŕňa vektory, ako sú plazmidové konštrukcie, obsahujúce také DNA sekvencie, ktoré sú schopné expresie požadovaného enzýmu. Vynález tiež zahŕňa hostiteľské organizmy transfektované takými konštrukciami, napr. baktérie, kvasinky, cicavčie bunky a transgénne živočíchy. Vynález ďalej zahŕňa spôsoby prípravy proteínov podľa vynálezu. Proteíny podľa vynálezu sa vzťahujú na enzým známy okrem iného ako ľudská lipáza stimulovaná žlčovou soľou.

Doterajší stav techniky

Ľudská laktujúca mliečna žľaza syntetizuje a sekretuje s mliekom žlčovou soľou stimulovanú lipázu /BSSL - bile sált stimulated lipase/ /Bläckberg L. Angquist K. A. a Hernell O. /1987/ FEBS Lett. 217, 37 až 41/, po špecifickej aktivácii primárnymi žlčovými soľami /Hernell O. /1975/ Eur. J. Clin. Invest. 5, 267 až 272; Hernell O. a T. Olivecrona, 1974, Human milk lipases II. Bile salt-stimulated lipase, Biochem. Biophys. Acta 369: 234 až 244; Hernell O.,

L. Bläckberg a T. Olivecrona 1981 Human milk Lipases, In Textbook of gastroenerology and nutrition in infancy, E. Lebenthal, vyd. Raven Press, New York 347 až 354/, ktorá sa podieľa u dojčených detí na endogénnej kapacite intestinálneho štiepenia tuku /Hernell O., Bläckberg L. a Bernbäck S. /1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B.S. ed./ Bristol - Myers Nutrition symposia zv. 6, str. 259272, Academic Press, New York; Hernell O., Bläckberg L., B. Frederikzon a T. Olivecrona, /1981/ Bile salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neonatal periód. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy, E. Lebenthal, vyd. Raven Press, New York, 465 až 471; Bembäck S., Bläckberg L. a Hernell O. /1990/ J. Clin. Invest. 221 až 226 /1990//. Tento enzým, ktorý sa rovná približne 1 % celkového mliečneho proteínu /Bläckberg L. a Hernell O. /1981/ Eur. J. Biochem. 116, 221 až 225/, je nešpecifickou lipázou; in vitro hydrolyzuje nielen tri-, di- a monoacylglyceroly, ale tiež cholesteryl- a retinylestery a lyzofosfatidylglyceroly /Hernell O. a Bläckberg L. /1982/ Pediatr. Res. 16, 882 až 885; Bläckberg L., Lombardo D., Hernell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284 až 288; Frederikzon B., Hernell O., Bläckberg L. a 0livecrona T. /1978/ Pediatr. Res. 12, 1048 až 1052; Wang

C. -S., Hartsuck J. A. aDowns D. /1988/ Biochemistry 27, 4834 až 4840/. Navyše jej aktivita nie je obmedzená na emulgované substráty, ale rovnakými rýchlosťami sú hydrolyzované micelárne a rozpustné substráty /Bläckberg L. a Hernell O. /1983/ FEBS Lett. 157, 337 až 341/.

BSSL nie jc degradovaná počas prechodu mlieka žalúdkom a v duodenálnom obsahu je chránená žlčovými soľami pred inaktiváciou pankreatickými proteázami, ako je trypsín a chymotrypsín /Hernell O. /1975/ Eur. J. Clin. Invest. 5, 267 až 272; Bläckberg L. a Hernell O. /1983/ FEBS Lett. 157, 337 až 341/. Predsa len je inaktivovaná pasterizáciou mlieka napr. zahriatím na 62,5 °C, 30 minút /Bjorksten B., Burman L. G., de Chateau P., Frederikzon

B., Gothefors L. a Hernell O. /1980/ Br. Med. J. 201, 267 až 272/. Modelové pokusy in vitro potvrdzujú, že konečné produkty štiepenia triacylglycerolu sa v prítomnosti BSSL /Bernbäck S., Bläckberg L. a Hernell O. /1990/, J. Clin. Invest. 221 až 226 /1990/; Hernell O. a Bläckberg L /1982/ Pediatr. Res. 16, 882 až 885/ líšia. Vzhľadom na väčšie in tralumináme koncentrácie žlčovej soli počas neonatálneho obdobia /Brueton : J. /1978/ Gut 19, 95 až 98; Murphy G.

M. a Singer E. /1975/ Gut 15, 151 až 163/ môže byť zlepšená absorpcia produktov /Bernbäck S., Bläckberg L. a Hernell O. /1990/ J. Clin. Invest. 221 až 226, /1990//.

Karboxylester-hydroláza /CEH/ ľudskej pankreatickej šťavy /Lombardo D., Guy O. Figarella C. /1978/ Biochem. Biophys. Acta 527, 142 až 149/ sa funkčne javí ako identická alebo aspoň veľmi podobná BSSL /Bläckberg L., Lombardo D., Hernell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284 až 288/. Obsahuje tiež zvyčajné epitopy /Bläckberg L., Lombardo D., Hernell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284 až 288; Abouakil

N. , Rogalska E., Bonicel J. a Lombardo D. /1988/ Biochem. Biophys. Acta 961, 299 až 308/, majú identické N - terminálne aminokyselinové sekvencie /Abouakil N., Rogalska E., Bonicel J. a Lombardo D. /1988/ Biochem. Biophys. Acta 961, 299 až 308/ a sú inhibované inhibítormi serín-esteráz, napr. eserínom a diizopropylfluorofosfátom /Bläckberg L. a Hernell O. /1981/ Eur. J. Biochem. 116, 221 až225; Bläckberg L. Lombardo D., Hernell O., Guy O. a Figarella C. /1978/ Biochem. Biophys. Acta 527, 142 až 149/. Bolo predpokladané, že dva enzýmy sú produktmi rovnakého génu /Hernell O., Bläckberg L. a Lindberg T. /1988/ v Textbook of Gastroenterology and Nutrition in infancy /Lebenthal E., cd./ str. 209 až 217, Raven Press, New York/. Pozorovaný rozdiel v molekulovej veľkosti /Bläckberg L. Lombardo D., Hernell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284 až 288; Frederikzon B., Hernell O., Bläckberg L. a Olivecrona T. /1978/ Pediatr. Res. 12, 1048 až 1052/ by mohol byť vysvetlený rozdielnymi rôznymi stupňami glykozylácie, ako bolo v poslednom čase potvrdené /Abouakil N., Rogalska E., Bonicel J. a Lombardo D. /1988/ Biochem. Biophys. Acta 961, 299 až 308/.

Diétne lipidy sú dôležitým zdrojom energie. Energeticky bohaté triacylglyceroly tvoria viac ako 95 % týchto lipidov. Niektoré z týchto lipidov, napr. určité mastné kyseliny a vitamíny rozpustné v tukoch, sú podstatnými diétnymi zložkami. Pred gastrointestinálnou absorpciou, triacylglyceroly, ako aj minoritné zložky, t. j. esterifikované v tukoch rozpustné vitamíny a cholesterol a diacylfosfatidylglyceroly, vyžadujú hydrolýzu esterových väzieb na získanie hydrofóbnejších, absorbovateľných produktov. Tieto reakcie sú katalizované špecifickou skupinou enzýmov nazývaných lipázy.

U dospelého človeka sú za podstatné lipázy považované gastrická lipáza, pankreatická kolipáza - závislá lipáza (hydrolýza tri- a diacylglycerolu), pankreatická fosfolipáza AZ (diacylfosfatidylglyceroly) a karboxyesterhydroláza (cholesterylestery a estery v tukoch rozpustných vitamínov). U dojčených novorodencov hrá žlčovou soľou stimulovaná lipáza dôležitú úlohu pri hydrolýze niektorých uvedených lipidov. Spolu so žlčovými soľami produkty štiepenia lipidov tvoria zmesové micely, z ktorých dochádza k absorpcii. /Hernell O., Bläckberg L. a Bernbäck S. /1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B. S., ed./ Bristol-Myers Nutrition symposia zv. 6, str. 259272, Academic Press, New York; Hernell O., Bläckberg L., Frederikzon a T Olivecrona /1981/ Bile salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neonatal periód. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, vydavateľ Raven Press, New York, 465 až 471; Bembäck S., Bläckberg L. a Hernell O. /1990/ J. Clin. Invest. 221 až 226 /1990/.

Zvyčajnými prípadmi zlej lipidovej absorpcie a teda podvýživy sú znížené intralumináme hladiny pankreatickej kolipázy - závislej lipázy a/alebo žlčových solí. Typickými príkladmi takého nedostatku lipázy sú pacienti trpiaci cystickou fibrózou, bežnými genetickými poruchami vedúcimi u asi 80 % pacientov ku skráteniu dĺžky života, a chronickou pankreatitídou, často spôsobenou chronickým alkoholizmom.

Funkcia pankreasu a pečene nie je úplne vyvinutá pri narodení, predovšetkým nie u predčasne narodených detí. Zvyčajne je zistená zlá tuková absorpcia z fyziologických príčin a predpokladá sa, že vzniká z nízkych intraluminárnych koncentrácií pankreatickej kolipázy - závislej lipázy a žlčovej soli /Hemell O., Bläckberg L. a Bembäck S. /1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B. S., ed./ Bristol-Myers Nutrition symposia zv. 6, str. 259272, Academic Press, New York; Hernell O., Bläckberg L., Frederikzon a T Olivecrona /1981/ Bile salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neonatal periód. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, vydavateľ Raven Press; Brueton M. J., Berger H. M., Brown G. A., Ablitt L., Iyangkaran N. a Wharton B. A. /1978/ Gut 19, 95 až 98; Murphy G. M. a Singer E. /1975/ Gut 15, 151 až 163; Hemell O., Staggers J. E. a Carey M. C. Biochemistry /1990/, 29: 2041 až 2056/. Predsa však kvôli BSSL je taká zlá absorpcia menej častá u dojčených detí ako u detí kŕmených pasterizovaným ľudským mliekom vhodným pre deti /Hemell O., Bläckberg L. a Bembäck S. /1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B. S., ed./ Bristol-Myers Nutrition symposia zv. 6, str. 259272, Academic Press, New York; Hemell O., Bläckberg L., Frederikzon a T. Olivecrona /1981/ Bile salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neonatal periód. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, vydavateľ Raven Press, New York, 465 až 471; Bembäck S., Bläckberg L. a Hemell O. /1990/ J. Clin. Invest. 221 až 226 /1990/; Bjôrksten B., Burman L. G., De Chateau P., Frederikzon B., Gothefors L. a Hemell O. /1980/ Br. Med. J. 201, 267 až 272; Atkinson S. A., Bryan M. H. a Andersson G. H. /1981/, Human milk in feeding in premature infants: protein, fat a carbohydrate balance in the first two days of life, J. Pediatr. 99: 617 až 624; Chappel J. E., Clandinin M. T., C. Kearney - Volpe, Reichman B. a Swyer P. W. /1986/ Fatty acid balance studies in premature infants fed human milk or formula: effect of calcium supplementation, J. Pediatr. 108: 438 až 447; Williamson S., Finucate E., Ellis H. a Gamsu H. R. /1978/, Effect of heat treatment of human milk on absorption of nitrogen, fat, sodium, calcium and phosphorus by preterm infants, Árch. Dis. Childhood 53: 555 až 563/. Toto je jedna z príčin, prečo je predkladaná teória, že novorodenci, predovšetkým predčasne narodené deti, ktoré nemôžu byť kŕmené materským mliekom svojich matiek, by mali byť kŕmené nepasterizovaným mliekom iných matiek /Bjôrksten B., Burman L. G., de Chateau P, Frederikzon B., Gothefors L. a Hemell O. /1980/ Br. Med. J. 201, 267 až 272/.

Liečenie pacientov postihnutých deficitom pankreatickej lipázy zahŕňa podanie veľmi veľkých dávok surového prípravku prasačích pankreatických enzýmov. Kolipáza - závislá pankreatická lipáza je pri nízkom pH inaktivovaná. Také podmienky prevládajú v žalúdku, čo spôsobuje, že orálne podávaná pankreatická lipáza je v skutočnosti celkom inaktivovaná prechodom zo žalúdka do čreva. Tento efekt nemôže byť úplne prekonaný použitím veľkých dávok enzýmu. Veľké podávané dávky nie sú u mnohých pacientov adekvátne a prípravky nie sú čisté a chutné. Niektoré tabletky boli formulované tak, že prechádzajú kyslými oblasťami žalúdka a uvoľňujú enzým len v relatívne alkalickom prostredí jejuna. Predsa však mnoho pacientov pos tihnutých pankreatickými poruchami má abnormálne kyslé jejunum a také tabletky potom neuvoľňujú a môžu byť preto neúčinné. Navyše, pretože dostupné prípravky sú z nehumánneho zdroja, je tu nebezpečenstvo imunoreakcií, ktoré môžu mať nebezpečný vplyv na pacienta alebo vedú k zníženiu účinku liečby. Ďalšou nevýhodou existujúcich prípravkov je, že ich obsah iných lipolytických aktivít ako kolipázy - závislej lipázy nie je stanovený. V skutočnosti väčšina z nich obsahuje veľmi nízke hladiny CEH/BSSL aktivity. Toto môže byť jedna z príčin, prečo mnoho pacientov, trpiacich cystickou fibrózou cez doplnkovú liečbu, trpí deficitom vitamínov rozpustných v tukoch a esenciálnych mastných kyselín.

Existuje značná potreba produktov s vlastnosťami a štruktúrou odvodenou od ľudských lipáz a so širokou substrátovou špecifítou, ktoré by mohli byť orálne podávané pacientom trpiacim nedostatkom jedného alebo niekoľkých pankreatických lipolytických enzýmov. Produkty podľa predloženého vynálezu spĺňajú túto potrebu samotné alebo v kombinácii s ďalšími lipázami alebo v kombinácii s prípravkami obsahujúcimi ďalšie lipázy. Ďalej pre niektoré deti je tu potreba zlepšenia využitia tuku z bežných detských prípravkov alebo pasterizovaného ľudského mlieka z takzvaných mliečnych bánk.

BSSL má niektoré jedinečné vlastnosti, pre ktoré je ideálne vhodná na substitučnú a doplnkovú terapiu. Svojím charakterom je určená na orálne podávanie. Je rezistentná pri prechode žalúdkom a je aktivovaná v obsahu tenkého čreva. Jej špecifický aktivačný mechanizmus by mal brániť nebezpečnej lipolýze potravín alebo tkanivových lipidov počas zdržania a prechodu na miesto jej pôsobenia. Vzhľadom na svoju širokú substrátovú špecifickosť je schopná kompletného štiepenia diétnych lipidov vrátane esterov v tukoch rozpustných vitamínov.

BSSL môže byť vynikajúca s pankreatickou kolipázou - závislou lipázou na hydrolýzu esterových väzieb obsahujúcich polynenasýtené mastné kyseliny s dlhým reťazcom.

V prítomnosti gastrickej lipázy a v neprítomnosti alebo pri nízkych hladinách kolipázy - závislej lipázy BSSL je možné zistiť úplné in vitro štiepenie triacylglycerolu, i keď hladiny žlčových solí sú také nízke ako u novorodencov. Za prítomnosti BSSL konečné produkty štiepenia triacylglycerolu tvoria voľné mastné kyseliny a monoacylglycerol, získané inými dvoma lipázami /Bembäck S., Bläckberg L. a Hemell O. /1990/ J. Clin. Invest. 221 až 226 /1990//. Môžu podporovať absorpciu produktu predovšetkým, keď sú intralumináme hladiny žlčových solí nízke /Hemell O., Bläckberg L. a Bembäck S. /1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B. S., ed./ Bristol-Myers Nutrition symposia zv. 6, str. 259272, Academic Press; Hemell O. Staggers J. E. a Carey M. C. Biochemistry /1990/, 29: 2041 až 2056/.

Podľa skoršieho prístupu bola detská výživa vyvíjaná a zlepšovaná podľa toho, aby jej zloženie bolo čo najpodobnejšie ľudskému mlieku. Takú potravu je žiaduce doplniť.

Použitie žlčovou soľou stimulovaných lipáz (BSSL) alebo proteínov s podstatnými funkciami BSSL na doplnenie, substitúciu alebo terapiu predsa však vyžaduje prístup k značnému množstvu produktu. V priemyselnom meradle nie je možné využívať prirodzené zdroje, ako je mlieko, ako východiskové suroviny. Okrem uvedeného problému s inaktívnou BSSL počas pasterizácie je tu ďalej nebezpečenstvo kontaminácie materiálu z prirodzeného zdroja infenkčnými činidlami, napr. vírusmi, ako je HIV vírus a CMV. Preto existuje potreba dostupnosti produktov majúcich BSSL vlastnosti vo veľkej miere. Predložený vynález poskytuje také produkty a spôsoby ich prípravy.

SK 281089 Β6

Podstata vynálezu

Predložený vynález je založený na klonovaní cDNA kódujúcej BSSL odvodenú od ľudskej mliečnej žľazy. Bola tiež izolovaná z ľudského pankreasu parciálna cDNA kódujúca CEH. Odvodené aminokyselinové sekvencie od ľudských cDNA a porovnanie s CEH iných druhov podporujú výklad, že BSSL a CEH sú identické.

Ako bude ďalej detailnejšie opísané, bolo s prekvapením zistené, že štruktúra proteínu odvodeného od cDNA sekvencie je celkom rozdielna od štruktúry iných lipáz. Štruktúra sa neočakávane javí byť podobnejšia štruktúre typických esteráz ako je cholínesteráza.

S odkazom na obr. II a obr. VII, produkty podľa vynálezu sú:

a) proteín definovaný aminokyselinovou sekvenciou 1 až

722 na obr. VII,

b) proteín definovaný aminokyselinovou sekvenciou 1 až

535 na obr. VII,

c) proteín definovaný aminokyselinovou sekvenciou 1 až 278 na obr. VII,

d) proteín definovaný aminokyselinovou sekvenciou 1 až 341 na obr. VII,

e) proteín definovaný aminokyselinovou sekvenciou 1 až 409 na obr. VII,

í) proteín definovaný aminokyselinovou sekvenciou 1 až 474 na obr. VII,

g) kombinácia proteínov definovaných pod b) až f), napr. definovaných aminokyselinovou sekvenciou v polohách 1 až 278, 279 až 341, 279 až 409, 279 až 474, 342 až 474 a

536 až 722,

h) kombinácia proteínov definovaných pod b) až g) v kombinácii s jedným alebo viacerými opakovaniami podľa obr. V,

i) proteín definovaný pod a) až h), majúci ďalšiu N - terminálnu aminokyselinu, predovšetkým metionín a funkčne ekvivalentné varianty a mutanty proteínov definovaných pod a) až i).

Treba uviesť, že proteíny a, b, c, d, e, f, g, h a i nebudú vo všetkých hľadiskách identické s prirodzene sa vyskytujúcou BSSL, ale budú mať jednu alebo viac podstatných funkcií prirodzene sa vyskytujúcej BSSL. Podstatné funkcie sú uvedenej ďalej.

j) DNA sekvencia kódujúca proteíny definované pod a, b, c, d, e, f, g, hai.

k) DNA sekvencia podľa obr. II definovaná nasledujúcimi nukleotidmi na obr. II:

a) DNA sekvencia 151 až 2316 podľa obr. II, kódujúca proteín definovaný sekvenciou aminokyselín 1 až 722 na obr. VII,

b) DNA sekvencia 151 až 1755 podľa obr. II, kódujúca proteín definovaný sekvenciou aminokyselín 1 až 535 na obr. VII,

c) DNA sekvencia 151 až 985 podľa obr. 11, kódujúca proteín definovaný sekvenciou aminokyselín 1 až 278 na obr. VII,

d) DNA sekvencia 151 až 1172 podľa obr. II, kódujúca proteín definovaný sekvenciou aminokyselín 1 až 341 na obr. Vil,

e) DNA sekvencia 151 až 1376 podľa obr. II, kódujúca proteín definovaný sekvenciou aminokyselín 1 až 409 na obr. Vil,

f) DNA sekvencia 151 až 1574 podľa obr. II, kódujúca proteín definovaný sekvenciou aminokyselín 1 až 474 na obr. Vil,

g) DNA sekvencia 986 až 1172 podľa obr. II, kódujúca proteín definovaný sekvenciou aminokyselín 279 až 341 na obr. VII,

h) DNA sekvencia 986 až 1376 podľa obr. II, kódujúca proteín definovaný sekvenciou aminokyselín 279 až 409 na obr. VII,

i) DNA sekvencia 986 až 1574 podľa obr. II, kódujúca proteín definovaný sekvenciou aminokyselín 279 až 474 na obr. VII,

j) DNA sekvencia 1173 až 1376 podľa obr. II, kódujúca proteín definovaný sekvenciou aminokyselín 342 až 409 na obr. VII,

k) DNA sekvencia 1173 až 1574 podľa obr. II, kódujúca proteín definovaný sekvenciou aminokyselín 342 až 474 na obr. VII,

Významné funkcie proteínov podľa vynálezu sú:

a) vhodnosť na orálne podanie,

b) sú aktivované špecifickými žlčovými soľami,

c) pôsobia ako nešpecifická lipáza v obsahu tenkého čreva a sú tak schopné hydrolyzovať lipidy relatívne nezávisle od ich chemickej štruktúry a fyzikálneho stavu (emulgované, miceláme, rozpustené),

d) schopnosť hydrolyzovať triacylglyceroly mastných kyselín s rôznou dĺžkou reťazca a rôznym stupňom nenasýtenia,

e) schopnosť hydrolyzovať tiež diacylglycerol, cholesterylestery, monoacylglycerol, lysofosfatidylacylglycerol a retinyl a iné estery vitamínov rozpustných v tukoch,

f) schopnosť hydrolyzovať nielen sn-l(3) esterové väzby v triacylglycerole, ale tiež sn-2 esterovú väzbu,

g) schopnosť byť ovplyvňovaný nielen primárnymi, ale tiež sekundárnymi žlčovými soľami,

h) závislosť optimálnej aktivity od žlčových solí,

i) taká stabilita, že obsah žalúdka neovplyvňuje katalytickú účinnosť v žiadnom podstatnom stupni,

j) stabilita proti inaktivácii pankreatickými proteázami, napr. trypsínom za podmienky, že sú prítomné žlčové soli,

k) schopnosť viazať heparín a jeho deriváty, napr. heparánsulfát,

l) schopnosť väzby na rozhraní lipid - voda,

m) stabilita pri lyofilizácii,

n) stabilita pri zmiešaní so zložkami potravy, ako je mlieko alebo mliečne prípravky.

Kritické funkcie pre doplnky, náhrady alebo liečbu sú uvedené pod a, c, d, e, f, i, j a 1. Na iné účely nie sú potrebné všetky kritické funkcie.

Na expresiu uvedených proteínov budú príslušné DNA sekvencie uvedené inzertované do vhodného vektora, ktorý je potom zavedený do vhodného hostiteľského organizmu. Uvedený vektor bude obsahovať príslušné signálne a ďalšie sekvencie, umožňujúce organizmu exprimovať požadovaný proteín.

Vhodné organizmy na expresiu:

Technikami rekombinácie DNA je možné klonovať a exprimovať požadovaný proteín v rôznych prokaryotických a eukaryotických hostiteľských organizmoch. Možnými organizmami na expresiu sú baktérie, jednoduché eukaryoty (kvasinky), kultúry živočíšnych buniek, kultúry buniek hmyzu, kultúry rastlinných buniek, rastliny a transgénne živočíchy. Každý jednotlivý systém má sám osebe určité výhody a nevýhody. Je možné urobiť jednoduchý záver, že každý gén, ktorý má byť exprimovaný, je zvláštnym prípadom a je vhodné neštandardné riešenie.

Zvyčajne užívanými bakteriálnymi systémami sú E.

coli, Bacillus subtilis, Streplomyces. Zvyčajne používanými kvasinkami sú Saccharomyces a Pichia pastoris. Zvyčajne

SK 281089 Β6 používanými živočíšnymi bunkami sú CHO bunky a COS bunky. Zvyčajne používanými kultúrami buniek hmyzu sú bunky získané z Drosophila.

Zvyčajne používanou rastlinou je tabaková rastlina. Možnými transgénnymi živočíchmi sú koza a krava.

Príklady možných bakteriálnych vektorov sú pUC a proteín A - vektory.

Príkladom možného kvasinkového vektora je pMA91.

Možné hmyzie vektory sú odvodené od Baculo vírusu.

Možné vektory živočíšnych buniek sú odvodené od SV/40.

Možné rastlinné vektory sú odvodené od Ti - plazmidu.

V každom systéme môžu byť použité prirodzené a syntetické promótory a terminátory.

V závislosti od výberu expresného systému môže exprimovaný proteín obsahovať N - terminálnu aminokyselinu (metionín), obsahovať málo zvláštnych aminokyselín, alebo byť fixovaný s heterológnym proteínom (napr. proteínom A), alebo sa líšiť od proteínu z prirodzeného zdroja glykozyláciou. Ďalej, vektory môžu tiež obsahovať signálne sekvencie kvôli premiestneniu proteínu do periplazmy alebo do kultivačného média.

Ďalšími aspektmi vynálezu tak sú:

a) vektor, obsahujúci DNA sekvenciu, kódujúcu vyššie špecifikovaný proteín,

b) hostiteľský organizmus, obsahujúci DNA sekvenciu špecifikovanú vyššie,

c) spôsob prípravy proteínu špecifikovaného vyššie, kultiváciou hostiteľského organizmu, obsahujúceho vektor špecifikovaný vyššie pod a) a izoláciou proteínu.

Spôsoby čistenia sú závislé od použitia expresného systému (napr. proteín A/IgG) a/alebo od metód použitých pri čistení enzýmu prirodzeného pôvodu ako je opísané v práci Bläckberg L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem. 116,221 až 225.

Ďalšími aspektmi vynálezu sú:

farmaceutická kompozícia, obsahujúca špecifikovaný proteín,

- použitie špecifikovaného proteínu na výrobu liečiva na liečenie patologických stavov spojených s exokrinnou pankreatickou insuficienciou,

- použitie proteínu špecifikovaného vyššie na výrobu liečiva na liečenie cystickej fibrózy, použitie proteínu špecifikovaného vyššie ako doplnku prípravku detskej výživy,

- použitie proteínu špecifikovaného vyššie na výrobu liečiva na liečenie chronickej pankreatitídy,

- použitie proteínu špecifikovaného vyššie na výrobu liečiva na liečenie zlej tukovej absorpcie akejkoľvek etiológie,

- použitie proteínu špecifikovaného vyššie na výrobu liečiva na liečenie zlej tukovej absorpcie vitamínov rozpustných v tukoch,

- použitie proteínu špecifikovaného vyššie na výrobu liečiva na liečenie zlej tukovej absorpcie vyvolanej fyziologickými príčinami, napr. novorodencov

DNA sckvcncia na obr. II od polohy 151 až do a vrátane polohy 2316 je sekvencia, kódujúca celý proteín. Sekvencia od polohy 2317 až do a vrátane polohy 2415 nie je translatovaná do proteínu, ale je zahrnutá v exóne d identifikovanom v tabuľke 2.

V jednom uskutočnení vynálezu, proteín definovaný v odsekoch a) až i) je poskytnutý v izolovanej forme a/alebo v podstate čistej forme.

DNA sekvencie definované v odsekoch a) až k) sú v jednom uskutočnení vynálezu poskytnuté v izolovanej forme a/alebo v podstate čistej forme.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. I až VII sú uvedené nasledujúce údaje.

Obr. I: Separácia tryptického digestu BSSL pomocou HPLC

Čistená BSSL bola spracovaná s trypsínom a chromatografovaná HPCL, ako je opísané v časti Materiály a metódy. Označené piky boli odobraté a čistené ďalej znova chromatograficky a bola stanovená ich aminokyselinová sekvencia.

Obr. II: cDNA nukleotidová sekvencia a predpovedaná aminokyselinová sekvencia pre ľudskú lipázu stimulovanú žlčovou soľou cDNA je 2428 báz dlhá. N-terminálna 23-kodónová sekvencia (nt82 až 150) vychádzajúca z ATG, je interpretovaná ako vedúci peptid, pretože N-terminálna aminokyselinová sekvencia maturovaného proteínu začína pri kodóne 24 (nt 151, Ala). Vedúci peptid je podčiarknutý. Označenie * označuje počiatočný bod exónu. Označenie # znamená počiatočný bod opakujúcej sa časti.

Obr. III: Nukleotidová sekvencia C-terminálnych GC-bohatých opakovaní v lipáze stimulovanej žlčovou soľou

Substitúcie sú označené *.

Obr. IV: Northern blot hybridizácia

Analýza Northern blot celkovej RNA izolovanej z ľudskej mliečnej žľazy, pankreasu, adipozového tkaniva a ľudskej hepatómovej bunkovej línie (HepG2). Celková TNA (10 pg) z taktujúcej mliečnej žľazy (dráha A), pankreasu (dráha B), adipozového tkaniva (dráha C) a HepG2 (dráha D), boli spracované elektroforézou na 1 % agarózovom géli v 40 mM MOPS tlmivom roztoku pri pH 7,0 po denaturácii RNA v IM glyoxale, 50 % dimetylsulfoxide a 40 mM MOPS. Glyoxalátovaná RNA bola potom prenesená na nitrocelulózový papier na hybridizáciu s (³²P) značenou BSSL cDNA (ABSSL).

Obr. V: Porovnanie predpovedanej aminokyselinovej sekvencie z BSSL z ľudského mlieka, potkanej pankreatickej lyzofosfolipázy (Ratlpl) /Han J. H., Stratowa C. a Rutter W. J. /1987/ Biochemistry 26, 1617 až 1625/, a hovädzej pankreatickej cholcsterol-esterázy (Bovceh) /Kyger E., Wiegand R. a Lange L. /1989/ Biochem. Biophys. Res. Comm 164,1302 až 1309/:

Serínové zvyšky obsiahnuté v aktívnom mieste sú označené * a# označuje jednotlivý možný N-glykozylačný signál proteínu. Priame opakovania sekvencií aminokyselín sú v rámčekoch. Opačné sekvencie sú označené veľkými písmenami, opačné sekvencie medzi dvoma enzýmami sú označené malými písmenami a nesúlad bodkou.

Obr. VI: Porovnanie primárnej štruktúry BSSL s inými esterázami, tyroglobulínom a jedným c-AMP závislým enzýmom z Dictyostelium discoideum :

BSSL: ľudská lipáza stimulovaná žlčovou soľou, Cheshum: cholínesteráza zfetálneho ľudského tkaniva /Prody C., Zevin-Sonkin D., Gnatt A., Goldberg O. a Soreg H. /1987/ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 355 až 3559/, Torpace: acctylcholínesteráza z Torpédo marmorata /Sikorav J.-L., Krejci E a Massoulie 'J. /1987/ EMBO J. 6, 1865 až 1873/,

Drosceh: karboxyesterhydroláza z Drosophila melaogaster /OakeshottJ. G., Collet C., Phillis R. W„ Nielsen K. M.,

Russcl R. J., Canbers G. K., Ross V. a Richmond R. C.

/1987/Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3359 až 3363/,

Ratlivce: karboxylesteráza z potkanej pečene /Long R.,

Satho H., Martin B., Kimura S., Gonzales F. a Pohl L.

/1988/ Biochem. Biophys. Res. Comm 156, 866 až 873/,

SK 281089 Β6

Drosace: acetylcholínesteráza zDrosophila melaogaster /Halí L. M. C. a Spierer P. /1986/ EMBO J. 5, 2949 až 2954/,

Thyrhum: ľudský tyroglobulín /Malthiery Y. a Lissitzky

S. /1987/Eur. J. Biochem. 165,491 až 498/a

Dict. Di: c-AMP dependentný enzým z Dictyostelium discoideum /Mann S. K. O. a Firtel R. A. /1987/ Mol. Celí Biol. 7, 458 až 469/.

Existuje tu 7 rôznych domén, ktoré ukazujú podobnosti medzi enzýmami. Rámčeky uzatvárajú zvyšky, ktoré sú identické a malé písmená v zhodnej (consensus) sekvencii označujú identické zvyšky vo všetkých enzýmoch s výnimkou jedného. Bodky označujú nesúlad. Serínový zvyšok obsiahnutý v aktívnom mieste je označený *. Obrázok v pravom rohu ukazuje, ako sú domény orientované.

Obr. VII: poskytuje aminokyselinovú sekvenciu I až 722 pre celý proteín (jedno písmenový kód) a indikuje exony a, b, c, a d. Označenie # indikuje východiskový bod opakujúcej sa časti.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Skratky:

aa - aminokyselina bp - bázový pár

BSSL - lipáza stimulovaná žlčovou soľou c-AMP - cyklický adenozínmonofosfát

CEH - karboxyester-hydroláza

Da - dalton c-GTP - 7-deáza-2-deoxyguanozín-5 '-trifosfát

EDTA - etyléndiamíntetraacetát kb - kilobáza

MOPS - 3-N-morfolinopropánsulfónová kyselina nt - nukleotid

PAGE -elektroforéza na polyakrylamidovom gcle

SDS - dodecylsulfát sodný

SSC - NaCl citrát x-Gal -5-bróm-4-chlór-3-indolyl-P-D-galaktopyranozid

Enzýmy lipáza stimulovaná žlčovou soľou EC 3.1.1.3 karboxyester-hydroláza EC 3.1.1.1

Materiál a metódy

A. Príprava enzýmu a protilátok

BSSL bola čistená z ľudského mlieka, ako bolo opísané /Bläckberg L. a Hernell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116, 221 až 225/. Na použitie na prípravu protilátky bol enzým ďalej čistený pomocou SDS-PAGE. Proteínový pruh zodpovedajúci lipáze bol po vyfarbení pomocou Coomassie Briliant modrej elektroeluovaný z gélu. 25 pg čisteného enzýmu, spolu s rovnakým objemom Freudovho kompletného adjuvans, bolo použitých na prvú s. c. injekciu a rovnaké množstvo enzýmu s nekompletným adjuvans pre nasledujúce mesačné posilňovacie injekcie. Králiky boli vykrvácané asi 2 týždne po každej posilňovacej dávke, boli pripravené séra a uchované pri teplote -20 “C.

B. Príprava tryptických fragmentov a analýza aminokyselinovej sekvencie mg čistenej BSSL boli rozpustené v 1 ml 0,1 M TrisC1 pufra, pH 8,5, obsahujúceho 6 M guanidínium hydrochlorid a 2 mM EDZTA. Ditioerytritol bol pridaný do koncetrácie 5 mM. Po inkubácii pri teplote 37 °C počas 2 hodín bolo pridaných 300 μΐ 50 mM jódacetátu. Po 90 minútovej inkubácii pri teplote 25 °C bez prístupu svetla bol redukovaný a karboxymetylovaný enzým odsolený na kolónii Sepadexu G-25, ekvilibrovanej 0,5 M hydrogenuhličitanom amónnym. Pred lyofilizáciou bolo pridaných 30 pg tozyl-L-fenylalanín chlórmetánom spracovaného hovädzieho trypsínu /Worthington diagnistic systém Inc., Freehol, NJ, USA/. Lyofdizovaný proteín bol rozpustený v 4 ml 0.1 M hydrogénuhličitanu amónneho a ďalej bolo pridaných 90 pg trypsínu. Po 5-hodinovej inkubácii pri teplote 37 °C bol proteín opäť lyofdizovaný. Tryptický digest bol rozpustený v 0,1 % trifluóroctovej kyseline (2 mg/ml). 300 pg trypsínom spracovanej BSSL bolo chromatizovaných na HPLC použitím C-18 kolónie sreveznou fázou a eluačným gradientom 0 až 50 % acetonitrilu v 0,1 % trifluóroctovej kyseline. Odoberanie peptidov bolo sledované kontinuálne, meraním absorbancie pri 215 nm. Peptidy, ktoré majú byť sekvenované, boli ďalej čistené rechromatografiou s použitím kolónie s upravenými gradientmi. Vzorky peptidových fragmentov po sekvenovaní boli sušené pod dusíkom na odstránenie acetonitrilu a aplikované na sekvenátor. Na N-terminálnu sekvenčnú analýzu bola natívna BSSL rozpustená v 0,1 % kyseline octovej. Sekvenčná analýza bola uskutočnená na Applied Biosystems Inc. 477A pulznom sekvenátore v kvapalnej fáze a on-line PTH 120A analyzátore s regulovanými programami cyklov a chemikáliami od výrobcu. Počiatočné a opakované výsledky, počítané zo sekvenovaného štandardného proteínu, β-laktoglobulínu, boli 47 a 97 %.

C. Izolácia RNA

Vzorky ľudskej pankreatickej adipozity a tkaniva taktujúcej mliečne žľazy boli získané chirurgicky a ihneď ponorené do guanídiumtiokyanátu (1 až 5 g v 50 ml). Celková RNA bola extrahovaná ako je opísané v práci Chirwina J. M., Przybyla A. E., MacDonalda R. J. a Ruttera W. J. /1979/ Biochemistry 18, 5294 až 5299. Poly A RNA bola pripravená chromatografiou na oligodeoxytymidilát(oligo)DT))- celulózovej kolónii /Aviv H. a Leder P. /1979/ Proc. Natl. Acad. Sci USA 69, 5201 až 5205/.

D. Konštrukcia a skríning cDNA knižníc

Približne 15 pg polyadenylovej RNA z ľudského pankreasu bolo denaturovaných metylmerkurihydroxidom /Bailey J. M. a Davidson N. /1976/ Anál. Biochem. 70, 75 až 85/ a primovaných s oligo (dT)i₂ ň is primermi /Pharmacia, Uppsala, Švédsko/ a reverzne transkribovaných použitím štandardných postupov /Maniatis T., Fritsch

E. F. a Sambrook J. /1982/: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York/. Syntéza druhého reťazca bola uskutočnená podľa práce Gublera U. a Hoffmana B. J. /1983/ Gene 25,263 až 269, s tým rozdielom, že DNA ligáza a β-NAD boli vynechané a reakčná teplota bola 15 °C. Prebytok RNA bol štiepený RNAázou A (50 pg/ml) a dvojreťazcová cDNA bola spracovaná s EcoRI metylázou /Maniatis T., Haldison R. C. a Lacy E,. Lauer J., O'Conell C. a Qvon

D. /1978/ Celí 15, 687 až 701/. Konce boli zarovnané pomocou Klenowho enzýmu. Po ligácii na EcoRI linkery a štiepení EcoRI, cDNA bola frakcionovaná na kolónii Sepharose 4B-C1. Frakcie boli vyzrážané etanolom a cDNA ligovaná do EcoRI miesta fosfatázou spracovaného gtll vektora /Young R. A. a Davis R. W. /1983/ Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80, 1194 až 198/. In vitro uskutočnenie poskytlo viac ako 7 x 10⁵ rekombinantov.

cDNA knižnica z ľudskej mliečnej žľazy, získaná z tkaniva ženy v ôsmom mesiaci tehotenstva, bola získaná od Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA.

Fágy z cDNA knižníc boli umiestnené na platňu v koncentrácii 5 x 10⁴ povlak tvoriacich jednotiek na 120 mm misku. Antisérum bolo zriedené v pomere 1 : 3200 a skríning bol uskutočnený podľa Younga R. A. a Davisa R. W. /1983/ Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80, 1194 až 1198/. Alkalickou fosľatázou konjugované kozie-antikráličie protilátky boli použité ako druhé protilátky /Bio-Rad, Richmond, CA USA/. Na izoláciu klonov zodpovedajúcich 5'koncu mRNA, bola hybridizácia nukleových kyselín uskutočnená za štandardných podmienok /Maniatis T., Fritsch E. F. a Sambrook J. /1982/: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York/. Posthybridizačné premytia boli uskutočnené s veľkou presnosťou (0,1 % SDS a 0.1 x SSC pri teplote 60 °C), (1 x SSC, 0,15 M NaCl, 0,0015 M Na₃citrát, pH 7,6).

F. Nukleotidová sekvencia cDNA inzerty z BSSL a CEH rekombinantov boli buď priamo klonované do M3mpl8 a mpl9 po sonifikácii a fŕakcionizácii podľa veľkosti alebo niektoré z nich boli ďalej subklonované do pTZ19R po štiepení pomocou P stí, BstXI, NarI, Smal a Ahall. Nukleotidová sekvencia bola stanovená dideoxy terminačnou metódou /Sanger F., Nicklen S. a Coulson A. R. /1977/ Proc. Natl. Acad. Sci, USA 74, 5463 až 5467/. GC-bohaté podiely (pozri ďalej) boli tiež sekvenované s Taql polymerázou a dc ⁷GTP. Oba reťazce boli sekvenované. Sekvenčné informácie boli získané z autorádiogramov použitím softvéru MS - EdSeq, ako je opísané v práci Sjôberga S., Carlssona P., Enerbäcka S. a Bjursella G. /1989/ CABIOS 5,41 až 46.

G. Predpovede aminokyselinových sekvencií a homológií

Na predpoveď aminokyselinovej sekvencie zodpovedajúcej cDNA inzertom, kodón použitý v rôznych čítacích rámcoch bol porovnávaný podľa Stadena a poskytol jeden otvorený čítací rámec /Staden R. /1984/ Nucl. Acids Res. 12, 551 až 567/. Homológie boli skúšané programami UWGCG softvéru /Devereux J., Haeberli P. a Smithies O. /1984/ Nucl. Acids Res. 12, 387 až 395/.

Výsledky a diskusia

A. Sekvencie tryptických fragmentov a N-konce BSSL

Trypsínové štiepenie čistenej BSSL poskytlo približne 50 ftagmetnov podľa píkov získaných HPLC chromatografiou (obr. I). Piky boli oddelené a označené piky, ktoré by mohli byť izolované vo vysoko čistom stave a v primeraných množstvách, boli sekvenované. Výsledné sekvencie sú uvedené v tabuľke I. Ďalej bolo sekventovaných 30 N-koncových zvyškov (obr. 2) a potvrdzujú skôr uvedenú sekvenciu podľa Abouakila N, Rogalskej E., Bonicela J. a Lombarda D. /1988/ Biochem. Biophys. Acta 961, 299 až 308, (30 zvyškov).

zvyškov dlhá N-terminálna sekvencia uvádzaná v práci Wanga C. S. a Johnsona K. /1983/ Anál. Biochem. 133, 457 až 461 jc glycín v tejto práci a lysín podľa uvedených autorov.

B. Nukleotidová sekvencia BSSL

Na konštrukciu Xgtll cDNA knižnice bola použitá polyadenylovaná RNA z ľudského pankreasu. Najskôr boli izolované štyri imunopozitívne klony a potom táto pankreatická cDNA knižnica bola prehľadaná antisérom proti BSSL. Nukleotidová sekvenčná analýza štyroch klonov ukázala, že sú v dokonalom súlade a zodpovedajú 3'-koncu mRNA. Všetky začínajú poly A koncom a líšia sa len v dĺžke; najdlhší inzert, označený ACEH, meria 996 bp.

cDNA knižnica z ľudskej mliečnej žľazy bola prehľadaná antisérom a pankreatickým klonom ACEH ako sondou. Pozitívne klony boli izolované z oboch skríningov, všetky z nich začínajú od 3'-konca. Najdlhší kloň ľudskej mliečnej žľazy, označený ABSSL, meria 2100 bp v protismere. Obsahuje štyri sekvenované tryptické fragmenty (obr. II), ale nezahŕňa N-terminálnu aminokyselinovú sekvenciu. Na predĺženie sekvencie ďalej od začiatku translácie bola cDNA knižnica ľudskej mliečnej žľazy znovu skrínovaná sondou s dĺžkou 118 báz získanou z najčastejších 5'proximálnych častí ABSSL. Bol izolovaný jeden kloň, ktorý pokračuje ďalej 328 nukleotidmi v protismere. Tvorí N-terminálnu aminokyselinovú sekvenciu a obsahuje zostávajúci tryptický fragment. Ako je uvedené na obr. II, v DNA je 2428 nukleotidov dlhá a obsahuje 81 báz v protismere od prvého ATG kodónu. Polyadenylačný signál, AATAAA je umiestnený 13 nukleotidov v protismere od poly A „chvosta“ a ako terminačný kodón TAG bol nájdený nukleotid 2317 nasledovaný 3'-netranslatovanou oblasťou 112 bp. GC bohatá oblasť obsahujúca 16 opakovaní 33 báz bola nájdená na 3-konci sekvencie medzi bázou 1756 a 2283. Nukleotidová sekvencia opakovania, uvedená na obr. III, obsahuje šesť identických opakovaní, obklopených desiatimi opakovaniami s rôznym počtom substitúcií, ktoré pravdepodobne vznikli po niekoľkých duplikáciách. Nízky počet substitúcií potvrdzuje, že tieto opakovania sa objavili neskôr počas vývoja.

C. Tkanivová distribúcia expresie

RNA z ľudskej laktujúcej mliečnej žľazy, pankreasu, adipozového tkaniva a z ľudskej hepatómovej bunkovej línie (HepG2) bola izolovaná Northem blottingom. Veľkosť mRNA bola stanovená približne 2,5 kb tak v laktujúcej mliečnej žľaze, ako aj v pankrease. Žiaden signál nebol detegovaný v dráhach s RNA extrahovanou z HepG2 alebo adipozového tkaniva (obr. IV).

Vzhľadom na to, že mRNA použitá na knižnicu mliečnej žľazy bola získaná od ženy v 8. mesiaci tehotenstva, je evidentné, že transkripcia a pravdepodobne translácia BSSL génu je uskutočnená pred pôrodom, v súlade s predchádzajúcimi nálezmi BSSL sekrécie pred pôrodom /Hamosh M. /1986/ vHuman Milk Infant Nutrition and Health /Howell R. R., Morriss F. H. a Pickering L. K. vyd. /str. 66 až 97, Charles C. Thomas, Springfield/, (pozri obr. IV).

D. Aminokyselinová sekvencia BSSL

Podľa SDS-PAGE bola uvedená molekulová hmotnosť 107 až 125 kDa /Bläckberg L., Lombardo D., Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284 až 288; Wang C. S. /1980/ Anál. Biochem. 105, 398 až 402/ a podľa analytickej ultracentrifugácie 105 kDa /Wang C. S. a Lee D. M. /1985/ J. Lipid. Res. 26, 824 až 830/. Enzým, ako je predpovedané z cDNA, obsahuje 722 aminokyselinových zvyškov (obr. II), ktoré pri molekulovej hmotnosti 76,271 Da, indikujú, že enzým obsahuje najmenej 15 až 50 % karbohydrátu. Vedúca sekvencia je dlhá 23 zvyškov. Skúšobné aktívne miesto serínového zvyšku je lokalizované na seríne 217 (obr. V). Sekvencie okolo tohto serínu sú v súlade so sekvenciou aktívneho miesta serín-hydroláz /Brenner S. /1988/ Náture 334, 528 až 530/. V poslednom čase sa predpokladá, že zvyšky báz nájdené tesne pri serínovom aktívnom mieste môžu byť zahrnuté v štiepení esterových väzieb v acylglyceroloch lipázami /Yang C. Y., Gu Z. W., Yang H. H., Rohde M. F., Gotto Jr. A. M. a Pownall

H. J. /1988/ J. Biol. Chem. 265, 16822 až 16827/. Je zaujímavé, že také zvyšky nie sú v BSSL prítomné. Jediné skú7 šobné N-glykozylačné miesto je lokalizované len sedem zvyškov od serínu. Stupeň glykozylácie /Bläckberg. L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116, 221 až 225/; Lombardo D., Guy O. a Figarella C. /1978/ Biochem. Biophys. Acta 527, 142 až 149/ potvrdzuje, že enzým obsahuje O-viazané karbohydráty. Existuje mnoho miest, kde by sa mohla taká glykozylácia objaviť. Aminokyselinové zloženia čisteného enzýmu preukázali vysoký obsah prolinových zvyškov / Bläckberg. L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116, 221 až 225/. Aminokyselinová sekvencia získaná zcDNA toto potvrdzuje. Najviac prolinových zvyškov je lokalizovaných v 16 opakovaniach 11 zvyškov, tvoriacich hlavnú časť C-terminálnej polovice enzýmu.

E. Porovnanie enzýmov v mliečnej žľaze (BSSL) a pankrease (CEH)

BSSL ľudského mlieka a ľudská pankreatická CEH sa prejavujú ako podobné, aj keď nie sú identické. Predložené údaje potvrdzujú, že dva enzýmy sú produktmi toho istého génu. Nukleotidová sekvencia cDNA klonov ukazuje, že pankreatický kloň ACEH je identický s klonom ABSSL ľudskej mliečnej žľazy od poly A „chvosta“ a 996 báz smerom na 5'-koniec vrátane sekvencie kódujúcej opakovania bohaté na prolin. Northem blot preukazuje jediný pruh 2,5 kb vRNA z pankreasu a laktujúcej mliečnej žľazy (obr. IV). Genomický Southern blot ďalej podporuje myšlienku, že len jeden gén kóduje BSSL a CEH. Rozdiely v mobilite na SDS-PAGE medzi BSSL a CEH môžu byť vysvetlené ako následok rôznej glykozylácie alebo rozdielneho spojenia.

Podobnosť BSSL potkaním a hovädzím enzýmom (pozri ďalej) a výsledky z genomických blotov podporujú možnosť, že rozdielne spojenie nemôže objasniť rozdiel v mobilite. Pretože C-terminálna sekvencia nebola v proteíne potvrdená, je menej pravdepodobná možnosť, že CEH môže byť získavaná proteolytickým štiepením na C-terminálnom konci.

Tak dlho, ako sú známe pankreatické enzýmy, ktoré zrejme zodpovedajú CEH, sú tieto často pomenúvané po druhoch a predovšetkým substrátoch, používaných na stanovenie ich aktivít: lyzofosfolipáza, cholesterylesteráza, sterolester-hydroláza, nešpecifická lipáza, karboxyester-lipáza a cholesterylester-hydroláza. Dostupné údaje sú kompaktibilné s názorom, že všetky tieto aktivity, ktoré sú opísané, vychádzajú z jednej a tej istej funkčnej entity /Bläckberg L. /1981/Fat digestion in newbom infant. Umea University Medical Dissertations New Šerieš No 71; Rudd

E. A. a Brockman H. L. /1984/ Lipases /Borgstrom B. a Brockman H. L. vyd. /str. 184 až 204, Elsevier, Amsterdam/. Ilustruje to širokú substrátovú špecificitu a relevantnosť ich označení ako nešpecifické lipázy. Ak sa sekvencia ľudskej BSSL/CEH porovná so sekvenciou lyzofosfolipázy z tuku pankreasu /Han J. H., Stratowa C. a Rutter W. J. /1987/Biochemistry 26, 1617 až 1625/ a cholesterolesterázy z hovädzieho pankreasu /Kyger E., Wiegand R. a Lange L. /1989/ Biochem. Biophys. Res. Comm 164, 1302 až 1309/, boli nájdené intenzívne podobnosti v predĺžení asi 530 zvyškov od N-konca (obr. V), ale líšia sa v časti molekuly, kde sa vyskytujú opakovania. Potkaní enzým má len štyri opakovania a hovädzí tri. Preto je ľudský enzým značne dlhší peptid.

Navyše boli nájdené neobyčajné podobnosti medzi BSSL a množstvom typických esteráz, napr. acetylcholínesterázami rôznych druhov vrátane ľudí a Drosophila a karboxyl-esterázami (obr. VI). Tieto podobnosti boli obmedzené na N-koncových 300 zvyškov BSSL, ktoré zahŕňajú hypotetické aktívne miesto serínového zvyšku. Po dobnosť s acetylcholín-esterázou bola predpovedaná zo skutočnosti, že BSSL je inhibovaná typickými inhibítormi cholín-esterázy /Bläckberg L. a Hernell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116, 221 až 225; Bläckberg L., Lombardo D., Hemell O., Guy O. aOlivecronaT./1981/FEBS Lett. 163, 284 až 288; Lombardo D., Guy O. a Figarella C. /1978/ Biochem, Biophys. Acta 527, 142 až 149/. S možnou výnimkou karboxyl-esterázy potkanej pečene /Cammulli E. D., Linke M. J., Brockman H. L. a Hui D. Y. /1989/ Biochem. Biophys. Acta 1005, 177 až 182/, žiaden z týchto enzýmov nemal rovnakú závislosť od žlčovej soli ako BSSL; to potvrdzuje, že štruktúrne bázy týchto vlastností sú umiestnené v C-terminálnej časti proteínu. Navyše BSSL môže účinne atakovať cmulgované substráty, čo nie je charakteristické pre podobné esterázy. Pre túto aktivitu je žlčová soľ základným predpokladom.

Predpovedaná sekvencia ľudskej BSSL bola porovnaná s inými dobre charakterizovanými cicavčími lipázami. Nehľadiac na rovnakú sekvenciu blízko aktívneho miesta serínu (G-X-S-X-G), neboli nájdené žiadne zrejmé podobnosti /Mickel S., Weidenbach F., Swarovsky B., La Forge S. a Scheele G. /1989/ J. Biol. Chem. 264, 12895 až 12901/.

Navyše okrem podobností s inými enzýmami, sú tu tiež výrazné podobnosti s jedným c-AMP závislým proteínom z Dictyostelium discoideum /Mann S. K. O. a Firtel R. A. /1987/ Mol. Celí. Biol. 7, 458 až 469/, ako aj tyroglobulínom z niektorých druhov (obr. VI), /Mercken L., Simons M. J., Swillens S., Masser M. a Vassart G. /1985/ Náture 316, 647 až 651; Lauro R., Obici S., Condliffe D., Ursini V. M., Musti A., Moscatelli C. a Avvedimento V. E. /1985/ Eur. J. Bioch. 148, 7 až 11; Malthiery Y. a Lissitzky S. /1987/ Eur. J. Biochem. 165, 491 až 498/. Podobnosti medzi BSSL a tyroglobulínom, ktoré zahŕňajú oblasť aktívneho miesta, ale aktívne miesto samostatne neindikujú, že tieto vysoko koncentrované reťazce aminokyselín sú dôležitejšie, ako len pri podpore enzymatickej aktivity esteráz.

Na záver, ľudská mliečna BSSL obsahuje 722 zvyškov aminokyselín. Dostupné údaje jasne ukazujú, že jej peptidový reťazec je identický stým istým reťazcom pankreatickej CEH, a že sú kódované tým istým génom. Je zrejmé, že sú nukleotidové sekvencie identické na ich 3 '-koncoch a na ich N-terminálnych aminokyselinových sekvenciách. Neobyčajné homológie nájdené pri potkanej pankreatickej lipáze a hovädzej pankreatickej cholesterol-esteráze podporujú hypotézu, že tieto enzýmy sú funkčne identické. Ale, ako bolo potvrdené, nie sú spôsobené rozdiely len v glykozylácii; odrážajú rôzny počet opakovaní jedenástich aminokyselín. Podobnosť sekvencie aktívneho miesta medzi týmito esterázami potvrdzuje, že tieto proteíny sú získané zo spoločného zdedeného génu.

Tabuľka 1

Aminokyselinová sekvencia BSSL peptidov

Z dôvodu interferujúcich píkov nemohla byť pri peptide č. 26 uskutočnená pozitívna identifikácia zvyšku v cykloch sekventovania 1 a 2. Čísla peptidov zodpovedajú píkom na obr. I.

Tryptické fragmenty

TP16: LysValThrGluGluAspPheTyrLys

TP19: GlylleProPheAlaAlaProThrLys

TP20: LeuValSerGluPheThrlleThrLys

TP24: ThrTyrAlaTyrLeuPheSerHisProSerArg

TP26: PheAspV alTyrThrGluSerTrpAlaGlnAsp

ProSeiGlnGluAsnLys

Tabuľka 2

Identifikácia exonov a, b, c a d číslovaných ako na obr. II a VII

umiestnenie
exón medzi nukleotidmi číslo	medzi aminokyselinami číslo
a	986 až 1172	279 až 341
b	1173 až 1376	342 až 409
C	1377 až 1574	410 až 474
d	1575 až 2415	475 až 722
celý proteín	151 až 2316	1 až 722
celý proteín
s výnimkou
opakovania	151 až 1755

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. DNA sekvencia kódujúca proteín majúci minimálne jednu alebo niekoľko funkčných vlastností ľudskej mliečnej BSSL definovaná nasledujúcimi nukleotidmi označenými na obr. II číslami:

151 až 2316

151 až 1755

151 až 985

151 až 1172

151 až 1376

151 až 1574

986 až 1172

986 až 1376

986 až 1574

1173 až 1376

1173 až 1574
2. DNA sekvencia podľa nároku 1, ktorá kóduje proteín s aminokyselinovou sekvenciou vyznačenou na obrázku VII od polohy 1 po polohu 722.
3. DNA sekvencia podľa nároku 1, ktorá kóduje proteín s aminokyselinovou sekvenciou vyznačenou na obrázku VII od polohy 1 po polohu 535.
4. DNA sekvencia podľa nároku 1, ktorá kóduje proteín s aminokyselinovou sekvenciou vyznačenou na obrázku VII od polohy 1 po polohu 278, od polohy 1 po polohu 341, od polohy 1 po polohu 409, od polohy 1 po polohu 474, od polohy 279 po polohu 341, od polohy 279 po polohu 409, od polohy 279 po polohu 474, od polohy 342 po polohu 409, od polohy 342 po polohu 474 alebo od polohy 536 po polohu 722.
5. DNA sekvencia kódujúca proteíny s aminokyselinovou sekvenciou definovanou v nárokoch 2 až 4, pričom proteíny sú v kombinácii s jedným alebo viacerými opakovaniami podľa obrázku V.
6. DNA sekvencia kódujúca proteíny s aminokyselinovou sekvenciou definovanou v nárokoch 2 až 5, pričom proteíny obsahujú metionín ako ďalšiu N-terminálnu aminokyselinu.
7. DNA sekvencia kódujúca funkčne ekvivalentý variant alebo mutant proteínu, ktorý je definovaný v nárokoch 2 až 6.
8. Vektor obsahujúci DNA sekvenciu podľa nárokov 1 až 7.
9. Vektor obsahujúci DNA sekvenciu kódujúcu proteín definovaný v nárokoch 1 až 7.
10. Hostiteľský organizmus, vyznačujúci sa t ý m , že je transformovaný vektorom podľa nárokov 8 alebo 9.
11. Proteín majúci minimálne jednu alebo niekoľko funkčných vlastností ľudskej mliečnej BSSL uvedený na obr. Vil od polohy 1 po polohu 722.
12. Proteín majúci minimálne jednu alebo niekoľko funkčných vlastností ľudskej mliečnej BSSL uvedený na obr. VII od polohy 1 po polohu 535.
13. Proteín majúci minimálne jednu alebo niekoľko funkčných vlastností ľudskej mliečnej BSSL uvedený na obr. VII od polohy 1 po polohu 278.
14. Proteín majúci minimálne jednu alebo niekoľko funkčných vlastností ľudskej mliečnej BSSL uvedený na obr. VII od polohy 1 po polohu 341.
15. Proteín majúci minimálne jednu alebo niekoľko funkčných vlastností ľudskej mliečnej BSSL uvedený na obr. VII od polohy 1 po polohu 409.
16. Proteín majúci minimálne jednu alebo niekoľko funkčných vlastnosti ľudskej mliečnej BSSL uvedený na obr. VII od polohy 1 po polohu 474.
17. Proteín majúci minimálne jednu alebo niekoľko funkčných vlastností ľudskej mliečnej BSSL uvedený na obr. VII od polohy 1 po polohu 278, od polohy 279 po polohu 341, od polohy 279 po polohu 409, od polohy 279 po polohu 474, od polohy 342 po polohu 409, od polohy 342 po polohu 474, alebo od polohy 536 po polohu 722.
18. Proteín majúci minimálne jednu alebo niekoľko funkčných vlastností ľudskej mliečnej BSSL podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 17 v kombinácii s jedným alebo viacerými opakovaniami podľa obr. V.
19. Proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 18, ktorý obsahuje metionín ako ďalšiu N-terminálnu aminokyselinu.
20. Funkčne ekvivalentný variant alebo mutant proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 19.
21. Spôsob prípravy proteínu podľa nárokov 11 až 20, vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje hostiteľský organizmus obsahujúci vektor podľa nároku 8 alebo 9 a proteín sa izoluje.
22. Farmaceutická kompozície, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 20.
23. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 20 v kombinácii s lipázou alebo v kombinácii s prípravkami obsahujúcimi lipázu.
24. Prípravok na detskú výživu, vyznačujúci sa t ý m , že je doplnený proteínom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 20.
25. Použitie proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 20 na výrobu liečiva na ošetrovanie patologických stavov spôsobených exokrinnou pankreatickou nedostatočnosťou.
26. Použitie proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 20 na výrobu liečiva na ošetrovanie cystickej fíbrózy.
27. Použitie proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 20 ako doplnku prípravku detskej výživy.
28. Použitie proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 20 na výrobu liečiva na ošetrovanie chronickej pankreatitídy.
29. Použitie proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 20 na výrobu liečiva na ošetrovanie zlej tukovej absorpcie.
30. Použitie proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 20 na výrobu liečiva na ošetrovanie zlej absorpcie vitamínov rozpustných v tukoch.
31. Použitie proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 20 na výrobu liečiva na ošetrovanie zlej tukovej absorpcie spôsobenej fyziologickými príčinami.
32. Použitie, podľa nárokov 25 až 31, proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 20 v kombinácii s lipázou alebo lipázami alebo v kombinácii s prípravkami obsahujúcimi lipázu alebo lipázy.