CN1326782A - 关于人消化酶的重组蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的DNA序列,由这些DNA序列编码的新的蛋白质,以及这些蛋白质的用途,下面将进一步描述。本发明还包括载体,如包含能表达所需酶之DNA序列的质粒构建体。本发明还包括由这些构建体转染的宿主生物体,如细菌、酵母、哺乳动物细胞以及转基因动物。本发明还包括制备本发明之新产品的方法。本发明的新蛋白质涉及一种酶,即所谓人胆盐刺激脂酶。

Description

关于人消化酶的重组蛋白及其制各方法

本申请是申请日为1991年6月1日，申请号为91104368.3，发明名称为“关于人消化酶的重组蛋白及其制备方法”的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及新的DNA序列，由这些DNA序列编码的新的蛋白质，以及这些蛋白质的用途，正如下面要进一步描写的。本发明还包括载体，如包含能表达所需酶之DNA序列的质粒构建体，本发明还包括由这些构建体转染的宿主生物体，如细菌、酵母、哺乳动物细胞及转基因动物。本发明还包括制备本发明之新产品的方法。本发明的新蛋白质涉及酶，即所谓人胆盐刺激脂酶。

人泌乳乳腺可合成并随乳汁分泌一种胆盐刺激脂酶(BSSL)〔1〕，其在受初级胆盐特异性激活之后〔2，57，58〕，可为乳儿提供内源性肠内脂肪消化的能力〔3—5〕。该酶是一种非特异性脂酶，约占总乳汁蛋白质的1％〔6〕；其在体外不仅可水解三、二和一酰基甘油，而且还可水解胆甾烯基和视黄基酯，以及溶血磷酯酰甘油〔7—10〕。此外，其活性不只限于乳化底物，而且可以相似速率水解微胶粒及可溶性底物〔11〕。

BSSL在与乳汁一起通过胃时不会被降解，而且在十二指肠中可受到胆盐的保护而不至于被胰脏蛋白酶如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶灭活〔2，11〕。但当乳汁被巴氏消毒，如加热到62.5℃，30分钟时即可失活〔12〕。体外模型实验提示，在BSSL存在下，三酰基甘油消化的终产物是不同的〔5，7〕。由于婴儿初生期间管腔内胆盐浓度较低〔13，14〕，故这种差异可有利于产物吸收〔5，15〕。

人胰液的羧酸酯水解酶(CEE)在功能上似乎相同或至少很相似于BSSL〔8〕。它们带有共同的抗原决定基〔8，17〕，有相同的N末端氨基酸序列〔17〕，而且均可被丝氨酸酯酶，如毒扁豆碱和二异丙基氟磷酸酯这类抑制剂所抑制〔6，8，16〕。已推测两种酶是同一基因的产物〔18，19〕。如最近有报导所提示的〔17〕，可将所观察到的分子大小差异〔8，19〕解释为糖基化作用的形式不同。

食物脂肪是重要的能量来源。高能三酰基甘油占这些脂类的95％以上。某些脂类，如某些脂肪酸和脂溶性维生素是基本营养成份。在胃肠吸收之前，三酰基甘油及较小组分，即酯化的脂溶性维生素和胆固醇，以及二酰基磷酯酰甘油(diacylphosphatidylglyce-rols)，须经水解酯键，以产生有较小疏水性的可吸收产物。这些反应都是由一组称为脂酶的特定酶类催化的。

参与成人体内上述代谢过程的重要脂酶被认为是胃脂酶，胰共脂酶依赖性脂酶(水解三和二酰基甘油)、胰磷脂酶A₂(二酰基磷酯酰甘油)及羧酸酯水解酶(胆甾醇和脂溶性维生素酯)。在哺乳婴儿体内，胆盐刺激脂酶对于水解上述几种脂类物质起着重要作用。这些脂类消化产物连同胆盐一起形成混合胶束，以此发生吸收作用(3—5)。

消化道内胰共脂酶依赖性脂酶和/或胆盐水平降低，是引起脂类吸收障碍，进而导致营养不良的常见原因。这种脂酶缺乏的典型实例是患有胆囊纤维变性(为一种在约80％病人中导致终生脂酶缺乏的遗传性疾病)和慢性胰腺炎(常常是由于慢性酒精中毒所致)的病人。

出生时，特别是未足月出生的婴儿，胰和肝脏功能尚未发育完全，常常发现有生理性脂肪吸收障碍并被认为是由消化道内胰共脂酶依赖性脂酶及胆盐浓度低引起的〔3，4，13—15)。但由于存在BSSL，这种吸收障碍在哺乳婴儿中要比喂消毒婴儿配制人乳的婴儿少得多(3—5，12，59，60，61)。这就是为什么新生儿，特别是早产婴儿，当不能喂自己母亲的奶时，提倡喂以别的妈妈的未消毒奶的一个原因。

目前对胰脏脂酶缺乏病人的治疗是口服大剂量的猪胰脏酶粗制品。低PH下可使共脂酶依赖性胰脂酶失活，在胃中很容易出现这种情况，结果使得口服的胰脂酶在通过胃进入肠道时最终完全被失活。因此，使用大剂量酶制剂并不能完全达到上述治疗目的。即使大剂量给药，对多数病人仍显不足，而且这些制剂都不纯，也很难吃。已将这些制剂制成片剂，使之通过胃的酸性区域，并只能在空肠的相对碱性环境中释放出酶。然而，许多患胰脏疾病的病人，空肠内常常呈异常的酸性环境，而这种片剂不能释放出酶，因而使之失效。此外，因为市售制剂是非人来源的，故存在出现免疫反应的危险，并可能对病人造成有害影响或使疗效降低。这种制剂的另一个缺点是，它们含有未曾提到的，共脂酶依赖性脂酶以外的其它脂解活性物质。事实上，它们中的大多数只含有很低水平的CEC/BSSL活性。这就是为什么许多患胆囊纤维变性的病人，尽管施以维持疗法，仍会有脂溶性维生素和基本脂肪酸缺乏的一个原因。

因此，迫切需要具有人脂酶衍生之特性和结构，并具有广泛底物特异性的产品，这些产品可对患有一种或几种胰脂解酶缺乏的病人口服给药。本发明的产品可单独使用，或与其它酯酶合用，或与含其它脂酶的制剂合用。再者，对某些婴儿，显然需要改善常规婴儿配制食品，或得自所谓奶库之消毒人奶的脂肪利用。

BSSL具有几种使之适于作替代或补偿治疗的独特性质：已根据其特性，设计成口服给药制剂。因而，它能免于在通过胃时被降解，并能在小肠中被激活，在储存和通向其作用部位时，其特异性活化机制，将阻止食物或组织脂类受到危险的脂解作用。由其广泛的底物特异性，其本身即有能力介导完全消化大多数食物脂类，包括脂溶性维生素酯。

对于水解含长链聚不饱和脂肪酸来说，BSSL可能更优越于胰共脂酶依赖性脂酶。

在有胃脂酶存在，且没有或只存在很低水平的共脂酶依赖性脂酶的情况下，即使象新生婴儿体内那样胆盐水平很低时，也表明BSSL能于体外完全消化三酰基甘油。在BSSL存在下，三酰基甘油消化的终产物为游离脂肪酸和游离甘油，而不是由另外两种脂酶消化产生的游离脂肪酸和一酰基甘油(5)。如此将有益于产物的吸收，特别是当肠道内胆盐水平低时这种效果更为突出(3，15)。

从开发和改善婴儿配制品的传统观点看，其组分应该尽可能地相似于人奶的组分，期望补充这样的配制品。

然而，利用胆盐刺激脂酶(BSSL)，或具有BSSL之基本功能的蛋白质进行补充，替代或治疗、需要使产品的产量达到大规模工业生产水平。不可能在工厂规模生产中依赖天然资源，如乳汁，作为起始材料。除上面提到的存在巴氏灭菌期间造成的BSSL失活问题外，还有携带感染因子，如HIV病毒和CMV等病毒之天然材料污染的危险。因此，需要得到大批量具有BSSL特性的产品，本发明即提供了这样的产品及其制备方法。

有关现有技术参考文献在本说明书的后面给出。

本发明是基于克隆编码衍生于人乳腺之BSSL的cDNA。我们已从人胰腺中分离了编码CEH的部分cDNA。根据由人cDNA推测的氨基酸序列及与其它种动物之CEH比较，支持BSSL和CEH为同一物质的解释。

如下文中详细描述的，令人惊奇地发现，由该cDNA序列推测的蛋白质结构完全不同于其它脂酶的结构。出人予料地证明该结构更象典型脂酶如胆碱脂酶的结构。

根据图2和图7，本发明的产品是：

a)如图7中氨基酸序列1—722限定的蛋白质

b)如图7中氨基酸序列1—535限定的蛋白质

c)如图7中氨基酸序列1—278限定的蛋白质

d)如图7中氨基酸序列1—341限定的蛋白质

e)如图7中氨基酸序列1—409限定的蛋白质

f)如图7中氨基酸序列1—474限定的蛋白质

g)b)至f)下限定之蛋白质的结合体，如由位置1—278，279-341，279—409，279—474，342—409342—474和536—722中的氨基酸序列限定的蛋白质结合体，

h)b)至g)下限定之蛋白质与根据图5之一个或多个重复序列的结合体，

i)a)至h)下限定的具有附加N末端氨基酸即蛋氨酸的蛋白质，及上面a)至i)中限定之蛋白质的功能等同变异体和突变体，

应注意的是，上面a、b、c、d、e、f、h和i下限定的蛋白质并不是在各方面完全相同于天然存在的BSSL，但它们可表现出天然BSSL的一个或多个关键性功能。关键性功能将在下文中给出。

j)编码上面a、b、c、d、e、f、h和i中限定之蛋白质的DNA序列。

k)由图2中下述核苷酸序号限定的，根据图2的DNA序列：

a)编码由图7中氨基酸序列1—722限定之蛋白质的，根据图2的DNA序列151—2316，

b)编码由图7中氨基酸序列1—535限定之蛋白质的，根据图2的DNA序列151—1755，

c)编码由图7中氨基酸序列1—278限定之蛋白质的，根据图2的DNA序列151—985，

d)编码由图7中氨基酸序列1—341限定之蛋白质的，根据图2的DNA序列151—1172，

e)编码由图7中氨基酸序列1—409限定之蛋白质的，根据图2的DNA序列151—1376，

f)编码由图7中氨基酸序列1—474限定之蛋白质的，根据图2的DNA序列151—1574，

g)编码由图7中氨基酸序列279—341限定之蛋白质的，根据图2的DNA序列986—1172，

h)编码由图7中氨基酸序列279—409限定之蛋白质的，根据图2的DNA序列986—1376，

i)编码由图7中氨基酸序列279—474限定之蛋白质的，根据图2的DNA序列986—1574，

j)编码由图7中氨基酸序列342—409限定之蛋白质的，根据图2的DNA序列1173—1376。

k)编码由图7中氨基酸序列342—474限定之蛋白质的，根据图2的DNA序列1173—1574。

本发明之蛋白质的重要功能是：

a)适于口服给药

b)被特异性胆盐激活

c)在小肠内容物中其作用为非特异性脂酶，即能够水解脂类，而相对不依赖于其化学结构和物理状态(乳化的、胶囊、可溶的)。

d)能水解有不同链长度和不同未饱和度的三酰基甘油。

e)也能水解二酰基甘油、一酰基甘油、胆甾烯基酯、溶血磷酯酰甘油、和视黄基及其他脂溶性维生素酯。

f)不仅能水解三酰基甘油中的sn—1(3)酯键，而且能水解sn—2酯键。

g)不仅能与初级胆盐反应，而且能与次级胆盐反应。

h)最佳活性依赖于胆盐。

i)其稳定性可使胃内容物不会明显地影响其催化效率。

j)在胆盐存在下，其稳定性使之不易被胰腺蛋白酶，如胰蛋白酶失活。

k)能够结合肝素和肝素衍生物，如硫酸肝素。

l)能够结合脂—水介相。

m)其稳定性使之能经受冻干处理。

n)当与食物成分，如人奶或奶类配制品混合时仍保持稳定。

用于补充、替代或治疗目的时，利用的是根据a)、c)、d)、e)、f)、i)、j)、和l)的关键性功能。对于其他目的，则不一定利用所有这些关键性功能。

为表达上述蛋白质，须将上面指出的适当DNA序列插入某一适当载体中，然后再将其引入适当宿主生物体内。所说的载体还包含适当的信号序列和其他序列，以使所说的生物体能够表达所需的蛋白质。

适合的表达生物体：

借助DNA重组技术，有可能在各种原核和真核宿主生物体中克隆并表达有用蛋白质。可用的表达生物体包括细菌、简单真核生物(酵母)、动物细胞培养物、昆虫细胞培养物，植物细胞培养物、植物和转基因动物。每个系统都有其自身的特殊优点和缺点。一个简单的结论是，每一个欲被表达的基因都有特定的问题，且没有一个标准解决方法。

常用的细菌系统是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。常用的酵母是酵母属和巴斯德毕赤酵母。常用的动物细胞是CHO细胞和COS细胞。常用的昆虫细胞培养物是来源于果蝇属的细胞。

常用的植物是烟草植物。可能的转基因动物是山羊和奶牛。

可举出的细菌载体的例子是pUC和蛋白A—载体。

可举出的酵母载体的例子是pMA91。

可用的昆虫载体为衍生于杆状病毒的载体。

可用的动物细胞载体是衍生于sv/40的载体。

可用的植物细胞载体可衍生于Ti质粒。

在系统中，可使用天然和合成的启动子和终止子。

须知，根据所选择的表达系统，被表达的蛋白质可含有附加的N末端氨基酸(蛋氨酸)，含有很少的额外氨基酸，或者可以是与异源蛋白质(如蛋白A)融合的，或可在糖基化作用方面不同于天然存在的蛋白质。此外，载体还可含有信号序列，以使蛋白质排出到周质中或培养基中。

因此，本发明的其他方面涉及：

a)含有编码上文特定蛋白质之DNA序列的载体。

b)含有上文指定之DNA序列的宿主生物体。

c)生产上文指定之蛋白质的方法，包括培养含有上文a)中指定之载体的宿主生物体，并分离所说的蛋白质。

如参考文献6中所述，可基于所用的表达系选择纯化方法(如蛋白质A/IgG)，和/或根据使用纯化天然酶的方法。

本发明的其他方面是：

——含有如上文指定之蛋白质的医药组合物。

——上文指定的蛋白质用于制造治疗与胰腺外分泌功能不全有关

    之病理状态的药物。

——上文指定的蛋白质用于制造治疗胆囊纤维变性的药物。

——上文指定的蛋白质用作婴儿配制食品的添加剂，

——上文指定的蛋白质用于制造治疗慢性胰腺炎的药物，

——上文指定的蛋白质用于制造治疗由任何病因所致之脂肪吸收

    障碍的药物，

——上文指定的蛋白质用于制造治疗脂溶性维生素吸收障碍的药

    物，

——上文指定的蛋白质用于制造治疗因生理原因(如新生儿)所

     致脂肪吸收障碍的药物。

图2中从位置151直到并包括位置2316的DNA序列是编码整个蛋白质的序列。从位置2317上至并包括位置2415的序列未被转译成蛋白质，但包括在下面表2中鉴定的外显子d中

在本发明的一个实施方案中，上文a)—i)中限定的蛋白质是以分离形式和/或基本上纯的形式提供的。

在本发明的一个实施方案中，上文a)—k)项限定的DNA序列是以分离形式和/或基本上纯的形式提供的。

实验部分

缩写符号

aa，氨基酸；bp，碱基对；BSSL，胆盐刺激脂酶；C—AMP，环腺苷一磷酸；CEH，羧酸酯水解酶；Da，道尔顿；C7GTP，7—脱氮—2—脱氧鸟苷5′三磷酸；EDTA，乙二胺四乙酸；kb，千碱基；MOPS，3—N—吗啉代—丙烷磺酸；nt，核苷酸； PAGE，聚丙烯酰胺凝胶电泳；SDS，十二烷基磺酸纳；SSC，NaCl，柠檬酸盐xGal，5—溴—4—氯—3—吲哚基—β3—D—吡喃半乳糖苷。

酶

胆盐刺激脂酶EC3.1.1.3

羧酸酯水解酶EC3.1.1.1.

材料和方法

A.酶和抗体制备

按已述方法〔6〕由人奶中提纯人BSSL。用于生产抗体时，须进一步用SDS-PAGE法纯化该酶。经考马斯亮兰染色后，由凝胶中电洗脱相当于脂酶的蛋白带，用25μg纯化的酶加等体积弗氏完全佐剂作第一次皮内(i.c)注射，继后每个月用同样量的酶加弗氏不完全佐剂作加强注射。每次加强注射后两星期采集兔血，制备血清并于-20℃下保存。

B.制备胰酶解片段及其氨基酸序列分析

将3mg纯化的BSSL溶解于1ml含6M盐酸胍和2mMEDTA的0.1MTris—Cl缓冲液(PH8.5)中。加入二硫赤藓糖醇至5mM。37℃下保温2小时后，加入300μl50mM碘乙酸盐。25℃下避光保温90分钟后，将还原并羧甲基化的酶加在用0.5M碳酸氢铵平衡过的Sephadex G—25柱上脱盐。加入30μg甲苯磺酰基—L—苯丙氨酸氯代甲烷处理的牛胰蛋白酶(Worthington diagnostics System Inc.Freehold，NJ，USA)，然后冻干。将冻干的蛋白质溶解在4ml0.1M碳酸氢铵中并再加入90μg胰蛋白酶。37℃保温5小时后，再次冻干蛋白质。将此胰酶消化产物溶解于0.1％三氟乙酸(2mg/ml)中。用C—18反相柱以高效液相色谱(HPLC)层析300μg胰蛋白酶处理的BSSL，并用加入0.1％三氟乙酸中的0—50％乙腈梯度洗脱之。经连续记录215nm波长处吸光率来监测收集的肽。使用上述层析柱及调整的洗脱梯度再次层析纯化欲进行序列分析的肽。于氮气环境下干燥待分析序列的肽片段的样品，以除去乙腈并加到序列分析仪上。为进行N末端序列分析，将天然BSSL溶解于0.1％乙酸中。使用AppliedBiosystems公司生产的477A型脉冲式液相序列分析仪和带定时循环程序的联机PTH120A型分析装置，以及由制造厂商提供的化学试剂进行序列分析。根据已确定序列的标准蛋白质(B—乳球蛋白)计算初始和重复得率分别为47％和97％。

C.分离RNA

于外科手术室得到人胰腺脂肪和泌乳乳腺组织的样品并直接放入硫氰酸胍(1—5g组织在50ml中)。按Chirgwin所述的方法〔20〕提取全部RNA。在寡脱氧胸苷酸(Oligo(DT))—纤维素柱上层析制备Poly(A)—RNA〔21)。

D.构建和筛选cDNA文库

用氢氧化甲基汞变性处理约15μg聚腺苷酸化的人胰腺RNA，用Oligo(DT)12—18引物(pharmacia，Uppsala，Sweden)引发，并用标准操作程序进行逆转录〔23〕。基本上按照Gubler和Hoffman〔24〕的方法合成第二股DNA链，不同的是不使用DNA连接酶和β—NAD，且反应温度定在15℃。用RNAseA(50μg/ml)消化过量RNA，并用EcoRI甲基化酶处理所得双股cDNA〔25〕。用Klenow酶将其修成平齐末端。与EcoRI接头连接后，在Sepharose 4B—Cl柱上分离用EcoRI切割的cDNA。用乙醇沉淀无效体积馏分，并将此cDNA连接到磷酸酶处理之gtll载体〔26〕的EcoRI位点中。经体外包装得到7×10⁵个以上的重组体。

人乳腺cDNA文库是由得自妊娠8个月的妇女之乳腺组织衍生的(购自Clontech Laboratories，Inc；Palo AltoCA；USA)。

将cDNA文库中的噬菌体以每个120mm平皿约5×10⁴个噬斑形成单位铺板。将抗血清稀释到1∶3200倍，并按Young和Davis〔27)所述方法筛选之。用碱性磷酸酶连接的羊抗兔抗体作为第二抗体(Bio—Rad，Richmond，CA；USA)。为分离相当于mRNA之5′端的克隆，使用得自一个免疫阳性克隆的再克隆片段作探针，于标准条件下进行核酸杂交〔23〕。

E.RNA分析

用乙二醛和二甲基亚砜变性〔28〕后，用加在40mMMOPS缓冲液(PH7.0)中的1％琼脂糖凝胶进行电泳。然后将乙醛酰化的总RNA转移到硝酸纤维素滤膜〔29)上。用Oligo标记技术〔30〕标记BSSL和CEH重组体的亚克隆探查转移印迹。于46℃下用50％甲酰胺进行预杂交和杂交〔23〕。以高严紧性(0.1％SDS和0.1×SSC，60℃)(1×SSC，0.15M NaCl，0.0015M柠檬酸三钠，PH7.6)进行杂交后洗涤。

F.核苷酸序列

将BSSL和CEH重组体的cDNA插入段经超声处理并按大小分级分离后直接克隆到M3mp18和mp19中，或者将其中某些cDNA插入段经PstI、BstXI、NarI、SmaI和Aha消化后再克隆到pTZ19R中。用二脱氧链终止法〔31〕测定核苷酸序列。另外还用TagI聚合酶和dc⁷GTP测定富GC重复区域(见下文)的序列。两条链均作序列测定。使用Sj _berg等人〔55〕所述的MS—EdSeq软件从放射自显影图谱中检出序列资料。

G.氨基酸序列预测及同源性

为了预测cDNA插入段的相应氨基酸序列，按Staden所述方法比较不同读码的密码子利用率并给出一个开放读码〔32〕。用UWGCG软件配套程序检索同源性〔33〕。

结果和讨论

A.BSSL之胰酶解片段和N末端的序列

根据HPLC层析所得洗脱峰的数目(图1)判定胰蛋白酶消化纯化之BSSL后产生了大约50个片段。收集各峰值部分，并测定所指出的能以高纯化状态和适当量分离的峰值部分的序列。所得序列示于表I中。此外测定了N末端最后30个残基的序列(图2)，结果进一步证实了先前由Abouakil等人所报导的序列(30个残基)〔17〕。

由Wang和Johnson〔34〕报导的22残基长N末端序列是一个赖氨酸，我们则报告为甘氨酸。

B.BSSL的核苷酸序列

为了构建入gtll cDNA文库，我们使用了来源于人胰腺细胞的聚腺苷酸化RNA。最初我们分离了四个免疫阳性克隆，然后用抗BSSL抗血清筛选该胰腺表达cDNA文库。分析这四个克隆的核苷酸序列，表明它们完全一致，并相当于mRNA的3′端。它们均以polyA尾部开始，且只是彼此的长度不同；将跨度为996bp的最长插入段定名为ACEH。

用抗血清，并以胰腺ACEH克隆作探针筛选人乳腺的cDNA文库。分离用两种方法筛选到的阳性克隆，它们均来源于3′端。将达到2100bp上游的最长的乳腺克隆定名为ABSSL。该克隆含有四个已确定了序列的胰酶解片段(图2)，但不包括N末端氨基酸序列。为了将该序列扩展到转译起点之后，用衍生于ABSSL之最靠近5′部分的118碱基长的探针重新筛选乳腺cDNA文库。分离一个进一步延伸328核苷酸上游的克隆。它与N末端氨基酸序列相匹配，并含有其余的胰酶解片段。如图2中所示，该cDNA长度为2428个核苷酸，并含有自第一个ATG密码子开始的81碱基上游区。聚腺苷酸化信号，AATAAA位于离polyA尾部的13核苷酸上游，且发现终止密码子TAG位在后面接有112bp3′未转译区的核苷酸2317处。发现在序列的3′端，碱基1756和2283之间有一个由16次重复的33碱基组成的富GC区域。图3中所示的重复的核苷酸序列，由六个完全相同的重复，其周围有不同数目之取代的十个重复区包围，其中所说取代可能是在几次复制后发生的。低数目的取代提示这些取代是在进化过程的晚期才出现的。

C.表达的组织分布

用Northern吸印法分析得自人泌乳乳腺、胰腺、脂肪组织及得自人肝细胞瘤细胞系(HepG2)的RNA。所测得的泌乳腺和胰腺中的信使RNA的大小约为2.5kb。在含有提取自HepG2或脂肪组织之RNA的各泳道中未能出现可确定的信号(图4)。

因为用于乳腺文库的mRNA是得自于妊娠第八个月的女性，故可证明BSSL基因的转录和可能的转译过程是于分娩前进行的，此结论与以前发现的BSSL在分娩前分泌相符合〔35〕。(参见图4)。

D.BSSL的氨基酸序列

文献报导用SDS—PAGE估测的分子量为107—125KDa〔8，36〕，用分析性超离心法估测为105KDa〔37〕。根据cDNA推测该酶由722个氨基酸残基组成(图2)，算得分子量为76，271Da，这表明酶分子中至少含有15—20％碳水化合物。先导序列的长度为23个残基。假定的活性位点丝氨酸残基定位于丝氨酸217(图5)。该丝氨酸周围的序列与丝氨酸水解酶的一致活性位点序相符合〔38〕。最近已有人提出，靠近活性位点丝氨酸的碱性残基可能参予脂酶对酰基甘油中酯键的裂解〔39〕。特别应注意的是，BSSL中并不存在这样的残基。单一假定的N—糖基化位点只位于距丝氨酸的七个残基。糖基化的程度〔6，16〕提示该酶含有O连接的碳水化合物。有许多可发生这种糖基化作用的位点。对纯化的酶所作的氨基酸组成分析显示其具有高含量的脯氨酸残基〔6〕。由根据cDNA推测的氨基酸序列进一步证实了这一点。但大多数脯氨酸残基都位于各11个残基的16次重复区内，其构成了酶之C末部半侧的大部分。

E.乳腺组织中的酶(BSSL)和胰腺组织中的酶(CEH)的比较

前已证明人乳的BSSL和人胰腺CEH即使不完全相同，也是很相似的。本资料有力地提示两种酶是同一基因的产物。cDNA克隆的核苷酸序列显示，胰腺ACEH克隆的polyA尾部和接近5′端的996碱基，包括编码富脯氨酸重复区的序列与乳腺ABSSL克隆相同。胰腺和泌乳乳腺RNA的Northern印迹产生出一条单一的2.5Kb带(图4)。基因组Southern印迹进一步支持仅由一个基因编码BSSL和CEH的观点。BSSL和CEH之间在SDS—PAGE上迁移率的差异可解释为不同糖基化作用和不均匀拼接的结果。

BSSL与大鼠和牛源脂酶的相似性(详见下述)以及基因组印迹分析的结果。支持这样一种可能性，即不均匀切接并不可能是迁移率差异的原因。因为尚未在蛋白质水平上证实C末端序列，故不大可能CEH是在C末端受蛋白水解酶切割后而得以加工的。

迄今我们所知道的明显相当于CEH的胰腺酶，通常都是根据其物种来源和用以确定其各自活性的特定底物命名的。如溶血磷酯酶、胆甾醇酯酶、甾醇酯水解酶、非特异性脂酶、羧酸酯酶和胆甾醇酯水解酶。可得到的数据与所有这些已述活性物均有一个起源并来自同一功能实体的观点是一致的〔42，43〕。这就进一步说明了它们具广泛底物特异性，且将其定名为非特异性脂酶是恰当的。当将人BSSL/CEH的序列与大鼠胰腺和溶血磷脂酶〔40〕和牛胰腺的胆甾醇酯酶〔41〕的序列比较时，可见它们之间在从N末端开始的530个残基范围内存在着广泛相似性(图5)，但它们在分子中出现重复的部分则有所差异。大鼠酶只有4个重复序列，牛酶只有3个，可见人酶是一种长得多的肽。

此外，发现BSSL与许多典型酯酶如乙酰胆碱酯酶(包括人和果蝇等几种不同来源的)和羧酸酯酶间具有显著的相似性(图6)。这些相似性限于BSSL的N末端300个残基，其中包括假定的活性位点丝氨酸残基。可根据BSSL能被典型胆碱酯酶抑制剂抑制这一事实〔6，8，16〕推测其与乙酰胆碱酯酶的相似性。可能除大鼠肝羧酸酯酶〔45〕外，这些相似酶都没有显示出具有象BSSL一样的胆盐依赖性；这说明这一特性的结构基础寓于蛋白质的C末端部分。再者，BSSL可有效地攻击乳化的底物，其他相似酯酶未见有这样的已知特性。胆盐是这一活性的必要条件。将推断的人BSSL序列与其他已鉴定之哺乳动物脂酶比较，除活性位点丝氨酸周围一致序列(G—X—S—X—G)外，未见有明显的相似性〔44〕。

除了与其他酶的相似性外，与得自Dictyosteliumdiscoideum的一种cAMP依赖性蛋白质〔46〕及来自几个种属的甲状腺球蛋白也有显著的相似性(图6)〔47—49〕。BSSL和甲状腺球蛋白之间的相似性，包括了活性位点区域，但不包括活性位点本身，表明这些高度守恒的氨基酸延伸部分除支持酯酶活性外，还有更为普遍化的重要性。

总之，人乳BSSL由722个氨基酸残基组成。现有资料有力地表明，其肽链与胰腺CEH的肽链相同，而且都是由同一基因编码的。最有力的证据是，它们的3′端和它们的N末端氨基酸序列是相同的。发现大鼠胰腺溶血磷脂酶和牛胰腺胆甾醇酯酶的显著同源性支持这些酶在功能上也是相同的这一假设。然而，如已经提到的，种间分子大小的差异不只是糖基化作用的不同，而且也反映了11个氨基酸重复次数的可变性。基于这些酯酶间活性位点序列的相似性，提示这些蛋白质衍生于共同的祖先基因。

对附图1—7的说明如下：

图1：用HPLC分离BSSL的胰酶消化产物

用胰蛋白酶处理纯化的BSSL，并如上文材料和方法部分所述进行高效液相色谱(HPLC)。收集所指出的峰值部分再次色谱纯化并测定其氨基酸序列。

图2：人胆盐刺激脂酶的cDNA核苷酸序列和推测的氨基酸序列

cDNA为2428碱基长。开始于ATG的N末端23密码子序列(nt82—150)被翻译成先导肽，因为成熟蛋白质的N末端氨基酸序列开始于密码子24处(nt151，Ala)。下方划横线部分为先导肽。记号*表示外显子的起始点。记号#表示重复部分的起始点。

图3：胆盐刺激脂酶中C末端富GC重复区的核苷酸序列

用星号★表示核苷酸取代。

图4：Northern印迹杂交

显示对分离自人泌乳乳腺、胰腺、脂肪组织和人肝癌细胞系(HepG2)的总RNA所谓Northern印迹的分析结果。总RNA在1M乙二醛、30％二甲基亚砜和40mM MoSP中变性后，分别将来自泌乳乳腺(泳道A)、胰腺(泳道B)、脂肪组织(泳道C)和HepG2(泳道D)的总DNA(10μg)加入40mMMoPS缓冲液(PH7.0)中用1％琼脂糖凝胶进行电泳。然后将乙醛酰化的RNA转移到硝基纤维素滤纸上，与32p标记的BSSL cDNA(ABSSL)杂交。

图5：推测的人乳BSSL、大鼠胰腺溶血磷脂酶(Ratlpl)〔40〕和牛胰腺胆甾醇酯酶(Bovceh)〔41〕之氨基酸序列的比较

*号表示参于活性位点的丝氨酸残基，#号表示蛋白质的一个可能的N糖基化信号。方框内是氨基酸序列的直接重复区。匹配序列用大写字母表示，两酶间的匹配序列用小写字母表示，错配序列则用点表示。

图6：BSSL与其他酯酶、甲状腺球蛋白及盘状网柱菌(Dictyostelium discoideum)的一种C—AMP依赖性酶之一级结构的比较

BSSL：人胆盐刺激脂酶，Cheshum：人胎组织的胆碱酯酶〔50〕Torpace：

Torpedo marmorata的乙酰胆碱酯酶〔51〕，Dorsceh：Drosophila melaogaster的羧酸酯水介酶〔52〕，Ratlivce：大鼠肝的羧酸酯酶〔53〕，Drosace：Drosophilamelaogaster的乙酰胆碱酯酶〔54〕，Thyrhum：人的甲状腺球蛋白〔49〕和Dict.Di：Dictyosteliundiscoideum的C—AMP依赖性酶〔46〕。它们之间有7个不同的区域显示出相似性。方框包括的是完全相同的残基，且一致序列中的小写字母表示除一个酶以外的所有酶的相同残基，点标示错配残基。参于活性位点中的丝氨酸残基用星号标示。右手角的图显示各区域的排列方向。

图7：

给出完整蛋白质的氨基酸序列1—722(一字母代码)并标出了外显子a、b、c和d。#号表示重复部分的起始点。

表1：BSSL肽的氨基酸序列

由于干扰峰的存在，笫1和2次序列测定循环甲的非阳性残基，可于26号肽中作出鉴定。肽序号是指图1中的各峰。

胰酶解片段

TP16：LysValThrGluGluAspPheTyrLys

TP19：GlyIleProPheAlaAlaProThrLys

TP20：LeuValSerGluPheThrIleThrLys

TP24：ThrTyrAlaTyrLeuPheSerHisProSerArg

TP26：PheAspValTyrThrGluSerTrpAlaGlnAsp

      ProSerGlnGluAsnLys

表2：如图2和7编号的外显子a、b、c和d的鉴定

外显子            定位

                  核苷酸序号间    氨基酸序号间a                     986—1172       279—341b                     1173—1376      342—409c                     1377—1574      410—474d                     1575—2415      475—722完整蛋白质            151—2316       1—722排除重复顺序的整个蛋白质                  151—1755       1—535参考文献1.  Bl_ckberg，L.，_ngquist，K.A，&Hernell，O.(1987)

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Claims (14)

1.一种生产药物组合物的方法，其特征在于将一种蛋白质掺入医药上可接受的载体中，所述蛋白质的生产方法包括(i)将一段DNA序列插入表达载体，所述DNA序列编码具有图7所示位置1—722、1—535、1—278、1—341、1—409、1—474、279—341、279—409、279—474、342—409、342—474或536—722的氨基酸序列的蛋白质，或其功能等价变异体或突变体；(ii)将所述表达载体转化到宿主生物中，(iii)使宿主生物生长，(iv)分离所述蛋白质。

2.权利要求1的方法，其特征在于所生产的蛋白质是与根据图5的一个或多个重复序列结合的。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于蛋白质具有蛋氨酸作为附加的N末端氨基酸。

4.权利要求1或2的方法，其特征在于蛋白质表现天然存在的胆盐刺激脂酶的一种或几种关键性功能。

5.权利要求1或2的方法，其特征在于DNA序列由图2中下列核苷酸编号限定：151—2316、151—1755、151—985、151—1172、151—1376、151—1574、986—1172、986—1376、986—1574、1173—1376或1173—1574。

6.权利要求1或2的方法，其特征在于蛋白质是与脂酶或含有脂酶的制剂结合的。

7.权利要求1或2的方法，其特征在于组合物用于治疗与胰腺外分泌功能不全有关的病理状态。

8.权利要求1或2的方法，其特征在于组合物用于治疗胆囊纤维变性、慢性胰腺炎、脂肪吸收障碍、脂溶性维生素吸收障碍或生理原因所致脂肪吸收障碍。

9.权利要求1或2的方法，其特征在于组合物是口服的。

10.一种生产婴儿配制食品的方法，其特征在于在婴儿食品中添加在权利要求1—5任一项中生产的蛋白质。

11.在权利要求1—5任一项中生产的蛋白质在制备用于治疗与胰腺外分泌功能不全有关的病理状态的药物中的应用。

12.在权利要求1—5任一项中生产的蛋白质在制备用于治疗胆囊纤维变性、慢性胰腺炎、脂肪吸收障碍、脂溶性维生素吸收障碍或生理原因所致脂肪吸收障碍的药物中的应用。

13.在权利要求1—5任一项中生产的蛋白质作为婴儿配制食品添加剂的应用。

14.权利要求11—13的应用，其特征在于蛋白质是与脂酶或含有脂酶的制剂结合的。

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