RO114793B1 - Peptida derivata de lipaza umana stimulata de sarea biliara si secventa de adn ce o codifica - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la o peptidă derivată de lipază umană stimulată de ’ sarea biliară și o secvență ADN, care o codifică, utilizată pentru suplimentarea, substituirea sau terapia lipazelor stimulate de sarea biliară sau a proteinelor cu funcțiuni esențiale a lipazelor stimulate de sarea biliară.

Este cunoscut faptul că, glanda mamară umană în lactație sintetizează și secretă împreună cu laptele o lipază stimulată de sarea biliară (BSSL) (Blackberg, L., Ăngguist, K. A, & Hermell., O. (1987) FEBS Lett. 217, 37...41), astfel încât după activarea specifică prin sărurile primare (Hermell, O. (1987) Eur. J.CIin. Invest, J.CIin. Invest 5, 267...272; Hermell O, & T.Oliv. Crona, 1974, Humanmilk lipase II. Bile salt Stimulated lipase. Biochem. Biophys. Acta 309·. 234...244; Hermell, O., L. Blăckber & T.Olivecrona, 1981. Human milk lipases - în Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy, E. Lebenthal, Editor Paven Press, New York. 347...354.) contribuie la capacitatea endogenă a sugarilor de a digera intestinal grăsimea. Helmell, O., Blackberg, L. & Bern Back, S (1988) în Perinatal nutrition (Lindblad, B. S., ed) Bristol-Myers Nutrition Symposia voi. 6, 66. 259...272, Academic Press, New York; Hernell, O. L. Blackberg, B. Fredriczon, and Olivercrona, 1981 - Bile salt-stimulated lipase in human milk and digestion in the neonatal period în Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy, E. Lebenthal, Editor. Raven Press, New York

465.. .471; Berback, S., Blackberg, 1. & Hernell, O. (1990) J.CIin. Invest, J.CIin. Invest221 ...225 (1990). Această enzimă, care constituie aproximativ 1 % din totalul proteinei din lapte (Blackberg,L. & Hernell, O. (1981) Eur. J.Biochim, 116,

221.. .225) este o lipază nespecifică. In vitro, ea hidrolizează nu numai tri-, di-, și monoacilgliceroli, ci de asemenea, colesteril- și rectinil esteri, și lizofosfatidilgliceroli (Hermell, □. & Blackberg, L. (1982) Pediatr. D.Guy, □. & Olivercrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284...288; Fredrikzon, B., Helmell, O., Blackberg,L. & Olivercrona, T. (1987) Pediatr. Res. 12, 1048... 1052; Wang, C.S., Hartsuck, J.A. & Downs, D. (1988), Biochemistry 27, 4834...4840). Mai mult, activitatea sa nu se reduce la substrate emulsionate, ci și substratele solubile și micelare sunt hidrolizate în aceleași proporții (Blackberg,L. & Hermell, O. (1983) FEBS Lett. 157, 337...341).

BSSL nu este degradată în timpul trecerii cu laptele prin stomac, iar în interiorul duodenului, ea este protejată, prin sărurile biliare, de inactivarea prin proteazele pancreatice, cum ar fi tripsina și chimiotripsina (Hermell, □. (1975) Eur. J.CIin. Invest, J.CIin. Invest 5, 267...272; Blackberg, L. & Hermell, □. (1983) FEBS Lett. 157,

337.. .341). Ea este totuși inactivată când laptele este pasteurizat, când laptele este încălzit la 62,5°C, timp de 30 min (Bjorksten, B., Burman, L.G., de Chateau, P., Fredrikzon, B., Gothefore, L. & Serger, H. M.Brown, G-A., Ablitt, L. lyangkaran, n. & Wharton B.A. (1978) Gut 19, 95...98.). Modelul exprimental in vitro sugerează că produsele finale ale digestiei triacilglicerolului sunt diferite în prezența BSSL (Berbaberg, L. & Hermell, O. (1981) Eur. J.Biochem, 116, 221...225; Hermell, O. & Blackberg,L. (1982) Pediatr. Res. 16, 882...885). Datorită concentrațiilor mai scăzute de săruri biliare în interiorul lumenului intestinal, în timpul perioadei de nou născut (Brueton, M. J., Berger, Η. M., Brown, G-A., Ablitt, L. Uyangkaran, N. & Whaton B. A. (1978) Gut 19, 85...98: Murphy, G.M. 8. Signer, E. (1975) Gut 15,

151.. .165), acestea pot fi favorabile pentru a produce absorbția (Helmell, O., Straggers, J.E. & Carey, M.C. Biochemistry (1990) 29:2041...2055).

Ester hidrolaza carboxilică (CEH) din sucul pancreatic uman (Helmell, O., Blackberg, L. (1982) Pediatr. Res. 16, 881...885) pare, din punct de vedere funcțional, a fi cel puțin foarte asemănătoare cu BSSL (Blackberg,L. Lombardo, D., Helmell, D. Guy, O. & Olivercrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284...288. De

RO 114793 Bl asemenea, ei au porțiuni epitopice comune (Blackberg.L. Lombardo, D., Helmell, 50

D. Guy, O. & Olivercrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284...288: Abgouaskil, N., Rogalska, E., Biocel, J. & Lombardo, S. (1988) Biochim. Biophys. Acta 961

299.. .308), au secvențe de aminoacizi N-terminali identice, (Abgouaskil, N., Rogalska,

E. , Biocel, J. & Lombardo, S. (1988) Biochim. Biophys. Acta 961, 299...308); și sunt inhibați de către inhibitorii serinesterazelor, de exemplu, serină și diizopropil- 55 fluorofosfat (Blackberg.L. & Hermell O (1981) Eur. J. Biochim, 116, 221...225; Blăckberg, L. Lombardo, D., Hermell, O.Guy, O. & Olivercrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284...288; Lombardo, D., Guy D. & Figarella, C. (1978) Biochim.Biophys. Acta 527, 142...149. S-a presupus că cele două enzime sunt produse ale aceleiași gene (Hernall, □., Blăckberg, L. & Londberg. T. (1988) în Textbook of gastroenterology and 60 nutrition in infancy, (Lebenthal, E., ed) p. 209...217, Raven Press, New York; Wang, C.S. (1988) Biochem. Biophys. Res. Corn. 155, 950...955). Diferența de mărime moleculară observată (Blăckberg, L. Lombardo, D., Helmell, O.Guy, O. & Olivercrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284...288: Wang, C.S. (1988) Biochem. Biophys. Res.

Corn. 155, 950...955) poate fi explicată prin două căi diferite de glicozilare, cum s-a 65 sugerat de curând (Abouskil, N., Rogalska, t., Biocel, J. & Lombardo. L. (1988) Biochem. Biophys. Acta 961, 299...308.

Lipidele din regimul alimentar sunt o importantă sursă de energie. Triglicerolii bogați în energie constituie mai mult de 95 % din aceste lipide. Unele dintre lipide, de exemplu, anumiți acizi grași și vitaminele liposolubile sunt constituenți esențiali ai regi- 70 mului alimentar. înaintea absorbției gastrointestinale, triglicerolii ca și componentele minore, de exemplu, vitaminele liposolubile esterificate și colesterolul, și diacilfosfatidilglicerolii, necesită hidroliza legăturii esterice pentru a obține produse absorbabile cu hidrofobicitate scăzută. Aceste reacții sunt catalizate de către un grup specific de enzime, numite lipaze. 75

La omul adult, lipazele esențiale sunt considerate a fi lipazele gastrice, lipaze colipaz-dependente pancreatice (tri și di- acilglicerolhidrolaze), fosfolipaze pancreatice A2 (diacilfosfatidilgliceroli) și esterhidrolaze carboxilice (colesteril și esteri de vitamine liposolubile). La copilul nou născut, lipaza stimulată de sarea biliară joacă un rol deosebit în hidroliza câtorva lipide menționate mai jos. împreună cu sărurile biliare, 80 produsele digestiei lipidelor formează micele mixte de la care are loc digestia ( (Helmell, O., Blackberg.L. & Bern Back, S (1988) în Perinatal nutrition (Lindblad, B.

5., ed.) Bristol-Myers Nutrition Symposia voi. 6, 66, 259...272, Academic Press, New York; Hernell, □. L. Blăckberg, B. Fredriczon, and Olivercrona, 1981. Bile saltstimulated lipase in uman milk and digestion in the neonatal period. în Textbook of 85 gastroenterology and nutrition in infancy, E. Lebenthal, Editor Raven Press, New York

465.. .471; Berback, S., Blăckberg, 1. & Hernell, □. (1990) J.CIin. Invest, J.CIin. Invest 221...225 (1990).

Cauzele comune ale absorbției lipidelor, și de aici ale malnutriției, sunt reducerea nivelelor de colindependente și/sau sărurilor biliare. Exemple tipice de astfel de 90 deficiențe lipazice sunt pacienții care suferă de fibroze chistice- o dereglare genetică obișnuită, care rezultă dintr-o deficiență de lungă durată la aproape 80% dintre pacienți, și pancreatită cronică.

Funcțiile pancreatice și hepatice nu sunt pe deplin dezvoltate, mai ales la copiii născuți înainte de termen. Malabsorbția grăsimilor, din motive fiziologice, este o 95 trăsătură comună și se apreciază că rezultă din concentrațiile scăzute, în lumenul intestinal, ale lipazei pancreatice colipaz-dependente și sării biliare (Helmell, O., Blackberg.L. &Bern Back, S (1988) în Perinatal nutrition (Lindblad, B. S., ed.) BristolRO 114793 Bl

Myers Nutrition Symposia voi. 6, 66, 259...272, Academic Press, New York; Hernell, □.L. Blackberg, B.Fredriczon, and Olivercrona, 1981. Bile salt stimulated lipase in uman milk and digestion in the neonatal period - în Textbook of gastroeneterology and nutrition in infancy, E. Lebenthal, Editor Raven Press, New York 465...471; Brueton, M. J., Berger, Η. M., Brown, G-A., Ablitt, L. lyangkaran, N. & Whaton B. A. (1978) Got 19, 95...98; Murphy, G.M. &Signer, E. (1975) Gut 15, 151 ...165; Hernell, O., Staggera, J. E. & Carey, M.C. Biochemistry (1990) 29:2041...2056). Cu toate acestea, datorită BSSL, astfel de malabsorbții sunt mult mai puțin frecvente la copiii sugari decât la copiii hrăniți cu lapte uman pasteurizat, din preparate pentru copii (Helmell. P., Blackberg,L. & Bern Băck, S (1988) în Perinatal nutrition (Lindblad, B.S., ed. Bristol-Myers Nutrition Symposia, voi. 6, 66, 259...272, Academic Press, New York; Hernell, □. L. Blackberg, B. Fredriczon, and Olivercrona, 1981. Bile saltstimulated lipase in uman milk and digestion in the neonatal period în Textbook of gastroenterology and nutrution in infancy, E. Lebenthal, Editor Raven Press, New York

465...471; Berbăck, S., Blackberg, 1. & Hernell, O. (1990) J. Clin. Invest. J. Clin. Invest. 221...225 (1990); Bjorksten, B., Burman, L.G., de Chateau, P., Fredrikyone, B., Gothefors, L. & Hernell, D. (1980) Br.Med. J. 201,267...272; Atkinson, S. A. Μ. H. Bryan & G. H. Anderson. 1981. Human milk feeding in premature infants:protein, fat and carbohydrate balance in the first 2 weeks of life. J. Pediatr. 99: 617...634; Chappel, J.C.M.T. Clandinin, c. Kearney-Volpe, s. Keichemen and P.W. Swyer. 1985, Fatty acid balance studies of calcium supplementation, D. Pediatr. 108: 438...447; Willimson, S.E. Finucane, H. Ellis, and H, R, Damsu. 1978. Effect of heat treatment of human milk on absorption of nitrogen, fat, sodium, calcium and phosphorus by preterminfants. Arch. Dis. Childhood, 555...563). Acesta este unul din motivele pentru care s-a susținut că noii născuți, în special prematurii, care nu pot fi hrăniți cu lapte de la propriile lor mame, să poată fi hrăniți cu lapte nepasteurizat de la alte mame (Bjoeksten, B., Burman, L.G., deChateau, P., Fredrikyone, B., Gothefors, L. & Hernell, D. (1980) Br.Med. J. 201, 267...272).

Tratamentul actual al pacienților, care suferă de o deficiență a lipazei pancreatice brute, constă în administrarea orală a unor doze foarte mari de preparate brute de enzime pancreatice porcine. Lipaza pancreatică colipaz-dependentă este inactivată la pH mic. Astfel de condiții sunt predominante în stomac și au ca rezultat inactivarea completă a lipazei pancreatice administrată oral din stomac către intestin. De aceea, acest efect nu poate fi complet depășit prin utilizarea unor doze mari de enzime. Dozele mari de administrare sunt inadecvate pentru majoritatea pacienților și preparatele sunt impure și nedigerabile. Au fost formulate anumite tablete care trec prin regiunile acide ale stomacului și eliberează enzima numai în mediul relativ alcalin al jejunului. Totuși, cei mai mulți pacienți care suferă de afecțiuni pancreatice au o aciditate normală în jejun, și astfel de tablete nu reușesc să elibereze enzima, putând fi, de aceea, ineficiente. Mai mult decât atât, întrucât preparatele prezente pe piață nu sunt din sursă umană, există riscul de imunoreacție care poate cauza efecte dăunătoare pacienților, sau au ca urmare reducerea eficienței terapeutice. Un alt dezavantaj legat de preparatele prezentate este acela că ele au alte activități lipolitice decât lipaza colipaz-dependentă și nu sunt stabile. De fapt cele mai multe dintre acestea au nivele foarte scăzute de activitate CEH/BSSL. Acesta poate fi unul din motivele pentru care mulți dintre pacienții care suferă de fibroză chistică, în ciuda suplimentării terapiei, suferă de deficiențe ale vitaminelor liposolubile și acizilor grași esențiali.

Astfel, este o mare nevoie de produse cu proprietăți și structuri derivate de la lipazele umane și cu o specificitate completă a substratului, produse care trebuie să

RO 114793 Bl fie administrate oral pacienților care suferă de o lipsă a uneia sau câtorva enzime pancreatice lipolitice.

Din punct de vedere istoric, preparatele pentru copii s-au dezvoltat și îmbunătățit, de la conceptul asemănării compozițiilor cu cel al laptelui uman, atât cât poate fi posibil. Este de dorit ca astfel de preparate să fie completate.

Utilizarea pentru suplimentare, substituire sau terapie a lipazelor stimulate de sarea biliară (BSSL), sau a proteinelor cu funcțiuni esențiale ale BSSL, necesită totuși acces la cantități de produs la scară industrială. La nivel industrial, aceasta nu este posibil pe bază de surse naturale, cum ar fi laptele ca materie primă. Pe lângă problema menționată mai sus, de inactivare a BSSLîn timpul pasteurizării, există, în plus, riscul contaminării materialului din surse naturale cu agenți infecțioși, de exemplu, este nevoie de produse având proprietăți BSSL produse pe scară largă.

Prezenta invenție se referă la o peptidă derivată de lipaza umană stimulată de sarea biliară și secvența ADN ce codifică peptida derivată de lipază umană stimulată de sarea biliară.

Peptida derivată de lipaza umană stimulată de sarea biliară, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că are lanțul de aminoacizi indicat în fig.7 de la 1 la 722.

Secvență ADN care codifică peptida derivată de lipaza umană stimulată de sarea biliară, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că lanțul de nucleotide este dat în fig.2, de la 151 la 2316.

Produsele prezentei invenții, înlătură dezavantajele prezentate mai sus, singure sau în combinație cu alte lipaze, sau în combinație cu preparate care conțin alte lipaze. Mai mult decât atât, pentru unii copii, există o nevoie evidentă de a îmbunătăți utilizarea grăsimii din preparatele convenționale pentru copii sau laptele uman pasteurizat din așa-numitele bănci de lapte.

BSSL a avut câteva proprietăți unice ce o fac ideală pentru substituirea și suplimentarea terapiei:

- este destinată pentru administrare orală; astfel, ea rezistă trecerii prin stomac și este activată în interiorul intestinului subțire. Mecanismul său specific de activare va preveni lipazele întâmplătoare provenite din alimente sau pe cele ale țesuturilor lipidice în timpul păstrării sau trecerii lor prin locul său de substrat, are potențialul său propriu de a media digestia completă a majorității lipidelor alimentare, incluzând esterii vitaminelor liposolubile. BSSL poate fi superioară lipazei pancreatice colipaz-dependente de a hidroliza legăturile esterice care conțin lanțuri lungi de acizi grași polinesaturați.

In prezența lipazei gastrice și în absența sau la nivele scăzute de lipază colipazdependentă, BSSL poate stabili o digestie completă a triglicerolului, in vitro, chiar dacă nivelele sării biliare sunt scăzute, așa cum sunt la noii născuți. In prezență de BSSL, produsele finale ale digestiei triglicerolului devin acizi grași liberi și gliceroli liberi, de preferat în locul acizilor grași liberi și monoacilglicerolului generat de alte două lipaze. Aceasta poate favoriza provocarea absorbției, în special când nivelurile de sare biliară sunt scăzute în lumenul intestinal.

Prezenta invenție se bazează pe donarea cADN-ului care codifică BSSL derivată din glanda mamară umană. S-a izolat, de asemenea, din pancreasul uman un cADN parțial care codifică CEH. Secvențele de aminoacizi deduse de la cADN-utile umane și combaterea cu CEH de la alte specii, susțin interpretarea că BSSL și CEH sunt identice.

Așa cum va fi detaliat mai jos, s-a găsit că structura proteinei, așa cum s-a

150

155

160

165

170

175

180

185

190

195

RO 114793 Bl dedus din secvența cADN, este complet diferită de structura altor lipaze. Structura neașteptată s-a dovedit a fi mai asemănătoare structurii esterazelor tipice, ca, de exemplu, colinesteraza.

Invenția cuprinde, de asemenea, un vector, cum ar fi construcții de plasmide care cuprind astfel de secvențe ADN, capabile să exprime enzima dorită. Invenția mai cuprinde și organisme gazdă transfectate cu astfel de construcții, ca de exemplu, bacterii, drojdii, invenția include și procedee pentru prepararea noilor produse ale invenției. Noile peptide ale invenției sunt în legătură cu o enzimă cunoscută ca lipază umană stimulată de sare biliară.

Produsele invenției sunt:

a) o proteină cum este definită prin secvența de aminoacizi 1-722 în fig. 7;

b) o proteină cum este definită prin secvența de aminoacizi 1-535 în fig.7;

c) o proteină cum este definită prin secvența de aminoacizi 1-278 în fig.7;

d) o proteină cum este definită prn secvența de aminoacizi 1-341 în fig.7;

e) o proteină cum este definită prin secvența de aminoacizi 1-409 în fig.7;

f) o proteină cum este definită prin secvența de aminoacizi 1-474 în fig.7;

g) combinațiile de proteine definite de la b) - f) de exemplu, definite prin secvențele de aminoacizi în pozițiile 1-278, 27-9341, 279-409, 279-474, 342-474 și 536-722;

h) combinațiile de proteine definite de la b) -f) în combinație cu una sau mai multe din repetițiile corespunzătoare fig.5;

I) o proteină cum a fost definită de la a)-h) care posedă în plus ca aminoacid Nterminal, metionina, și variantele funcționale echivalente și mutantele proteinelor definite în a) -I) de mai sus;

Este de notat că proteinele de la a), b), c), d], e), f), h) și I] de mai sus nu vor fi identice cu BSSL întâlnită natural, dar ele vor prezenta una sau mai multe dintre funcțiunile critice ale BSSL întâlnite natural.

j) o secvență ADN care codifică proteinele definite în a), b), c), d), e), f), h) și I) de mai sus.

k) o secvență conform fig.2, definită prin următoarele secvențe de nucleotide în fig.2:

- o secvență AND 151-2316, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 1-722 în fig.7;

- o secvență AND 151-1755, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 1-585 în fig.7;

- o secvență AND 151-985, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 1-278 în fig.7;

- o secvență AND 151-1172, conform fig.2 care codifică proteina prin secvența de aminoacizi 1-341 în fig.7;

- o secvență AND 151-1376, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 1-409 în fig.7;

- o secvență AND 151-1574, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 1-474 în fig.7;

- o secvență AND 151-1172, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 279-341 în fig.7;

- o secvență AND 986-1376, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 279-409 în fig.7;

- o secvență AND 986-1594, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 279-474 în fig.7;

RO 114793 Bl

250

- o secvență AND 1173-1376, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 342-409 în fig.7;

- o secvență AND 1173-1574, conform fig. 2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 342-474722 în fig.7;

Proteinele invenției au următoarele funcții semnificative:

a) sunt adecvate pentru administrare orală;

b) sunt activate prin săruri biliare specifice;

c) acționează ca lipaze specifice în interiorul intestinului subțire, deci sunt capabile să hidrolizeze lipide relativ independent de structura lor chimică și de starea lor fizică (emulsionate.micelare, solubile);

d) capacitatea de a hidroliza trigliceroli cu acizi grași având lungimi ale catenelor diferite și grad diferit de nesaturare;

e) capacitatea de hidroliză, de asemenea, a glicerolilor, monoglicerolilor, ester colesterolilor lizofosfatildiacilglicerolilor, retinil și alți esteri de vitamine liposolubile;

f) capacitatea de hidroliză nu numai a legăturilor ester sn-1 (3) într-un triglicerol, ci de asemenea, legătura sn-2;

g) capacitatea de a interacționa nu numai cu săruri biliare primare ci și cu cele secundare;

h) dependența de săruri biliare pentru activitatea optimă;

i) stabilitatea, în așa fel încât, conținutul gastric nu va afecta eficiența catalitică într-o măsură substanțială;

j) stabilitatea împotriva inactivării prin proteaze pancreatice, de exemplu tripsină, asigurată prin prezența sărurilor biliare;

k) capacitatea de a se lega la heparină și derivați de heparină, de exemplu, heparinsulfat;

l) capacitatea de a se lega la interfaze lipide-apă;

m) stabilitatea, care permite liofilizarea;

n) stabilitatea când sunt alimentați cu constituenți alimentari,cum ar fi laptele uman sau în preparate de lapte.

Funcțiile critice pentru suplimentare, înlocuire sau terapie,sunt cele conform cu a), c), d), e), f), i], j) și i). Pentru alte scopuri, nici o altă funcțiune critică nu trebuie să fie necesară.

Pentru expresiile proteinelor indicate mai sus,secvențele ADN indicate vor fi inserate într-un vector adecvat, care apoi se introduce într-un organism gazdă potrivit. Numitul vector, de asemenea, va cuprinde un semnal necesar și alte secvențe care permit organismului să exprime proteina dorită.

Organismele potrivite pentru expresie. Cu tehnicile ADN recombinant este posibil să se doneze și să se exprime o proteină de interes într-o varietate de organisme gazdă procariote și eucariote. Organisme posibile pentru expresie sunt: bacterii, eucariote simple (drojdii), culturi de celule animale, culturi de celule de insecte, culturi de celule de plante, plante și animale transgenice. Fiecare sistem individual are avantajele și dezavantajele sale specifice. Simpla concluzie este că pentru a fi exprimată fiecare genă este o problemă unică și nu există o soluție standard, accesibilă.

Sistemele bacteriene utilizate în mod curent sunt E.coli, Bacillus subtilis, Streptomyces. Drojdiile folosite de regulă sunt Saccharomyces și Pichia Pastoris. Celulele de animale folosite, de regulă sunt celulele CHO și celulele COS. Culturile de celule de insecte uzuale sunt celulele derivate de la Drosophila.

Planta folosită în mod obișnuit este tutunul. Animalele transgenice posibile sunt capra și vaca.

255

260

265

270

275

280

285

290

RO 114793 Bl

Vectorii bacterieni posibili sunt pUC și vectorii proteinei A.

Vector posibil la drojdii este pUC.

Vectorii posibili la insecte sunt derivați de la Baculo-virus.

Vectorii posibili de la celule animale sunt derivați de la SV/4O.

Vectorii posibili la plante sunt derivați de la plasmida-Ti.

In oricare sistem, pot fi folosiți promotori și terminatori atât naturali cât și sintetici.

Se înțelege că în funcție de alegerea sistemului de expresie, proteina exprimată poate să conțină un aminoacid N-terminal suplimentar (metionina), să conțină câțiva extraaminoacizi, sau să fuzioneze la o proteină heterologă (exemplu proteina A], sau să difere de proteina întâlnită în mod natural în glicozilări. Mai mult decât atât, vectorii trebuie să conțină, de asemenea, secvențe semnal în vederea eliminării proteinei spre periplasmă sau spre mediul de cultură.

Astfel, ulterioarele aspecte ale invenției sunt:

a) un vector care cuprinde o secvență ADN care codifică o proteină cum este specificat mai sus;

b) un organism gazdă care cuprinde o secvență ADN cum s-a specificat mai sus

c) un procedeu pentru obținerea unei proteine cum s-a specificat mai sus, prin creșterea unui organism gazdă care conține un vector cum s-a specificat la a] de mai sus și izolarea proteinei.

Metodele pentru purificare se bazează pe sistemul de expresie (de exemplu, proteina A/lgG) și/sau pe metodele folosite la purificarea enzimelor naturale așa cum este descris în Blackberg, L. & Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem. 116, 221 ...225

Aspectele suplimentare ale invenției sunt:

- o compoziție farmaceutică care cuprinde peptida derivată a lipazei umane stimulată de sarea biliară, cum s-a specificat mai sus;

- utilizarea unei peptide, descrisă mai sus, pentru obținerea unui medicament pentru tratamentul unei stări patologice legată de insuficiența pancreatică exocrină;

- utilizarea unei peptide, descrisă mai sus, pentru producerea unui medicament pentru tratamentul fibrozei chistice;

- utilizarea unei peptide, descrisă mai sus, ca supliment pentru un preparat alimentar de uz pediatric;

- utilizarea unei peptide, descrisă mai sus, pentru obținerea unui medicament pentru tratamentul pancreatitei cronice;

- utilizarea unei peptide, descrisă mai sus, pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul malabsorbției vitaminelor liposolubile;

- utilizarea unei peptide, descrisă mai sus, pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul malabsorbției grăsimilor datorat unor cauze fiziologice, de exemplu, la copii nou născuți.

Secvența ADN din fig.2 de la poziția 151 până la, inclusiv poziția 2316, este secvența care codifică întreaga proteină. Secvența de la poziția 2317 până la, inclusiv, 2415, nu este translatată în proteină, dar este inclusă în exonul de identificat în tabelul 2 de mai jos.

Intr-o realizare a invenției, peptida, cum este definită în paragrafele a)-l) de mai sus este asigurată în formă izolată și/sau în formă substanțial pură.

Secvențele ADN, așa cum au fost definite în paragraful a]-k) de mai sus, sunt într-o formă de realizare a invenției, obținute sub formă izolată și/sau sub formă substanțial pură.

RO 114793 Bl

In prezenta descriere, s-au folosit următoarele abrevieri:

- aa = aminoacid;

bp = baze pereche;

BSSL = lipază stimulată de sarea biliară:

c-AMP =adenozin monofosfat ciclic;

CEH = ester hidrolaza carboxilică;

Da = dalton;

c-7-GPT = 7-deaza-2-deoxiguanozin-5-trifosfat;

EDTA = etilen-diamino-tetraacetat kb = kilobaze;

MOPS = acid 6-N-morfolinpropansulfonic;

nt = nucleotide:

PAGE = electroforeză în gel de poliacrilamidă;

SDS = dodecil sulfat de sodiu;

SSC = NaCI citrat;

xGal = 5-bromo-4-cloro-6-indolil-p-D-galactopiranozidă.

In continuare, se prezintă exemplele de realizare a invenției în legătură cu fig. 1...7, care reprezintă:

-fig.1, separarea digestului triptic al BSSL prin HPLC.

BSSL purificat s-a tratat cu tripsină și s-a cromatografiat prin HPLC, așa cum s-a descris în Materiale și metode. Vârfurile indicate s-au colectat și s-au purificat în continuare printr-o recromatografie și s-a determinat secvența lor de aminoacizi.

-fig.2, secvența nucleotidică cDNA și secvența de aminoacizi dedusă pentru lipaza umană stimulată de sarea biliară.

cDNA-ul are o lungime de 2428 baze. Secvența de 23 codoni N-terminală (nt 82-150) care începe cu un ATG, se interpretează ca o peptidă lider, în timp ce secvența de aminoacizi N-terminală a proteinei mature începe la codonul 24 (nt 151, Ala). Peptida lider este subliniată. Semnul * indică punctul de start al unui axon. Semnul ** indică punctul de start al părții de repetiție.

- fig.3, secvența de nucleotidă a repetițiilor C-terminale bogată GC în lipază stimulată de sare biliară.

Substituțiile sunt indicate prin următorul semn *

-fig.4, hibridizarea petei Northern.

Analiza Northern a ARN-ului total izolat din glanda mamară umană în lactație, pancreas, țesut adipos și o linie celulară a hepatomului uman (HepG2). ARN-ul total (10 pg) din glanda mamară în lactație (bandaA), pancreas (bandaB), țesutul adipos (bandaC) și HepG2 (bandaD) au fost supuse electroforezei în gel de agaroză1% tampon MOPS 40mM la pH=7,0, după denaturarea ARN-ului în glioxal 1M, dimetilsulfoxid 50% și MOPS 40mM. ARN-ul glioxilat a fost apoi transferat pe hârtie de nitroceluloză pentru hibridizare cu BSSL cDNA (ABSSL) marcat cu (³²P).

-fig.5, compararea secvenței deduse de aminoacizi din BSSL din lapte uman, lizofosfolipaza pancreatică de la șobolan (Ratlpl) (40) și colesterolesteraza pancreatică bovină (Bovceh) (41).

Resturile de serină implicate în situl activ sunt indicate prin * și * * și indică singurul semnal posibil de N-glicozilare al proteinei. Repetițiile directe ale secvențelor de aminoacizi sunt încadrate. Secvențele ajustate sunt marcate cu litere mari. Secvențele ajustate dintre două enzime sunt marcate cu litere mici și discordanțele cu un punct.

- fig.6, compararea structurii primare cu alte esteraze, tiroglobulina și un cAMP dependent de enzimă de la Dictyostelium discoideum.

345

350

355

360

365

370

375

380

385

390

RO 114793 Bl

BSSL: lipază stimulată de sarea biliară de la om, Cheshum: acetilcolinesterază de la Torpedo marmorată (51), Torpace Cheshum: colinesterază din țesut fetal uman (5), Drosceh: hidrolază carboxilică de la Drosophila melanogaster (52), Ratlivce: carboxilesteraza din ficat de șobolan (53), Drosace: acetilcolinesteraza din Drodophila melanogaster (54), Thyrhum: tiroglobulina de la om (49) și Dict.Di: c.AMP dependent de enzima de la Dictyostelium discoideum (469). Există 7 domenii diferite care arată asemănările dintre enzime. Căsuțele includ resturile care sunt identice și literele mici în secvență consens indică resturile identice în toate enzimele, cu excepția uneia. Punctele indică neconcordanțe. Restul de serină cuprins în situl activ este indicat cu *. Figura din colțul din dreapta arată cum sunt orientate domeniile.

- fig.7 și 7’, indică secvența de aminoacizi de la 1 la 722 pentru întreaga proteină (un cod literal) și indică exonii a, b, c și d. Semnul ** indică punctul de plecare al părții care se repetă.

Exemplul 1.

Enzime folosite:

- lipaza stimulată de sarea biliară EC 3.1.1.3;

- ester hidrolaza carboxilică EC 3.1.1.1.

Materiale și metode:

A) Enzima și prepararea anticorpului.

BSSL este purificat din laptele uman așa cum s-a descris mai sus (Blackberg, L. & Hernell, O. (1981), Eur. J. Biochem, 116, 221...225). Când s-a folosit pentru producerea anticorpului, enzima a fost purificată, ulterior prin SDS-PAGE. Banda de proteină care corespunde lipazei este, după colorare cu Coomassie Brilliant Blue, electroeluată din gel. 25 pg de enzimă purificată, împreună cu un volum egal de adjuvant Freud complet și s-a folosit pentru o primă injecție i.c. și aceeași cantitate de enzimă cu adjuvant incomplet pentru injecțiile ulterioare lunare de susținere. Se recoltează sânge de la iepurii injectați la aproximativ 2 săptămâni. După fiecare serie de tratament, serul preparat s-a păstrat la -20°C.

A) Prepararea fragmentelor triptice și analiza secvenței de aminoacizi.

mg de BSSL purificată și dizolvată într-un ml de tampon tris-HCI 0,1 M, pH=8,5, care conține 6 M clorhidrat de guanidină și 2 mM EDTA. Se adaugă ditioeritriol până la 5 mM. După incubare la 37°C timp de 2 h, se adaugă 300 pg iodoacetat 50 mM. După incubare 90 min, la 25°C, la întuneric, enzima redusă și carboximetilată este desalinizată pe o coloană de Sephadex C-25, echilibrată cu bicarbonat de amoniu 0,5M. 30 pg de tosil-L-fenilalanin-clormetan se tratează cu tripsină bovină (Worthington Diagnostic System Inc., Freehold, NJ, USA), se adaugă înainte de liofilizare. Proteina liofilizată se dizolvă în 4 ml bicarbonat de amoniu □, 1 M și se adaugă un plus de 90 pg tripsină. Digeratul triptic se dizolvă în acid trifluoracetic 0,1 % (2 mg/ml). 300 pg de BSSL tripsinată este cromatografiată prin HPLC folosind o coloană C-18 în fază inversă și este eluată cu un gradient de acetonitril O... 50 % prin înregistrarea continuă a absorbției la 215 nm. Peptidele de secvențiat sunt apoi purificate prin cromatografiere în aceeași coloană având gradienți ajustați.

Probele de fragmente de peptide de secvențiat sunt uscate sub azot pentru a îndepărta acetonitrilul și sunt puse la un aparat de secvențiere. Pentru analiza secvenței N-terminale,BSSL naturală se dizolvă în acid acetic 0,1 %. Analizele secvenței se realizează pe un aparat de secvențiere cu pulsație în fază lichidă Applied Biosystems Inc. 477A și în direct cu un analizator PTH 180A cu programe de reglare ciclică și reactivi de la fabricant. Randamentele inițial și repetitiv calculate pe proteină standard, secvențiată, β-lactoglobulină, au fost 47 și respectiv 97 %.

RO 114793 Bl

445

C) Izolarea ARN-ului.

Probele de adipoză pancreatică umană și țesut din glandă mamară în lactație sunt obținute chirurgical și sunt puse imediat în tiocianat de guanidină (1...5 g în 50 ml). ARN-ul total este extras așa cum este descris de către Chirgwin, J.. M. Przybyla, A. E. MacDonald R. J. & Rutter, W. J. (1979). Poli(A)-ARN-ul se prepară prin cromatografie pe o coloană oligo-dezoxitimidilat-(oligo(dT)(-celuloză (Aviv, H. & Leder, P. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 5201...5205).

D) Construcția și cercetarea depozitelor de cADN.

Aproximativ 15 pg de ARN poliadenilat din pacreasul uman s-a denaturat cu hidroxid metil mercuric(Bailey, J.M. & Davidson, N. (1976), Anal. Biochem, 70,

75...85), s-a inițiat cu oligo inițiatori (dT)₁₂.₁₆ (Pharmacia, Upssala, Sweden], și s-a transcris invers folosind procedee standard (Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambook J. (1982): Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Sinteza catenei secundare s-a realizat conform lui Gubler și Hoffman (Gubler, U. & Hoffman, B. J. (1983), Gene 25, 263...269), cu excepția faptului că And-ligaza și β-NAD au fost omise și temperatura reacției s-a menținut la 15°C. Excesul de ARN a fost digerat cu ARN-aza A, și cADN-ul dublu catenar s-a tratat cu EcoRI metilaza (Maniatis t., Haldison, R., Lacy, E., Lauer, J. O'Conell, C. & □von, D. (1978), Cell 15, 687...701). Capetele au fost teșite cu enzima Klenow. După ligarea la linkerii EcoRI și clivarea cu EcoRI, cADN-ul s-a fracționat pe o coloană de Sepharoze 48-C1. Fracția de volum eliminat a fost precipitată cu etanol și cADN-ul a fost ligatîn situl EcoRI a unui vector gtll tratat cu o fosfatază (Young, R. A. & Davids, R. W (1983), Science 222, 778...782). In vitro, se obțin mai mult de 7 x 10⁵ recombinați.

Un stoc de cADN din glanda mamară derivat dintr-un țesut obținut de la o femeie în luna a Vlll-a de graviditate, s-a procurat de la Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA; USA.

Fagii de la depozitele cADN se plasează la 5 x 10⁴ pe plăci care formează unități pe discuri de 120 mm. Antiserul se diluează la un raport de 1:3200 și se realizează selecția conform lui Zoung și Davis (Young, R. A. & Davids, R. W (1983), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80, 1194. ..1198). Ca anticorpi secundari, s-au folosit anticorpii capră-anti-iepure conjugați cu alcalinfosfataza., (Bio-Rad, Richmond, CA USA). Pentru a izola clone care corespund capătului 5 al mARN-ului, acidul nucleic hibridizat a fost definit în condiții standard (Maniatis, t., Frirsch, E. F. & Sambrook, J. (1982): Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), folosind un fragment subclonat de la una din clonele imunopozitive ca o sondă.

E) Analiza ARN.

Electroforezele se realizează într-un gel de la 1 % agaroză în tampon MOPS 40mM, pH=7,0 după denaturare cu glioxal și dimetilsulfoxid (McMaster, G.K., & Charmichael, G.S. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci.,USA 74 48 353...48 358), ARN-ul total glioxilat se trasferă apoi pe filtre din nitroceluloză. Petele se probează cu subclone de BSSL și CEH recombinat care s-au caracterizat prin tehnica oligo-cloning (Feinberg, A. P. &Vogelstein, B. (1983), Analyt. Biochem. 132, 6...13. Prehibridizările și hibridizările se realizează cu formamidă 50 % la 45°C (Maniatis, t., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. (1982): Molecular Cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York),. Spălările posthibridizare se realizează cu strictețe (0,1 % SDS și 0,1 x SSC la 60°C). (1 x SSC, 0,15 M NaCI, 0,0015 M Na3 citrat, pH=7,6).

450

455

460

465

470

475

480

485

490

RO 114793 Bl

495

500

505

510

515

52Q

525

530

Secvența de nucleotide.

Inserții de cADN din recombinantii de BSSL si CEH s-au donat fie direct în I ’ '

M3mp18 după sonicare și fracționare de mărime, fie unii din ei s-au subclonat, în continuare, în pTZ19R, după digestii cu Pstl, BstXI, Nari, Smal și Ahall. Secvența nucleotidică s-a determinat prin metoda dideoxi a lanțului terminal (Sânger, F., Nicklen, S. SCoulson, a.R. (1977), Proc. Natl. Aca. Sci., USA 74, 5463...5467. Repetițiile GCbogate sunt, de asemenea, secvențate cu polimeraza Taql și ⁷GTP. Ambele catene sunt secvențate. Informația din secvență a fost recuperată din autoradiograme prin folosirea de software MS-EdSeq cum a descris Sjoberg și alții.

Secvențe anticipate de aminoacizi și omologi.

Pentru a anticipa secvențele de aminoacizi corespunzătoare inserțiilor de cADN, codonul uzual al diferitelor cadre citite se compară conform lui Staden și dă un cadru deschis pentru citire (Staden, R, 1984, Nuci. Acids Res, 12, 551...567). Omologii sunt cercetați cu programele din pachetul software UWGCG (Devereux, J., Haeberli.P., Smithies, O., 19B4), Nuci. Acids Res, 12, 387...395.

Rezultate și discuții.

A) Secvențele fragmentelor triptice și N-terminal ale BSSL.

Digestia cu tripsină a BSSL purificată dă aproximativ 50 de fragmente care sunt apreciate prin numărul de vârfuri obținute în timpul cromatografiei HPLC (fig. 1). Se colectează vârfurile și cele indicate care au putut fi izolate în stare foarte pură și sunt secvențiate cantități rezonabile.

Secvențele rezultate sunt prezentate în tabelul 1. In plus, sunt secvențate majoritatea dintre cele 30 de resturi N-terminale (fig.2) și ele confirmă secvența raporată anterior de Abouakil și alții (30 de resturi) (Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J., Lombardo.S., 1988, Biochim. Biophys. Acta 961,299...308).

Secvența lungă de 22 de resturi N-terminale raportate de Wang.c.S. și Johnson.K., Anal.Biochem.{'} 983, 133, 457...461), în lucrarea noastră, este o glicină și o lizină în cea a lui Wang și Johnson.

B) Secvența nucleotidică a BSSL.

Pentru construcția stocului de cDNA Ăgtll se folosește ARN poliadenilat din pacreas uman. Inițial se izolează patru clone imunopozitive și apoi acest stoc de expresii pancreatice cDNA este selectat cu antiser împotriva BSSL. Analiza secvenței nucleotidice a celor 4 clone arată că ele sunt într-un perfect acord și corespund terminației 3' a ARNm. Toate încep cu un capăt poli A și diferă ca lungime; cel mai lung insert, denumit ACEH, cuprinde 996 bp.

Un depozit cDNA din glanda mamară umană este selectat cu antiser și clona ACEH de pancreas ca sondă. Clonele pozitive se izolează din ambele selecții, toate care au originea în capătul 3'.

Cea mai lungă clonă din glanda mamară, denumită ABSSL, poate să atingă mai mult de 2100 bp. Ea conține din fragmentele triptice secvențate (fig.2), dar nu include secvența aminoacidului N-terminal. Pentru extinderea secvenței dincolo de începutul translării, depozitul cDNA din glanda mamară este reselectat cu o sondă de 118 baze lungime derivată de la majoritatea părții 5' aproximativ a ABSSL. Se izolează o clonă care conține un plus de mai mult de 328 nucleotide. Secvența de aminoacizi N-terminală se ajustează și conține ceea ce a mai rămas din fragmentul triptic. Așa cum arată fig.2, cDNA-ul are lungimea de 2428 nucleotide și conține 81 de baze mai sus de primul codon ATG. Semnalul de poliadenilare, AATAAA, este localizat la 13 nucleotide mai sus de terminația poli A și codonul de terminație TAG se găsește la nucleotida 2317 urmată de o regiune 3' netranslată de 112 bp.

535

RO 114793 Bl

Se găsește o regiune GC bogată care constă în 16 repetiții a 33 de baze în terminația 3' a secvenței dintre baza 1756 și 2283. Secvența de nucleotide a repetiției, prezentată în fig.3, constă în 5 repetiții identice înconjurate de către 10 repetiții cu număr diferit de substituții care probabil se întâlnesc după câteva duplicări.

Numărul scăzut de substituții sugerează că aceste repetiții au apărut târziu în cursul evoluției.

C) Distribuția țesutului de expresie.

ARN-ul din glanda mamară umană în lactație, pancreas, țesut adipos și dintr-o linie celulară de hepatom (HepG2) se analizează prin pete Northern. Mărimea mesagerului este determinată a fi aproximativ 2,5 kb atât în glanda mamară în lactație, cât și în pancreas. Nu se poate detecta nici un semnal în benzile cu ARN extras din HepG2 sau țesutul adipos (fig.4).

Chiar dacă ARN-ul folosit pentru depozitul de glandă mamară se obține de la o femeie în luna Vlll-a de graviditate, este evident că transcripția și, probabil, translația genei BSSL este dirijată înainte de naștere în concordanță cu găsirea de secreție BSSL înainte de naștere (vezi fig.4), Hamosh. (1986) în Human Milk Infant Nutrition and Health, (Howell, R.R., Morriss, F.H. 8. Pickering.L.K. eds), 66...97, Charles, C. Thomas, Springfield.

D) Secvența de aminoacizi a BSSL.

Masa moleculară evaluată prin SDS-PAGE este 107-125 kDa (8,36) și prin ultracentrifugare analitică 105 kDa (Wang.C.S. & Lee, D.M., 1985, J.Lipid Res, 26,

824.. .402). Enzima, așa cum s-a dedus din cDNA, constă din 722 resturi aminoacide (fig.2) care dau o masă moleculară de 76271 Da indicând că enzima conține cel puțin

15.. . 20 % carbohidrați. Secvența lider este lungă de 23 de resturi. La serina 217 (fig.5) este localizat experimental un rest de serină într-o poziție activă. Secvența din jurul acestei serine este în concordanță cu consensul poziției active a secvenței serin hidrolazelor (Brenner.S., 1988, Nature, 334, 528...530). Recent, s-a presupus că resturile bazice găsite în interiorul sitului activ al serinei ar putea fi implicate în clivarea legăturilor ester din acilgliceroli de către lipaze (Yang.C.Y., Gu.Z.W., Yang.H.H., Rihde.M.F., Gotto, Jr., A.H. & Pownall.J.H., 1989, J.Biol.Chem., 265,

16822.. .16827). Este interesant de notat că astfel de resturi nu sunt prezente în BSSL. Singura încercare de sit de N-glicozilare este localizată numai în 7 resturi de la serină. Gradul de glicozilare sugerează că enzima conține un carbohidrat legat (Blackberg.L. & Mernell, □., 1981, Eur.J.Biochem., 116, 221...225; Lombardo, □., Guy.B. & Figarelle.C., 1978, Biochim. Biophys. Acta, 527, 142...149). Aici sunt numeroase situri unde pot fi întâlnite astfel de glicozilări. Compoziția de aminoacizi bazată pe enzima purificată a arătat un conținut ridicat de resturi de prolină (Blackberg.L. & mernell, O., 1981, Eur. J. Biochem., 116, 221...225). Secvența de aminoacizi obținută de la cADN confirmă aceasta. Mai mult, cele mai multe resturi de prolină sunt localizate în 16 repetiții a 11 resturi fiecare, constituind principala parte a jumătății C-terminale a enzimei.

Interpretarea rezultatelor obținute.

Compararea enzimelor din glanda mamară (BSSL) și pancreas (CEH) BSSL din lapte uman și CEH din pancreas uman s-au prezentat mai sus a fi similare, dacă nu identice. Date recente sprijină puternic ideea că cele două enzime sunt produse de aceeași genă. Secvența nucleotidică a clonelor cADN arată că clona pancreatică ACEH este identică cu clona glandei mamare ABSSL de la capătul poli A și 996 baze spre capătul 5' incluzând secvența care codifică pentru repetările bogate în prolină. Pata Northern dă o singură bandă de 2,5 kb în ARN-ul din pancreas și glanda mamară în

540

545

550

555

560

565

570

575

580

585

RO 114793 Bl

590

595

600

605

610

615

620

625

630 lactație. Petele Southern genomice susțin în continuare ideea că pentru BSSL și CEH codifică doar o singură genă. Diferența în mobilitate pe SDS-PAGE dintre BSSL și CEH poate fi explicată ca o consecință a glicozilării diferită sau a îmbinării diferențiale.

Similaritatea enzimelor BSSL la șobolani și bovine (vezi în continuare) și rezultatele de la petele genomice susțin posibilitatea ca îmbinarea diferențială să nu poată fi luată în considerare pentru diferențe de mobilitate. Din moment ce secvența C-terminală nu a fost confirmată pe nivelul de proteină există aici o probabilitate mai mică pentru posibilitatea ca CEH să poată fi produsă printr-un clivaj proteolitic în capătul Cterminal.

In măsura în care cunoaștem enzime pancreatice, acestea evident corespund cu CEH având numele adeseori după felul și specificul substratelor folosite pentru a determina respectivele lor activități: lizofosfolipază, colesterilesterază, sterolesterhidrolază, lipază nespecifică, estercarboxillipază și estercolesterilhidrolază. Datele accesibile sunt compatibile cu faptul că toate aceste activități au fost descrise inițial într-una și aceeași entitate funcțională (Blackberg.L., 1981, Fat digestion in newborn infant, Urnea University Medical Dissertations New Series No.71; Rudd, E.A. & Brockman.H.L., 1984, Lipases, Bergstrim.B. Brockman.H.L. eds., 184...204, Elsevier, Amsterdam). Aceasta ilustrează gama de specificitate de substrat și relevă destinația lor ca lipaze nespecifice. Când secvența BSSL/CEH se compară cu secvența de lizofosfolipază din pancreas de șobolan (Han.J.H., Stratowa.C. & Rutter.W.J., 1987, Biochemistry 26, 1617...1625) și colesterolesteraza din pancreas bovin (Kyger.S., Wiegand.R. & Lange.L., 1989, Biochim. Biophys. Res. Corn, 164, 1302...1309), se găsesc asemănări extensive care se întind la aproximativ 530 de resturi de la N-terminal (fig.5); dar ele diferă în partea moleculei unde se întâlnesc repetițiile. Enzima de la șobolan a avut numai 4 repetiții și enzima bovină 3. Deci, enzima umană este o peptidă considerabil mai lungă.

Mai mult, s-au găsit asemănări izbitoare între BSSL și un număr de esteraze tipice, de exemplu, acetilcolinesterazele de la câteva specii, inclusiv om și Drosophila și carboxilesteraze (fig.6). Aceste asemănări sunt restrânse la 300 resturi N-terminale ale BSSL care includ restul de serină în situl activ experimental. O asemănare cu acetilcolinesteraza a fost presupusă de faptul că BSSL este inhibat de către inhibitori tipici ai colinesterazei ((Blackberg.L. & Mernell, O., 1981, Eur.J.Biochem., 116,

221.. .225; Blackberg, L., Lombardo. D., Hernell, O., Guy, O. & Olivercrona.T., 1981, FESS Lett. 136, 284...288; Lombardo,O., Guy,B. & Figarelle, C., 1978, Biochim. Biophys. Acta”, 527,142...149). Cu posibila excepție a carboxilesterazei din ficatul de șobolan (Cammuli, E.D., Like.M.J., Brockman, H.L. & Hui.O.Y., 1989, Biochim. Biophz. Acta”, 1005, 177...182), niciuna dintre aceste enzime similare nu au apărut a avea aceeași dependență de sarea biliară ca BSSL; aceasta sugerează că baza structurală pentru această proprietate constă în partea C-terminală a proteinei. Mai mult, BSSL poata ataca eficient substrate emulsionate, ceea ce nu este cunoscut a fi caracteristic esterazelor similare. Pentru această activitate, sarea biliară este o condiție obligatorie.

Secvența propusă pentru BSSL uman s-a comparat cu alte lipaze bine caracterizate de la mamifere. Lăsând la o parte consensul secvenței din jurul sitului activ al serinei (G-X-S-X-G), nu s-au găsit similarități evidente (Mickel.S., Weidenbach.F., Swarowsky.S., LaForge.S. & Scheele.G., 1989, J. Biol. Chem.”, 264,

12895.. .12901).

In plus, la asemănările cu alte enzime, există, de asemenea, asemănări cu un cAMP dependent de proteina de la Dictyostelium discoideum (Mann.S.K. & Firtel.R.A.,

635

RO 114793 Bl

640

1987, Mol.Cell Biol., 7, 458...469) ca și tiroglobulina de la câteva specii (fig.6) (Mercken.L., Simons.M.J., Swîllens.S., Masser.M. & Vassaet.G., 1985, Nature, 316, 647...651; lauro.R., Obici.S., Condliffe.D., Ursini.V.M., Musti,A., Moscatelli.C. & Awedimento.V.E. (1985), Eur.J.Biochem, 148, 7...11; Malthiery.Y, Lissitzky.S., 1987, Eur. J. Biochem.”, 165, 491...498). Asemănările între BSSL și tiroglobulină care cuprinde regiunea sitului activ, dar nu situl activ în sine, arată că aceste strânse legături ale aminoacizilor sunt de o importanță generală mai mare decât simpla susținere a activității enzimatice a esterazelor.

In concluzie, BSSL din laptele uman este constituită din 722 resturi de aminoacizi. Datele accesibile indică evident faptul că, lanțul său peptidic este identic cu cel al CEH pancreatice și sunt codificate de aceeași genă. Cel mai evident este faptul că secvențele lor terminale 3' și secvențele lor aminoacidice N-terminale sunt identice. Omologia găsită la lizofosfolipaza pancreatică de la șobolan și colesterolesteraza pancreatică bovină susține ipoteza că aceste enzime sunt, de asemenea, funcțional identice. Totuși, așa cum s-a sugerat, mărimile moleculare diferite care s-au găsit la diferite specii, nu sunt datorate doar diferențelor de glicozilare; mai degrabă, ele reflectă un număr variabil de repetări ale aminoacidului unsprezece. Asemănarea secvenței de la situl activ între aceste esteraze sugerează că aceste proteine derivă de la o genă comună ancestrală.

Tabelul 1 Secvențe de aminoacizi ale peptidelor BSSL

Datorită interferării vârfurilor non-pozitive, identificarea de resturi în ciclurile 1 și 2 ale secvenței poate fi făcută în peptida 26. Numerele peptidelor se referă la vârfurile din fig. 1.

645

650

655

660

Fragmente triptice

TP16: LysValThrGIuGluAspPheTyrLys

TP19:GlylleProPheAlaAlaProThrLys

TP 20: LeuValSerGIuPheThrIleThrLys

TP24: ThrT yr AlaT yrLeuPheSerHisProSerArg

TP26:

PheAspValTyrGIuSerTrpAlaGInAspProSerGInGluAsnLys

665

670

Tabelul 2

Identificarea exonilor a, b, c și d, numerotați ca în fig. 2 și 7.

Exon	Localizare
între nucleotidele nr.	între aminoacizii nr.
a	986-1172	279-341
b	1173-1376	342-409
c	1377-1574	410474
d	1575-2415	475-722
întreaga proteină	151 -2316	1 - 722
întreaga proteină
excluzând repetițiile	151 - 2316	1 - 535

675

Claims (9)

1. Revendicări

   1. Peptidă derivată de lipază umană stimulată de sarea biliară, caracterizată prin aceea că, peptidă are lanțul de aminoacizi indicat în fig. 7, de la aminoacidul 1 la aminoacidul 722.
2. 2. Peptidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că prezintă metionina ca aminoacid N-terminal suplimentar.
3. 3. Peptidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că prezintă una sau mai multe dintre funcțiile critice ale lipazei umane naturale stimulată de sarea biliară.
4. 4. Peptidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se administrează în combinație cu lipaza sau lipaze, sau în combinație cu preparate care conțin lipaza sau lipaze, pentru tratamentul unei stări patologice privind insuficiența pancreatică exocrină, pentru tratamentul fibrozei chistice, al pancreatitei cronice, al malabsorbției lipidelor, al malabsorbției vitaminelor liposolubile sau al malabsorbției lipidelor datorate unor motive fiziologice.
5. 5. Peptidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se administrează ca stimulent în hrana copiilor.
6. 6. Peptidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se administrează sub forma unei compoziții farmaceutice împreună cu un agent purtător acceptabil farmaceutic pentru administrarea orală.
7. 7. Secvență ADN ce codifică peptidă derivată a lipazei umane stimulată de sarea biliară definită la revendicarea 1, caracterizată prin aceea că are secvența de nucleotide indicată în fig.2, de la poziția 151 la poziția 2316.
8. 8. Secvență ADN, conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că cuprinde un lanț de nucleotide capabil de hibridizare, în condiții de hibridizare strictă, într-un lanț de nucleotide conform cu revendicarea 7 și care codifică proteina din fig.7 sau o formă modificată a acesteia, echivalentă din punct de vedere funcțional.
9. 9. Secvență ADN, conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că cuprinde un lanț de nucleotide care este degenerat, ca rezultat al codului genetic, într-un lanț de nucleotide conform revendicării 7 și care codifică proteina din fig.7 sau o formă modificată a acesteia, echivalentă din punct de vedere funcțional.