FI114639B - Ihmisen sappisuolojen stimuloimat lipaasijohdannaiset ja menetelmä niitä sisältävän farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi - Google Patents

Description

114639

Ihmisen sappisuolojen stimuloimat lipaasijohdannaiset ja menetelmä niitä sisältävän farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi - Lipasderivat sti-mulerade av männsikans gallsalter och farmaceutiska ämnen innehällande därav 5 Tämä keksintö liittyy uusiin DNA-sekvensseihin, näiden DNA-sekvenssien koodit-tamiin uusiin proteiineihin, ja näiden seuraavassa edelleen kuvattujen proteiinien käyttöön. Keksintö käsittää myös vektorit, plasmidin rakenneosina, sisältäen sellaiset DNA-sekvenssit, jotka kykenevät ilmentämään toivottuja entsyymejä. Kek-10 sintö sisältää myös tällaisilla rakenneyksiköillä transfektoitavat isäntäsolut, esimerkiksi bakteeri-, hiiva- ja nisäkässolut. Keksintö sisältää myös menetelmät uusien keksinnön tuotteiden valmistamiseksi. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut uudet proteiinit liittyvät entsyymiin, joka tunnetaan esimerkiksi ihmisen sappisuolan stimuloimana lipaasina.

15 Ihmisen maitoa erittävä rauhanen tuottaa ja erittää maidon ohella sappisuolan stimuloimaa lipaasia (BSSL) [1] joka, primaaristen sappisuolojen erityisen aktivaation jälkeen [2, 57, 58], myötävaikuttaa rintaruokinnassa olevan lapsen ruoansula-tusrasvojen endogeeniseen kapasiteettiin [3-5]. Tämä entsyymi, jota on suurinpiirtein 1 % kokonaismaidonproteiinista [6], on epäspesifinen lipaasi; se ei hydrolysoi 20 ainoastaan tri-, di- ja monoasyyliglyseroleita in vitro, vaan myös kolesteryyli- ja re-: tinyyliestereitä, ja lysofosfatidyyliglyseroleita [7-10]. Ennen kaikkea sen aktiivisuus ei rajoitu emulsoiviin aineisiin, vaan miselli- ja liukoiset substraatit hydrolysoituvat ; samalla nopeudella [11].

: BSSL ei pilkkoudu maidon mukana vatsan läpi kulkeutuessaan, ja pohjukkaissuo- ‘ 25 Ien sisällössä sitä suojelevat sappisuolat haiman proteaasien, kuten trypsiinin ja kymotrypsiinin [2, 11] inaktivaatiolta. Se kuitenkin inaktivoituu, kun maito pastöroi-daan, esim. lämmitetään 62,5 °C:ssa 30 minuuttia [12]. Malliesimerkit in vitro eh-dottavat, että triasyyliglyseroolien digestion lopputuotteet ovat erilaisia BSSL:n , mukana ollessa [5, 7]. Matalampien intraluminaalisia sappisuolojen pitoisuuksien » t » !!!_ 30 johdosta ajanjakson aikana ennen syntymää [13, 14] voi olla hyötyä sen tuotteen *;·’ sitoutumisessa.

.]*: Ihmisen haimanesteen karboksyyliesterihydrolaasi (CEH) [16] näyttää olevan toi- » »· minnallisesti samanlainen, tai ainakin hyvin samanlainen kuin BSSL [8]. Ne jakavat myös yhteiset epitoopit [8,17], niillä on identtiset N-pään aminohapposekvens- 114639 2 sit [17] ja ne inhiboituvat seriiniesteraasi-inhibiittoreilla, esim. eseriinillä ja diisopro-pyylifluorofosfaatilla [6, 8, 16]. On oletettu, että nämä kaksi entsyymiä ovat saman geenin tuotteita [18, 19]. Havaittu molekyylikokojen ero [8, 19] voisi selittyä erilaisten glykosylaatiomallien avulla, kuten äskettäin on ehdotettu [17], 5 Ravinnosta saatavat lipidit ovat tärkeitä energianlähteitä. Energiapitoiset triasyyli-glyserolit koostuvat yli 95 %:sta näitä rasvoja. Muutamat lipideistä, esim. tietyt rasvahapot ja rasvaliukoiset vitamiinit ovat välttämättömiä ravinnon ainesosia. Ennen ruoansulatuskanavaan imeytymistä triasyyliglyserolit kuin myös pienemmät yhdisteet, esim. esteröidyt rasvaliukoiset vitamiinit ja kloesteroli, ja diasyylifosfatidyyli-10 glyserolit, vaativat esterisidosten hydrolysoitumista muodostaen vähemmän hydrofobisia, imeytviä tuotteita. Nämä reaktiot katalysoidaan erityisen entsyymiryhmän, nimeltään lipaasien avulla.

Aikuisella ihmisellä välttämättömiin lipaaseihin katsotaan kuuluvan ruoansulatuksen lipaasi, haiman kolipaasiriippuvainen lipaasi (tri- ja diasyyliglyserolien hydro-15 lyysi), haiman fosfolipaasi A2 (diasyylifosfatidyyliglyserolit) ja karboksyyliesterihyd-rolaasi (kolesteroli- ja rasvaliukoisten vitamiinien esterit). Rintaruokinnassa olevan vastasyntyneen sappisuolojen stimuloimalla lipaasilla on oleellinen osa muutamien edellämainittujen lipidien hydrolyysissä. Yhdessä sappisuolojen kanssa rasva-hajotuksen tuotteet muodostavat sekoittuneita misellejä, joista imeytyminen tapah-20 tuu [3-5].

; : Lipidien imeytymishäiriö, ja täten aliravitsemuksen yleiset seuraukset, alentavat , ;* haiman kolipaasiriipuvaisen lipaasin ja/tai sappisuolojen intraluminaaliset tasot.

: : Tyypilliset esimerkit tällaisesta lipaasin vajaavuudesta on potilailla, jotka kärsivät ; * kystisestä fibroosista, yleisestä geneettisestä häiriöstä, jossa tuloksena on elinikäi- : . 25 nen vajaavuus noin 80 %:lla potilaista, ja kroonisesta haimatulehduksesta, joka johtuu usein kroonisesta alkoholismista.

:* Haiman ja maksan toiminnot eivät ole vielä täysin kehittyneet syntymän aikana, joka on parhaiten huomattavissa ennenaikaisesti syntyneillä lapsilla. Rasvan imey-. tymisvajavuus, fysiologisista syistä johtuen, on yleinen löydös ja ajateltu olevan 30 tulos intraluminaalinen haiman kolipaasista riippuvan lipaasin ja sappisuolojen pitoisuuksista [3, 4, 13-15]. Kuitenkin, BSSL:stä johtuen, tällainen imeytymisvaja-vuus on paljon yleisempi rintaruokintalapsilla kuin lapsilla, jotka ruokitaan ihmisen * pastöroidulla vauvan maitokoostumuksella [3-5, 12, 59, 60, 61 ]. Tämä on yksi syy, miksi on kannatettu, että vastasyntyneitä, etenkin ennen laskettua aikaa syntynei- 114639 3 tä, ei voida ruokkia heidän oman äitinsä maidolla vaan heitä pitäisi ruokkia muista äideistä saadulla pastöroimattomalla maidolla [12].

Tämänhetkisenä hoitona potilaille, jotka sairastavat haiman lipaasivajavuutta, on puhdistamattomien sian haimaentsyymivalmisteiden suun kautta nautittavat hyvin 5 suuret annokset. Kolipaasi-riippuvainen haimanlipaasi inaktivoituu matalassa pH:ssa. Tällaiset olosuhteet vallitsevat mahalaukussa, jonka tuloksena suun kautta nautittavat haiman lipaasit todellisuudessa täysin inaktivoituvat matkatessaan läpi mahalaukun suolistoon. Sen vuoksi tätä vaikutusta ei voida täysin poistaa edes käyttämällä entsyymien suuria annoksia. Suuret annokset nautittuna ovat riit-10 tämättömiä useimmille potilaille, ja valmisteet ovat epäpuhtaita ja mauttomia. Tietyt tabletit ovat koostumukseltaan sellaisia, että kulkiessaan läpi mahalaukun happamat alueet ne luovuttavat entsyymit vasta suhteellisen anaalisessa jejunumin ympäristössä. Kuitenkin monilla potilailla, jotka kärsivät haiman häiriöistä, on epänormaalin hapan jejunum ja nämä tabletit epäonnistuvat luovuttamaan entsyymit 15 ja saattavat sen vuoksi olla tehottomia. Lisäksi, nykyiset valmisteet markkinoilla, jotka eivät ole peräisin ihmisestä, muodostavat riskin immuunireaktioista, jotka voivat aiheuttaa ikäviä seurauksia potilailla, tai tuloksen vähentyneestä hoidon tehosta. Edelleen nykyisin valmisteita poistetaan markkinoilta siksi, että niiden muut kuin kolipaasista riippuvien lipolyyttiaktiivisuuksien sisältö ei ole esitettävissä. Itse 20 asiassa useimmat niistä sisältävät hyvin pieniä CEH/BSSL-aktiivisuuksia. Tämä saattaa olla yksi syy miksi monet potilaat, jotka kärsivät kystisestä fibroosista, täy-; dennyshoidosta huolimatta kärsivät rasvaliukoisten vitamiinien ja välttämättömien rasvahappojen puutteesta.

' · Sen tähden on suuri tarve tuotteista, joilla on ihmisen lipaaseista johdettuja omi- t * : 25 naisuuksia ja rakenteita sekä laaja substraattispesifisyys, jonka tuotteita voidaan v : annostella suun kautta potilaille, jotka kärsivät yhden tai useamman haiman lipo- lyyttisten entsyymien vajaavuudesta. Tämän keksinnön tuotteet täyttävät nämä :· vaatimukset itsessään ja muiden lipaasien yhdistelmänä tai muita lipaaseja sisäl- i ' · t tävien valmisteiden yhdistelmänä. Lisäksi joillakin vauvoilla on ilmeistä tarvetta 30 kehittää rasvojen käyttöä perinteisissä maitokoostumuksissa tai pastöroitua ihmis-maitoa niinkutsutuista maitopankeista.

- « » ';t BSSL:llä on muutamia erikoisia ominaisuuksia, jotka tekevät sen ihanteellisesti SO- Τ'. pivaksi korvaus- ja täydennyshoidossa (substituutio- ja supplementaatiohoidossa): * * ·

1 I I

Sitä on muotoiltu luonnostaan suun kautta nautittavaksi. Siten se vastustaa kulkua 35 läpi mahalaukun ja aktivoituu pienen ruoansulatuskanavan sisällössä. Sen erityi- 114639 4 sen aktivaatiomekanismin pitäisi estää ruoka- tai kudoslipidien vahingollista lipo-lyysiä varastoitumisen ja kulkeutumisen aikana sen tapahtumapaikalle.

Tämän laajan substraattispesifisyyden johdosta sillä on kykyä itsessään ohjata useimpien ruoasta saatavien rasvojen, mukaan lukien rasvaliukoisten vitamiinies-5 tereiden täydellistä hajoitusta.

BSSL saattaa olla parempi kuin haiman kolipaasi-riippuvainen lipaasi hydrolysoimaan esterisidoksia, jotka sisältävät pitkäketjuisia monityydyttämättömiä rasvahappoja.

Ruoansulatusnesteen lipaasien läsnä ollessa ja kolipaasi-riippuvaisen lipaasin 10 BSSL:n poissaollessa tai pieninä pitoisuuksina voi heikentää täydellistä triasyyli-glyserolien hajoittamista in vitro, jopa matalilla sappisuolapitoisuuksilla, kuten vastasyntyneillä lapsilla. Kun BSSL:ä on saatavilla, triasyyliglyserolihajoituksen lopputuotteet muodostavat vapaita rasvahappoja ja vapaata glyserolia ennemmin kuin vapaita rasvahappoja ja toisten kahden lipaasin avulla muodostuneita monoasyy-15 liglyseroleita [5]. Tämä saattaa suosia tuotteen imeytymistä erityisesti silloin, kun intraluminaarin sappisuolatasot ovat matalalla [3,15].

Historian kannalta vauvan maitokoostumuksia ollaan kehitelty ja paranneltu siitä käsityksestä, että niiden koostumus pitäisi olla niin samanlaista kuin mahdollista , *: ihmismaitoon verrattuna. On toivottavaa täyttää nämä mallit.

,· 20 Sappisuolojen stimuloimien lipaasien (BSSL) täydentämisen, korvaamisen tai hoi don, tai olennaisten BSSL-toimintoja omaavien proteiinien hyväksikäytöksi vaadi-: : taan kuitenkin tuotteen määrän lisäämistä laajalla teknisellä tasolla. Mahdollista ei · ole tehtaan tasolla luottaa luonnonlähteisiin, kuten maitoon lähtömateriaalina. Sitä V : paitsi edellä mainitun pastöroinnin aikana tapahtuvan BSSL:n inaktivaatio-ongel- 25 man ohella on lisäriski luonnosta saatavan materiaalin saastuminen infektoivilla :· aineilla, esim. viruksilla, kuten HIV.IIa ja CMV.IIa. Niin ollen BSSL-ominaisuuksia * * * omaaville tuotteille on suurimääräistä tarvetta. Tämä keksintö tarjoaa sellaiset tuotteet ja menetelmät näiden valmistamiseksi.

Tekniikan tason viitteet annetaan myöhemmin tässä selvityksessä.

, Γ 30 Tämä keksintö perustuu ihmisen maitorauhasesta johdettua BSSL:ä koodaavan ·, \ cDNA:n kloonaamiseen. Me olemme myös eristäneet ihmisen haimasta osittaisen cDNA:n, joka koodaa CEH:tä. Johdetut aminohapposekvenssit ihmisperäisistä 114639 5 cDNAiista ja muiden lajien CEH:n vertailu tukevat tulkintaa, että BSSL ja CEH ovat identtisiä.

Kuten tullaan myöhemmin yksityiskohtaistamaan, oli yllättävää löytää, että cDNA-sekvenssistä johdetun proteiinin rakenne on melkoisesti poikkeava muiden lipaa-5 sien rakenteista. Rakenne osoittautui odottamattomasti olevan enemmän tyypillisten esteraasien, kuten kolinesteraasin kaltainen.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on kuvattu oheisissa patenttivaatimuksissa.

Viitaten kuvioon II ja kuvioon VII, keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut tuotteet: 10 a) proteiini määritettynä aminohapposekvenssillä 1-722 kuviossa VII, b) proteiini määritettynä aminohapposekvenssillä 1 -535 kuviossa VII, c) proteiini määritettynä aminohapposekvenssillä 1-278 kuviossa VII, d) proteiini määritettynä aminohapposekvenssillä 1-341 kuviossa VII, e) proteiini määritettynä aminohapposekvenssillä 1-409 kuviossa VII, 15 f) proteiini määritettynä aminohapposekvenssillä 1-474 kuviossa VII, g) proteiinien yhdistelmät määritettynä kohdissa b) - f) esim. määritettynä aminohapposekvenssillä asemissa 1-278, 279-341, 279-474, 342-474 ja 536-722, ; h) proteiinien yhdistelmät määritettynä kohdissa b) - g) yhdistettynä yhden tai ; 20 useamman toistoalueen kanssa kuvion V mukaan, i) proteiini määritettynä kohdissa a) - h) omaten lisä N-terminaalisen aminoha- pon, nimittäin metioniinin, ja toiminnallisesti tasavertaiset a) - i) kohdissa ; määritettyjen proteiinien variantit ja mutantit I · : Pitäisi huomioida, että proteiinit kohdissa a, b, c, d, e, f, h ja i edellä eivät ole 25 identtisiä kaikissa suhteissa luonnollisesti esiintyvän BSSL:n kanssa, mutta ne omaavat yhden tai useamman luonnollisesti esiintyvän BSSL:n kriittiset toiminnot.

. ·. Kriittiset toiminnot luetellaan seuraavassa.

» * : j) DNA-sekvenssi, joka koodaa kohdissa a, b, c, d, e, f, h ja i edellä määritetty- jä proteiineja.

30 k) DNA-sekvenssi kuvion II mukaan, joka määritetään seuraavien nukleotidi numeroiden avulla kuviossa II.

I I t a) DNA-sekvenssi 151-2316 kuvion II mukaisesti koodaten proteiinia, joka on määritetty aminohapposekvenssillä 1-722 kuviossa VII, 114639 6 b) DNA-sekvenssi 151-1755 kuvion II mukaisesti koodaten proteiinia, joka on määritetty aminohapposekvenssillä 1-535 kuviossa VII, c) DNA-sekvenssi 151-985 kuvion II mukaisesti koodaten proteiinia, joka on määritetty aminohapposekvenssillä 1-278 kuviossa VII, 5 d) DNA-sekvenssi 151-1172 kuvion II mukaisesti koodaten proteiinia, joka on määritetty aminohapposekvenssillä 1-341 kuviossa VII, e) DNA-sekvenssi 151-1376 kuvion II mukaisesti koodaten proteiinia, joka on määritetty aminohapposekvenssillä 1-409 kuviossa VII, f) DNA-sekvenssi 151-1574 kuvion II mukaisesti koodaten proteiinia, joka on 10 määritetty aminohapposekvenssillä 1 -474 kuviossa VII, g) DNA-sekvenssi 986-1172 kuvion II mukaisesti koodaten proteiinia, joka on määritetty aminohapposekvenssillä 279-341 kuviossa VII, h) DNA-sekvenssi 986-1376 kuvion II mukaisesti koodaten proteiinia, joka on määritetty aminohapposekvenssillä 279-409 kuviossa VII, 15 i) DNA-sekvenssi 986-1574 kuvion II mukaisesti koodaten proteiinia, joka on määritetty aminohapposekvenssillä 279-474 kuviossa VII, j) DNA-sekvenssi 1173-1376 kuvion II mukaisesti, koodaten proteiinia, joka on määritetty aminohapposekvenssillä 342-409 kuviossa VII, k) DNA-sekvenssi 1173-1574 kuvion II mukaisesti, koodaten proteiinia, joka on 20 määritetty aminohapposekvenssillä 342-474 kuviossa VII.

Huomattavat keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun proteiinin toiminnot * ovat: ‘ t 9 j a) sopivuus suun kautta annettavaksi, : b) aktivoituminen spesifisten sappisuolojen avulla, ·: 25 c) toimiminen epäspesifisenä lipaasina pienen ruoansulatuksen sisällössä niin, » , ·* että se pystyy hydrolysoimaan rasvoja suhteellisen riippumattomasti niiden kemiaallisesta rakenteesta ja fysikaalisesta tilasta (emulsoituneena, misellei- ·· nä, liukoisena) huolimatta.

>» d) Kyky hydrolysoida triasyyliglyseroleita eri pituisten ja eri asteisten tyydyttä- 30 mättömien rasvahappojen kanssa.

e) Kyky hydrolysoida myös diasyyliglyserolia, monoasyyliglyserolia, '··’ kolesteroliestereitä, lysofosfatidyyliasyyliglyserolia ja retinyyli ja muita ·· rasvaliukoisia vitamiiniestereitä.

f) Kyky hydrolysoida ei vain sn-1(3) esterisidoksia triasyyliglyserolissa, vaan 35 myös sn-2 esterisidoksia.

114639 7 g) Kyky reagoida ei vain primääristen, vaan myös sekudääristen sappisuolojen kanssa.

h) Riippuvuus sappisuoloista optimaalisen aktiivisuuden saavuttamiseksi.

i) Stabiilisuus niin, että vatsan sisällöt eivät vaikuta katalyyttiseen tehokkuuteen 5 millään huomattavalla tasolla.

j) Stabiilisuus inaktivaatiota vastaan haiman proteaasien avulla, esim. trypsii-nin, jolloin aikaansaadut sappisuolat ovat läsnä.

k) Kyky sitoutua hepariiniin ja hepariinijohdannaisiin, esim. hepariinisulfaattiin.

l) Kyky sitoutua rasva-vesi-välitiloihin.

10 m) Stabiilisuus sallia lyofilisaatio.

n) Stabiilisuus, kun sekoitettuna ruoka-aineisiin, kuten ihmisen maitoon tai vauvan maitokoostumukseen.

Kriittiset toiminnot täydennys-, korvaus- tai muuta hoitoa varten ovat näiden mukaan kohdilla a), b), c), d), e), f), i), j) ja I). Toisia tarkoituksia varten ei kaikki kriitti-15 set toiminnot ole välttämättömiä.

Edellä esitettyjen proteiinien ekspressoimiseksi sopivat DNA-sekvenssit edellä liitetään sopiviin vektoreihin, jotka sitten liitetään sopiviin isäntäsoluihin. Mainitun vektorin täytyy myös sisältää tarkoituksen mukaisen signaalin ja muita sekvenssejä, jotka tekevät organismin mahdolliseksi tuottamaan haluttua proteiinia.

20 Sopivia ekspressio-organismeja

Yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla on mahdollista kloonata ja ilmentää kiinnostuk->. sen kohteena olevaa proteiinia monenlaisissa prokaryootti- ja eukaryootti-isäntä- ! soluissa. Mahdolliset ekspressio-organismit ovat bakteerit, yksinkertaiset eukary- ootit (hiiva), eläinsoluviljelmät, hyönteissoluviljelmät, kasvisoluviljelmät, kasvit ja 25 transgeeniset eläimet. Jokaisella yksittäisellä systeemillä on omat erityiset hyödyt ja haitat. Yksinkertainen johtopäätös on, että jokainen ekspressoitava geeni on ainutlaatuinen ongelma ja stadardiliuosta siihen ei ole saatavilla.

* » » * *

Yleisesti käytetty kasvi on tupakkakasvi. Mahdolliset transgeeniset eläimet ovat vuohi ja lehmä.

30 Mahdolliset esimerkkeinä olevat bakteerivektorit ovat pUC ja proteiini A-vektorit.

:. * · | Mahdollinen esimerkkinä oleva hiivavektori on pMA 91.

Mahdolliset hyöteisvektorit ovat johdettuja Baculo-viruksesta.

114639 8

Mahdolliset eläinsoluvektorit ovat johdettuja SV40:stä.

Mahdolliset kasvivektorit ovat johdettuja Ti-plasmidista.

Jokaisessa systeemissä, sekä luonnollisia että synteettisiä promoottoreita ja ter-minaattoreita voidaan käyttää.

5 On ymmärretty, että ekspressiosysteemin valinnasta riippuen, ilmentynyt proteiini saattaa sisältää lisäksi N-päätteisen aminohapon (metioniini), muutamia ylimääräisiä aminohappoja tai olla fuusioituneena heterologisen proteiinin kanssa (esim. proteiini A) tai erota luonnollisesti esiintyvistä proteiineista glykosulaation suhteen. Sitäpaitsi vektorit saattavat sisältää signaalisekvenssejä tuottaakseen proteiinia 10 periplasmaan tai kasvuliuokseen.

Siten seuraavat keksinnön muodot ovat: a) vektori, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka koodaa proteiinia,kuten eritelty edellä, b) isäntäsolu, joka käsittää DNA-sekvenssin, kuten eritelty edellä, 15 c) menetelmä tuottaa edellä eriteltyä proteiinia, kasvattamalla edellä eritellyn kohdan a) vektorin sisältämää isäntäsolua ja eristämällä proteiini.

Menetelmät puhdistuksesta perustuvat käytettyyn ekspressiosysteemiin (esim.

.·* proteiiniin A/lgG) ja/tai käytettyihin menetelmiin luonnossa esiintyvän entsyymin i I puhdistuksessa, kuten esitetty viitteessä 6.

* · ·. 20 Hakemuksessa esitetyt lisäaspektit ovat: ' * · . ’ ·: - farmaseuttinen yhdiste, joka käsittää edellä eritellyn proteiinin, v : - edellä eritellyn proteiinin käyttö lääkkeen valmistamiseksi eksokriinisen hai man vajaatoimintaan liittyvän patologisen tilan hoitoa varten, ·· - edellä eritellyn proteiinin käyttö lääkkeen valmistamiseksi kystisen fibroosin ·. 25 hoitoa varten, edellä eritellyn proteiinin käyttö lasten ruokamallin täydentäjänä, - edellä eritellyn proteiinin käyttö lääkkeen valmistamiseksi kroonisen ‘ * haimatulehduksen hoitoa varten, · - edellä eritellyn proteiinin käyttö lääkkeen valmistamiseksi rasvan . ’. : 30 imeytymishäiriön, mistä syyopista tahansa, hoitoa varten, edellä eritellyn proteiinin käyttö lääkkeen valmistamiseksi rasvaliukoisten vitamiinien imeytymishäiriön hoitoa varten, 114639 9 edellä eritellyn proteiinin käyttö lääkkeen valmistamiseksi rasvan imeytymishäiriön, joka johtuu fysiologisista syistä, kuten vastasyntyneillä lapsilla, hoitoa varten.

DNA-sekvenssi kuviossa II aminohaposta 151 ylöspäin sisältäen aseman 2316 on 5 sekvenssi, joka koodaa sisäistä proteiinia. Sekvenssi alkaen asemasta 2317 ylöspäin sisältäen aseman 2415 ei transloidu proteiiniksi, mutta sisältyy eksoniin d, joka on esitetty taulukossa 2 myöhemmin.

Yhdessä keksinnön suoritusmuodossa proteiini määriteltynä kohdissa a) - i) edellä saadaan aikaan eristetyssä muodossa ja/tai on suurin piirtein puhtaassa muodos-10 sa.

Lyhennykset aa, aminohappo; bp, emäspari; BSSL, sappisuolan stimuloima lipaasi; c-AMP, syklinen adenosiinimonofosfaatti; CEH, karboksyyliesterihydrolaasi; DA, dalton; c-7GTP, 7-deaza-2-deoksiguanosiini 5'-trifofaatti; EDTA, etyleenidiamiinitetra-ase-15 taatti; kb, kilobases; MOPS, 3-N-morfolinopropaanisulfonihappo; nt, nukleotidi; PAGE, polyakryyliamidigeelielektroforeesi; SDS, natriumdodekyylisulfaatti; SSC, NaCI-sitraatti; X-Gal, 5-bromo-4-kloro-3-indoyyli-p-D-galaktopyranosidi.

Entsyymit > · i : : Sappisuolojen stimuloima lipaasi EC 3.1.1.3 ; ·. 20 Karboksyyliesterihydrolaasi EC 3.1.1.1

Materiaalit ja menetelmät A. Entsyymin ja vasta-aineen valmistus . BSSL puhdistettiin ihmisen maidosta, kuten edellä kuvattiin [6]. Vasta-aineen tuo- ; tantoa varten käytetty entsyymi puhdistettin edelleen SDS-PAGE:n avulla. Lipaa- ’ 25 siä vastaava proteiinin palanen, sen jälkeen, kun se oli värjätty Coomassie- : Brilliant-sinisellä, eluoitiin sähköisesti geelistä.

Kaksikymmentäviisi pg puhdistettua entsyymiä, yhdessä samanmääräisen Freun-., din täydellisen adjuvantin kanssa käytettiin ensimmäisessä i.c.-injektiossa ja sama määrä entsyymiä epätäydellisen adjuvantin kanssa seuraavissa kuukausittaisissa 30 booster-injektioissa. Kaneilta otettiin verta noin kaksi viikkoa jokaisen vahvistusan-noksen jälkeen ja seerumit valmistettiin ja säilöttiin -20 °C:ssa.

114639 10 B. Trypsiinifragmenttien valmistus ja aminohapposekvenssin analyysi

Kolme mg puhdistettua BSSL:ä liuotettiin 1 ml:aan 0,1 M Tris-HCI-puskuria, pH 8,5, joka sisälsi 6 M guanidiniumhydrokloridia ja 2 mM EDTArta. Ditioerytritolia lisättiin 5 mM:ksi asti. Kahden tunnin inkubaation jälkeen 37 °C:ssa lisättiin 300 pl 5 50 mM jodoasetaattia. 90 minuutin inkubaation jälkeen 25 °C:ssa pimeässä pel kistyneestä ja karboksimetyloituneesta entsyymistä poistettiin suolat Sephadex G-25-pylväässä, tasapainotettiin 0,5 M ammoniumbikarbonaatilla. Kolmekymmentä pg tosyyli-L-fenyylialaniinikloorimetaanilla käsiteltyä naudan trypsiiniä (Worthington diagnostics system Inc., Freehold, NJ, USA) lisättiin ennen lyofilisaatiota. Lyo-10 filisoitu proteiini liuotettiin 4 ml:aan 0,1 M ammoniumbikarbonaattia ja lisäksi 90 pg trypsiiniä lisättiin. Viiden tunnin inkubaation jälkeen 37 °C:ssa proteiini lyofilisoitiin jälleen. Trypsiinin digestio liuotettiin 0,1 % trifluoroetikkahappoon (2mg/ml). Kolmesataa pg trypsinoitua BSSL kromatografoitiin HPLC:llä käyttäen C-18 käänteis-faasikolonnia ja eluoitiin 0-50 %:n gradientilla 0,1 % asetonitriilintrifluoroetikkaha-15 possa. Peptidin keräämistä monitoroitiin jatkuvalla absorbanssimittauksella 215 nm:ssa. Sekvensoitavaksi tarkoitetut peptidit puhdistettiin edelleen rekroma-tografialla käyttäen kolonnia säädetyllä gradienteilla.

Peptidinäytteiden sekvensoitavaksi tarkoitetut fragmentit kuivattiin typen avulla asetonitriilin poistamiseksi ja asetettiin ne sekvensointilaitteeseen. N-terminaalisen 20 sekvenssianalyysin saamiseksi, luonnollinen BSSL liuotettiin 0,1 % etikkahap-! ! poon. Sekvenssianalyysit suoritettiin Applied Biosystems Inc. 477A pulssineste- V faasisekvessilaitteella ja on-line PTH 120A analysaattorilla säännöllisillä syklioh- ; jelmilla ja valmistajan kemikaaleilla. Alku- ja toistosaannot, jotka laskettiin sekven- ; : soiduista standardiproteiineista, β-laktoglobuliinista, olivat 47 ja 97 %.

25 C. RNA:n eristäminen

Ihmisen haiman rasvakudos- ja maitoa tuottavan rauhaskudosnäytteet saatiin ki- ·.’:* rurgian avulla ja laitettiin välittömästi guanidiinitiosyanaattiin (1-5 g 50 ml:ssa). Ko- • · » konais-RNA erotettiin Chirgwinin kuvaamalla tavalla [20]. Poly(A)-RNA valmistet-. tiin kromatografian avulla oligodeoksitymidylaatti-(oligo(DT))-selluloosapylväässä 30 [21].

> · D. cDNA-kirjastojen rakentaminen ja seulonta “ Suunnilleen 15 pg polyadenyloitua ihmisen haiman RNA:ta denaturoitiin metyyli- merkurihydroksidilla [22] ja siihen liitettiin oligo(dT)12-1 δ-alukkeilla (Pharmacia, Uppsala, Sweden), ja käänteisesti transkriptoitiin käyttäen standardimenetilmiä 11 [23]. Toisen nauhan synteesi suoritettiin Gublerin ja Hoffmanniin mukaisesti [24], paitsi että DNA-ligaasi ja β-NAD jätettiin pois, ja reaktiolämpötilat asetettiin 15°C:seen. Lisäksi RNA digestoitiin RNaasi A:lla (50 pg/ml), ja kaksinauhaista cDNA:ta käsiteltiin EcoRI-metylaasilla [25]. Päät tasattiin Klenovv-entsyymillä. Li-5 gaation jälkeen EcoRkiin liittäjät ja EcoRLIlä katkaistu cDNA fraktioitiin Sepharose 4B-C1 -pylväässä. Erottunut tilavuusfraktio saostettiin etanolilla ja cDNA liitettiin fosfataasikäsiteltyyn gt11 -vektorin EcoRI-kohtaan [26]. In vitro -liittäminen antoi saannoksi enemmän kuin 7x105 rekombinanttia.

Hankittiin ihmisen maitorauhasen cDNA-kirjasto, joka johdettiin kahdeksan kuu-10 kautta raskaana olevien naisten kudoksista, (Clontech Laboratories, Inc., Palo Aito, CA, USA).

cDNA-kirjastosta saadut faagit kaadettiin 120 mm:n maljoille, kussakin 5x104 pla-kinmuodostusyksikköä, kasvamaan. Antiseerumi laimennettiin suhteessa 1:3200 ja seulonta suoritettiin Youngin ja Davisin mukaan [27], Anaalisella fosfataasilla 15 konjukoidut vuohen antikani-vasta-aineet käytettiin toisina vasta-aineina (Bio-Rad, Richmond, CA USA). mRNA:n 5'-päita vastaavien pesäkkeiden eristämiseksi suoritettiin nukleiinihappohybridisaatio standardiolosuhteissa [23] käyttäen koettimena alakloonattuja palasia yhdestä immunopositiivisesta kloonista.

E. RNA-analyysi ! I · * ·

• :*: 20 Elektroforeesi suoritettiin 1 %:lla agaroosigeelillä 40 mM MOSP-puskurissa pH

7,0:ssa glyoksaali- ja dimetyylisulfoksididenaturoinnin jälkeen [28]. Glyoksyloitu ,·. kokonais-RNA siirrettiin nitroselluloosapaperille [29]. Näytteet tutkittiin BSSL- ja j CEH-rekombinanttien alaklooneilla, jotka leimattiin oligoleimaustekniikalla [30].

* 4 · > * V : Esihybridisaatio ja hybridisaatio suoritettiin 50% formamidissa 46 °C:ssa [23].

25 Hybridisaation jälkeiset pesut suoritettiin ankarissa olosuhteissa (0,1 % SDS ja :· 0,1xSSC 60 °C; 1xSSC, 0,15M NaCI, 0,0015M Na3-sitraatti, pH 7,6).

F. Nukleotidisekvenssi cDNA-insertit BSSL- ja CEH-rekombinanteista kloonattiin joko suoraan > » ’’’ M3mp18:aan ja mp19:aan sen jälkeen, kun ne oli sonikoitu ja fratioitu koon mu- , 30 kaan tai jotkut niistä alakloonattiin edelleen pTZ19R:ään sen jälkeen, kun ne oli :. i digestoitu entsyymeillä Pstl, BstXI, Narl, Smal ja Ahall. Nukleotidisekvenssi määri tettiin dideoksiketjuterminaatiomenetelmällä [31]. GC:tä runsaasti sisältävät toistoalueet (ks. alla) sekvensoitiin myös Taql-polymeraasin ja dc-7GTP:n avulla. Mo- 114639 12 lemmat juosteet sekvensoitiin. Sekvenssien tiedot noudettiin autoradiogrammeista käyttämällä MS-EdSeq-ohjelmaa, kuten kuvattuna Sjöberg et ai [55].

G. Aminohapposekvenssien ennusteet ja homologiat Määritettäessä vastaavia cDNA-inserttien aminohapposekvenssejä, verrattiin ko-5 donien käyttöä erilaisissa lukukehyksissä Stadenin mukaan ja se antoi yhden avoimen lukukehyksen [32]. Homologioita etsittiin UWGCG-ohjelmiston avulla [33].

A. Trypsiinifragmenttien ja BSSL:n N-pään sekvenssit BSSL:N trypsiinidigestio tuotti noin 50 fragmenttia, kuten ratkaistiin saatujen piik-10 kien lukumääräksi HPLC-kromatografian aikana (kuvio I). Piikkifraktiot kerättiin talteen ja ne piikit, jotka voitiin eristää korkeasti puhdistettuina ja riittävinä pitoisuuksina, sekvensoitiin. Muodostuneet sekvenssit on esitetty taulukossa I. Lisäksi 30 useimmat N-pään nauhat sekvensoitiin (kuvio II), ja ne varmistettiin viimeisten Abouakil et al.:n raportoitujen sekvenssien kanssa (30 päätä) [17].

15 22 aminohappoa pitkässä N-pään sekvenssissä on glysiini meidän raportissa ja lysiini Wang & Johnsonin raportissa [34].

B. BSSL:N nukleotidisekvenssi · : :·. Agt11:n cDNA-kirjaston rakentamiseen käytettiin polyadenyloitua ihmisen haiman RNA:ta. Alkujaan neljä immunopositiivista kloonia eristettiin, ja sitten tämä haimaa : ·. 20 ilmentävä cDNA-kirjasto seulottiin BSSL-antiseerumia vastaan. Neljän kloonin ’: nukleotidisekvenssianalyysit osoittivat, että niillä on täydellinen sopivuus ja vastaa- / vuus mRNA 3-pään kanssa. Ne kaikki alkavat poly(A)-hännällä ja eroavat vain pi- “ ’ tuudeltaan; pisin insertti, nimetty ACEN, yltää 996 bp:iin.

i· cDNA-kirjasto ihmisen maitorauhasesta seulottiin antiseerumilla, jolloin koettimena ; 25 oli haiman klooni ACEN. Positiiviset kloonit eristettiin molemmista seulonnoista, jotka kaikki olivat peräisin 3'-päästä. Pisin rintarauhasen klooni, nimetty ABSSL, ;* saavuttaa 2100 bp ylävirtaan. Se sisältää neljä sekvensoitua trypsiinifragmenttia • (kuvio II), mutta ei sisällä N-päätteistä aminohapposekvenssiä. Translaation alka- ;· misen alapuolella olevan sekvenssin laajentamiseksi, rintarauhasen cDNA-kirjasto . : 30 seulottiin 118 aminohappoa pitkän koettimen avulla, joka on johdettu useimmista ABSSL:n 5'-proksimaalisista osista. Yksi klooni eristettiin, joka jatkui 328 nukleotidia ylöspäin. Se sopi hyvin yhteen N-pään aminohapposekvenssin kanssa ja sisäl- 114639 13 si siihen jääneet trypsiinifragmentit. Kuten kuviossa II näytetään, cDNA on 2428 nukleotidia pitkä ja sisältää 81 emästä ylävirtaan ensimmäisestä ATG-kodonista. Polyadenylaatiosignaali, AATAAA sijaitsee 13 nukleotidia ylävirtaan polyA-hän-nästä ja terminaatiokodoni TAG löydettiin nukleotidissä 2317, jota seuraa 112 5 bp:n 3'-transloitumaton alue.

GC-rikas alue koostuu kuudesta identtisestä toistoalueesta, joita ympäröi kymmenen toistokohtaa, joilla on eri määrät substituutioita, jotka ovat mahdollisesti syntyneet muutamista kahdennuksista. Substituutioiden vähäinen määrä viittaa, että nämä toistoalueet ovat ilmestyneet myöhään evoluution aikana.

10 C. Kudoksen ilmentymisen jakaantuminen

Ihmisen maitoa tuottavan rintarauhasen, haiman, rasvakudoksen ja ihmisen syöpäsolullaan (HepG2) RNA:t analysoitiin Northern-blottauksella. Lähetimen kooksi määritettiin suunnilleen 2,5 kb molemmille maitoatuottavalle rauhaselle sekä haimalle. Mitään signaalia ei pystytty havaitsemaan linjoilla RNA:n kanssa, joka eris-15 tettiin HepG2:sta ja rasvakudoksesta (kuvio IV).

Kun mRNA:ta, jota käytettiin rintarauhasen kirjaston tekemiseen, saatiin kahdeksannella kuukaudella raskaana olevista naisista, niin on ilmeistä, että BSSL:n geenin transkriptio ja mahdollisesti translaatio käynnistyy ennen synnytystä, mikä on yhtäpitävää edellisten löytöjen BSSL:n erittymisessä ennen synnytystä [35].

: 20 Katso kuvio IV.

* * * · ft· D. BSSL:n aminohapposekvenssi « * · * i · ti· t ; ,· SDS-PAGE:n avulla molekyylimassan on raportoitu olevan 107-125 kDA [8, 36] ja : analyyttisen ultrasentrifugaation avulla olevan 105 kDA [37]. Entsyymi, kuten mää ritetty cDNA:sta, koostuu 722 aminohaposta (kuvio II), joka antaa molekyylimas-25 saksi 76 271 Da, osoittaa, että entsyymi sisältää ainakin 15-20 % hiilihydraattia. Johtosekvenssi on 23 aminohappoa pitkä. Kokeiltava aktiivisen kohdan seriini pai-kallistetaan seriiniksi 217 (kuvio V). Sekvenssi tämän seriinin ympärillä on yhtäpi-tävä konsensus-aktiivisen kohdan serrinihydrolaasisekvenssin kanssa [38]. Viime aikoina on ehdotettu, että emäksiset päät, joita on löydetty olevan lähellä aktiivista 30 kohtaa, kuten seriini saattaa olla mukana lipaasien suorittamien asyyliglyserolien esterisidosten katkaisussa [39]. On mielenkiintoista huomata, että näitä amino-' : happoja ei ole BSSL:ssä. Yksittäinen kokeiltava N-glykosylaatiokohta sijaitsee vain seitsemän aminohappoa seriinistä. Glykosylaation aste [6, 16] viittaa, että entsyymillä on O-sidoksinen hiilihydraatti. Löytyy useita kohtia, joissa glykosylaatio 114639 14 on voinut tapahtua. Aminohappo koostumus, joka perustuu puhdistettuun entsyymiin osoittaa proliineja olevan runsaasti [6]. cDNA:sta saatu aminohapposekvenssi varmistaa tämän. Lisäksi useimmat proliineista sijaisevät 11 aminohapon sisältävillä 16 toistoalueilla, muodostaen pääosan entsyymin C-terminaalisesta 5 puolesta.

E. Entsyymien vertailu rintarauhasessa (BSSL) ja haimassa (CEH)

Ihmisen maidon BSSL:n sekä ihmisen haiman CEH:n on äskettäin osoitettu olevan samanlaisia, jos ei identtisiä. Nykyinen tietämys vahvasti olettaa, että nämä kaksi entsyymiä ovat saman geenin tuotteita. cDNA-kloonien nukleotidisekvenssi 10 näyttää, kuinka haiman klooni ACEH on identtinen maitorauhaskloonin ABSSL:n kanssa polyA-hännästä ja 996 emästä 5'-päähän, sisältäen sekvenssin, joka koo-daa proliinia paljon sisältäviä toistoalueita. Northern-plot antoi yksittäisen nauhan 2,5 kb:n kohdalla haiman ja rintamaitorauhasen RNA:lla (kuvio IV). Genomin southern-plotit edelleen kannattavat ideaa, että vain yksi geeni koodaa BSSL:ää ja 15 CEH:ta. Erot BSSL:n ja CEH:n välillä liikkuvuudessa SDS-PAGE-geelissä voidaan selittää erilaisen glykosylaation tai pilkkoutumisen seurauksena.

BSSL:n samanlaisuus rotan ja naudan etsyymeillä (katso alla) ja genomisten kuvaajien tuloksilla kannattavat mahdollisuutta, että erilaista pilkkoutumista ei voida laskea liikkuvuuden eroille. Kun C-pään sekvenssiä ei ole vielä varmistettu prote- i 20 iinitasolla, niin on vähemmän todennäköistä, että CEH:tä voidaan ohjata C-pään * · : proteolyyttisellä pilkkoutumisella.

: ,·. Kuten me tiedämme, haiman entsyymeitä, jotka ilmeisesti vastaavat CEH:ta, on usein nimetty lajien ja erityisesti substraattien mukaan, käytetään määrittämään niiden vastaavia aktiivisuuksia; lysofosfolipaasi, kolesteroliesteraasi, steroliesteri- * ’ 25 hydrolaasi, epäspesifinen lipaasi, karboksyyliesterilipaasi ja kolesteroliesterihydro- laasi. Saatavissa olevat tiedot sopivat yhteen näkemyksen kanssa, että kaikki nä-·.!:* mä kuvatut aktiivisuudet ovat lähtöisin yhdestä ja samasta toiminnallisesta koko- ..naisuudesta [42, 43]. Tämä kuvastaa laajaa substraatin spesifisyyttä ja niiden asi-, aankuuluvaa osoittamista epäspesifisinä lipaaseina. Kun ihmisen BSSL/CEH-sek- ,··. 30 venssejä vertaillaan rotan haiman lysofosfolipaasientsyymiin [40] ja naudan hai-

> I

'1' man kolesteroliesteraasiin [41], niin huomattavia samankaltaisuuksia on löydetty, jotka yltävät noin 530 aminohapon N-päähän (kuvio V); mutta ne eroavat siinä * · \‘·· osassa molekyyliä, jossa toistot ilmenevät. Rotan entsyymillä on vain neljä toistoa ja naudan kolme. Täten ihmisen entsyymi on huomattavasti pidempi peptidi.

114639 15

Lisäksi huomattavia samankaltaisuuksia löydettiin BSSL:n ja useiden tyypillisten esteraasien välillä, esim. useiden lajien asetyylikoliiniesteraaseilla, mukaanlukien ihmisen ja Drosophilan, ja karboksiesteraaseilla (kuvio VI). Nämä samankaltaisuudet rajoitettiin BSSL:n 300 nukleotidin N-päähän, joka sisältää kokeiltavan seriinin 5 aktiivisen kohdan. Yhtäläisyys asetyylikoliiniesteraasin kanssa on ennustettu siitä tosiasiasta, että BSSL inhiboidaan tyypillisen koliiniesteraasi-inhibiittorien avulla [6, 8, 16]. Rotan maksan karboksyyliesteraasin mahdollisella poikkeuksella [45], ei yhdelläkään samanlaisella entsyymillä ole osoitettu olevan samaa sappisuolojen riippuvuutta kuin BSSL:llä; se viittaa, että rakenteellinen perusta tälle ominaisuu-10 delle esiintyy proteiinin C-terminaalisessa osassa. Lisäksi BSSL voi tehokkaasti hyökätä emulsoituneita substraatteja vastaan, jota ei ole tunnettu olevan luonteenomaista samanlaisille esteraaseille. Tälle aktiivisuudelle sappisuolat ovat välttämätön ehto.

Ihmisen BSSL:n ennustettua sekvenssiä verrattiin toisiin hyvin karakterisoituihin 15 nisäkkäiden lipaaseihin. Erotettuna konsensussekvenssistä aktiivisen kohdan seriinin ympärillä (G-X-S-X-G), mitään ilmeistä samanlaisuutta ei havaittu [44],

Toisten entsyymien samankaltaisuuksien lisäksi, on myös huomattavaa yhtenevyyttä yhden Dictyostelium discoideumin cDNA:sta riippuvaisella proteiinilla [46] yhtä hyvin kuin muutamista lajeista peräisin olevalla tyroglobuliinilla, joka sisältää 20 aktiivikohdan alueen, mutta ei itse aktiivista kohtaa, osoittaa, että nämä hyvin kon- ‘ l' servoituneet aminohappojuosteet ovat yleisesti tärkeämpiä kuin esteraasien ent- » * · ' ’ *.' syymiaktiivisuutta kannattavia.

* * *

Lopuksi ihmisen maidon BSSL koostuu 722 aminohaposta. Saatavilla oleva tieto osoittaa vahvasti, että sen peptidiketju on identtinen haiman CEH:n kanssa, ja nii-:25 tä koodaa sama geeni. Vahvimpana todisteena niiden 3'-päiden nukleotidisek-venssit sekä niiden N-päiden aminohappojärjestykset ovat identtisiä. Huomattavat homologiat, jotka ovat löydetty rotan haiman lysofosfolipaasin ja naudan haiman T!# kolesteroliesteraasin välillä, kannattavat olettamusta, että nämä entsyymit myös ’: ' olisivat toiminnallisesti identtisiä. Kuitenkin, kuten ehdotetaan, eri löydettyjen lajien 30 erot eivät johdu molekyylikoosta, vaan pikemmin glykosylaatiosta; sen sijaan, että ne heijastaisivat erilaisia määriä yhdentoista aminohapontoistoja. Aktiivisen koh-dan sekvenssin samankaltaisuus näillä esteraaseilla ehdottaa, että nämä proteiinit Τ'. ovat peräisin yhteisestä esihistoriallisesta geenistä.

Viitteenä kuvioista l-VII annetaan seuraavat selitykset.

114639 16

Kuvio I: BSSL:n ja CEH:n trypsiinidigestioiden erottaminen

Puhdistettu BSSL käsiteltiin trypsiinillä ja kromatotofoitiin HPLC:llä kuten kuvattiin materiaalit ja menetelmät-osassa. Saadut piikit kerättiin ja puhdistettiin edelleen rekromatografian avulla ja niiden aminohappojärjestys määritettiin.

5 Kuvio II: cDNA:n nukleotidisekvenssi ja ihmisen sappisuolan stimuloiman lipaasin johdettu aminohapposekvenssi cDNA on 2428 emästä pitkä. N-pään 23 kodonin sekvenssi (nt82-150) alkaen ATG:llä, tulkittiin johtopeptidinä, kun N-pään valmiin proteiinin aminohapposekvenssi alkaa kodonista 24 (nti51, Ala). Johtopeptidi (=leader) on alleviivattu. 10 Merkki * osoittaa eksonin alkukohtaa. Merkki # osoittaa toistoalueen ^repetition) alkukohtaa.

Kuvio III: C-pään GC-rikkaiden toistojen nukleotidisekvenssi sappisuolan stimuloimalla lipaasilla

Substituutiot on esitetty merkillä *.

15 Kuvio IV: Northern blot-hybridisaatio

Northern blot-analyysit ihmisen maitoa tuottavan rintarauhasen, haiman, rasvaku-[: doksen ja ihmisen maksasyöpäsolulinjan (HepG2) eristetyistä kokonais-RNA:ista.

Kokonais-DNA (10 pg) maitorauhasesta (rivi A), haimasta (rivi B), rasvakudokses-ta (rivi C) ja HepG2 (rivi D) erotettiin sähköllä 1 %:lla agaroosigeelillä 40 mM

t ·. 20 MOPS-puskurissa pH:ssa 7,0 RNA:n denaturaation jälkeen 1M glyoksaalissa, jos- ,* sa oli 50 % dimetyylisulfoksidi ja 40 mM MOPS. Glyoksyloitu RNA siirrettiin sen jälkeen nitroselluloosapaperille hybridisaatiota varten, jossa oli [32P]-leimattua BSSL-cDNA:ta (ABSSL).

;· Kuvio V: Ihmisen maidon BSSL:n, rotan haiman lysofosfolipaasin (Ratlpl) [40] ja 25 naudan haiman kolesteroliesteraasin (Bovceh) [41] johdettujen aminohapposekvenssien vertailu BSSL: sappisuolan stimuloima lipaasi ihmisestä, Cheshum: kolinesteraasi sikiön :t ihmiskudoksesta, [50], Torpce: asetyylikolinesteraasi Torpedo marmoratasta [51],

Drosceh: karboksyyliesterihydrolaasi Drosophila melanogasterista [52], Ratlivce: ‘ ; 30 karboksyyliesteraasi rotan maksasta [53], Drosace: asetyylikolinesteraasi Dro sophila melanogasterista [54], Thyrhum: tyroglobuliini ihmisestä [49] ja Dict.Di: c-AMP-riipuvainen entsyymi Dictyostelium discoideumistä [46]. Entsyymien välillä 114639 17 löytyy 7 erilaista domeiinia, jotka ovat samankaltaisia. Laatikot sisältävät aminohappoja, jotka ovat identtisiä ja pienet kirjaimet konsensussekvenssissä esittävät identtisiä aminohappoja kaikilla, paitsi yhdellä. Pisteet esittävät virhepariutumia (mismatches). Seriini, joka kuuluu aktiiviseen kohtaan esitetään *:llä. Kuvaaja oi-5 kealla nurkassa esittää, kuinka domeiinit ovat suuntautuneet.

Kuvio VII: esittää aminohapposekvenssin 1 -722 koko proteiinille (yhden kirjaimen koodi) ja tarkoittaa eksoneita a, b, c ja d. Merkki # esittää toistoalueen alkamiskohdan.

Taulukko 1. BSSL-peptidien aminohapposekvenssit.

10 Keskeytyvistä piikeistä johtuen yhtään positiivista syklien 1 ja 2 aminohappojen sekvenssiä ei voitu tehdä peptidille numero 26. Peptidinumerot viittaavat piikkeihin kuviossa I.

Trypsiinin fragmentit TP16:LysValThrGluGluAspPheTyrLys 15 TP19:GlylleProPheAlaAlaProThrLys TP20:LeuValSerGluPheThrlleThrLys TP24:ThrTyrAlaTyrLeuPheSerHisProSerArg TP26:PheAspValTyrThrGluSerTrpAlaGlnAsp : ProSerGInGluAsnLys > · 20 Taulukko 2: Eksonien a, b, c ja d tunnistus, numeroitu kuten kuvioissa II ja VII. eksoni Sijainti : nukleotidien välissä aminohappojen välissä ;· a 986-1172 279-341 25 b 1173-1376 342-409 c 1377-1574 410-474 d 1575-2415 475-722 ’ koko proteiini 151-2316 1-722 ;* koko proteiini 151-1755 1-535 : *, j 30 ilman toistoalueita 114639 18

Viitejulkaisut 1. Bläckberg, L, Ängqvist, K.A., & Hernell, O. (1987) FEBS Lett. 217, 37-41.

2. Hernell, O. (1975) Eur. J. Clin. Invest. 5, 267-272.

3. Hernell, 0., Bläckberg, L. & Bernbäck, S. (1988) In Perinatal Nutrition (Lind- 5 blad, B.S., ed.) Bristol Myers Nutrition Symposia Vol. 6, pp. 259-272, Aca demic Press, New York.

4. Hernell, 0., Bläckberg, L., Fredrikzon, B. and Olivercrona (1981) Bile salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in neonatal period. In textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, editor. Raven 10 Press, New York. 465-471.

5. Bernbäck, S., Bläckberg, L. & Hernell, 0. (1990) J. Clin. Invest. 221-226.

6. Bläckberg, L. & Hernell, 0. (1981) Eur. J. Biochem. 116, 221-225.

7. Hernell, 0. & Bläckberg, L. (1982) Pediatr. Res. 16, 882-885.

8. Bläckberg, L., Lombardo, D., Hernell, 0., Guy, O. & Olivecrona, T. (1981) 15 FEBS Lett. 136, 284-288.

: 9. Fredrikzon, B., Hernell, 0., Bläckberg, L. & Olivecrona, T. (1978) Pediatr.

; Res. 12, 1048-1052.

>, 10. Wang, C.-S., Hartsuk, J.A. & Downs, D. (1988) Biochemistry 27, 4834-4840.

• 11. Bläckberg, L. & Hernell, 0. (1983) FEBS Lett. 157, 337-341.

• · 20 12. Björksten, B., Burman, L.G., deChateau, P., Fredrikzon, B., Gothefors, L. & :. Hernell, 0. (1980) Br. Med. J. 201,267-272.

13. Brueton, M.J., Berger, H.M., Brown, G.A., Ablitt, L., lyangkaran, N. & Whar-. j·. ton, B.A. (1978) Gut 19, 95-98.

• : 14. Murphy, G.M. & Singer, E. (1975) Gut 15, 151-163.

; 25 15. Hernell, 0., Staggers, J.E. & Carey, M.C. (1990) Biochemistry, 29:2041- '· 2056.

114639 19 16. Lombardo, D., Guy, O. &Figarella, C. (1978) Biochem. Biophys. Acta 527, 142-149.

17. Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. & Lombardo, D. (1988) Biochem. Biophys. Acta 961,299-308.

5 18. Hernell, O., Bläckberg, L. & Lindberg, T. (1988) in Textbook of Gastroen terology and Nutrition in infancy (Lebenthal, E., ed.) pp. 209-217, Raven Press, New York.

19. Wang, C.-S. (1988) Biochem. Biophys. Res. Com. 155, 950-955.

20. Chirqwin, J.M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J. & Rutter, W. J. (1979) 10 Biochemistry 18, 5294-5299.

21. Aviv, H. & Leder, P. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 5201-5205.

22. Bailey, J. M. & Davidson, N. (1976) Anal. Biochem. 70, 75-85.

23. Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New 15 York.

: .. 24. Gubler, U. & Hoffman, B. J. (1983) Gene 25, 263-269.

; 25. Maniatis, T., Haldison, R. C., Lacy, E., Lauer, J., O'Conell, C. & Qvon, D.

Γ (1978) Cell 15, 687-701.

j 26. Young, R. A. & Davis, R. W. (1983) Science 222, 778-782.

20 27. Young, R. A. & Davis, R. W. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194- 1198.

; 28. McMaster, G.K. & Charmichael, G.G. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 48353-48358.

•. 29. Thomas, P. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201 -5205.

;· 25 30. Feinberg, A. P. & Vogelstein, B. (1983) Analyt. Biochem. 132, 6-13.

> · j ·

• 31. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

74, 5463-5467.

114639 20 32. Staden, R. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 551 -567.

33. Devereux, J., Haeberli, P. & Smithies, O. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 387-395.

34. Wang, C.-S. & Johnson, K. (1983) Anal. Biochem. 133, 457-461.

5 35. Hamosh, M. (1986) in Human Milk Infant Nutrition and Health (Howell, R. R.,

Morriss, F. H. & Pickering, L. K. eds) pp. 66-97, Charles, C., Thomas, Springfield.

36. Wang, C.-S. (1980) Anal. Biochem. 105, 398-402.

37. Wang, C.-S. & Lee, D. M. (1985) J. Lipid. Res. 26, 824-830.

10 38. Brenner, S. (1988) Nature 334, 528-530.

39. Vang, C.-Y., Gu, Z.-W., Yang, H.-H., Rohde, M. F., Gotto, Jr., A. M. & Pown-hall, H. J. (1989) J. Biol. Chem. 265, 16822-16827.

40. Han, J. H., Stratowa, C. & Rutter, W. J. (1987) Biochemistry 26,1617-1625.

41. Kyger, E., Wiegand, R. & Lange, L. (1989) Biochem. Biophys. Res. Com 15 164, 1302-1309.

42. Bläckberg, L. (1981) Fat digestion in newborn infant. Umeä University Medi- • · cal Dissertations New Series No 71.

j 43. Rudd, E. A. & Brockman, H. L. (1984) in Lipases (Borgström, B. & Brock- man, H. L. eds) pp. 184-204, Elsevier, Amsterdam.

20 44. Mickel, S., Weinbach, F., Swarovsky, B., LaForge, S. & Scheele, G. (1989) .:. J. Biol. Chem. 264, 12895-12901.

*’ 45. Cammulli, E. D., Linke, M. J., Brockman, H. L. & Hui, D. Y. (1989) Biochem.

Biophys. Acta 1005, 177-182.

: : : 46. Mann, S. K. O. & Firtel, R. A. (1987) Mol. Cell Biol. 7, 458-469.

’ , 25 47. Mercken, L., Simons, M. J., Swillens, S, Masser, M. & Vassart, G. (1985) Na- ture 316, 647-651.

114639 21 48. Lauro, R., Obici, S., Conliffe, D., Ursini, V. M., Musti, A., Moscatelli, C. & Av-vedimento, V. E. (1985) Eur. J. Biochem. 148, 7-11.

49. Malthiery, Y. & Lissitzky, S. (1987) Eur. J. Biochem. 165, 491-498.

50. Prody, C., Zevin-Sonkin, D., Gnatt, A., Goldberg, O. & Soreq, H. (1987) Proc.

5 Natl. Acad. Sci. USA 84, 3555-3559.

51. Sikorav, J.-L, Krejci, E. & Massoulie, J. (1987) EMBO J. 6, 1865-1873.

52. Oakeshott, J. G., Collet, C., Phillis, R. W., Nielsen, K. M., Russel, R. J., Cambers, G. K., Ross, V. & Richmond, R. C. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3359-3363.

10 53. Long, R., Satho, H., Martin, B., Kimura, S., Gonzales, F. & Pohl, L. (1988)

Biochem. Biophys. Res. Comm. 156, 866-873.

54. Hall, L. M. C. & Spierer, P. (1986) EMBO J. 5, 2949-2954.

55. Sjöberg, S., Carlsson, P., Enerbäck, S. & Bjursell, G. (1989) CABIOS 5, 41- 46.

15 56. EP-A-317355.

57. Hernell, O. and Olivecrona, T. (1974) Human milk lipases II. Bile salt- • j stimulated lipase. Biochem. Biophys. Acta 369, 234-244.

58. Hernell, 0., Bläckberg, L. and Olivecrona, T. (1981) Human milk lipases. In ' Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, editor.

,/ 20 Raven Press, New York, 347-354.

59. Atkinson, S. A., Bryan, M. H. and Andersson, G. H. (1981) Human milk feed- ·· ing in premature infants: protein, fat and carbohydrate balances in the first *. two weeks of life. J. Pediatr. 99, 617-624.

60. Chappell, J. E., Clandinin, M. T., Kearney-Volpe, C., Reichman, B. and 25 Swyer, P. W. (1986) Fatty acid balance studies in premature infants fed hu man milk or formula: effect of calsium supplementation. J. Pediatr. 108, 438- \ 447.

114639 22 61. Williamson, S., Finucane, E., Ellis, H. and Gamsu, H. R. (1978) Effect of heat treatment of human milk on absorption of nitrogen, fat, sodium, calcium and phosphorus by preterm infants. Arch. Dis. Childhood 53, 555-563.

Claims (11)

114639 23

1. DNA-sekvens, kännetecknad av att den kodar lipasderivat, som har en ami- J nosyrasekvens frän position 1 tili position 722 som illustreras i figur 7, eller en / funktionellt ekvivalent variant som stimuleras med gallsalter av protein.

1. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa lipaasijohdannaista, jolla on kuviossa 7 asemasta 1 asemaan 722 esitetty aminohapposekvenssi, tai proteiinin sappisuoloilla stimuloituva funktionaalisesti ekvivalentti variantti.

2. DNA-sekvens som kodar lipasderivat, kännetecknad av att den innefattar en ; · aminosyrasekvens enligt figur 7 • 25 frän position 1 tili position 535, eller Λ frän position 1 tili position 278, eller frän position 1 tili position 341, eller frän position 1 tili position 409, eller frän position 1 tili position 474, eller 30 frän position 279 tili position 341, eller frän position 279 tili position 409, eller frän position 279 tili position 474, eller 114639 25 frän position 342 till position 474, eller frän position 536 tili position 722, eller en funktionellt ekvivalent variant som stimuleras med gallsalter av protein.

2. Lipaasijohdannaista koodaava DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sillä on kuvion 7 mukainen aminohapposekvenssi asemasta 1 asemaan 535, tai asemasta 1 asemaan 278, tai asemasta 1 asemaan 341, tai 10 asemasta 1 asemaan 409, tai asemasta 1 asemaan 474, tai asemasta 279 asemaan 341, tai asemasta 279 asemaan 409, tai asemasta 279 asemaan 474, tai 15 asemasta 342 asemaan 474, tai asemasta 536 asemaan 722, tai proteiinin sappisuoloilla stimuloituva funktionaalisesti ekvivalentti variantti.

3. DNA-sekvens enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknad av att aminosyra-5 sekvensen är kombinerad med ett eller flera repetitionsomräden i figur 5.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että aminohapposekvenssi on yhdistetty yhden tai useamman kuvion 5 toistoalueisiin.

4. DNA-sekvens enligt nägot av patentkraven 1-3, kännetecknad av att amino-syrasekvensen innehäller en N-terminal av metionin som tilläggsaminosyra.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että aminohapposekvenssi sisältää metioniinin N-pään lisäaminohappona. / 5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että proteiinilla on yksi tai useampia kriittisiä luonnonmukaisesti tapahtuvia sappisuolojen stimuloiman lipaasin toimintoja. \ 25 6. DNA-sekvenssi, joka on määritetty seuraavilla nukleotidien numeroilla kuvi- ’ ossa 2: 151-2316 ! 151-1755 151-985 30 151-1172 151-1376 151-1574 114639 24 986-1172 986-1376 986-1574 1173-1376 5 1173-1574

5. DNA-sekvens enligt nägot av patentkraven 1-4, kännetecknad av att pro-teinet har en eller flera kritiska naturliga lipasfunktioner stimulerade av gallsalter.

6. DNA-sekvens, som definieras med följande nukleotidnummer i figur 2: 151-2316 151-1755 151-985 151-1172 15 151-1376 151-1574 986-1172 986-1376 986-1574 :· 20 1173-1376 · *: 1173-1574 :7. Vektor, innefattande en DNA-sekvens enligt nägot av patentkraven 1-6. > · t

7. Vektori, joka käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen DNA-sekvenssin.

8. En icke-human värdcell, kännetecknad av att den transformeras med en * · · vektor enligt patentkrav 7. ;** 25 9. Förfarande för att framställa ett protein, kännetecknat av att man odlar en : ’: icke-human värdcell enligt patentkrav 8 och isolerar proteinet. ‘1* 10. Förfarande för att framställa en farmaceutisk komposition, kännetecknat av att man producerar protein med ett förfarande enligt patentkrav 9 och att nämnda , ’ ; protein inkluderas skilt eller tillsammans med lipasen eller tillsammans med prepa- 30 rat som innehäller lipaser i en farmakologiskt acceptabel bärare. 26 114639

8. Ei-humaani isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 7 mukaisella vektorilla.

9. Menetelmä proteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että kasvatetaan patentti vaatimuksen 8 mukaista ei-humaania isäntäsolua ja proteiini eristetään.

10. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että tuotetaan proteiinia patenttivaatimuksen 9 mukaisella menetelmällä ja mainittu proteiini yksin tai yhdessä lipaasin kanssa tai yhdessä valmisteiden kanssa, jot- 15 ka sisältävät lipaaseja, sisällytetään farmakologisesti hyväksyttävään kantajaan.

11. Menetelmä vauvan ruokakoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että tuotetaan proteiinia patenttivaatimuksen 9 mukaisella menetelmällä ja mainitulla proteiinilla täydennetään vauvan ruokakoostumusta.

11. Förfarande för att framställa en matsammansättning för spädbarn, känne-tecknat av att man producerar protein med förfarandet enligt patentkrav 9 och att man kompletterar matsammansättningen för spädbarn med nämnda protein. e » · s t t