CZ287470B6 - Léčivo k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností - Google Patents
Léčivo k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností Download PDFInfo
- Publication number
- CZ287470B6 CZ287470B6 CS19911644A CS164491A CZ287470B6 CZ 287470 B6 CZ287470 B6 CZ 287470B6 CS 19911644 A CS19911644 A CS 19911644A CS 164491 A CS164491 A CS 164491A CZ 287470 B6 CZ287470 B6 CZ 287470B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ability
- medicament
- manufacture
- protein
- use according
- Prior art date
Links
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 201000007089 exocrine pancreatic insufficiency Diseases 0.000 title claims abstract description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims description 34
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims description 33
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims description 33
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims description 33
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 claims description 21
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 claims description 19
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 claims description 16
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- 206010025476 Malabsorption Diseases 0.000 claims description 12
- 208000004155 Malabsorption Syndromes Diseases 0.000 claims description 12
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 10
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 10
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 10
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 10
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 8
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol group Chemical group [C@@H]1(CC[C@H]2[C@@H]3CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)[C@H](C)CCCC(C)C HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 6
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 claims description 5
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical class OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 5
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 5
- 150000002759 monoacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 5
- 208000000668 Chronic Pancreatitis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033649 Pancreatitis chronic Diseases 0.000 claims description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 4
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 claims description 4
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 claims description 4
- -1 vitamin esters Chemical class 0.000 claims description 4
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 claims description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical class C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 claims description 2
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 claims description 2
- 239000002628 heparin derivative Substances 0.000 claims description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 claims description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 70
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 62
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 60
- 108010087173 bile salt-stimulated lipase Proteins 0.000 description 52
- 102100035687 Bile salt-activated lipase Human genes 0.000 description 49
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 33
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 33
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 33
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 30
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 229940040461 lipase Drugs 0.000 description 18
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 16
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 10
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 10
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 6
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 6
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 210000004293 human mammary gland Anatomy 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 5
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 4
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 4
- 102100036045 Colipase Human genes 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 101000715643 Homo sapiens Bile salt-activated lipase Proteins 0.000 description 4
- 101000876022 Homo sapiens Colipase Proteins 0.000 description 4
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 102000052905 human CEL Human genes 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 101000929928 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000019280 Pancreatic lipases Human genes 0.000 description 3
- 108050006759 Pancreatic lipases Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 102000005311 colipase Human genes 0.000 description 3
- 108020002632 colipase Proteins 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000020958 lipid digestion Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229940116369 pancreatic lipase Drugs 0.000 description 3
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 2
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031416 Gastric triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031415 Hepatic triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108020002496 Lysophospholipase Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101000715641 Rattus norvegicus Bile salt-activated lipase Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241001104043 Syringa Species 0.000 description 2
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 102100033504 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N chloromethane Chemical compound ClC NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 2
- 239000002329 esterase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 2
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 108010091264 gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 125000000946 retinyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])=C([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])=C([H])/C1=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- CGRCVIZBNRUWLY-HNNXBMFYSA-N (2s)-2-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 CGRCVIZBNRUWLY-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 1
- 102100036806 Carboxylesterase 5A Human genes 0.000 description 1
- 102000004308 Carboxylic Ester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000863 Carboxylic Ester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 108700012227 Drosophila ase Proteins 0.000 description 1
- 108020002908 Epoxide hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101001077840 Homo sapiens Lipid-phosphate phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101000938676 Homo sapiens Liver carboxylesterase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000800133 Homo sapiens Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 101710128782 Liver carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 102100030817 Liver carboxylesterase 1 Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102100026001 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Human genes 0.000 description 1
- 101710099648 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000016222 Pancreatic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIJVFDBKTWXHHD-UHFFFAOYSA-N Physostigmine Natural products C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)C2C1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101100235661 Rattus norvegicus Lpl gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 description 1
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000011360 adjunctive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000004626 essential fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 150000002314 glycerols Chemical class 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 102000047688 human TG Human genes 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 235000021125 infant nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 235000020978 long-chain polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004203 pancreatic function Effects 0.000 description 1
- 210000001819 pancreatic juice Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229960001697 physostigmine Drugs 0.000 description 1
- PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N physostigmine Chemical compound C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)[C@@H]2[C@@]1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000020185 raw untreated milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 108020002447 serine esterase Proteins 0.000 description 1
- 102000005428 serine esterase Human genes 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
- A61K8/36—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
- A61K8/361—Carboxylic acids having more than seven carbon atoms in an unbroken chain; Salts or anhydrides thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
- A61K8/37—Esters of carboxylic acids
- A61K8/375—Esters of carboxylic acids the alcohol moiety containing more than one hydroxy group
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
- A61K8/42—Amides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
- A61K8/44—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
- A61K8/44—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof
- A61K8/442—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof substituted by amido group(s)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
- A61K8/494—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with more than one nitrogen as the only hetero atom
- A61K8/4946—Imidazoles or their condensed derivatives, e.g. benzimidazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/92—Oils, fats or waxes; Derivatives thereof, e.g. hydrogenation products thereof
- A61K8/922—Oils, fats or waxes; Derivatives thereof, e.g. hydrogenation products thereof of vegetable origin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
- A61K2800/59—Mixtures
- A61K2800/596—Mixtures of surface active compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Birds (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Použití rekombinantního proteinu, jak je uveden na obrázku VII od polohy 1 do polohy 722, nebo jeho funkční varianty, která projevuje schopnosti a stabilitu, jaké jsou blíže specifikovány v popise, pro výrobu léčiva k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností.ŕ
Description
Léčivo k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností
Oblast techniky
Předložený vynález se týká použití rekombinantního proteinu, jak je uveden na obrázku VII od polohy 1 do polohy 722, nebo jeho funkční varianty, která projevuje dále specifikované schopnosti a stabilitu, pro výrobu léčiva k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností.
Dosavadní stav techniky
Lidská laktující mléčná žláza syntetizuje a seceruje s mlékem žlučovou solí stimulovanou lipázou (BSSL - bile salt stimulated lipase) (Blackberg L. Ángquist K.A. a Hemell O. /1987/ FEST Lett. 217, 37-41/, po specifické aktivaci primárními žlučovými solemi (Hemell O. /1975/ Eur. J. Clin. Invest. 5,267-272; Hemell O. a Olivecrona T. /1974/ Human milk lipases II. Bile salt-stimulated lipase, Biochem. Biophys. Acta, 369, 234-244; Hemell O., Blackberg L. a Olivecrona T. /1981/ Human milk lipase v Textbook of gastrenterology and nutrition in infancy, E. Lebenthal, vyd., Raven Press, New York, 347-354), která přispává u kojených dětí k endogenní kapacitě intestinálního štěpení tuku (Hemell O., Blackberg L. a Bembáck S. /1988/ v Perinetal nutrition /Lindblad B. S., vyd./ Bristol-Myers Nutrition Symposia, sv. 6, str. 259-272, Academie Press, New York; (Hemell O., Blackberg L. a Fredrikzon B. a T. Olivecrona. 1981. Bile salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neanatal period. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, vyd. Raven Press, New York, 465D71; Bembáck S., Blackberg L. a hemell O. /1990/ J. Clin. Invest. J. Clin. Invest. 221-226 /1990//. Tento enzym, který činí přibližně 1 % celkového mléčného proteinu /Blackberg L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116, 221-225/, je nespecifickou lipázou; in vitro hydrolyzuje nejen tri-, di- a monoacylglyceroly, ale také cholesteryl- a retinylestery a lysofosfatidylglyceroly /Hemell O. a Blackberg L. /1982/ Pediatr. Res. 16, 882-885; Blackberg L., Lombardo D., Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284-288; Fredrikzon B., Hemell O., Blackberg L. a Olivecrona T. /1978/ Pediatr. Res. 12,1048-1052; Wang C.-S., Hartsuck J.A. a Downs D. /1988/ Biochemistry 27, 4834D840/. Navíc její aktivita není omezena na emulgované substráty, ale stejnými rychlostmi jsou hydrolyzovány micelámí a rozpustné substráty (Blackberg L. a Hemell O. /1983/FEBS Lett. 157, 337-341/.
BSSL není degradována během průchodu mléka žaludkem a v duodenálním obsahu je chráněna žlučovými solemi před inaktivací pankreatickými proteázami, jako je trypsin a chymotrypsin /Hemell O. /1975/ Eur. J. Clin. Invest. 5, 267-272; Blackberg L. a Hemell O. /1983/ FEBS Lett. 157, 337-341/. Nicméně je inaktivována při pasteuraci mléka, např. zahřátím na 62,5 °C, 30 min /Bjorksten B., Burman L. G., DeChateau P., Fredrikzon B. Gothefors L. a Hemell O. /1980/ Br. Med. J. 201, 267-272/. Modelové pokusy in vitro potvrzují, že konečné produkty štěpení triacylglycerolu se za přítomnosti BSSL /Bembáck S., Blackberg L. a Hemell O. /1990/, J. Clin. Invest. J. Clin. Invest. 221-226 /1990/; Hemell O. a Bláckberg L. /1982/ Pediatr. Res. 16, 882— 885/ liší. Vzhledem k větším intraluminálním koncentracím žlučové soli během neonatálního období /Brueton M.J., Berger H.M., Brown G.A., Ablitt L., Iyangkaran N. a Wharton B.A. /1978/ Gut 19, 95-98; Murphy G.M. a Singer E. /1975/ Gut 15, 151-163/ může být zlepšena absorpce produktů /Bembáck S., Bláckberg L. a Hemell O. /1990/ J. Clin. Invest. J. Clin. Invest. 221-226 /1990//.
Karboxyester-hydrolýza /CEH/ lidské pankreatické šťávy /Lombardo D., Guy O. Figarella C. /1978/ Biochem. Biophys. Acta 527, 142-149/ se funkčně jeví jako identická nebo alespoň velmi podobná BSSL /Bláckberg L., Lombardo D., Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284—288/. Obsahuje také obvyklé epitopy /Bláckberg L., Lombardo D., Hemell O.,
-1 CZ 287470 B6
Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284-288; Abouakil N., Rogalska E., Bonicel J. a Lombardo D. /1988/ Biochem. Biophys. Acta 961, 299-308/, mají identické N-terminální aminokyselinové sekvence /Abouakil N., Rogalska E., Bonicel J. a Lombardo D. /1988/ Biochim. Biophys. Acta 961, 299-308/ a jsou inhibovány inhibitory serin-esteráz, např. eserinem a 5 diizopropylfluorefosfátem /Bláckberg. L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116, 221-225;
Bláckberg L., Lombardo D., Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284288; Lombardo D., Guy O. a Figarella C. /1978/ Biochem. Biophys. Acta 527, 142-149/. Bylo předpokládáno, že dva enzymy jsou produkty stejného genu /Hemell O., Blackberg L. a Lindberg T. /1988/ v Textbook of Gastroenterology and Nutrition in infancy /Lebenthal E., ed/ str. 209ío 217, Raven Press, New York/. Pozorovaný rozdíl v molekulové velikosti /Blackberg L.,
Lombardo D., Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284-288; Fredrikzon B., Hemell O., Bláckberg. L. a Olivecrona T. /1978P Pediatr. Res. 12, 1048-1052/ by mohl být vysvětlen rozdílnými různými stupni glykosylace, jak bylo v poslední době potvrzeno /Abouakil N., Rogelska E., Bonicel J. a Lomberdo D. /1988/ Biochim. Biophys. Acta 961, 299-308/.
Dietní lipidy jsou důležitým zdrojem energie. Energeticky bohaté triacylglyceroly tvoří více než 95 % těchto lipidů. Některé z těchto lipidů, např. určité mastné kyseliny a vitaminy, rozpustné v tucích, jsou podstatnými dietními složkami. Před gastrointestinální absorpcí triacylglyceroly, jakož i minoritní složky, tj. esterifikované v tucích rozpustné vitaminy a cholesterol a 20 diacylfosfatidylglyceroly, vyžadují hydrolýzu esterových vazeb pro získání hydrofobnějších absorbovatelných produktů. Tyto reakce jsou katalyzovány specifickou skupinou enzymů, nazývaných lipázy.
U dospělého člověka jsou za podstatné lipázy považovány gastrická lipáza, pankreatická 25 colipáza-dependentní lipáza /hydrolýza tri- a diacylglycerolu/, pankreatická fosfolipáza AZ /diacylfosfatidylglyceroly/ a karboxyesterhydroláza /cholesterylestery a estery v tucích rozpustných vitaminů/. U kojených novorozenců hraje žlučovou solí stimulovaná lipáza důležitou úlohu při hydrolýze některých výše uvedených lipidů. Spolu se žlučovými solemi produktu štěpení lipidu tvoří směsné micely, ze kterých dochází k absorpci /Hemell O., Bláckberg L. a 30 Bembáck S. /1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B.S., ed. /Bristol-Myerst Nutrition symposia sv. 6, str. 259272, Academie Press, New York; Hemell O., L. Bláckberg, B. Frederikzon a T. Olivecrona. 1981. Bíle salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neonatal period. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, editor. Raven Press, New York. 465-471; Bembáck S., Bláckberg L. a Hemell O. /1990/ J. Clin. Invest. J.
Clin. Invest. 221-226/1990/Obvyklé případy lipidové malabsorpce a tudíž podvýživy jsou snížené intraluminální hladiny pankreatická colipáza-dependentní lipázy a/nebo žlučových solí. Typickými příklady takové defícience lipázy jsou pacienti, trpící cystickou fibrózou, běžnými genetickými poruchami, 40 vedoucími u asi 80 % pacientů ke zkrácení délky života, a chronickou pankreatitidou, často způsobenou chronickým alkoholismem.
Funkce pankreatu a jater nejsou plně při narození vyvinuty, zejména ne u předčasně narozených dětí. Obvykle je zjištěna tuková malabsorpce z fyziologických příčin a předpokládá se, že vzniká 45 z nízkých intraluminálních koncentrací pankreatické colipáza-dependentní lipázy a žlučové soli /Hemell O., Bláckberg L. a Bembáck S. /1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B.S. ed/, Bristol Myers Nutrition Symposia sv. 6., str. 259272, Academie Press, New York; Hemall O., Bláckberg L., Frederikzon B. a Olivecrona T. 1981. Bíle salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neonatal period. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E.
Lebenthal, vyd. Raven Press, New York; Brueton M.J., Berger H.M., Brown G.A., Ablitt L., Iyangkaran N. a Wharton B.A. /1978/ Gut 19, 95-98; Murphy G.M. a Signer E. /1975/ Gut 15, 151-163; Hemell O., Staggers J.E. a Carey M.C. Biochemistry /1990/, 29:2041-2056/. Nicméně kvůli BSSL je taková malabsorpce méně častá u kojených dětí než u dětí, krmených pasteurovaným lidským mlékem, vhodným pro děti /Hemell O., Bláckberg L. a Bembáck S.
/1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B.S. ed/ Bristol-Myers Nutrition symposia sv. 6, str.
-2CZ 287470 B6
259272, Academie Press, New York; Hernell O., Blackberg L., Frederikzon B. a Olivecrona T. 1981. Bile salt-stimulated lipasein human milk and lipid degestion in the neonatal period. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, vyd. Raven Press, New York; 465-471; Bembáck S., Blackberg L. a Hernell O. /1990/ J. Clin. Invest. J. Clin. Invest. 221-226 /1990/; Bjorksten B., Burman L.G., deChateau P., Frekrikzon B., Gothefors L. a Hernell
O. /1980/ Br. Med.J. 201, 267-272; Atkinson S.A., M.H. Bryan a G.H.Andersson. 1981. Human milk feeding in premature infents: protein, fat and carbohydrate balance in the first two weeks of lige. J. Pediatr. 99:617—624; Chappell J.E., M.T.Clandinin, C.Keamey-Volpe, B.Reichman a
P. W.Swyer. 1986. Fatty acid balance studies in premature infents fed human milk or formula: effect of calcium supplementation. J. Pediatr. 108:438-447; Williamson S., E. Finucane, H. Ellis a H.R. Gamsu. 1978. Effect of heat treatment of human milk on absorption of ntirogen, fat, sodium, calcium and phosphorus by preterm infents. Arch. Dis. Chíldhood 53:555-563/. Toto je jedna z příčin, proč je předkládána teorie, že novorozenci, zejména předčasně narozené děti, které nemohou být krmeny mateřským mlékem svých matek, by měly být krmeny nepasterovaným mlékem jiných matek /Bjorksten B., Burman L.G., deChateu, P. Fredrikzon B., Gothefors L. a Hernell O. /1980/ Br. med. J. 201, 267-272/.
Léčení pacientů, postižených deficitem pankreatické lipázy, zahrnuje podání velmi velkých dávek surového přípravku vepřových pankreatických enzymů. Colipáza-dependentní pankreatická lipáza je při nízkém pH inaktivována. Takové podmínky převládají v žaludku, což způsobuje, že orálně podávaná pankreatická lipáza je skutečně zcela inaktivována průchodem žaludkem do střeva. Tento efekt nemůže být úplně překonán použitím velkých dávek enzymu. Velké podávané dávky jsou neadekvátní u mnoha pacientů a přípravky nejsou čisté a chutné. Některé tablety byly formulovány tak, že procházejí kyselými oblastmi žaludku a uvolňují enzym pouze v relativně alkalickém prostředí jejuna. Nicméně mnoho pacientů, postižených pankreatickými poruchami, má abnormálně kyselé jejunum a takové tablety pak neuvolňují a mohou být proto neúčinné. Navíc jelikož dostupné přípravky jsou z nehumánního zdroje, je zde nebezpečí imunoreakcí, které mohou mít nebezpečný vliv na pacienta nebo vedou ke sníženému účinku léčby. Další nevýhodou existujících přípravků je, že jejich obsah dalších lipolytických aktivit než colipáza-dependentní lipáza není stanoven. Ve skutečnosti většina z nich obsahuje velmi nízké hladiny CEH/BSSL aktivity. Toto může být jedna z příčin, proč mnoho pacientů, trpících cystickou fibrózou, přes doplňkovou léčbu trpí deficitem vitaminů rozpustných v tucích a esenciálních mastných kyselin.
Existuje značná potřeba produktů s vlastnostmi a strukturou, odvozenou od lidských lipáz, a se širokou substrátovou specifitou, které by mohly být orálně podávány pacientům, trpícím nedostatkem jednoho nebo několika pankreatických lipolytických enzymů. Produkty podle předloženého vynálezu splňují tuto potřebu jako takové nebo v kombinaci s dalšími lipázami nebo v kombinaci s přípravky, obsahujícími další lipázy. Dále pro některé děti je zde potřeba zlepšení využití tuku z běžných dětských přípravků nebo pasterovaného lidského mléka z tak zvaných mléčných bank.
BSSL má některé jedinečné vlastnosti, pro které je ideálně vhodná pro substituční a doplňkovou terapii. Svým charakterem je určena pro orální podání. Je rezistentní při průchodu žaludkem a je aktivována v obsahu tenkého střeva. Její specifický aktiva ční mechanismus by měl bránit nebezpečné lipolýze potravy nebo tkáňových lipidů během zdržení a průchodu na místo jejího působení. Vzhledem ke své široké substrátové specifitě je schopna kompletního štěpení většiny dietních lipidů včetně esterů v tucích rozpustných vitaminů.
BSSL může být vynikající s pankreatickou colipázadependentní lipázou pro hydrolýzu esterových vazeb, obsahujících polynenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem.
Za přítomnosti gastrické lipázy a za nepřítomnosti nebo při nízkých hladinách colipázadependentní lipázy BSSL je možno zjistit úplné in vitro štěpení triacylglycerolu, i když hladiny žlučových solí jsou tak nízké jako u novorozenců. Za přítomnosti BSSL konečné produkty
-3CZ 287470 B6 štěpení triacylglycerolu tvoří volné mastné kyseliny a volný glycerol spíše než volné mastné kyseliny a monoacylglycerol, získané jinými dvěma lipázami /Bemback S., Blackberg L. a Hemell O. /1990/ J. Clin. Invest. 221-226 /1990//. Mohou podporovat absorpci produktu zejména, když jsou intraluminální hladiny žlučových solí nízko /Hemell O., Blackberg L. a Bemback S. /1988/ vPerinatal nutrition /Lindblad B.S., ed./ Bristol-Myers Nutrition symposia sv. 6, str. 259271, Academie Press; Hemell O., Staggers J.E. a Carey M.C. Biochemistry /1990/, 29:2041-2056/.
Podle dřívějšího přístupu byl dětská výživa vyvíjena a zlepšována tak, aby její sloužení bylo co nejpodobnější lidskému mléku. Takovou potravu je žádoucí doplnit.
Použití žlučovou solí stimulovaných lipáz /BSSL/ nebo proteinů s podstatnými funkcemi BSSL pro doplnění, substituci nebo terapii nicméně vyžaduje přístup ke značně velkým množstvím produktu. V průmyslovém měřítku není možno využívat přirozených zdrojů, jako je mléko, jako výchozí surovina. Mimo problému, uvedeného výše s inaktivací BSSL během pasterizace, je zde další nebezpečí kontaminace materiálu z přirozeného zdroje infekčními činidly, např. viry, jako je EÍIV virus a CMV. Proto existuje potřeba dostupnosti produktů, majících BSSL vlastnosti ve velkém měřítku. Předložený vynález poskytuje takové produkty a způsoby jejich přípravy.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je použití rekombinantního proteinu, jak je uveden na obrázku VII od polohy 1 do polohy 722, nebo jeho funkční varianty, která projevuje
- schopnost být aktivována zvláštními solemi žlučové kyseliny,
- schopnost působit jako nespecifická lipáza v tenkém střevě, kde se projevuje schopnost hydrolýzy lipidů relativně nezávisle na jejich chemické struktuře a fyzikálním stavu, jako je emulgace, micelámí stav nebo solubilizace,
- schopnost hydrolýzy triacylglycerolů mastnými kyselinami o rozdílné délce řetězce a rozdílném stupni nenasycenosti,
- schopnost hydrolýzy dalších látek, jako jsou diacylglyceroly, monoacylglyceroly, cholesterylestery, lysofosfatidylacylglyceroly a retinyl- a jiné estery vitaminů, rozpustné v tucích,
- schopnost hydrolýzy nejen pouze sn—1 (3) esterových vazeb v triacylglycerolu, ale také sn-2 esterové vazby,
- schopnost reagovat nejen s primárními, ale také se sekundárními solemi kyseliny žlučové,
- závislost na solích kyseliny žlučové pro optimální aktivitu,
- stabilita, takže obsah žaludku není nepříznivě ovlivněn katalytickými účinky v jakémkoli podstatném stupni,
- stabilita vůči inaktivaci proteázami slinivky břišní, například tiypsinem, za předpokladu, že jsou přítomny soli kyseliny žlučové,
- schopnost vázat deriváty heparinu, například heparinsulfát,
- schopnost vázat se na fázovém rozhraní lipid - voda, a
- stabilita při smísení s některými složkami potravy, jako je mateřské mléko nebo mléčné přípravky, pro výrobu léčiva k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností.
Výhodné použití podle tohoto vynálezu je určeno pro výrobu léčiva k ošetřování cystické fibrózy, chronické pankreatidy, tukové malabsorpce, malabsorpce vitaminů, rozpustných v tucích, a k ošetřování tukové malabsorpce, způsobené fyziologickými příčinami.
-4CZ 287470 B6
Všechna použití podle tohoto vynálezu jsou výhodně určena pro výrobu léčiva pro souběžné, oddělené nebo postupné podávání v kombinaci s lipázou nebo lipázami.
Dále se uvádí detailní popis tohoto vynálezu v širších souvislostech.
Předložený vynález je založen na klonování cDNA kódující BSSL, odvozenou z lidské mléčné žlázy. Byla také izolována z lidského pankreatu parciální cDNA, kódující CEH. Odvozené aminokyselinové sekvence od lidských cDNA a srovnání s CEH jiných druhů podporují výklad, že BSS1 a CEH jsou identické.
Jak bude dále detailně popsáno, bylo s překvapením zjištěno, že struktura proteinu, odvozeného do cDNA sekvence, je zcela rozdílná od struktury jiných lipáz. Struktura se neočekávaně jeví být podobnější struktuře typických esteráz, jako je cholinesteráza.
S odkazem na obr. II a obr. VII, produkty podle vynálezu jsou:
a/ protein, definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-722 na obr. VII, b/ protein, definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-535 na obr. VII, c/ protein, definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-278 na obr. VII, d/ protein, definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-341 na obr. VII, e/ protein, definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-409 na obr. VII, f/ protein, definovaný aminokyselinovou sekvencí 1—474 na obr. VII, g/ kombinace proteinů, definovaných pod b/ - f/, např. definovaných aminokyselinovou sekvencí v polohách 1-278, 279-341, 279-409,279-474, 342-474 a 536-722, h/ kombinace proteinů, definovaných pod b/ až g/, v kombinaci s jedním nebo více opakováními podle obr. V, i/ protein, definovaný pod a/ až h/, mající další N-terminální aminokyselinu, zejména methionin, a funkčně ekvivalentní varianty a mutanty proteinů, definovaných pod a/ až i/ výše.
Je třeba uvést, že proteiny pod a, b, c, d, e, f, h a i výše nebudou ve všech hlediscích identické s přirozeně se vyskytující BSSL, ale budou vykazovat jednu nebo více podstatných funkcí přirozeně se vyskytující BSSL. Podstatné funkce jsou uvedeny dále.
j/ DNA sekvence kódující proteiny, definované pod a, b, c, d, e, f, h a i výše, k/ DNA sekvence podle obr. II, definovaná následujícími nukleotidy na obr. II:
a/ DNA sekvence 151-2316 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 1-722 na obr. VII, b/ DNA sekvence 151-1755 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 1-535 na obr. VII, c/ DNA sekvence 151-985 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 1278 na obr. VII, d/ DNA sekvence 151-1172 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 1-341 na obr. VII, e/ DNA sekvence 151-1376 podle obr. VII, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 1-409 na obr. VII, f/ DNA sekvence 151-1574 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 1-474 na obr. VII, g/ DNA sekvence 986-1172 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 279-341 na obr. VII, h/ DNA sekvence 986-1376 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 279-409 na obr. VII, i/ DNA sekvence 986-1574 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 279-474 na obr. VII,
-5CZ 287470 B6 j/ DNA sekvence 1173-1376 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 342-409 na obr. VII, k/ DNA sekvence 1173-1574 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 342—474 na obr. VII.
Významné funkce proteinů podle vynálezu jsou a/ vhodnost pro orální podání, b/ jsou aktivovány specifickými žlučovými solemi, c/ působí jako nespecifická lipáza v obsahu tenkého střeva a jsou tak schopny hydrolyzovat lipidy relativně nezávisle na jejich chemické struktuře a fyzikální stavu /emulgované, micelámí, rozpouštěné/, d/ schopnost hydrolyzovat triacylglyceroly mastných kyselin o různé délce řetězce a různém stupni nenasycení, e/ schopnost hydrolyzovat také diacelglycerol, cholesterylestery, monoacylglycerol, lysofosfatidylacylglycerol a retinyl a jiné estery vitaminů, rozpustných v tucích, f/ schopnost hydrolyzovat nejen sn—1/3/ esterové vazby v triacylglycerolu, ale také sn-2 esterovou vazbu, g/ schopnost být ovlivňovány nejen primárními, ale také sekundárními žlučovými solemi, h/ závislost optimální aktivity na žlučových solích, i/ taková stabilita, že obsah žaludku neovlivňuje katalytickou účinnost v žádném podstatném stupni, j/ stabilita vůči inaktivaci pankreatickými proteázami, např. trypsinem za podmínky, že jsou přítomny žlučové soli, k/ schopnost vázat heparin a jeho deriváty, např. heparansulfát,
1/ schopnost vazby na rozhraní lipid-voda, m/ stabilita při lyofílizaci, n/ stabilita při snímání se složkami potravy, jako je mléko nebo mléčné přípravky.
Kritické funkce pro doplňky, náhrady nebo léčbu jsou uvedeny pod a, c, d, e, f, i, j a 1. Pro jiné účely nejsou nezbytné všechny kritické funkce.
Pro expresi výše uvedených proteinů budou příslušné DNA sekvence uvedené výše inzerovány do vhodného vektoru, který je pak zaveden do vhodného hostitelského organismu. Uvedený vektor bude obsahovat příslušné signální a další sekvence, umožňující organismu exprimovat požadovaný protein.
Vhodné organismy pro expresi:
Technika rekombinace DNA je možné klonovat a exprimovat požadovaný protein v různých prokaryotických a eukaiyotických hostitelských organismech. Možnými organismy pro expresi jsou bakterie, jednoduché eukaiyoty /kvasinky/, kultuiy živočišných buněk, kultury hmyzích buněk, kultury rostlinných buněk, rostliny a transgenní živočichové. Každý jednotlivý systém má sám o sobě určité výhody a nevýhody. Je možno učinit jednoduchý závěr, že každý gen, který má být exprimován, je zvláštním případem a je vhodné nestandardní řešení.
Obvykle užívanými bakteriálními systémy jsou E. coli, Bacillus sublitis, Streptomyces. Obvykle používanými kvasinkami jsou Saccharomyces a Pichia pastoris. Obvykle používanými živočišnými buňkami jsou CHO buňky a COS buňky. Obvykle používanými kulturami hmyzích buněk jsou buňky, získané z Drosophila.
Obvykle užívanou rostlinou je tabáková rostlina. Možnými transgenními živočichy jsou koza a kráva.
Příklady možných bakteriálních vektorů jsou pUC a protein A-vektory.
-6CZ 287470 B6
Příkladem možného kvasinkového vektoru je pMA91.
Možné hmyzí vektory jsou odvozeny od Baculoviru.
Možné vektory živočišných buněk jsou odvozeny od SV/40.
Možné rostlinné vektory jsou odvozeny od Ti-plazmidu.
V každém systému mohou být použity přirozené a syntetické promotory a terminátory.
V závislosti na výběru expresního systému může exprimovaný protein obsahovat další Nterminální aminokyselinu /methionin/, obsahovat málo zvláštních aminokyselin, nebo být fixován s heterologním proteinem /např. proteinem A/, nebo se lišit od proteinu z přirozeného zdroje glykosylací. Dále, vektory mohou také obsahovat signální sekvence za účelem přemístění proteinu do periplazmy nebo do kultivačního média.
Dalšími aspekty vynálezu tak jsou a/ vektor, obsahující DNA sekvenci, kódující výše specifikovaný protein, b/ hostitelský organismus, obsahující DNA sekvenci, specifikovanou výše, c/ způsob přípravy proteinu, specifikovaného výše, kultivací hostitelského organismu, obsahujícího vektor specifikovaný výše pod a/ a izolací proteinu.
Způsoby čištění jsou závislé na použitém expresním systému /např. protein A/IgG/ a/nebo na metodách, použitých při čištění enzymu přirozeného původu, jak je popsáno v práci Bláckerg L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem. 116, 221-225.
Dalšími aspekty vynálezu jsou:
- farmaceutická kompozice, obsahující výše specifikovaný protein,
- použití výše specifikovaného proteinu pro výrobu léčiva pro léčení patologických stavů, spojených s exokrinní pankreatickou insulficiencí,
- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení cystické fibrózy,
- použití proteinu specifikovaného výše jako doplňku přípravků dětské výživy,
- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení chronické pankreatitidy,
- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení tukové malabsorpce jakékoliv etiologie,
- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení malabsorpce vitaminů, rozpustných v tucích,
- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení tukové malabsorpce, vyvolané fyziologickými příčinami, např. novorozenců.
DNA sekvence na obr. II od polohy 151 až do a včetně polohy 2316 je sekvencí, kódující celý protein. Sekvence od polohy 2317 až do a včetně polohy 2415 není translatována do proteinu, ale zahrnuje v exonu d, identifikovaném v tabulce 2 dále.
V jednom provedení vynálezu protein, definovaný v odstavcích a/ - i/, je poskytnut v izolované formě a/nebo v podstatě čisté formě.
DNA sekvence, definované v odstavcích a/ - k/, jsou v jednom provedení vynálezu poskytnuty v izolované formě a/nebo v podstatě čisté formě.
Příklady provedení vynálezu
Zkratky:
aa - aminokyselina, bp - pár bází, BSSL - žlučovou solí stimulovaná lipáza, c-AMP - cyklický adenosinmonofosfát, CEH-karboxyester-hydroláza, Da - dalton, c7 GTP - 7-deaza-2deoxyguanosin-5'-trifosfát, EDTA - ethylendiamintetraacetát, kb - kilobáze, MOPS - 3-Nmorfolinopropansulfonová kyselina nt - nukleotid, PAGE - elektroforéza na polyakrylamidovém gelu, SDS - dodecysulfát sodný, SSC - NaCl citrát, xGal, 5-brom^l-chlor-3-indolyl-(3-Dgalaktopyranosid.
Enzymy žlučovou solí stimulovaná lipáza EC 3.1.1.3 karboxyester-hydrolýza EC 3.1.1.1
Materiály a metody
A. Příprava enzymu a protilátek
BSSL byla čištěna z lidského mléka, jak bylo dříve popsáno /Blackberg L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116, 221-225/. Při použití pro přípravu protilátky byl enzym dále čištěn pomocí SDS-PAGE. Proteinový pruh odpovídající lipáze byl po vybarvení pomocí Coomassie Briliant modři z gelu elektroeluován. Dvacet pět pg čištěného enzymu, spolu se stejným objemem Freudova kompletního adjuvans, bylo použito pro první s.c. injekci a stejné množství enzymu s nekompletním adjuvans pro následující měsíční booster injekce.Králíci byli vykrváceni asi dva týdny po každém boosteru a byla připravena séra a uchovávána při -20 °C.
B. Příprava tryptických fragmentů a analýza aminokyselinové sekvence
Tři mg čištěné BSS1 byly rozpuštěny v 1 ml 0,lM Tris-Cl pufru, pH 8,5, obsahujícím 6M guanidinium hydrochlorid a 2 mM EDTA. Dithioeiythritol byl přidán do koncentrace 5mM. Po inkubaci při 37 °C po dobu 2 hodin bylo přidáno 300 μΐ 50 mM jodacetátu. Po 90 minutové inkubaci při 25 °C za nepřístupu světla byl redukovaný a karboxymethylovaný enzym odsolen na koloně sephadexu G-25, ekvilibrované 0,5M hydrogenuhličitanem amonným. Před lyofilizací bylo přidáno třicet pg tosyl-Lfenylalanin chlormethanem opracovaného hovězího trypsinu /Worthington diagnistic systém lne., Freehol, NJ, USA/. Lyofilizovaný protein byl rozpuštěn ve 4 ml 0,lm hydrogenuhličitanu amonného a dále bylo přidáno 90 pg trypsinu. Po 5 hodinové inkubaci při 37 °C byl protein opět lyofilizován. Tryptický digest byl rozpuštěn v 0,1% trifluoroctové kyselině /2 mg/ml/. Třista pg trypsinem zpracované BSS1 bylo chromatografováno na HPLC za použití C-18 kolony s reverzní fází a eluováno gradientem 0-50 % acetonitrilu v 0,1% trifluoroctové kyselině. Odebírání peptidů bylo sledováno kontinuálně měřením absorbance při 215 nm. Peptidy, které mají být sekvenovány, byly dále čištěny rechromatografií za použití téže kolony s upravenými gradienty. Vzorky peptidových fragmentů pro sekvenování byly sušeny pod dusíkem pro odstranění acetonitrilu a aplikovány na sekvenátor. Pro N-terminálnr sekvenční analýzu byla nativní BSSL rozpuštěna v 0,1% kyselině octové. Sekvenční analýza byla provedena na Applied Biosystems lne. 477A pulzním sekvenátoru v kapalné fázi a on-line PTH 120A analyzátoru s regulovanými programy cyklů a chemikáliemi od výrobce. Počáteční a opakované výsledky, počítáno ze sekvenovaného standardního proteinu, β-laktoglobulinu, byly 47 a 97 %.
-8CZ 287470 B6
C. Izolace RNA
Vzorky lidské pankreatické adipózy a tkáně taktující mléčné žlázy byly získány chirurgicky a ihned ponořeny do guanidiumthiokyanátu /1-5 g v 50 ml/. Celková RNA byla extrahována, jak je popsáno v práci Chirwina J.M., Przybyla, A.E., MacDonalda R.J. a Ruttera W.J. /1979/ Biochemistry 18, 5294-5299. Poly/A/-RNA byla připravena chromatografií na oligodeoxythymidilát/oligo/DT//-celulózové koloně /Aviv H. a Leder P. /1979/ Proc.Natl. Acad. Sci USA 69, 5201-5205/.
D. Konstrukce a ascreening cDNA knihoven
Přibližně 15 pg polyadenylované RNA z lidského pankreatu bylo denatudováno methylmerkurihydroxidem /Bailey J.M. a Davidson N. /1976/ Anal. Biochem. 70, 75-85/ a primovány s oligo /dT/12-18 primery /Pharmacia, Uppsala, Švédsko/ a reverzně transkribovány za použití standardních postupů /Maniatis T., Fritsch E.F. a Sambrook J. /1982/: Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York/. Syntéza druhého řetězce byla provedena podle práce Gublera U. a Hoffmana B.J. /1983/ Gene 25, 263269, s tím rozdílem, že DNA ligáza a β-NAD byly vynechány a reakční teplota byla 15 °C. Přebytek RNA byl štěpen RNAzou A /50 pg/ml/ a dvojřetězcová cDNA byla zpracována s EcoRI methylázou /Maniatis T., Haldison R.C a Lacy E., Lauer J. O'Conell C. a Qvon D. /1978/ Cell 15, 687-701/. Konce byly zarovnány pomocí Klenow enzymu. Po ligaci k EcoRI linkerům a štěpení s EcoRI, cDNA byla frakcionována na koloně Sepharose 4B-C1. Frakce byly vysráženy ethanolem a cDNA ligovány do ECORI místa fosfatázou zpracovaného gtll vektoru /Young R.A. a Davis R.W /1983/ Proč. Nati. Acad. Sci, USA 80, 1194-1198/. In vitro provedení poskytlo více než 7 x 105 rekombinantů.
cDNA knihovna z lidské mléčné žlázy, získaná z tkáně ženy v osmém měsíci těhotenství, byla získána od Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA. USA.
Fágy z cDNA knihoven byly umístěny na plotnu v koncentraci 5 x 104 plakotvomých jednotek na 120mm misku. Antisérum bylo zředěno v poměru 1:3200 a screening byl proveden podle Younga R.A. a Davise R.W. /1983/ Proč. Nati. Acad. Sci, USA 80, 1194-1198/. Alkalickou fosfatázou konjugované kozí-anti-králičí protilátky byly použity jako druhé protilátky /Bio-Rad, Richmond, CA USA/. Pro izolaci klonů, odpovídajících 5' konci mRNA, byla hybridizace nukleových kyselin provedena za standardních podmínek /Maniatis T., Fritsch E.F. a Sambrook J. /1982/: Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York/ za použití subklonovaných fragmentů z jednoho z imunopozitivních klonů jako sondy.
E. RNA analýza
Elektroforéza byla provedena na 1% agarozovém gelu v 40mM MOPS pufru o pH 7,0 po denaturaci glyaoxalem a dimethylsulfoxidem /McMaster G.K. a Charmichael G.G. /1977/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 48 352-48 358/. Glyoxalátovaná celková RNA pak byla transferována na nitrocelulózové filtry /Thomas P. /1980/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205/. Bloty bylo sondovány subklony rekombinantů BSSL a CEH, které byly radioaktivně značeny oligoradioaktivní technikou /Feinberg A.P. a Vogelstein B. /1983/ Analyt. Biochem. 132,6-13/. Prehybridizace a hybridizace byly provedeny s 50% formamidem při 46 °C /Maniatis T., Fritsch E.F. a Sambrook J. /1982/: Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York/. Posthybridizační promytí byla prováděna s velkou přesností /0,1% SDS a 0,lxSSC při 60 °CP. /lxSSC, 0,15M NaCl., O,OO15MNa3citrát, pH 7,6/.
-9CZ 287470 B6
F. Nukleotidová sekvence cDNA inzerty s BSS1 a CEH rekombinantů byly buď přímo klonovány do M3mpl8 a mpl9 po sonifikaci a frakcionaci podle velikosti, nebo některé z nich byly dále subklonovány do pTZ19R po štěpeních pomocí Pstl, BstXI, Narl, Smál a Ahall. Nukleotidová sekvence byla stanovena dideoxy terminační metodou /Sanger F., Nicklen S. a Coulson A.R. /1977/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467/. GC-bohaté podíly /viz dále/ byly také sekvenovány s Taql polymerázou a dc 7GTP. Oba řetězce byly sekvenovány. Sekvenční informace byly získány z autoradiogramů za použití softwaru MS-EdSeq, jak je popsáno v práci Sjoberga S., Carlssona P., Enerbácka S., a Bjursella G. /1989/ CABIOS 5, 41^16.
G. Předpovědi aminokyselinových sekvencí a homologií
K předpovědi odpovídající aminokyselinové sekvence cDNA inzertů, kodon použitý v různých čtecích rámečcích byl porovnán podle Stadena a poskytl jeden otevřený čtecí rámeček /Staden R., /1984/Nucl. Acids Res. 12, 551-567/. Homologie byly zkoušeny s programy UWGCG softwaru /Devereux J., Haeberli P. a Smithies O. /1984/Nucl. Acids. Res. 12, 387-395/.
Výsledky a diskuse
A. Sekvence tryptických fragmentů a N-konce BSSL
Trypsinové štěpení čištěné BSS1 poskytlo přibližně 50 fragmentů podle píků, získaných HPLC chromatografií /obr. 1/. Píky byly odděleny a označené píky, které by mohly být izolovány ve vysoce čistém stavu a v přiměřených množstvích, byly sekvenovány. Výsledné sekvence jsou uvedeny v tabulce I. Dále bylo sekvenováno 30 N-koncových zbytků /obr. 2/ a potvrzují dříve uvedenou sekvenci podle Abouaila N., Rogalske E., Bonicela J. a Lombarda D. /1988/ Biochim. Biophys. Acta 961, 299-308, /30 zbytků/.
zbytků dlouhá N-terminální sekvence, uváděná v práci Wanga C.-S. a Johnsona K. /1983/ Anal. Biochem. 133, 457-461, je glycin v této práci a lysin podle uvedených autorů.
B. Nukleotidová sekvence BSSL
Pro konstrukci λ gtll cDNA knihovny byla použita polyadenylovaná RNA z lidského pankreatu. Nejprve byly izolovány čtyři imunopozitivní klony a pak tato pankreatická cDNA knihovna byla prohledána antisérem proti BSSL. Nukleotidová sekvenční analýza čtyř klonů ukázala, že jsou v dokonalém souladu a odpovídají 3'-konci mRNA. Všechny začínají póly A koncem a liší se pouze v délce; nejdelší inzert, označený ACEH, měří 996 bp.
cDNA knihovna z lidské mléčné žlázy byla prohledána antisérem a pankreatickým klonem ACEH jako sondou. Pozitivní klony byly izolovány z obou screeningů, všechny z nich začínají od 3'-konce. Nejdelší klon lidské mléčné žlázy, označený ABSSL, měří 2100 bp v protisměru. Obsahuje čtyři sekvenované tryptické fragmenty /obr. II/, ale nezahrnuje N-terminální aminokyselinovou sekvenci. K prodloužení sekvence dále od počátku translace byla cDNA knihovna lidské mléčné žlázy rescreenována sondou o délce 118 bází, získanou z nejčastějších 5'proximálních částí ABSSL. Byl izolován jeden klon, který pokračuje dále 328 nukleotidy protisměru. Tvoří N-terminální aminokyselinovou sekvenci a obsahuje zbývající tryptický fragment. Jak je uvedeno na obr. II, cDNA je 2428 nukleotidů dlouhá a obsahuje 81 bází v protisměru od prvního ATG kodonu. Polyadenylační signál, AATAAA je umístěn 13 nukleotidů v protisměru od póly A „chvostu“ a jako terminační kodon TAG byl nalezen nukleotid 2317, následovaný 3'-netranslatovanou oblastí 112 bp. GC bohatá oblast, obsahující 16 opakování 33 bází, byla nalezena na 3'-konci sekvence mezí bází 1756 a 2283. Nukleotidová sekvence opakování, uvedená na obr. III, obsahuj šest identických opakování, obklopených deseti
-10CZ 287470 B6 opakováními s různým počtem substitucí, které pravděpodobně vznikly po několika duplikacích. Nízký počet substitucí potvrzuje, že tato opakování se objevila později během vývoje.
C. Tkáňová distribuce exprese
RNA z lidské laktující mléčné žlázy, pakreatu, adipozové tkáně a z lidské hepatomové buněčné linie /HepG2/, byla analyzována Norhem blottingem. Velikost messengeru byla stanovena přibližně 2,5 kb jak v laktující mléčné žláze, tak v pankreatu. Žádný signál nebyl detekován v drahách s RNA, extrahovanou z HepG2 nebo adipozové tkáně /obr. IV/.
Vzhledem ktomu, že mRNA, použitá pro knihovnu mléčné žlázy, byla získána od ženy v 8. měsíci těhotenství, je evidentní, že transkripce a pravděpodobně translace BSS1 genu je provedena před porodem, v souladu s předcházejícími nálezy BSSL sekvence před porodem /Hamosh M. /1986/ vHamun Milk Infant Nutrition and Health /Howell, R.R., Morriss F.H. a Pickering L.K. eds./ str. 66-97, Charles C. Thomas, Springfield/ /viz obr. IV/.
D. Aminokyselinová sekvence BSSL
Podle SDS-PAGE byla uvedena molekulová hmotnost 107-125 kDa /Bláckberg L., Lombardo D., Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284-288; Wang C.-S./1980/ Anal. Biochem. 105, 398^102/ a podle analytické ultracentrifugace 105 kDa /Wang C.-S. a lee
D. M. /1985/ J. Lipid. Res. 26, 824-830/. Enzym, jak je předpovězeno z cDNA, obsahuje 722 aminokyselinových zbytků /obr. II/, které, při molekulové hmotnosti 76,271 Da, indikují, že enzym obsahuje nejméně 15-20 % karbohydrátu. Leader sekvence je 23 zbytků dlouhá. Zkusmé aktivní místo serinového zbytku je lokalizováno k serinu-217 /obr. V/. Sekvence okolo tohoto šeřinu jsou v souladu se sekvencí aktivního místa serin-hydrolýz /Brenner S. /1988/ Nátuře 334, 528-530/. V poslední době se předpokládá, že zbytky bází, nalezené těsně u serinového aktivního místa, mohou být zahrnuty ve štěpení esterových vazeb v acylglycerolech lipázami /Yang C.Y., Gu Z.-W., Yang H.-H., Rohde M.F., Gotto Jr. A.M. a Pownall H.J. /1988/ J. Biol. Chem. 265, 16822-16827/. Je zajímavé, že takové zbytky nejsou v BSS1 přítomny. Jediné zkušební Nglykosylační místo je lokalizováno pouze sedm zbytků od šeřinu. Stupeň glykosylace /Bláckberg L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116,221-225; Lombardo D., Guy O. a Figarella C. /1978/ biochim. Biophys. Acta 527, 142-149/ potvrzuje, že enzym obsahuje O-vázané karbohydráty. Existuje mnoho míst, kde by se mohla taková glykosylace objevit. Aminokyselinové složení čištěného enzymu prokázalo vysoký obsah prolinových zbytků /Bláckberg L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116, 221-225/. Aminokyselinová sekvence, získaná z cDNA, toto potvrzuje. Nejvíce prolinových zbytků je lokalizováno v 16 opakováních 11 zbytků, tvořících hlavní část Cterminální poloviny enzymu.
E. Porovnání enzymů v mléčné žláze /BSSL/ a pankreatu /CEH/
BSSL lidského mléka a lidská pankreatická CEH se projevuje jako podobné, ačkoliv identické nejsou. Prodloužené údaje potvrzují, že dva enzymy jsou produkty téhož genu. Nukleotidová sekvence cDNA klonů ukazuje, že pankreatický klon ACEH je identický s klonem ABSS1 lidské mléčné žlázy od póly A „chvostu“ a 996 bází směrem k 5'-konci, včetně sekvence, kódující opakování bohatá na prolin. Northen blot prokazuje jediný pruh 2,5 kb v RNA z pankreatu a laktující mléčné žlázy /obr. IV/. Genomický Southem blot dále podporuje myšlenku, že pouze jeden gen kóduje BSSL a CEH. Rozdíly v mobilitě na SDS-PAGE mezi BSSL a CEH mohou být vyloženy jako následek různé glykosylace nebo rozdílného spojení.
Podobnost BSSL krysím a hovězím enzymům /viz dále/ a výsledky z genomických blotů podporují možnost, že rozdílné spojení nemůže objasnit rozdíl v mobilitě. Jelikož C-terminální sekvence nebyla v proteinu potvrzena, je méně pravděpodobná možnost, že CEH může být získávána proteolytickým štěpením na C-terminálním konci.
-11CZ 287470 B6
Tak dlouho, že jsou známy pankreatické enzymy, které zřejmě odpovídají CEH, jsou tyto často pojmenovávány po druzích a zejména substrátech, používaných pro stanovení jejich aktivit: lysofosfolipáza, cholesterylesteráza, sterolester-hydroláza, nespecifická lipáza, karboxyesterlipáza a cholesterylester-hydroláza. Dostupné údaje jsou kompatibilní s názorem, že všechny tyto aktivity, které jsou popsány, vycházejí z jedné a té samé funkční entity /Bláckberg L. /1981/ Fat digestion in newbom infant. Umea University Medical Dissertations New Series No 71; Rudd E.A. a brockman H.L. /1984P v Lipases /Borgstóm B. a Brockman H.L. eds/ str. 184-204, Elsevier, Amsterodam/. Ilustruje to širokou substrátovou specifitu a relevantnost jejich označení jako nespecifické lipázy. Jestliže se sekvence lidské BSSL/CEH porovná se sekvencí lysofosfolipázy z tuku pankreatu /Han J.H., Stratowa C, a Rutter W.J. /1987/ Biochemistry 26, 1617-1625/ a cholesterolesterázy z hovězího pankreatu /Kyger E., Wiegand R., a lange L. /1989/ Biochim. Biophys. Res. Com 164, 1302-1309/, byly nalezeny intenzivní podobnosti v prodloužení asi 530 zbytků od N-konce /obr. V/, ale liší se v části molekuly, kde se vyskytují opakování. Krysí enzym má pouze čtyři opakování a hovězí tři. Proto je lidský enzym značně delší peptid.
Navíc byly nalezeny neobyčejné podobnosti mezi BSSL a množstvím typických esteráz, např. acetylcholinesterázami různých druhů včetně lidí a Drosophila a karboxyl-esterázami /obr. VI/. Tyto podobnosti byly omezeny na N- koncových 300 zbytků BSSL, které zahrnují hypotetické aktivní místo serinového zbytku. Podobnost s acetylcholinesterázou byla předpovězena ze skutečnosti, že BSS1 je inhibována typickými inhibitory cholin-esterázy /Bláckberg L. a Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Let. 136, 284-288; Lombardo D., Guy O. a Figarella C. /1978/ Biochim Biophys. Acta 527, 142-149/. S možnou výjimkou karboxyl-esterázy krysích jater /Cammulli E.D., Linka M.J., Brockman H.L a Hui D.Y. /1989/ Biochim. Biophys. Acta 1005, 177-182/, žádný z těchto enzymů nevykazoval stejnou závislost na žlučové soli jako BSSL; to potvrzuje, že strukturní báze těchto vlastností jsou umístěny v C-terminální část proteinu. Navíc BSSL může účinně atakovat emulgované substráty, což není charakteristické pro podobné esterázy. Pro tuto aktivitu je žlučová sůl základním předpokladem.
Předpovězená sekvence lidské BSSL byla porovnána s jinými dobře charakterizovanými savčími lipázami. Nehledě na shodnou sekvenci poblíž aktivního místa šeřinu /G-X-S-X-G/, nebyly nalezeny žádné zřejmé podobnosti /Mickel S., Weidenbach F., Swarovsky B., LaForge S. a Scheele G. /1989/ J. Biol. Chem. 264, 12895-12901P.
Navíc k podobnostem s jinými enzymy zde jsou také výrazné podobnosti s jedním c-AMP závislým proteinem z Dyctyostellium discoideum /Mann S.K.O. a Firtel R.A. /1987/ Mol. Cell. Biol. 7, 458-469/, jakož i s thyroglobulinem z některých druhů /obr. VIP /Mercken L., Simons M.J., Swillens S., Masser M. a Vassart G. /1985/ Nátuře 316, 647—651; Lauro R., Obici S., Condliffe D., Ursini V.M., Musti A., Moscatelli C. a Awedimento V.E. /1985/ Eur. J. Biochem. 148,7-11; Malthiery Y. a Lissitzky S. /1987/ Eur. J. Biochem. 165, 491-498/. Podobnosti mezi BSSL a thyroglobulinem, které zahrnují oblast aktivního místa, ale ne aktivní místo samotné, indikují, že tyto vysocekonzervované řetězce aminokyselin jsou důležitější, než pouze při podpoře enzymatické aktivity esteráz.
Jako závěr- lidská mléčná BSS1 obsahuje 722 zbytků aminokyselin. Dostupné údaje jasně ukazují, že její peptidový řetězec je identický s tímtéž řetězcem pankreatické CEH a že jsou kódovány tímtéž genem. Nejzřejmější je, že nukleotidové sekvence na jejich 3-koncích a jejich N-terminálních aminokyselinových sekvencí jsou identické. Neobyčejné homologie, nalezené u krysí pankreatické lysofosfolipázy a hovězí pankreatické cholesterol-esterázy, podporují hypotézu, že tyto enzymy jsou funkčně identické. Nicméně, jak bylo potvrzeno, rozdílné molekulové velikosti, zjištěné mezi druhy, nejsou způsobeny rozdíly pouze v glykosylaci; odrážejí různý počet opakování jedenácti aminokyselin. Podobnost sekvence aktivního místa mezi těmito esterázami potvrzuje, že tyto proteiny jsou získány z běžného zděděného genu.
Na obr. I - VII jsou uvedeny následující údaje.
-12CZ 287470 B6
Obr. I: Separace tryptického digestu BSSL pomocí HPLC
Čištěná BSSL byla zpracována s trypsinem a chromatografována HPLC, jak je popsáno v části Materiály a metody. Označené píky byly odebrány a čištěny dále rechromatograficky a byla stanovena jejich aminokyselinová sekvence.
Obr. II: cDNA nukleotidová sekvence a předpovězená aminokyselinová sekvence pro lidskou žlučovou solí stimulovanou lipázu cDNA je 2428 bází dlouhá. N-terminální 23-kodonová sekvence /nt82-150/, vycházející z ATG, je interpretována jako leader peptid, jelikož N-terminální aminokyselinová sekvence maturovaného proteinu začíná u kodonu 24 /nt 151, Ala/. Leader peptid je podtržen. Onačení * označuje počáteční bod exonu. Označení # znamená počáteční bod opakující se části.
Obr. III: Nukleotidová sekvence C-terminálních GC-bohatých opakování v lipáze stimulované žlučovou solí
Substituce jsou označeny *.
Obr. IV: Northem blot hybridizace
Analýza Northert blot celkové RNA, izolované z lidské laktující mléčné žlázy, pankreatu, adipozové tkáně a lidské hepatomové buněčné linie /HepG2/. Celková TNA /10 pg/ z laktující mléčné žlázy /dráha A/, pankreatu /dráha B/, adipozové tkáně /dráha C/ a HepG2 /dráha D/, byly zpracovány elektroforézou na 1% agarosovém gelu ve 40 mM MOPS pufru při pH 7,0 po denaturaci RNA v 1M glyoxalu, 50% dimethylsulfoxidu a 40 mM MOPS. Glyoxalátovaná RNA byla pak přenesena na nitrocelulózový papír pro hybridizaci s /32P/ značenou BSS1 cDNA /ABSSL/.
Obr. V: Porovnání předpovězené aminokyselinové sekvence z BSSL z lidského mléka, krysí pankreatické lysofosfolipázy /Ratlpl/ /Han J.H., Stratowa C. a Rutter W.J. /1987/ Biochemistry 26, 1617-1625/, a hovězí pankreatické cholesterol-esterázy /Bovceh/ /Kyger E., Wiegand R. a Lange L. /1989/ Biochim. Biophys. Res. Com. 164, 1302-1309/:
Serinové zbytky, obsažené v aktivním místě, jsou označeny * a # označuje jednotlivý možný Nglykosylační signál proteinu. Přímá opakování sekvencí aminokyselin jsou v rámečcích. Protější sekvence jsou označeny velkými písmeny, protější sekvence mezi dvěma enzymy jsou označeny malými písmeny a nesrovnalosti tečkou.
Obr. VI: Porovnání primární struktury BSSL s jinými esterázami, thyroglobulinem a jedním cAMP dependentním enzymem z Dictyostelium discoideum:
BSSL: lidská žlučovou solí stimulovaná lipáza, Cheshum: cholinesteráza z fetální lidské tkáně /Prody C., Zevin-Sonkin D., Gnatt A., Goldberg O., a Soreg H. /1987/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 355-3559/, Torpace: acetylcholinesteráza z Torpédo marmora /Sikorav J-L., Krejci E. a Massoulie'J. /1987/ EMBO J. 6, 1865-1873/, Drosceh: karboxyesterhydroláza zDrosophila melaogaster /Oakeshott J. G., Collet C., Phillis R.W., Nielsen K.M., Russel R.J., Cambers G.K., Ross V. a Richmond R.C. /1987/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 3359-3363/, Ratlivce: karboxylesteráza z krysích jater /Long R., Satho H., Martin B., Kimura S., Gonzales F. a Pohl L. /1988/ Biochem. Biophys. Res. Comm, 156, 866-873/, Drosace: acetyl cholinesteráza z Drosophila melaogester /Halí L.M. C. a Spierer P. /1986/ EMBO J. 5, 2949-2954P, Thyrhum: thyroglobulin lidský /Malthiery Y. a Lissitzky S. /1987/ Eur. J. Biochem. 165, 491—498/ a Diet. Di: c-AMP dependentní enzym z Dictyostelium discoideum /Mann, S.K.O. a Firtel R.A. /1987/ Mol. Cell Biol. 7, 458-469/. Existuje zde 7 různých domén, které ukazují podobnosti mezi
-13CZ 287470 B6 enzymy. Rámečky uzavírající zbytky, které jsou identické a malá písmena ve shodné /consensus/ sekvenci označují identické zbytky ve všech enzymech s výjimkou jednoho. Tečky označují nesrovnalosti. Serinový zbytek, obsažený v aktivním místě, je označen *. Obrázek v pravém rohu ukazuje, jak jsou domény orientovány.
Obr. Vil:
poskytuje aminokyselinovou sekvenci 1-722 pro celý protein /jednopísmenový kod/ a indikuje exony a, b, c a d. Označení # indikuje výchozí bod opakující se části.
Tabulka 1
Aminokyselinová sekvence BSSL peptidů
Z důvodů interferujících píků nemohla být u peptidu č. 26 provedena pozitivní identifikace zbytku v cyklech sekvenování 1 a 2. Čísla peptidů odpovídají pikům na obr. I.
Tryptické fragmenty
TP16:LysValThrGluGluAspPheTyrLys
TP19:GlyIleProPheAlaAlaProThrLys
TP20:LeuValSerGluPheThrIleThrLys
TP24:ThrTysAlaTyrLeuPheSerHisProSerArg TP26:PheAspValTyrThrGluSerTrpAlaGlnAsp
ProSerGlnGluAsnLys
Tabulka 2
Identifikace exonů a, b, c, a d, číslovaných jako na obr. II a VII
| exon | umístění | |
| mezi nukleotidy číslo | mezi aminokyselinami číslo | |
| a | 986-1172 | 279-341 |
| b | 1173-1376 | 342-409 |
| c | 1377-1574 | 410-474 |
| d | 1575-2415 | 475-722 |
| celý protein | 151-2316 | 1-722 |
| celý protein s výjimkou opakování | 151-175 | 1-535 |
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Použití rekombinantního proteinu, jak je uveden na obrázku VII od polohy 1 do polohy 722, nebo jeho funkční varianty, která projevuje- schopnost být aktivována zvláštními solemi žlučové kyseliny,- schopnost působit jako nespecifická lipáza v tenkém střevě, kde se projevuje schopnost hydrolýzy lipidů relativně nezávisle na jejich chemické struktuře a fyzikálním stavu, jako je emulgace, micelámí stav nebo solubilizace,-14CZ 287470 B6- schopnost hydrolýzy triacylglycerolů mastnými kyselinami o rozdílné délce řetězce a rozdílném stupni nenasycenosti,- schopnost hydrolýzy dalších látek, jako jsou diacylglyceroly, monoacylglyceroly, cholesterylestery, lysofosfatidylacylglyceroly a retinyl- a jiné estery vitaminů, rozpustné v tucích,5 - schopnost hydrolýzy nejen pouze sn-l(3) esterových vazeb v triacylglycerolů, ale také sn-2 esterové vazby,- schopnost reagovat nejen s primárními, ale také se sekundárními solemi kyseliny žlučové,- závislost na solích kyseliny žlučové pro optimální aktivitu,- stabilitu, takže obsah žaludku není nepříznivě ovlivněn katalytickými účinky v jakémkoli10 podstatném stupni,- stabilitu vůči inaktivaci proteázami slinivky břišní, například trypsinem, za předpokladu, že jsou přítomny soli kyseliny žlučové,- schopnost vázat deriváty heparinu, například heparinsulfát,- schopnost vázat se na fázovém rozhraní lipid - voda, a15 - stabilitu při smísení s některými složkami potravy, jako je mateřské mléko nebo mléčné přípravky, pro výrobu léčiva k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností.
- 2. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva k ošetřování cystické fibrózy.
- 3. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva k ošetřování chronické pankreatidy.
- 4. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva k ošetřování tukové malabsorpce.
- 5. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva k ošetřování malabsorpce vitaminů, rozpustných v tucích.
- 6. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva k ošetřování tukové malabsorpce, způsobené fyziologickými příčinami.
- 7. Použití podle některého z nároků 1 až 6, pro výrobu léčiva pro souběžné, oddělené nebo 35 postupné podávání v kombinaci s lipázou nebo lipázami.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9001985A SE9001985D0 (sv) | 1990-06-01 | 1990-06-01 | New chemical products |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ164491A3 CZ164491A3 (cs) | 1999-07-14 |
| CZ287470B6 true CZ287470B6 (cs) | 2000-12-13 |
Family
ID=20379662
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS19911644A CZ287470B6 (cs) | 1990-06-01 | 1991-05-31 | Léčivo k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností |
Country Status (44)
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HRP930935A2 (en) * | 1992-06-11 | 1994-12-31 | Astra Ab | New dna sequences |
| SE9300686D0 (sv) | 1993-03-01 | 1993-03-01 | Astra Ab | Novel polypeptides |
| IS4130A (is) * | 1993-03-01 | 1994-09-02 | Ab Astra | Ný fjölpeptíð |
| FR2754827B1 (fr) * | 1996-10-17 | 1998-12-24 | Biocem | Lipases pancreatiques et/ou colipases recombinantes et polypeptides dervies produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations |
| JP2000026311A (ja) * | 1998-07-02 | 2000-01-25 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 胃排出能亢進剤組成物 |
| US20090226904A1 (en) * | 2005-12-01 | 2009-09-10 | University Of Bergen | Diagnosis and treatment of exocrine pancreatic dysfunction and diabetes |
| AU2011242461B2 (en) | 2010-04-23 | 2015-10-01 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Lysosomal storage disease enzyme |
| DK2613798T4 (en) | 2010-09-09 | 2018-04-16 | Synageva Biopharma Corp | USING LYSOSOMAL SUR LIPASE TO TREAT PATIENTS WITHOUT LYSOSOMAL SUR LIPASE |
| AU2010362575A1 (en) | 2010-10-21 | 2013-04-11 | Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) | Method to increase the absorption of unsaturated fatty acids by human infants |
| EP2629790B1 (en) | 2010-10-21 | 2016-08-24 | Swedish Orphan Biovitrum AB (Publ) | Method to increase the growth velocity of human infants |
| AU2018288152A1 (en) * | 2017-06-19 | 2020-01-16 | Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) | Fusion protein with half-life extending polypeptide |
| CN115175995B (zh) | 2019-08-30 | 2025-05-02 | 雀巢产品有限公司 | 工程化脂肪酶变体 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU3107684A (en) * | 1983-07-01 | 1985-02-07 | Celltech Limited | Proteins, pharmaceutical compositions, genes, vectors, host organisms and processes for their production |
-
1990
- 1990-06-01 SE SE9001985A patent/SE9001985D0/xx unknown
-
1991
- 1991-05-17 ZA ZA913778A patent/ZA913778B/xx unknown
- 1991-05-18 TW TW080103838A patent/TW221712B/zh not_active IP Right Cessation
- 1991-05-20 DZ DZ910064A patent/DZ1503A1/fr active
- 1991-05-22 NZ NZ238223A patent/NZ238223A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-05-23 MY MYPI91000877A patent/MY111245A/en unknown
- 1991-05-27 IL IL9827391A patent/IL98273A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-05-29 EG EG33391A patent/EG19937A/xx active
- 1991-05-29 YU YU95191A patent/YU49138B/sh unknown
- 1991-05-29 MA MA22438A patent/MA22166A1/fr unknown
- 1991-05-30 ES ES91911030T patent/ES2099159T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-30 JP JP91510382A patent/JPH05507201A/ja active Pending
- 1991-05-30 RU RU92016526/13A patent/RU2140983C1/ru active
- 1991-05-30 DE DE69125489T patent/DE69125489T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-30 RO RO92-01490A patent/RO114793B1/ro unknown
- 1991-05-30 SG SG1996006887A patent/SG48078A1/en unknown
- 1991-05-30 AU AU79645/91A patent/AU651979B2/en not_active Expired
- 1991-05-30 UA UA93003780A patent/UA39165C2/uk unknown
- 1991-05-30 IE IE184491A patent/IE911844A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-05-30 EP EP91911030A patent/EP0535048B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-30 AT AT91911030T patent/ATE151077T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-05-30 CA CA002083396A patent/CA2083396C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-30 HU HU9203774A patent/HU215258B/hu unknown
- 1991-05-30 PL PL91296937A patent/PL166534B1/pl unknown
- 1991-05-30 DK DK91911030.4T patent/DK0535048T3/da active
- 1991-05-30 WO PCT/SE1991/000381 patent/WO1991018923A1/en not_active Ceased
- 1991-05-31 CZ CS19911644A patent/CZ287470B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-05-31 SK SK1644-91A patent/SK281089B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-05-31 TN TNTNSN91041A patent/TNSN91041A1/fr unknown
- 1991-05-31 IS IS3710A patent/IS1751B/is unknown
- 1991-05-31 PT PT97836A patent/PT97836B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-06-01 AP APAP/P/1991/000270A patent/AP207A/en active
- 1991-06-01 CN CN91104368A patent/CN1075113C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-01 JO JO19911694A patent/JO1694B1/en active
- 1991-10-11 PH PH43285A patent/PH30761A/en unknown
-
1992
- 1992-10-01 HR HRP-951/91A patent/HRP920771B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-11-24 NO NO19924528A patent/NO322962B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-11-26 BG BG97123A patent/BG61165B1/bg unknown
- 1992-11-30 KR KR1019920703049A patent/KR100212411B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-30 FI FI925453A patent/FI114639B/fi active IP Right Grant
-
1993
- 1993-07-30 LV LVP-93-1005A patent/LV10292B/en unknown
- 1993-12-30 LT LTIP1736A patent/LT4020B/lt not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-05-08 HK HK62497A patent/HK62497A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-05-30 GR GR970401262T patent/GR3023618T3/el unknown
-
2000
- 2000-11-20 CN CN00130975A patent/CN1326782A/zh active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nilsson et al. | cDNA cloning of human‐milk bile‐salt‐stimulated lipase and evidence for its identity to pancreatic carboxylic ester hydrolase | |
| Reue et al. | cDNA cloning of carboxyl ester lipase from human pancreas reveals a unique proline-rich repeat unit. | |
| Morimoto et al. | Saposin A: second cerebrosidase activator protein. | |
| Lowe et al. | Cloning and characterization of human pancreatic lipase cDNA | |
| Baba et al. | Structure of human milk bile salt activated lipase | |
| CZ287470B6 (cs) | Léčivo k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností | |
| HRP930935A2 (en) | New dna sequences | |
| SK285420B6 (sk) | Varianty lipázy stimulovanej soľou žlčových kyselín, DNA molekuly ich kódujúce a transgénne cicavceodlišné od človeka | |
| Poulose et al. | Cloning and sequencing of the cDNA for S-acyl fatty acid synthase thioesterase from the uropygial gland of mallard duck. | |
| Gooden | The importance of lipolytic enzymes in milk-fed and ruminating calves | |
| EP0131418A1 (en) | Proteins, pharmaceutical compositons, genes, vectors, host organisms and processes for their production | |
| de Araújo et al. | Purification of an acidic phospholipase A2 from Bothrops lanceolatus (fer de lance) venom: molecular and enzymatic properties | |
| Day et al. | Triglyceride fatty acid chain length influences the post prandial rise in serum intestinal alkaline phosphatase activity | |
| Hwang et al. | Molecular cloning and sequencing of thioesterase B cDNA and stimulation of expression of the thioesterase B gene associated with hormonal induction of peroxisome proliferation | |
| VÉRINE et al. | Immunodetection and molecular cloning of a bile-salt-dependent lipase isoform in HepG2 cells | |
| Lai et al. | Purification of pregastric lipases of caprine origin | |
| Kumar | Cloning and expression of rabbit pancreatic phospholipase A2 | |
| Rice | Secretory type II phospholipase A2 and the generation of intrauterine signals | |
| Timmermans | Purification, mofecular cloning and expression of the cDNA of bovine pregastric esterase | |
| WO2001089553A1 (en) | Enhanced triglyceride digestion in a deficiency of bile salts | |
| Mas et al. | [20] Glycosylation of bile salt-dependent lipase (Cholesterol esterase) | |
| Farid | Effect of dietary fat and cholesterol on plasma lecithin: cholesterol acyltransferase activity in man |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20110531 |