JPH0427385A - プロテアーゼ耐性セルラーゼ３１１２５ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なプロテアーゼ耐性を有するセルラーゼに
関する。

〔従来の技術〕

繊維素分解酵素（セルラーゼ）の開発は、従来バイオマ
ス資源の有効利用を一大目標として進められており、ト
リコデルマ属、アスペルギルス属アクレモニウム属、フ
ミコーラ属等の糸状菌を中心に、シニウドモナス属、セ
ルロモナス属、ルミノコッカス属、バチルス属等の細菌
、更に、ストレプトコツカス属、アクチノマイセス属等
の放線菌を供給源とするセルラーゼが報告されている。

しかしながら、現時点では、バイオマス用セルラーゼの
工業的規模での利用は多くはない。

一方、セルラーゼの産業的用途として、衣料用洗浄剤の
配合成分としての利用が大きくなっている（特公昭５９
−４９２７９号、特公昭６０−２３１５８号、特公昭６
０−３６２４０号）。衣料用洗浄剤組成物として使用し
得るセルラーゼを生産する方法としては好アルカリ性バ
チルス属細菌の培養によりセルラーゼＡを採取する方法
（特公昭５０−２８５１５号）、セルロモナス属に属す
る好アルカリ性細菌を培養してアルカリセルラーゼ３０
１−Ａを生産する方法（特開昭５８−２２４６８６号）
、好アルカリ性バチルスＮＣＬ１１３９を培養してカル
ボキシメチルセルラーゼを生産する方法（）ｌｏｒｉｋ
ｏｓｉ　ら、　Ｊ、　Ｇｅｎ９Ｍ１ｃｒｏｂｉｏ１．、
　１３１巻。

３３３９頁、　（１９８５年））、ストレプトマイセス
属の一種を用いてアルカリセルラーゼを生産する方法（
特開昭６１−１９４８３号）、好アルカリ性細菌の一種
バチルス・エスピーＫＳＭ−６３５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｓｐ、　ＫＳＭ６３５）を培養してアルカリセルラー
ゼＫを生産する方法（特開昭６３−１０９７７６号）等
の所謂アルカリセルラーゼを生産する方法と、バチルス
属細菌を培養してアルカリ耐性セルラーゼに−５２２及
びに−５８８を生産する方法（特開昭６４−３７２８５
号、特開昭６４＝３７２８６号）等の所謂アルカリ耐性
セルラーゼを生産する方法が報告されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、これらのセルラーゼはタンパク質分解酵
素であるプロテアーゼに対する耐性を有していない。そ
のため、例えば、プロテアーゼが配合された衣料用洗浄
剤に同時に配合することができなかった。

かかる問題を解決する手段として、セルラーゼを固定化
する方法、或いは化学修飾することにより安定化する方
法等が考えられるが、コスト、収率等の問題より産業的
利用に適しているとはいえない。

従って、本発明はプロテアーゼ耐性を有し、衣料用洗浄
剤等にブロテ了−ゼと共に配合することのできる新規な
セルラーゼを提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らはかかる課題を解決すべく数多くの
微生物の生産物について検討してきた結果、アスペルギ
ルス　ニガーに属する微生物の生産するセルラーゼ群の
なかに、界面活性剤及びプロテアーゼに対する耐性を有
するセルラーゼを見８し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は新規なプロテアーゼ耐性を有するセ
ルラーゼを提供するものである。

本発明のプロテアーゼ耐性セルラーゼは、例えばアスペ
ルギルス属に属するプロテアーゼ耐性セルラーゼ生産菌
を培養し、その培養物より採取することにより製造され
る。

プロテアーゼ耐性セルラーゼ生産菌としては、例えばア
スペルギルス　ニガーＩＦＯ＝３１１２５［ｒＬＩｓＴ
　ＯＦ　ＣＩＪＬＴＵＲＥＳ；　Ｅｉｇｈｔｈ　Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ、　Ｖｏｌ、　１（１９８８）大阪発酵研究所
」に記載〕が挙げられる。

培養は、固体又は液体培地を用い、常法により行われる
。

培地中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有
せしめておくことが好ましい。この炭素源及び窒素源に
ついては特別に制限はないが、その例としては、窒素源
として無機態の硝安、硫安、塩安、リン酸アンモニウム
、硝酸ソーダや大豆粉、コーンスチープリカー、カザミ
ノ酸、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、綿実油粕、カ
ルチベータ、アジックス及びグルタミン酸ソーダ等が挙
げられる。

又、炭素源としては、籾殻、ふすま、おが屑等の゛植物
繊維質、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）　、ア
ビセル、セルロース綿、キシラン、ペクチン等に加え；
資化し得る炭素源例えば、アラビノース、キシロース、
グルコース、マンノース、フラクトース、ガラクトース
、ショ糖、トレハロース、グリセリンや資化し得る有機
酸、例えば、クエン酸や酢酸が挙げられる。また、その
他、リン酸、Ｍ　ｇ　２　＋、Ｃａ　２　＋、Ｎａ”、
Ｋ１等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養
源を培地中に適宜添加することもできる。

かくして得られた培養物から目的物であるプロテアーゼ
耐性セルラーゼを採取するには、一般の酵素の分離及び
精製の手段に準じて行うことができる。更に、必要に応
じ、後記実施例に示すごとく、プロテアーゼ耐性である
ことを利用しプロテアーゼ処理を行うこともできる。

即ち、培養物を遠心分離、又は濾過等によって菌体を分
離し粗酵素液を得ることができる。この粗酵素液はその
まま使用することもできるが、必要に応じて、例えば、
塩析法、溶媒沈澱法（メタノール、エタノール、イソプ
ロパツール等）によってタンパク質を沈澱させたり、限
外濾過（例えば、旭化成社製、分画分子量１．３万）に
より濃縮後、凍結乾燥により、粗酵素粉末を得ることが
できる。塩析法では、例えば、硫安（６０〜１００％飽
和画分）で沈澱させた後、濾過或いは遠心分離、脱塩す
ることによってこれを凍結乾燥粉末にすることができる
。脱塩の方法としては透析又はセファデックスＧ−２５
（ファルマシア社製）等を用いるゲル濾過法等の一般的
方法が用いられる。

更に、必要に応じて、例えば、プロテアーゼ処理、イオ
ン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフ
ィー等を適宜組み合わせてプロテアーゼ耐性セルラーゼ
を分別精製することができる。

かくして得られた本発明のプロテアーゼ耐性セルラーゼ
は、以下に示す酵素学的性質を有する。

なお、酵素活性の測定は、以下の方法に従って行い、次
の緩衝液を用いた。

ｐＨ２〜３ニゲリシン−塩酸緩衝液 ｐＨ３〜６：クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６〜８ニリ
ン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ８〜１１ニゲリシン−水酸化す）ＩＪウムＭ衝液液
酵素活性測定法 ■　ＣＭＣ了−ゼ活性 １０■ｇＣＭＣ（Ａ［］ＩＭＣ，山陽国策バルブ社製）
、１００ｍＭ各緩衝液を含む基質溶液０．９−に０．１
−の酵素溶液を加え、４０℃、２０分反応した。反応後
、３．５−ジニトロ−サリチル酸＜３．５−ｃｌ＋ｎ＋
ｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＤＮＳ））法
にて還元糖の定量を行った。すなわち、反応後、１．ｏ
ｍｌにＤＮＳ試薬１．０−を加え、５分間、１００℃で
加熱発色させ、冷却後、４．０社の蒸留水を加えて希釈
した。

これを波長５３５ｎｍで比色定量した。酵素力価は、上
記の条件下で１分間に１μｍｏｂのグルコースに相当す
る還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

■　ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性０．１μ
ｍｏＩｌｐ−二トロフェニルセ口ビオシド（シグマ社製
）、１００ｍＭクエン酸す）　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ５
）を含む反応液１．０−中に適当量の酵素液を４０℃で
作用させた後、ＩＮ　Ｎａ２ＣＯ３を０．３ｍｌ、蒸留
水を１．７ｍｆ！順次加え、遊離するｐ−二トロフェノ
ールを４００ｎｍで比色定量した。酵素力価は、上記の
条件下で１分間に１μｍｏβのｐ−ニトロフェノールを
遊離させる酵素量を１単位とした。

■　アビセノベセルロース粉末、リン酸膨潤セルロース
及ヒ濾紙分解活性１５ｍｇアビセル（メルク社製）、１
００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を含む反
応液２．　Ｏｍｆ中に適当量の酵素液を加え、４０℃で
振とうしながら作用させた。反応後、冷却遠心分離（５
℃、　３０００ｒｐｍ、　２０分）を行い、（−（７）
上１１．０ｗｌ！を３．５−ジニトロサリチル酸法にて
還元糖の定量を行った。セルロース粉末分解活性はセル
ロース粉末（東洋濾紙社製）を、リン酸膨潤セルロース
分解活性はトミタらの方法（Ｔｏｍｉｔａ、　　Ｙ、　
ｅｔ　　ａｌ、；　　Ｊ、　　Ｆｅｒｍｅｎｔ、　　Ｔ
ｅｃｈｎｏｌ、；　　５２゜２３５、１９７４）により
処理したセルロースを、濾紙分解活性は濾紙（セルラー
ゼ活性度検定用濾紙、東洋Ｎα５１−特）を用いアビセ
ル分解活性の時と同様に行った。酵素力価は上記の条件
下で１分間に１μＩＴｌｏβのグルコースに相当する還
元糖を生成する酵素量を１単位とした。

■　セロビオーゼ活性 １０ｍｇセロビオース（東洋化学社製）、１００ｍＭク
エン酸す）　ＩＪウム緩衝液を含む反応液１．　Ｏｍｆ
中に適当量の酵素液を４０℃で作用させた後、１００℃
、１０分間処理して酵素を失活させた後、生成グルコー
スをムタロターゼ・ＧＯＤ法（Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｃ−Ｔ
ｅ５ｔ、和光純薬工業社製）で測定した。

酵素力価は上記の条件下で１分間に２μｍｏｌのグルコ
ースを生成する酵素量を１単位とした。

（酵素学的性質） （１）　　作用 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）によく作用し、
これを溶解せしめ、グルコース等の還元糖を生成する。

（２）基質特異性 カルボキシメチルセルロースの他、リン酸膨潤セルロー
ス、アミロースに対しても若干の活性を有する。アビセ
ル、セルロース粉末、濾紙等の結晶繊維及びｐ−ニトロ
フェニルセロビオシド、セロビオースに対する分解活性
は有していない。

（３）　　作用ｐＨ及び至適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は２〜１０と広範囲である。至適ｐｌ（は
５．０であり、３〜８の範囲に於いても至適ｐＨに於け
る活性の５０％以上の相対活性を有していたく第１図）
。

（４）ｐｆｌ安定性 種々のｐＨで３０℃、１時間保持した場合ｐＨ３〜１１
と極めて広範囲で安定である（第２図）。

（５〕　　作用温度及び至適温度 １００　ｍＭ、　ｐＨ９のグリシン−水酸化ナトリウム
緩衝液中で作用温度を測定した結果、作用温度は２０〜
８５℃の広範囲にわたり、その至適温度は７０℃であっ
た。また、４０〜８０ｔに於いても、至適温度での活性
の５０％以上の相対活性を有していた（第３図）。

（６）　　温度安定性 １００ｍＭ５ｐＨ９（７）グリシン−水酸化ナトリウム
緩衝液中で、１０分間各温度で処理した後、残存活性を
測定した結果、６０ｔでは安定してふり、８０℃でも５
０％以上の残存活性を有していたく第４図）。

（７）　　プロテアーゼ耐性 各プロテアーゼ〔例えば、サビナーゼ（ノボ社！！り　
、ペプシン（シグマ社ＦＭ）、パパイン（シグマ社！ｌ
り　〕に対する、本酵素の安定性を検討するた狛に各プ
ロテアーゼ［サビナーゼ０，２５％、ペプシン（サビナ
ーゼ活性相当量）、パパイン（サビナーゼ活性相当量）
（各プロテアーゼをｐＨ７で活性測定し酵素量を決定し
た）］と共に１００ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７）中、
４０℃で１〜２週間保存し、その残存活性を測定した。

その結果５０％以上の残存活性を有し、プロテアーゼに
対し極めて強い耐性を有していた。

第１表 （８）キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ及びＳＴ
ＰＰを活件測定時に共存させ、その影響を検討した結果
、はとんど活性を阻害しなかった。

（９）金属イオンの影響 各種金属イオン（Ａ　ｐ　３＋、Ｆｅ″＋　、　Ｂａ２
＋　、　Ｃａ２＋Ｃｏ　２”＋　Ｃｕ”　＋　Ｆ　ｅ”
　＋　Ｈｇ２”　＋　Ｍｇ２”　＋　Ｍｎ２”　＋　Ｎ
　ｔ　２”Ｓ　ｎ　２　＋、　２　ｎ　２　＋　、　Ｋ
　＋　、　Ｎａ　＋）を活性測定時に共存サセ、その影
響を検討した（に“、Ｎａ“についてはそれらの塩濃度
を５０ｍＭとし、他のイオンについては、１ｍＭとした
）。その結果、Ｃｕ２＋、　Ｓｎ２＋及びＨｇｆｆ＋に
より阻害された。

αＯ分子量 本酵素をＴＳＫ−Ｇ２０ＱＯ３Ｉ’ｌ　（東ソー社製）
によるゲル濾過法により分子量測定したところ、約４万
であった。また、ファストシステム（Ｐｈａｓｔｓｙｓ
ｔｅｍ　（ファルマシア社製））による、５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法では、約４．２万の分子
量を示した（第５図）。

（６）糖含量 本酵素をフェノール硫酸法により糖含量を測定したとこ
ろ、約９％（マンノース相当）の糖を含有していた。

（支）界面活性剤耐性 各界面活性剤〔例えば、直鎮アルキルベンゼンスルホン
酸（ＬＡＳ）　、アルキルスルホン酸ナトリウム（ＳＡ
Ｓ）、アルキル硫酸エステルナトリウム塩（ＡＳ）、ポ
リオキシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩（
ＥＳ））に対する安定性を検討するために、本酵素を界
面活性剤１０％水溶液と共に４０℃で保存し、１〜２週
間後の残存活性を測定した。その結果、何れの界面活性
剤と共存した場合も５０％以上の残存活性を有していた
（第２表）。

第２表 本：１ ０ｍＭグリ シン緩衝液 （ｐＨ９） 〔発明の効果〕 本発明のプロテアーゼ耐性セルラーゼは、長期にわたっ
てプロテアーゼが共存してもその酵素活性が低下しない
。更に、本発明のプロテアーゼ耐性セルラーゼは、界面
活性剤等の洗浄剤配合成分に対し極めて強い耐性を有し
ており、キレート剤によってもほとんど阻害を受けない
。

また、ｐＨ５に至適ｐｉ（を有しているが、ｐｉ（７，
０〜９．０のアルカリ側でも、活性の発現が見られる。

更に、広範囲で極めて安定である。したがって、本酵素
は、例えば、液体洗浄剤組成物等の配合成分として有利
に使用することができるものである。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 土壌からの分離菌及び微生物の保存機関より入手した菌
を液体培地（培地１）に接種し、３０℃、３日間振とう
培養した。培養後、遠心分離した上清液に、１％ＥＳ、
０．２％サビナーゼ（ノボ社製〉となるように添加し、
４０℃にて保存し、ｐＨ９におけるＣＭＣアーゼ活性の
残存活性を測定し、プロテアーゼ耐性セルラーゼ生産菌
をスクリーニングした。

上記の方法により、財団法人発酵研究所により入手シた
アスペルギルス　ニガー　ＩＦＤ−３１１２５（＾ｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ＩＦＤ−３１１２５＞
が、本発明のプロテアーゼ耐性セルラーゼを生産するこ
とを確認した。

培地１：ＣＭＣ１％ ポリペプトン　　　　　　　０．５％ 酵母エキス　　　　　　　　　Ｇ　０５％Ｋ）Ｉ２ＰＯ
，０，１％ Ｍｇ５Ｏａ・７）１，０　　　　　　　０．０２％実施
例２ 実施例１で得たアスペルギルス　ニガーｌＰＯ３１１２
５株を、ＣＭＣを３％ふすまに代え、ポリペプトンを０
，５％硝酸に代えた実施例１の液体培地１に接種し、３
０℃、３日間、通気量０，５シＶｍ、攪拌数２０　Ｏｒ
ｐｍで３０１発酵槽により培養した。

培養後、フィルタープレスにより、菌体及び不溶物を除
き、粗酵素液を得た。この粗酵素液１５ｆを限外濾過（
旭化成社製１分画分子量１．３万）により濃縮、脱塩を
行いＩＩｌの粗酵素液を得た。更に、凍結乾燥を行い、
乾燥粉末としてプロテアーゼ耐性酵素（比活性”５００
単位／ｇ）２．１ｇを得た。

本：酵素活性はｐＨ９に於ける測定値である。

実施例３ 実施例２で得られた粗酵素液を１０％ＥＳＩＡｔｌ／ｄ
サビナーゼと共存させ、４０℃、２週間後の残存活性を
測定した。その結果、５５％の活性を有していた。

実施例４ 実施例２により得られた乾燥粉体１ｇを１０ｍｆｆの５
０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ）９）に
溶解し以下の手順により精製を行った。

（１）　　酵素溶解液にサビナーゼを０．５Ａ［Ｉ／ｍ
ｌ！と成るよう添加し、４０℃で２４時間処理し、プロ
テアーゼ耐性セルラーゼ以外の夾雑タンパク質を分解す
る。

（２）　　プロテアーゼ処理液を限外濾過（アミコン社
製９分画分子量１万）により、ｐＨ６！ｌン酸緩衝液に
交換する。

（３）上記液をＴＳＫ−ＤεＡＥ３ＳＷカラム（東ソー
社製）（５０ｍＭ、ｐＨ６！Ｊン酸緩衝液で平衡化した
もの）に吸着させ、ＮａＣｆ濃度をＯ〜０．３Ｍまで直
線的に増加させて溶８した。

（４）　　（３）の９８〜１１０のフラクションを限外
濾過により濃縮、ｐＨ９グリシン緩衝液に交換した。

（５）　　（４）をＴＳＫ−ＤＢＡＢ５Ｐｌｉｌ　　（
東ソー社製）（５０ｍＭ。

ｐＨ９グリシン緩衝液で平衡化したもの）に吸着させ、
ＮａＣ１濃度を０〜０，５Ｍまで直線的に増加させて溶
出した。

（６）　　（５）の３０〜３６フラクシヨンをＴＳに−
Ｇ２０００３ＳＩＩｌ（東ソー社製）のゲル濾過クロマ
トグラフィーにより分子量分画を行い、分子量約４万の
位置にプロテアーゼ耐性セルラーゼを溶出した。

（７）　　（６）で得られた画分を、ファストシステム
（ファルマシア社製）を用いてポリアクリル了ミドゲル
電気泳動後、コマシー・ブＩＪ　ＩＪアント・ブルー染
色法及び銀染色を行い、単一ハンドであることを確認し
た。

実施例５ 実施例４で得られた酵素についてファストシステムを用
いて、ＳＤＳ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。その結果、プロテアーゼ耐性セルラーゼは、分子量
が約４２．０００であることが示された（第５図）。

参考例１ 市販のセルラーゼ（ＩＣＮバイオケミカルス社製、アス
ペルギルス　ニガー由来）を実施例３と同一条件で保存
試験したところ２週間後の残存活性は５％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プロテアーゼ耐性セルラーゼの酵素反応ｐＨ
と相対活性の関係を示す図面である。 第２図は、同酵素の処理ｐ）Ｉと相対活性の関係を示す
図面である。 、第３図は、同酵素の反応温度と相対活性の関係を示す
図面である。 第４図は、同酵素の処理温度と相対活性の関係を示す図
面である。 第５図は、同酵素のＳＤＳ・ポリアクリルアミドゲル電
気泳動の結果を示す図面である。 以上 呂願人花王株式会社 一−７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の物理化学的性質を有するプロテアーゼ耐性セル
   ラーゼ３１１２５ （１）作用 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）によく作用し、
   これを溶解せしめ還元糖を生成する。 （２）基質特異性 ＣＭＣの他、リン酸膨潤セルロース、アミロースに対し
   ても若干の活性を有する。 （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は３〜１０であり、至適ｐＨは５である。 （４）ｐＨ安定性 ３０℃で１時間保持した場合ｐＨ３〜１１の範囲でほと
   んど失活しない。 （５）作用温度及び至適温度 作用温度は２０〜８５℃の広範囲にわたり、その至適温
   度は７０℃である。 （６）温度安定性 ６０℃１０分間保持した後もほとんど失活しない。また
   、８０℃１０分間保持した後も５０％以上の残存活性を
   有する。 （７）プロテアーゼ耐性 プロテアーゼ１ＡＵ／ｍｌと共に４０℃で保存した場合
   、２週間後でも５０％以上の残存活性を有する。 ２、次の物理化学的性質を有する請求項１記載のプロテ
   アーゼ耐性セルラーゼ。 （８）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ及びＳＴＰＰは活性を阻害
   しない。 （９）金属イオンの影響 Ｃｕ＾２＾＋、Ｓｎ＾２＾＋及びＨｇ＾２＾＋により阻
   害される。 （１０）分子量 約４万（ゲル濾過法による） （１１）糖含量 フェノール硫酸法により、約９％である。 （１２）界面活性剤耐性 線状アルキルベンゼンスルホン酸（ＬＡＳ）、アルキル
   スルホン酸ナトリウム（ＳＡＳ）、アルキル硫酸エステ
   ルナトリウム塩（ＡＳ）又はポリオキシエチレンアルキ
   ル硫酸エステルナトリウム塩（ＥＳ）の１０％水溶液と
   共に４０℃で保存した場合、２週間後でも５０％以上の
   残存活性を有する。 ３、アスペルギルスニガーＩＦＯ−３１１２５の培養物
   より分離取得されるものである請求項１又は２記載のセ
   ルラーゼ。