JPH0418019A

JPH0418019A - シアリダーゼ阻害剤

Info

Publication number: JPH0418019A
Application number: JP11974290A
Authority: JP
Inventors: Akishiro Yamada; 陽城山田; Takayuki Nagai; 隆之永井; Takeshi Tomimori; 富森　毅
Original assignee: Tsumura and Co; Kitasato Institute
Current assignee: Tsumura and Co; Kitasato Institute
Priority date: 1990-05-11
Filing date: 1990-05-11
Publication date: 1992-01-22
Anticipated expiration: 2014-11-10
Also published as: JP2974370B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、シアリダーゼ阻害作用を有し、インフルエン
ザ等のウィルス疾患の治療に有用な抗ウィルス剤に関す
るものである。

［従来の技術および課題］インフルエンザ疾患は、インフルエンザウィルスによっ
て起こる呼吸器感染症であり、集約される特徴は、Ａ型
に代表されるウィルスの激しい抗原変異と世界を一つの
流行圏とする大流行である。

現在においても、臨床応用レベルで満足のいく抗インフ
ルエンザウィルス剤は皆無といってもよいのが現状であ
り、インフルエンザウィルスは、人類にとって依然とし
て大きな脅威として存在している状況は改善されていな
い。

最近、インフルエンザウィルスをはじめとするある種の
ウィルスが細胞に感染する過程において、ノアル酸が重
要な役割を演じていることが知られてきている。特に、
インフルエンザウィルスのエンベロープ上にあるシアル
酸加水分解酵素（シアリダーゼ）が、ウィルスの宿主細
胞への侵入あるいは宿主細胞からのウィルスの遊離過程
に密接に関与していることが示唆されてきている。

そこでシアリダーゼ阻害剤は次世代の抗インフルエンザ
ウィルス薬としての有望なターゲットであると考えられ
ており、その開発が求められていた。

１課題を解決する手段］本発明者は、抗ウィルス剤、特に抗インフルエンザウィ
ルス薬の開発をずへく鋭意検討を行っており、シアリダ
ーゼ阻害活性を有する物質の探索を行ってきた。そして
、今回下記式Ｉで表されるある種のフラボンにシアリダ
ーゼ阻害作用があることを見いだし、本発明を完成させ
た。すなわち、本発明は以下に示すごとくである。

下記式！ ■ （式中、Ｒは水素原子、水酸基またはメトキシル基を示
す。）で表される化合物（以下、式の化合物という。）を有効
成分とするンアリグーゼ明害剤。

式の化合物は例えば以下のようにして得ることができる
。

すなわち、式の化合物含有生薬である黄苓（Ｓｃｕｔｅ
ｌｌａｒｉａｅ　Ｒａｄｉｘ）、その原植物である５ｃ
ｕｔｅｌｌａｒｉａ　ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓまたは半
枝蓮（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ　Ｈｅｒｂａ）、その
原植物である５ｃｕｔｅｌｌａｒｉａ　ｒｉｖｕｌａｒ
ｉｓ、またはその他同属植物をメタノール、エタノール
等の低級アルコール、クロロホルム等の有機溶媒または
水で抽出し、溶媒を留去した後、残渣につきシリカゲル
カラムクロマトグラフィーを行うことにより式の化合物
を得ることができる。

また場合によっては、含水有機溶媒で抽出を行った後、
ベンゼン等の炭化水素類を用いて脱脂し、エーテルまた
は酢酸エチル等の溶媒を用いて振盪抽出し、酢酸鉛を加
えて、沈澱物を除去し、濾液をエーテル、酢酸エチル、
または水とエーテル、水と酢酸エチルの混合溶媒で分配
し、有機溶媒可溶部の溶媒を留去し、残渣につきシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーを行ってもよい（Ｒがメ
トキシル基または水素原子である化合物）。また、上記
の酢酸鉛を加えたときに生じた沈澱を脱鉛した後、エー
テル、酢酸エチル、または、水とエーテル、水と酢酸エ
チルの混合溶媒で分配し、有機溶媒可溶部の溶媒を留去
し、残渣につきシリカゲルカラムクロマトグラフィーを
行ってもよい（Ｒが水酸基である化合物）。

さらに必要に応じてメタノール等を用いて、再結晶する
ことにより精製してもよい。

また、式の化合物の中には市販（フナコシ薬品株式会社
）されているものもあり、これを購入しても差し支えな
い。

また、式の化合物は既知物質ではあるが、シアリダーゼ
阻害作用を有することは、従来全く知られていなかった
ことである。

次に式の化合物の製造の具体例を示す。

具体例！式の化合物のうち、Ｒが水酸基である化合物はイソスフ
テラレイン（ｉｓｏｓｃｕｔｅｌｌａｒｅｉｎ）と呼ば
れ、例えば、以下のようにして得ることができる。

コガネバナ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ　ｂａｉｃａｌｅ
ｎｓｉｓ）の葉１００ｇを少量の水に一夜浸漬した後、
クロ〔Ｊホルムで抽出した。この抽出液より溶媒を留去
し、残渣を熱５０％メタノールまたは５０％エタノール
２００ｄで抽出した。この抽出液に酢酸鉛の５０％メタ
ノールまたは５０％エタノール飽和溶液を沈澱が生じな
くなるまで加え、遠心分離した。

沈澱を１０％塩酸水溶液＋００ｉｔ（！に懸洞し、酢酸
エチル３０１１１で３回振盪抽出した。酢酸エチル層を
水洗し、溶媒を留去し、残渣０４９が得られた。

これを薄層クロマトグラフィーでモニター（展開溶媒；
クロロホルム・メタノール：水、酢酸＝１００＋２０　
：２二１１発色試薬、１０％硫酸）しながら、クロロホ
ルムを展開溶媒として、シリカゲルカラムクロマトグラ
フィーに付し、メタノールから再結晶することによりイ
ソスフテラレイン０．２９を得た。

具体例２式の化合物のうち、Ｒがメトキシル基である化合物は、
８−０−メチルイソスフテラレインと呼ばれ、例えば以
下のようにして得ることができる。

コガネバナ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ　ｂａｉｃａｌｅ
ｎｓｉｓ）の根１００９を５０％メタノール３００ｄで
３回温浸し、抽出液を約半量に濃縮した後、これをベン
ゼン２００−で２回振盪抽出し、可溶部を除いた。

水層をエーテル３００−で３回抽出し、溶媒を留去しエ
キスを得た。このエキスをメタノール＋００１ｄに溶解
し、酢酸鉛のメタノール飽和溶液をもはや沈澱が生じな
くなるまで加え、遠心分離した。濾液に水１００１ｄを
加え、約半量に濃縮した後、エーテル５０１ｄで３回振
盪抽出した。抽出液より溶媒を留去し、残渣を薄層クロ
マトグラフィーでモニター（展開溶媒：クロロポルム：
メタノール：水：酢酸＝１００：１０：Ｉ：０．５．発
色試薬：１０％硫酸）しながら、クロロホルムを展開溶
媒として、ンリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し
、メタノールから再結晶することにより８−０−メチル
イソスフテラレイン０．４９を得た。

具体例３式の化合物のうち、Ｒが水素原子で表される化合物はア
ビゲニンと呼ばれ、これはフナコシ薬品株式会社より購
入した。

次に式の化合物がシアリダーゼ阻害作用を有し、抗イン
フルエンザウィルス剤として有用であることについて、
実験例を挙げて説明する。

実験例１（シアリダーゼ阻害活性）酵素としてインフルエンザＨＡワクチン（北里研究所製
）Ｉ　０７Ｊ、基質としてｐ−ニトロフェニル−Ｎ−ア
セチル−ａ−Ｄ−ノイラミン酸（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅ
ｎｙｉＮ−ａｃｅｔｙｌ−ａ−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉ
ｃ　ａｃｉｄ、Ｐ　Ｎ　Ｐ　−Ｎ　ｅｕＡ　ｃ）２５ｎ
−および式の化合物を加えたクエン酸−リン酸緩衝液（
ｐＨ５，０）ｌ　１０ｕ１をマイクロプレート中に加え
、３７℃で１５分間反応後、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ９，８）を１９０ｄ加えて反応を停止し、遊離したＰ
ＮＰの吸光度を４０５　ｎ、で測定することにより求め
た。

その結果を第１表に示す。

第１表（ｎ、ｄ、は未測定。）上記の結果より、式の化合物のシアリダーゼ阻害活性が
確認された。

実験例２カルチャープレート中でＭＤＣＫ細胞またはＭＤＢＫ細
胞にインフルエンザＡ型ウィルスを３４℃で３０分間吸
着させた後、式の化合物をメタノールに溶解した液を含
むペーパーディスクを溶媒を除去した後、置くかまたは
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した液を加え
、５％二酸化炭素下、３４℃で３日間培養した。培養上
清につき、赤血球凝集反応によりウィルスの定量を行い
、さらにプレートを洗浄後、ギムザ染色を行い、生存細
胞の割合を観察した。

その結果を第２表に示す。

（ただし第２表中、Ａは１００〜９０％、Ｂは８０〜４
０％、Ｃは３０〜ｌＯ％の細胞生存率を表している。赤
血球凝集価は、凝集反応を起こす最高希釈倍数をＩ　ｕ
ｎｉｔとして表した。また、式の化合物未添加時の凝集
価は６４であった。ｎ、ｄ、は未測定。）上記の結果よ
り、式の化合物がｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、抗インフ
ルエンザウイルス活性を有することが確認された。

実験例３インフルエンザウィルスＡ／Ｐ　Ｒ／８　／３４と式の
化合物１００１／ｅｇｇをジメチルスルホキシドに溶解
した液を混合後、酢化鶏卵（１０日卵）のしよう尿膜腔
内に接種し、３４℃で２日間インキュベートした。しよ
う尿液を採取し、赤血球凝集反応およびシアリダーゼ活
性によりインフルエンザウィルスの定量を行った。

その結果を第３表に示す。

第３表（ただし、シアリダーゼ活性のＩ　ｕｎｉｔは、ＰＮＰ
−ＮｅｕＡｃを１分間に１μ−加水分解する酵素量であ
る。）上記の結果より、式の化合物が酢化鶏卵を用いた系（ｉ
ｎ　ｖｉｖｏ）において、抗インフルエンザウイルス活
性を有することが確認された。

以上の結果より、式の化合物はシアリダーゼ阻害作用を
有し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏにおいて
も抗インフルエンザウイルス活性が確認された。

式の化合物は、実験を行っている過程において、細胞毒
性等の副作用は認められず、その安全性も確認された。

従って式の化合物は、シアリダーゼ阻害作用を有し、そ
の安全性が高いことから、抗インフルエンザウィルス剤
等のシアリダーゼ阻害剤として有望である。

また、式の化合物はインフルエンザウィルスのシアリダ
ーゼ活性をド■害するが、マウスの肝臓に存在するシア
リダーゼに対しては、阻害活性を殆ど示さない。このよ
うにインフルエンザウィルスのみに特異的に作用する物
質の探索は、特異的な抗インフルエンザウィルス剤を開
発していく上で非常に重要なことである。それを簡単に
行うにあたって、本発明に開示したようにノアリダーゼ
阻害活性を指標にするということは、現在まで知られて
おらず、本発明者らによって初めて行われたものである
。

次に式の化合物の投与量および製剤化について説明する
。

式の化合物はそのまま、あるいは慣用の製剤担体と共に
動物および人に投与することができる。

投与形態としては、特に限定がなく、必要に応じ適宜選
択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、
散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられ
る。

経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年
令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で式の
化合物の重量として５０Ｒ９〜５ｇを、１日数回に分け
ての服用が適当と思われる。

経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、
カルボキンメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩
類等を用いて常法に従って製造される。

この種の製剤には、適宜前記賦形剤の他に、結合剤、崩
壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着
色剤、香料等を使用することができる。それぞれの具体
例は以下に示すごとくである。

［結合剤］デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、
ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カル
ボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピ
ルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポ
リビニルピロリドン、マクロゴール。

［崩壊剤］デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキンメ
チルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロー
スカルシウム、カルボキンメチルセルロース、低置換ヒ
ドロキソブ口ピルセルロース。

［界面活性剤］ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸
エステル、ポリソルベート　８０゜［滑沢剤］タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステ
ル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウ
ム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコー
ル。

［流動性促進剤コ軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケ
イ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム。

また、式の化合物は、懸濁液、エマルジョン剤、シロッ
プ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これ
らの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有してもよ
い。

非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の
年令、体重、疾叡の程度により異なるが、通常成人で式
の化合物の重量として１日０　、１　Ｎ９〜１９までの
静注、点滴静注、皮下注射、筋゛肉注射が適当と思われ
る。

この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一
般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射
用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロ
コシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌
剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口
剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常
の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾
燥物から液剤を再調製することもできる。さらに、必要
に応じて適宜、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等
を加えても良い。

その他の非経口剤としては、外用液剤、軟膏等の塗布剤
、直腸内投与のための半割等が挙げられ、常法に従って
製造される。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はこれによって同等制限されるものではない。

実施例１ ■コーンスターチ　　　　　　　４４９■結晶セルロー
ス　　　　　　４０ｇ ■カルボキンメチルセルロースカルシウム　　　５ｇ ■軽質無水ケイ酸　　　　　　０．５９■ステアリン酸
マグネシウム　０．５ｇ■具体例１で得た化合物　　　
１０４１計　　　　　　１００ｇ上記の処方に従って■〜■を均一に混合し、打錠機にて
圧縮成型して一部２００　ｍｇの錠剤を得た。

この錠剤−錠には、具体例１で得た化合物２０１９が含
有されており、成人１日１０〜２５錠を数回にわけて服
用する。

実施例２ ■結晶セルロース　　　　　８４．５ｆ！■ステアリン
酸マグネンウム　０．５９■カルボキノメチルセルロースカルシウム　　　　５ｇ ■具体例２で得た化合物　　　１０９計　　　　　　ｌ　００９上記の処方に従って■、■および■の一部を均一に混合
し、圧縮成型した後、粉砕し、■および■の残量を加え
て混合し、打錠機にて圧縮成型して一部２００１ｇの錠
剤を得た。

この錠剤−錠には、具体例２で得た化合物２０りが含有
されており、成人１日ｌＯ〜２５錠を数回にわけて服用
する。

実施例３ ■結晶セルロース　　　　　４９．５ｇ■Ｉθ％ヒドロ
キシプロピルセルロースエタノール溶液　３５９ ■カルボキシメチルセルロースカルシウム　　　５９ ■ステアリン酸マグネシウム　０．５９０具体例３で得
た化合物　　　１０ｇ計　　　　　１００９上記の処方に従って■、■および■を均一に混合し、常
法によりねっ和し、押し出し造粒機により造粒し、乾燥
・解砕した後、■および■を混合し、打鍵機にて圧縮成
型して一部２００〜の錠剤を得た。

この錠剤−錠には、具体例３で得た化合物２０句が含有
されており、成人１日１０〜２５錠を数回にわけて服用
する。

実施例４ ■コーンスターチ　　　　　３４．５９■ステアリン酸
マグネシウム　５０ｇ ■カルボキシメチルセルロースカルシウム　　　５ｆＩ ■軽質無水ケイ酸　　　　　　０．５ｇ■具体例１で得
た化合物　　　＋０９計　　　　　１００ｇ上記の処方に従って■〜■を均一に混合し、圧縮成型機
にて圧縮成型後、破砕機により粉砕し、篩別して顆粒剤
を得た。

この顆粒剤１ｇには、具体例１で得た化合物１００１１
９が含有されており、成人１日２〜５ｇを数回にわけて
服用する。

実施例５ ■結晶セルロース　　　　　　５５１Ｆ■１０％ヒドロ
キシプロピルセルロースエタノール溶液３５９ ■具体例２で得た化合物　　　ｔｏｇ計　　　　　　１００９上記の処方に従って■〜■を均一に混合し、ねつ和した
。押し出し造粒機に上り造粒後、乾燥し、篩別して顆粒
剤を得た。

この顆粒剤１９には、具体例２で得た化合物１０（１ｇ
が含有されており、成人１日２〜５ｇを数回にわけて服
用する。

実施例６ ■コーンスターチ　　　　　８９．５９■軽質無水ケイ
酸　　　　　　０．５ｇ■具体例３で得た化合物　　　
１０９計　　　　　　１００９上記の処方に従って■〜■を均一に混合し、２００■を
２号カプセルに充填した。

このカプセル剤１カプセルには、具体例３で得た化合物
２０肩９が含有されており、成人１日１０〜２５カプセ
ルを数回にわけて服用する。

実施例７ ■大豆油　　　　　　　　　　　５９ ■注射用蒸留水　　　　　８９．５９ ■大豆リン脂質　　　　　　　２．５９■グリセリン　
　　　　　　　　２９ ■具体例１で得た化合物　　　　Ｉｇ全１　　　　　　　１００ｇ上記の処方に従って■を■および■に溶解し、これに■
と■の溶液を加えて乳化し、注射剤を得た。

Claims

【特許請求の範囲】下記式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ I （式中、Ｒは水素原子、水酸基またはメトキシル基を示
す。）で表される化合物を有効成分とするシアリダーゼ阻害剤
。