JPH0338281B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な酸性ヘテロ多糖類に関するも
のである。また本発明は植物の組織培養法による
酸性ヘテロ多糖類の製造法に関するものである。 〔従来の技術〕 植物由来の多糖類は、増粘剤、ゲル化剤、気泡
安定剤、懸濁・乳化安定剤、被膜形成剤、粘着剤
及び生理活性剤等として広く使用されている。 斯かる多糖類は、従来一般に、天然又は栽培し
た植物の種子、果実、茎、幹、葉、根、塊茎、塊
根からの抽出又はタツピング等によつて製造され
ている。 しかしながら、天然資源からの生産は気候条件
等の影響を受け易く、生産量、価格等が一定しな
いという欠点があつた。従つて、近年、天然由来
物質を、植物組織培養法を用いて、カルスまたは
器官を培養することによつて人為的制御下に、気
候条件に影響されること無く生産しようとする試
みが数多くなされている。 植物組織培養法を応用した植物由来の多糖類の
生産に関する報告はほとんどないが、細胞壁の発
達のメカニズムを研究するなかで、液体培養され
たカルスが培地中に少量の多糖類を分泌すること
が知られている。例えば、Vinca roseaの場合に
は10日間培養で培地１あたり0.22ｇ、Clycine
maxの場合には８日間の培養で培地１あたり
0.49ｇ、Phaseolus vulgarisの場合には21日間の
培養で培地１あたり1.6ｇの多糖類が生産され
ることが報告されている。 〔発明が解決しようとする課題〕 しかしながら、従来の植物組織培養法には多糖
類の生産量が極めて低いという欠点があり、生産
性の高い組織培養法の開発が所望されていた。 〔課題を解決するための手段〕 斯かる実状において、本発明者は、鋭意研究を
行つた結果、植物資源としてポリアンテス属
（Polianthes L.）に属する植物を用い、これより
誘導されるカルスを植物ホルモン含有培地で培養
すれば多量の多糖類が生産されること、そしてこ
の多糖類の中に従来知られている多糖類とは異な
る新規な酸性ヘテロ多糖類が含まれていることを
見出し本発明を完成した。 すなわち、本発明は、ポリアンテス属に属する
植物から誘導されるカルスを植物ホルモン含有培
地で培養し、その培養物から多糖類を採取するこ
とを特徴とする多糖類の製造方法を提供すること
を目的とするものである。 また、本発明は、アラビノース、マンノース、
ガラクトース、グルクロン酸及びキシロースを構
成成分として含有し、それらの結合様式と構成比
が Aral→：3Aral→：Gal1→：→３ Man1 ２ ↑→ ：→４ GlcUA1 ３ ↑→：Xyl1→＝1.6〜2.4 ：1.2〜2.0：1.0〜1.8：1.4〜2.2：1.4〜2.2：0.1〜
0.3 であり、分子量が1.0×10⁴〜２×10⁷である酸性
ヘテロ多糖類の提供を目的とするものである。 本発明の多糖類の製造方法は、例えば次のよう
にして実施される。すなわち、ポリアンテス属に
属する植物を用い、該植物から誘導されるカルス
を植物ホルモン含有培地で培養しその培養物から
多糖類を採取することによつて実施される。 ポリアンテス属に属する植物としては、例えば
チユーベローズ（Polianthes tuberosa L.）が挙
げられる。これはその花、茎、葉、鱗茎、根等の
器官又は組織の一部が外植片として使用される
が、就中特に花の一部が好ましい。 カルス誘導用の基本培地としては、植物組織培
養に通常用いられるMurasige−Skoogの培地、
Linsmaier−Skoogの培地、Gamborgの培地、
Whiteの培地、Tuleekeの培地、Nitsch＆Nitsch
の培地などが用いられうる。 この基本培地には植物ホルモンを添加する必要
があり、植物ホルモンとしては、２，４−ジクロ
ロフエノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、α−ナフタレ
ン酢酸（NAA）、インドール酢酸（IAA）、イン
ドール酪酸（IBA）等のオーキシン類；フルフリ
ルアミノプリン（カイネチン）、ベンジルアデニ
ン（BA）、ジメチルアミノプリン（2iP）等のサ
イトカイニン類が挙げられる。その中でも、２，
４−Ｄ単独、もしくはNAAとBAの組合わせ、
またはNAAとカイネチンの組合わせが良好な結
果を与える。カルス誘導に必要な植物ホルモン濃
度は、２，４−Ｄ単独の場合は５×10^-4Mから１
×10^-7M、NAAとBAまたはNAAとカイネチン
の組合わせの場合は、NAAの濃度は５×10^-4M
から１×10^-7M、BAまたはカイネチンの濃度は
１×10^-4Mから１×10^-7Mである。 カルス誘導培地には上記の基本培地と植物ホル
モンのほかに炭素源として糖が加えられる。糖と
しては、グルコース、フラクトース、マンノー
ス、キシロース、サツカロース、ラムノース、フ
コース、デンプンなどが挙げられるが、通常はサ
ツカロースが用いられる。 カルス誘導は固体培地でも液体培地でも可能で
あるが、通常は固体培地が用いられる。 誘導されたカルスは上記のカルス誘導培地で同
じ形態を維持したまま10代以上にわたつて継代培
養をすることができる。継代培養用の培地として
は、通常基本培地としてLinsmaier−Skoogの培
地、Murasige−Skoogの培地、植物ホルモンと
して１×10^-4〜１×10^-7Mの２，４−Ｄまたは１
×10^-4〜１×10^-7MのNAAと１×10^-4〜１×
10^-7MのBA、炭素源としては、グルコース、フ
ラクトース、マンノース、キシロース、サツカロ
ース、ラムノース、フコース、デンプンなど用い
られるが、就中サツカロースが好ましく、その添
加量は１〜６％が好ましい。 カルスから多糖類を製造するには、カルスを寒
天培地等の固体培地、液体培地で培養するが、就
中液体培地で培養するのが好ましい。 基本培地としてはカルス誘導培地と同じもの、
例えばMurasige−Skoogの培地、Linsmaier−
Skoogの培地、Gamborgの培地、Whiteの培地、
Tuleckeの培地、Nitsch＆Nitschの培地などが用
いられうるが、就中Murasige−Skoogの培地、
Linsmier−Skoogの培地が好ましい。 植物ホルモンの種類及び濃度は多糖類の生産性
に関係があり、例えば２，４−Ｄ、NAA、
IAA、IBA等のオーキシン類；カイネチン、
BA、2iP等のサイトカイニン類；ジベレリンA₃
（GA₃）等のジベリン類等が使用される。この中
で、２，４−Ｄ、NAAを単独で、またはNAA
とBAもしくはカイネチンを組合わせて用いるの
が好ましい。その濃度は、２，４−Ｄ又はNAA
を単独で用いる場合は５×10^-4Mから１×
10^-7M、特に５×10^-5Mから５×10^-6Mが；
NAAとBAまたはNAAとカイネチンを組合わせ
て用いる場合には、NAAの濃度は１×10^-7Mか
ら１×10^-7M、特に１×10^-4Mから５×10^-6M、
BAまたはカイネチンの濃度は５×10^-5Mから１
×10^-9M、特に１×10^-5Mから１×10^-7Mが好ま
しい。 炭素源としては、グルコース、フラクトース、
マンノース、キシロース、サツカロース、ラムノ
ース、フコース、デンプンなど用いられる。多糖
類の生産は添加する炭素源の種類にはあまり強く
影響されるものではなく、通常サツカロースが用
いられる。炭素源の濃度と多種類の生産量との間
にもあまり深い関係はないが、一般には１〜６％
が好ましい。 培養法は特に制限されないが、通常、20〜30℃
の温度で15〜30日間行うのが好ましく、また振と
う培養が好ましい。 このようにして得られた培養物から多糖類を採
取するには、例えば培養物から細胞を遠沈又はろ
過等によつて除去したのち、培養液をロータリー
エバポレーター等を用いて濃縮し、濃縮液にエタ
ノールを加えて沈澱させ、沈澱物を凍結乾燥する
ことによつて行われる。 上記多糖類の精製は、通常の多糖類の精製法に
従つて精製することができる。例えば、粗精製の
上記多糖類を水に溶解し、遠心分離して不溶物を
完全に除去し、透析あるいはイオン交換樹脂を用
いる方法によつて高純度精製品を得ることもでき
る。 叙上の方法により得られる多糖類中には、新規
なヘテロ多糖類が含まれている。このものは、
2NのH₂SO₄を用い、100℃、８時間加水分解した
あと、酢酸エチル：ピリミジン：酢酸：水＝５：
５：１：３の混合比の展開溶媒を用いて薄層クロ
マトグラフイーを行ない、アニリン：ジフエニル
アミン：アセトン：燐酸試薬で呈色させるとアラ
ビノース、マンノース、ガラクトース、グルクロ
ン酸、キシロースが検出された。また、ガスクロ
マトグラフイーによる分析結果からも、アラビノ
ース、マンノース、ガラクトース、グルクロン
酸、キシロースが構成糖として含まれることが確
認された。そして、箱守法によるメチル化、加水
分解の後のガスクロマト分析（GC−MS法）に
よれば、その結合様式と構成比は、 Aral→：→3Aral→：Gal1→：→３ Man1 ２ ↑→ ：→４ GlcUA1 ２ ↑→：Xyl1→＝1.6〜2.4 ：1.2〜1.6：1.0〜1.4：1.4〜2.2：1.4〜2.2：0.1〜
0.3 であることが認められた。また、グルクロン酸の
カルボキシル基はその０〜50％がメチルエステル
体として存在する。更に、本発明の多糖類は陰イ
オン交換樹脂等に吸着するので酸性であると判断
された。更にまた、高速液体クロマトグラフイー
（東曹製TSK Gel4000PW、5000PW、6000PWの
カラムを用いる）によれば、その分子量は1.0×
10^-4〜2.0×10⁷であつた。 この酸性ヘテロ多糖類は、更に次の物理化学的
性質を有する。 溶媒に対する溶解性 水に可溶で、エタノール、エーテル、アセトン
に不要である。 呈色反応 アンスロン反応：陽性 カルバゾール反応：陽性 エルソン−モルガン反応：陰性 色および形状 エタノール沈澱を経たものは白色ないし灰白色
粉末である。 透析を経てイオン交換により精製し、凍結乾燥
を経たものは白色線状または繊維状である。 比施光度 〔α〕²⁵ _D：０〜＋20（ｃ＝1.0、水溶液） 赤外吸収スペクトル 赤外吸収スペクトルは第１図に示すとうりであ
る。 該磁気共鳴スペクトル ¹³C−核磁気共鳴スペクトルは第２図に示すと
うりである。（溶媒：D₂O、チユーブ５mm、内部
標準ジオキサン） また、本発明の酸性ヘテロ多糖類は、次の繰返
し構造を有する。 Ｒ：Ｌ−Ara1→、 Ｄ−Gal（１→３）Ara1→、 Ｄ−Gal1→、 Ｌ−Ara（１→３）−Ｌ−Ara1→、または Xyl1→ そしてＲの構成比は、：：：：＝
1.2〜1.6：0.8〜1.2：0.4〜0.8：0.4〜0.8：0.05〜
0.15である。 本発明の酸性ヘテロ多糖類が新規であること
は、他の多糖類との比較から明らかとなる。すな
わち、本発明の酸性ヘテロ多糖類に含まれるグル
クロノマンナン構造〔→２）−α−Ｄ−Man−
（１→４）−β−Ｄ−GlcUA−（１→〕を部分構造
として持つ公知多糖としては、Drosera
capensisから得られる多糖（CHANNEら
Carbohydr.Res.113巻、113〜124頁、 1983年）、Drosera binataから得られる多糖
（CHANNEらPhytochemistry.21巻、９号、2297
〜2300頁、1982年）、Nicotiana tabacumの培養
細胞から得られる多糖（MoriらCarbohydr.
Res.91巻、49〜58頁、1981年；AKIYAMAら
Agric.Biol.Chem.48巻、２号、403〜407頁、1984
年）などが知られている。しかしながら、
Drosera capensis、Drosera binateから得られ
る多糖類は、主な結合様式に−2Man1、−
4GlcUA1−があり、−3Ara1−がないという点で
あきらかに本発明の酸性ヘテロ多糖類と異なる。
Nicotiana tabacumの多糖については、
CHANNEらの報告では主な結合様式に−3Ara1
−がないとうこと、またAKIYAMAらの報告で
は主な結合様式に−4GlcUA1−、−2Man1−、−
5Ara1−があり、−3Ara1−がないという点で本
発明の酸性ヘテロ多糖類とはあきらかに異なる。
従つて本発明の酸性ヘテロ多糖類は、従来得られ
たものとは異なる新規な酸性ヘテロ多糖類である
といえる。 〔発明の効果〕 本発明により、従来植物から抽出またはタツピ
ングなどの方法で製造されていた植物由来の多糖
類を植物組織培養法により製造することができ
る。このことにより広い農場を必要とせず、また
天然資源の最大の弱点とされる気候の影響による
価格の変動を克服することができる。 また、本発明の新規な酸性ヘテロ多糖類は、増
粘剤、ゲル化剤、気泡安定剤、懸濁・乳化安定
剤、被膜形成剤、粘着剤及び生理活性剤として広
く利用することができる。 〔実施例〕 次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明す
る。 実施例 １ チユーベローズカルスと他の植物カルスの液体
培養における多糖類生産量の比較： (a) カルスの誘導： チユーベローズについては、開花２〜７日前
の蕾を取り、70％エタノール溶液で１分間滅菌
し、さらに１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で10
分間滅菌した後、滅菌水で洗浄した。滅菌処理
された外植片を適当な大きさにきり、カルス誘
導用培地に接種した。ニンニクについては、塊
茎を上記の方法で滅菌し、外皮を除いて適当な
大きさに切り、カルス誘導用培地に接種した。
タバコについてもチユーベローズと同様の方法
で滅菌し、カルス誘導用培地に接種した。ダイ
ズについては、種子を70％エタノール溶液で１
分間滅菌し、さらに１％次亜塩素酸ナトリウム
溶液で20分間滅菌したのち、滅菌水で洗浄し
た。滅菌された種子を無菌的に発芽させ、約10
日後胚軸長１cm程度となつた無菌幼植物から、
子葉、胚軸を切り取り、カルス誘導用培地に接
種した。 カルス誘導用培地には、基本培地として0.8
％の寒天を含むLinsmaier−Skoogの培地を用
いた。植物ホルモンとしてはオーキシンとして
10^-5M、NAAとサイトカイニンとして10^-6M
BAを添加した。炭素源としては３％サツカロ
ースを添加した。この培地を0.1N KOHでPH
5.7に調整したのち、オートクレープにより120
℃、12気圧で15分間滅菌した。培養は電照下25
±１℃で行われた。30〜60日間の培養の後それ
ぞれの外植片からはカルスが誘導された。 (b) カルスの継代： (a)において誘導されたそれぞれのカルスは、
誘導培地と同一の培地を用いて同一条件下で培
養され、30日おきに新しい培地に移植された。 (c) 振とう培養： (b)において10代以上継代培養されたカルスに
ついて、上記カルス培養培地と同様の成分から
なる液体培地を用いて振とう培養を行つた。培
地の量は、200ml容の三角フラスコ当り80mlと
した。カルスは新鮮重で２ｇを接種し、25±１
℃、120rpmで30日間振とう培養した。 (d) 多糖類の採取方法： (c)の培養液から遠心分離またはろ過により細
胞を除き、培養液をロータリーエバパレーター
を用いて濃縮した。この濃縮培養液に約３倍量
のエタノールを加え、５℃で24時間静置し沈澱
を得た。この沈澱を遠心分離により回収し、70
％エタノールで洗浄した後凍結乾燥により水分
を除去した。 上記の方法により４種のカルスから細胞外多
糖類が得られた。表−１に示すように、チユー
ベローズカルスは1.91ｇ／／３日と他のカル
スと比較して多糖類の生産量が高いことがわか
つた。

【表】 斯くして得られる多糖類のうち、チユーベロ
ーズより得たものは次のような物性を有してい
た。 外観：白色〜灰白色粉末 糖含量（フエノール硫酸法及びカルバゾール
法による）：80％（うちウロン酸含量25％） 構成糖：アラビノース：ガラクトース：マン
ノース：キシロース＝10：５：４：１ タンパク含量：２％ 水分含量：５％ 分子量：10000〜20000000 実施例 ２ 植物ホルモンの種類と多糖類の生産量：チユー
ベローズカルスについて植物ホルモンの種類を変
えて培養を行つた。実施例１の(a)、(b)に従つて培
養されたチユーベローズカルスを、植物ホルモン
として10^-5M NAA＋10^-6M BA、10^-5M2、４
−Ｄ、10^-5MNAA、10^-5M IAA、10^-5M IBA
をそれぞれ含むLinsmaier−Skoogの培地を基本
培地とする液体培地に移植し、実施例１の(c)と同
じ条件で培養した。培他量は100ml容の三角フラ
スコ当り30mlとした。多糖類の採取は実施例１の
(d)と同様の方法で行つた。 表−２に示すように、多糖類の生産量は２、４
−Ｄ、NAA、NAA＋BA、IBA、IAAの順に高
く、２、４−Ｄでは他に比較して3.60ｇ／／30
日と特に高かつた。

【表】 実施例 ３ ２、４−Ｄ、NAA＋BAの濃度と多糖類の生
産量： チユーベローズカルスについて植物ホルモンの
濃度を変えて培養を行つた。実施例１の(a)、(b)に
従つて培養されたチユーベローズカルスを、植物
ホルモンの濃度を２、４−Ｄでは５×10^-4Mから
１×10^-6M、NAAとBAとの組合わせでは１×
10^-4Mから１×10^-6MNAAと１×10^-5Mから１
×10^-7M BAとし、Linsmaier−Skoogの培地を
基本培地とする液体培地に移植した。培地量は実
施例１の(C)と同様にした。多糖類の採取は実施例
１の(d)に従つた。２、４−Ｄ濃度を５×10^-4Mか
ら１×10^-6Mとして培養を行つた場合、表−３に
示すように５×10^-5Mから５×10^-6Mで多糖類の
生産量が高く、特に１×10^-5Mで3.41ｇ／／30
日と特に高かつた。また、NAAとBAの組合わ
せでは、表−４に示すように１×10^-4M NAA＋
１×10^-5M BAで多糖類の生産量が高かつた。

【表】

【表】 実施例 ４ チユーベローズ多糖類から酸性ヘテロ多糖類の
分離： 実施例１の方法で得たチユーベローズ多糖類２
ｇを水400mlに溶かし、透析用セルロースチュー
ブ（ユニオンカーバイド社製）を使用して24時間
透析を行なつた。透析内液をそのままDEAEセフ
アデツクス（Sephadex）Ａ−25（CH₃COO^-型、
フアルマシア社製）カラム（カラムサイズ70×６
cmφ）にかけた。次いで水２でカラムを洗浄
し、その後0.5M酢酸緩衝液（pH6.0）２にて目
的物を溶出した。溶出画分を濃縮した後、上記の
透析セルロースチユーブにて透析を行なつた。さ
らに透析内液を濃縮後、凍結乾燥を行なうことに
より、前記の物理化学的性質を有する酸性ヘテロ
多糖類1.5ｇを得た。 尚、核磁気共鳴スペクトルの主要ピークは、
174.8、170.9、108.8、103.9、103.2、102.5、98.9、
85.5、84.9、84.4、82.7、81.7、79.5、78.9、77.6、
77.2、76.8、75.9、74.8、74.4、73.6、71.8、69.4、
66.5、64.9、64.4、62.5、61.7、60.8、54.4の各
ppmである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の酸性ヘテロ多糖類の赤外吸収
スペクトルを示す図面であり、第２図は ¹³C−核
磁気共鳴スペクトルを示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アラビノース、マンノース、ガラクトース、
   グルクロン酸及びキシロースを構成成分として含
   有し、それらの結合様式と構成比が Aral→：3Aral→：Gal1→：→３ Man1 ２ ↑→ ：→４ GlcUA1 ３ ↑→：Xyl1→＝1.6〜2.4 ：1.2〜2.0：1.0〜1.8：1.4〜2.2：1.4〜2.2：0.1〜
   0.3 であり、分子量が1.0×10⁴〜２×10⁷である酸性
   ヘテロ多糖類。 ２ ポリアンテス属（Polianthes L.）に属する
   植物から誘導されたカルスを植物ホルモン含有倍
   地で培養し、その培養物から採取したものである
   第１項記載の酸性ヘテロ多糖類。 ３ ポリアンテス属（Polianthes L.）に属する
   植物から誘導されたカルスを植物ホルモン含有倍
   地で培養し、その培養物から多糖類を採取するこ
   とを特徴とする多糖類の製造方法。 ４ ポリアンテス属に属する植物が、チユーベロ
   ーズ（Polianthes tuberosa L.）である第３項記
   載の多糖類の製造方法。 ５ 多糖類が、その構成糖としてアラビノース、
   ガラクトース、マンノース、キシロース及びウロ
   ン酸を含有するものである第３項記載の多糖類の
   製造方法。