JP3461528B2 - イネのカルボキシメチルセルラーゼ及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、イネの細胞から新規な
イネのカルボキシメチルセルラーゼ及びその製造法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】カルボキシメチルセルラーゼ( エンド-
β-1,4- グルカナーゼ) は、β-1,4-グルカンを分解し
てオリゴサッカライドを生成する酵素である。そしてこ
のカルボキシメチルセルラーゼは由来の植物の種類によ
りそれぞれ性質を異にするものである。植物組織からカ
ルボキシメチルセルラーゼを分離した具体的な例として
は、エンドウ豆からカルボキシメチルセルラーゼの製法
が報告されている。この方法は、バーミキュライト中、
暗所、室温で１週間成育したエンドウ豆に2,4-ジクロロ
フェノキシ酢酸の1000ppm をスプレーし、さらに同じ条
件で48時間育成し、得られるエンドウ豆の茎の伸長部域
からカルボキシメチルセルラーゼを採取するものである
(Hayashi, Maclachlan, Plant Physiol. 34, 739-742,
(1984))。しかし、イネの組織からのイネのカルボキシ
メチルセルラーゼの製法については、全く報告がない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】イネ組織培養におい
て、植物ホルモンによる成長制御技術をを安定化するた
めにこの植物ホルモンに代わる特異性の高いオリゴサッ
カライドの生産が望まれている。そして、このホルモン
活性を持つオリゴサッカライドは、イネ植物の細胞壁に
含まれる糖質を分解することにより得られる。そして、
この細胞壁に最も多く含まれるβ-1,4- グルカンの分解
のためには、イネ植物体に固有のカルボキシメチルセル
ラーゼの生産が緊急の課題となっている。そこで、本発
明者らは、この課題の解決を目的として鋭意研究を行い
本発明を完成した。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、次の理化学的
性質を有するイネのカルボキシメチルセルラーゼであ
る。 （１）基質特異性 β-1,4- グルカン鎖をエンドタイプに分解する。カルボ
キシメチルセルロース、β-1,3-1,4- グルカン、β-D-
グルカン等を分解する。 （２）分子量 セファクリルＳ-200によるゲル濾過で測定して、24キロ
ダルトンである。 （３）至適ｐＨ 至適ｐＨは、カルボキシメチルセルロースを基質とし、
３０℃で１５〜３０分間作用させて、5.5 〜6.0 であ
る。 （４）安定ｐＨ リン酸ナトリウム（10 mM 、1 mM DDT) に１週間放置し
て、6.0 〜7.0 である。 （５）至適温度 カルボキシメチルセルロースを基質とし、ｐＨ5.5 のも
とで１５〜３０分間作用させて、30〜35℃である。

【０００５】更に、本発明は、イネの組織をオーキシン
を含む培地で培養し、得られる組織切片から上記理化学
的性質を有するイネのカルボキシメチルセルラーゼを採
取することによりイネのカルボキシメチルセルラーゼを
製造する方法である。このオーキシンとしては 2,4- ジ
クロロフェノキシ酢酸、α−ナフタレン酢酸、３−イン
ドール酪酸、３、６−ジクロロアニス酸、３−インドー
ル酢酸等が用いられる。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
イネのカルボキシメチルセルラーゼは、イネの組織をオ
ーキシンを含む培地で培養し、得られる組織切片をリン
酸ナトリウム緩衝液中で磨砕し、この磨砕物よりイネの
カルボキシメチルセルラーゼを精製し、分離することに
より製造する。

【０００７】本発明で用いられるイネとしては、いずれ
の品種でも良く、特に限定されないが、例えば栽培品種
ササニシキが用いられる。また、イネの組織としては幼
根、幼葉、葉鞘等が挙げられる。上記イネの組織切片、
例えば幼根切片を培養する培地としては、オーキシンを
含むカルボキシメチル−セルラーゼ誘導培地が用いられ
る。この培地において、炭素源としては、ショ糖、グル
コース等が用いられる。無機塩及びビタミン源として
は、アミノ酸培地（Toriyama Hinata, 1985 )（表
１）、ＭＳ培地（Murashige Skoog, 1962 )（表２）、
Ｎ６培地（Chu et al. 1975)（表３）、又は、Ｂ５培地
（Gamborg et al. 1976)（表４）等が用いられる。

【０００８】培養は、ｐＨ5.0 〜6.0 、好ましくは5.8
、温度２０〜３０℃、好ましくは２８℃、暗所下で１
〜３日間行う。

【０００９】

【表１】

【００１０】

【表２】

【００１１】

【表３】

【００１２】

【表４】

【００１３】培養終了後、幼根切片からの本酵素の採取
は、本酵素が幼根部内に存在するものであるから幼根部
の切片をリン酸ナトリウム緩衝液中でガラス、乳鉢等の
磨砕手段で磨砕し、遠心分離して上清を得、この上清か
ら通常の酵素の精製手段をも用いて行われる。酵素の精
製手段としては、例えば、硫安分割法、セファデックス
もしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換
体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用
いる電気泳動法、ハイドロオキシアパタイトを用いる吸
着溶出法、庶糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニテ
ィクロルト法等が挙げられ、これらを適宜選択し、組合
わせて実施して行われる。

【００１４】このようにして得られる本発明の新規なイ
ネのカルボキシメチルセルラーゼの理化学的性質を次に
示す。 （１）基質特異性 β-1,4- グルカン鎖をエンドタイプに分解する。カルボ
キシメチルセルロース、β-1,3-1,4- グルカン、β-D-
グルカン等を分解する。 （２）分子量 セファクリルＳ-200によるゲル濾過で測定して、24キロ
ダルトンである。 （３）至適ｐＨ 至適ｐＨは、カルボキシメチルセルロースを基質とし、
３０℃で１５〜３０分間作用させて、5.5 〜6.0 であ
る。 （４）安定ｐＨ リン酸ナトリウム（10 mM 、1 mM DDT) に１週間放置し
て、6.0 〜7.0 である。 （５）至適温度 カルボキシメチルセルロースを基質とし、ｐＨ5.5 のも
とで１５〜３０分間作用させて、30〜35℃である。 （７）精製方法 本酵素は、別項で記載した精製方法により精製すること
ができる。 （８）酵素の力価の測定法 カルボキシメチルセルラーゼ１単位は、30℃、pH 5.5、
2 時間の反応条件で 0.8％のカルボキシメチルセルロー
ス溶液の粘度の相対低下量１％を引き起こす酵素量であ
る。

【００１５】本発明のイネのカルボキシメチルセルラー
ゼは、イネ組織培養に関連したカルボキシメチルセルラ
ーゼであり、イネ組織培養に係わるオリゴサッカライド
の製造のため有用であり、また、イネの細胞壁の軟化を
起こさせてイネプロトプラストを分離するためのプロト
プラスト化剤として有用である。以下、本発明を実施例
により具体的に説明する。ただし、これら実施例により
本発明は限定されない。

【００１６】

【実施例】イネ栽培品種ササニシキの種子25ｇを70％エ
タノールで30秒間、次に有効塩素濃度１〜２％の次亜塩
素酸水溶液で15分間それぞれ消毒する。消毒の後、クリ
ーンベンチ内で種子を滅菌水で充分濯ぐ。この滅菌した
種子を0.4 〜0.8 ％寒天培地にシャーレ（高さ２cm、直
径９cm)１枚当たり20粒を植える。このシャーレを28
℃、暗所下に置いて４日間培養する。

【００１７】４日間培養した後、４〜７cmに伸長した根
を寒天培地から引き抜き、濾紙上で図２に示すように、
根端１mmを除く２〜3.5 cmの根切片を作る。これを次の
組成を有するカルボキシメチル−セルラーゼ誘導培地を
オートクレーブで120℃、15分間又は0.2μm のアセテー
トフイルターで濾過滅菌したものの各20ccづつを分注し
た滅菌シャーレ( 高さ２cm、直径９cm)へ植え、このシ
ャーレをパラフィンフイルムで密閉する。（図２参
照）。

【００１８】

【表５】

【００１９】この植え付けた根の切片を 28℃で暗所下
に 80rpmで振とう培養した。１〜２日後に培養した幼根
の切片を分離してこの切片中のカルボキシメチルセルラ
ーゼを測定した。その結果、この幼根の切片１ｇ中に15
000単位のカルボキシメチルセルラーゼが含まれてい
た。この幼根の切片を生重量100gに対して３倍容量のホ
モジェネート用リン酸ナトリウム緩衝液（10mM、pH7.
0,、１mM DTT、０度）を氷上でガラス乳鉢上で磨り潰
す。磨り潰した後遠心分離(18000 G 、４℃で15分間)
し、上清を回収する。得られる沈澱物を前記緩衝液に懸
濁し、同じ条件で遠心分離し、操作を２回繰り返す。上
清ををまとめて300cc とする。この上清に硫安を70％飽
和の条件で加え、氷水中で18時間硫安沈澱を行う。沈澱
物を遠心分離(10000 G、４℃、15分間)して回収し、50c
cのホモジェネート用緩衝液に再溶解する。再溶解物を
遠心分離(10000 G、４℃、15分間) し、上清を集める。
上清を約10倍量のホモジェネート用緩衝液で４℃でセフ
ァデックスＧ−25により脱塩する。脱塩物をQAE-陰イオ
ン交換カラムにかける。0.0 〜0.5MのNaClの濃度勾配で
吸着物をカラムから溶出する。0.06Ｍで溶出された画分
を集めて、これを限外濾過して濃縮する。この画分を続
いてSephacryl 200ゲル濾過カラムにかけ、分子量 25,0
00 の画分を回収する。この画分には、イネのカルボキ
シメチルセルラーゼが18000 ユニット含まれていた。

【００２０】

【発明の効果】本発明により新規なイネのカルボキシメ
チルセルラーゼの製法を提供する。この方法によりイネ
の組織に含まれるイネのカルボキシメチルセルラーゼの
量が５〜10倍に増加させることができた。この酵素は、
イネ組織培養に係わるオリゴサッカライドの製造のため
有用であり、また、イネの細胞壁の軟化を起こさせてイ
ネプロトプラストを分離するためのプロトプラスト化剤
として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】幼根切片の調整を示す図。

【図２】幼根切片の培養法を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/14 - 9/46 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の理化学的性質を有するイネのカルボ
   キシメチルセルラーゼ。 （１）基質特異性 β-1,4- グルカン鎖をエンドタイプに分解する。カルボ
   キシメチルセルロース、β-1,3-1,4- グルカン、β-D-
   グルカン等を分解する。 （２）分子量 セファクリルＳ-200によるゲル濾過で測定して、24キロ
   ダルトンである。 （３）至適ｐＨ 至適ｐＨは、カルボキシメチルセルロースを基質とし、
   ３０℃で１５〜３０分間作用させて、5.5 〜6.0 であ
   る。 （４）安定ｐＨ リン酸ナトリウム（10 mM 、1 mM DDT) に１週間放置し
   て、6.0 〜7.0 である。 （５）至適温度 カルボキシメチルセルロースを基質とし、ｐＨ5.5 のも
   とで１５〜３０分間作用させて、30〜35℃である。
2. 【請求項２】 イネの組織をオーキシンを含む培地で培
   養し、得られる組織切片からイネのカルボキシメチルセ
   ルラーゼを採取することを特徴とする請求項１記載のイ
   ネのカルボキシメチルセルラーゼの製造法。
3. 【請求項３】 オーキシンが 2,4- ジクロロフェノキシ
   酢酸、α−ナフタレン酢酸、３−インドール酪酸、３、
   ６−ジクロロアニス酸、３−インドール酢酸である請求
   項２記載のイネのカルボキシメチルセルラーゼの製造
   法。