JPH0334991A - 環状テトラペプチドおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、新規な環状テトラペプチドおよびその製造法
に関する。

［従来の技術］ 本発明による環状テトラペプチドは文献などに記載のな
い新規化合物である。

す・ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス、３６
巻、　４７８〜４８３頁、１９８３年（Ｊ、Ａｎｔｉｂ
。

３８、　４７８〜４８３　（１９１１１３））には、類
似構造をもつ化合物かリストされている。しかし、これ
らの化合物は、構成アミノ酸について本発明の化合物と
区別されるものである。また、これらのものについて細
胞の形質転換阻害が報告された例はない。

作用として、細胞の形態を正常化するものは以下のよう
な報告がある。

ゲニステイン（小河原宏他、す・ジャーナル・オブ・ア
ンチバイオティックス（Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、３９巻、　６０Ｂ　−６０
８頁、１９８６年）、エルブスクチン（梅沢浜夫他、す
・ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス（Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、３９巻、　１．７０〜１７
３頁、１９８６年）、オキサノシン（イト−・ニスら（
Ｉｔｏｈ、Ｓ、ｅｔａｌ）　、キャンサー・リサーチ（
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４９　（４，）、　９９６〜
１０００頁、１９８９年）［発明か解決しようとする課
題］ 近年、癌遺伝子産物の働らきを阻害することで、癌細胞
を可逆的に正常の表現形質に転換する物質およびその製
造法の開発が望まれている。

そこで、本発明者らは前記実情に鑑み鋭意研究を重ねた
結果、カビの一種へリコーマ・アンビエンス（ｌｌｅｌ
ｉｃｏｍａ　ａｌｌｂｉｅｎｓ）の微生物株の培養物中
より採取される環状テトラペプチドが癌遺伝子による細
胞の形質転換を阻害し、正常細胞に復帰させる活性およ
び同細胞に対する細胞増殖阻害活性からなる抗腫瘍活性
を有するすぐれた薬理学的特性を有するものであること
を見出し本発明を完成するに至った。

［課題を解決するための手段］ すなわち本発明は、式（Ｉ）： ［以下余白］ ６　Ｈｓ Ｃ）１２ （Ｃ１（２）５ Ｃ０ （式中、ｎは４または３を表わす）で示されるＲＦ−１
０２３−Ａ　（ｎ−４）またはＲＦ−王０２３−Ｂ　（
ｎ−３）である環状テトラペプチド、ヘリコーマ属に属
する式（１） ％式％） （式中、ｎは前記と同じ）で示されるＲＦ−１０２３−
Ａ　（ｎ−４）またはＲＦ−１０２３−Ｂ　（ｎ−３）
である環状テトラペプチド産生菌を培地に培養し、産生
された弐（１１ ｅＨｓ １ １１２ （ＣＨ２）５ ０ （式中、ｎは前記と同じ）で示されるＲＦ−ＩＯ２３Ａ
　（ｎ−４）またはＲＰ−１０２３−Ｂ　（ｎ−３）で
ある環状テトラベプチトを採取することを特徴とする式
（１）％式％ （式中、ｎは前記と同じ）で示されるｌ？Ｐ−１０２３
−Ａ　（ｎ−４）またはＲＰ−１０２３−Ｂ　（ｎ−３
）である環状テＩ・ラペプチドの製造法に関する。

［実施例］ 本発明の方法に用いる式（１）で示される環状テトラペ
プチド産生菌としては、ヘリコーマ属に属するすべての
菌があげられるが、その中での代表的なものとしてヘリ
コーマ・アンビエンス（Ｉｌｅｌｉｃｏｍａ　ａｍｂｉ
ｅｎｓ）ＲＰ−１０２３Ｕ株があげられる。

この菌株はＶ８ジュース寒天培地上でのコロニーの生育
は遅く、分生子柄は単純で、はとんど分枝しない。胞子
が着生しない下部は直状で、胞子が着生ずる」二部はし
ばしば屈曲しており、その長さは０５〜２７０ｓｌ、幅
は３−４．５ｇである。

また、その色は下部では茶色、上部では中程度の茶色、
先端部では薄茶色であり、先になる程薄くなる。分生胞
子は最も幅の広い部分で５５〜９０珊で、隔壁により７
〜９に区分されている。最も基部の細胞はＵ字型をして
おり、不明瞭な痕跡か残っていて、その色は薄オリーブ
色からオリーブ色である。分生子はコイル状となり、そ
のコイルの直径は１４〜２２珊である。本菌株ではホー
マー状態（Ｐｈｏｍａ　５ｔａｔｅ）は観察されない。

以上の諸性状から、ＲＦ−１０２３菌株はマイコロジカ
ル・ペーパーズ１２９巻、２９〜３０頁、１９７２年（
Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐａｐｅｒｓ　１２９．２９
〜３０（１９７２））に記載されているヘリコーマ・ア
ンビエンスと同定された。なお、本菌株は工業技術院微
生物工業技術研究所に受託番号微工研菌寄第１０６８０
号（以下、ＦＥＰＮ　Ｐ−１０６８０という）として寄
託されている。

なお、前記産生菌の菌学的性質は変異しやすく、人工変
異株はもちろん、自然変異株も含めて、ヘリコーマ属に
属する菌株のうち式＋１＋で示される環状テトラペプチ
ド産生菌は、すべて本発明に使用することができる。

弐（１）で示される環状テトラペプチドの製造にあたっ
ては、まずヘリコーマ属に属する式（Ｉ）で示される環
状テトラペプチド産生菌を環状テトラペプチドを誘導す
る栄養培地に接種して、好気的に培養を行ない、目的と
する式ｍで示される環状テトラペプチドをうる。

培養法としては、たとえば以下に記す方法があげられる
。

ます、環状テトラペプチド産生菌を培地に接種し、培養
する。

この培養に用いる栄養培地としてはポリペプトン（日本
製薬■製）、牛肉エキス（デイフコ（Ｄｊｆｃｏ）社製
）、酵母エキス（デイフコ社製）、麦芽エキス（デイフ
コ社製）、バクトペプトン（デイフコ社製）などの有機
窒素源、グルコース、可溶性デンプン、ポテトスターチ
などの炭素源、Ｎ　ａ、ＣＩなどの無機塩などを添加し
た培地が通常用いられ、培養方法としては振盪培養が好
ましい。

この振盪培養において振盪回数は毎分１２０回転が好ま
しい。

培養温度は２５〜３０℃が好ましく、とくに２７〜２８
℃が好ましい。培養時間は４８〜９６時間が好ましく、
とくに７２時間が好ましい。

ついで、前記培養によりえられた培養液を新たな培地に
接秤して、培養する。

培地組成、培地条件などは抗生物質の生産に一般に用い
られているものを用いるとよい。培地は原則として、炭
素源、窒素源、無機塩などを含む。必要に応じて、ビタ
ミン類、先駆物質などを加えてもよい。炭素源としては
、例えば、ポテト、ポテトスターチ、シュクロース、可
溶性デンプン、グルコース、澱粉、デキストリン、グリ
セリン、糖蜜、有機酸などが単独でまたは混合物として
用いられる。窒素源としては、たとえば、大豆粉、コー
ンスチープリカー、肉エキス、酵母エキス（デイフコ社
製）、綿実粉、ペプトン、ポリペプトン（日本製薬■製
）、小麦胚芽、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
麦芽エキス（デイフコ社製）などが単独または、混合物
として用いられる。無機塩としては、たとえば、炭酸カ
ルシウム、塩化すトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネ
シウム、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバル
ト、各種リン酸塩などかあげられ、必要に応じて培地に
添加する。

培養は一般に抗生物質の製逍に用いられる方法に準じて
行なえばよく、好ましくは成体培養が、大量生産を行な
うばあいは、深部通気培養がよい。培地のｐＨが変動し
うるばあいには、培２ 地に炭酸カルシウムなどの緩衝剤を加えてもよい。培養
中に激しい発泡が起こるばあいには、培責前または培養
中にたとえば、埴物浦、ラド、ポリプロピレングリコー
ルなどの泪泡剤を適宜添加するとよい。培養方法として
は振盪培養が好ましい。

この振盪培養において、振盪回数は毎分１２０〜１８０
回転が好ましく、とくに１８０回転（７ｃｍストローク
）が奸ましい。招養温度は２５〜３０℃が好ましく、と
くに２７〜２８°Ｃが奸ましい。培養時間はＬＯ〜１４
日間が好ましく、とくに１２〜１４日間が好ましい。

式ｍで示される環状テトラペプチドは、たとえば以下に
記す方法によって採取することができる。

えられた培養液を通常の方法で濾過し、菌体と濾液に分
離する。えられた菌体を、メタノル、アセトン、エタノ
ールなどの有機溶媒で抽出し、次にこの抽出液を濃縮し
、Ｉ’ｌ＋を１．０〜５．０に調整した後、酢酸エチル
、ブタノール、塩化メチレンなどの有機溶媒で抽出し、
以後も通常の精製操作を経て粗抽出物（１）をつる。

一方、前記濾液は、ｐＨを１．０〜５．０に調整した後
、酢酸エチル、ブタノール、塩化メチレンなどの有機溶
媒で抽出し、以後も通常の精製操作を経て、粗抽出物（
２）をうる。

前記粗抽出物（１）および（２）を混合し、この混合試
料を調整用薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣとい
う）で単離、精製し、さらに再結晶を行い目的物である
式（１）で示される環状テトラペプチドをうることかで
きる。

前記ＴＬＣにおいて、ＴＬＣ用プレートとしてはメルク
プリコーテッドＴＬＣプレートシリカゲル００　Ｆ２５
４など、展開溶剤としてはトルエン：酢酸エチルエステ
ル（１：１）の混合溶媒などが好ましい。

なお、検出手段としては、けい光色素を混入したプレー
トを用いれば、展開後紫外線下で直接、非破壊的に検出
できる。

ＴＬＣ用プレート」二に近接した２個のバンドをうる（
以下、バンドＩおよびバンド■という）。

えられたハントＩから式（１）（ｒ＋−４）で示される
ＲＦ−１０２３−Ａをさらにバント■からＲ１”−１０
２３−ＡとＲＰ　−１０２３−１１（ｎ　−３）の混合
物をうる。バンド■からのＲＦ−１０２３−Ｂの分離は
ＴＬＣにより行なう。

ＴＬＣ用プレートとしては前述のメルクプリコテッドＴ
Ｉ、Ｃプレートなど、展開溶剤としては塩化メチレン、
メタノール（９：１．）の読合溶媒などが好ましい。ま
た検出手段としては、けい光色素をａ人したプレートを
用いれば、展開後紫外線下で直接、非破地的に検出でき
る。また式（１）（ｎ−３）で示されるＲＦ−１，０２
３−１３は前記ＴＬＣによりえられる。えられたＩ？Ｆ
〜１０２３−ＡおよびＩ？　Ｆｌ、０２１Ｂを通常の方
法にしたがって再結晶などしてさらに精製を行なっても
よい。

本発明の式（１）で示される環状テトラペプチドを有効
成分とする抗癌剤の製剤としては、経口または非経口的
投与による製剤のいずれをも選ぶことができる。具体的
製剤としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、シロップ剤
などの経口用５ 剤、生薬、軟膏剤、注射剤などの非経口用剤をあげるこ
とができる。本発明による抗癌剤の製剤の担体としては
、経口、その他罪経口的に投与するために適した有機ま
たは無機の固体または液体の、通常は不活性な薬学的担
体材料か用いられる。具体的には、たとえば経口用担体
としては、デンプン、マンニット、結晶セルロス、水、
エタノール、非経口用担体としては、水、生理食塩水、
グルコース溶液などがある。

製剤中の担体に対する本発明の抗癌剤の割合は１〜９９
％の間で変化させることができる。また、本発明による
抗癌剤は、これと両立性の他の抗癌剤その他の医薬を含
むことができる。このばあい、本発明による抗癌剤が、
その製剤中の主成分でなくてもよいことはいうまでもな
い。

以下に製造例および実施例をあげて本発明の化合物およ
び製造法をさらに詳しく説明するが本発明はかかる実施
例のみに限定されるものではない。

実施例１ ６ ５００　ｍｌ容の坂ロフラスコ３本にポリペプトン１０
％（重量％、以下同様）、グルコース２．０％、牛肉エ
キス　０．３％、酵母エキス０．２％、ＮａＣｐｏ、１
％および水道水（ｐＨ７，０、滅菌前）よりなる培地１
００ｍ１を調整した。ボテｌ−２００ｇ、グルコース１
０ｇ５基大１５ｇ／Ｉ、の組成の培地で２５〜２８℃で
１０〜１４０間斜面培養したヘリコーマ・アンビエンス
ＲＰ−１，０２３菌株（ＰＥｌ？Ｍ　Ｐ−ＬＯ［１８０
）の種培養スラントより１エーゼを前記培地に接種し、
温度２８℃、振盪器（掬いわしや生物科学製）を用い毎
分　１．２０同転（７０ｍストローク）で７２時間、振
盪培養を行なった。

ついで、えられたＦ？ｉ義液Ａ　ｍｌずつをポテトスタ
ーチ２．０％、シュークロース　２．０％、酵母エキス
０，５％、ｐＨ７，０よりなる培地８０ｍ１を含む５０
０ｍ１容広ロマイヤ一フラスコ２４本に植菌し、温度２
８°Ｃ１振盪器（■いわしや生物科学製）を用い、毎分
１８０８０同転１２日間、振盪培養を行なった。

えられた培異液２ρをハイフロス−パーセルを用いて濾
過し、菌体と濾ｌ（ｋに分離した。

２ρ容のコルベンにえられた菌体を入れ、ついでメタノ
ール５００　ｍｌを加えマグネティクスタークー上で１
０分間ホモジナイズした。つぎにこの溶液を濾別した。

３０〜４０°Ｃの水浴上ロータリーエバポレーターで濃
縮後、２Ｎ塩酸戚を添加し、ｐｌ＋を２０に調整した。

この溶液を酢酸エチル１００　ｍｌで２回抽出し、つい
で水で洗浄し、Ｎａ２８０４で乾燥して粗抽出物（１）
　２４０■をえた。

一方、培養戒の濾過によりえられた濾波（ｐＨＧ、７）
を４９容の容器に入れ、２Ｎ塩酸液を添加し、Ｉ’ｌｌ
を２．０に調整した。この溶液を酢酸エチル［ｉ　００
　ｍｌで２回抽出し、ついで２０％ＮａＣＪ水溶液で洗
浄し、Ｎａ２　ＳＯ４で乾燥して、粗抽出物（２）３１
７＋ｎｇをえた。

えられた粗抽出物（１）および（２）（合計５５７ｍｇ
）を酢酸エチルに溶解し、この溶液をＴＬＣ（ＴＩ、Ｃ
用プレー１：　２０　Ｘ　２０ｃｍメルクプリコーテッ
ドＴ１、Ｃプレートシリカゲル６０　Ｆ２５４　　（メ
ルク社製）、展開剤　トルエン−酢酸エチル（１／１　
：　ｖ／ｖ）、検出方法：展開後紫外縁下で的接険出）
で分肉１［シ、ＴＬＣ用プレート上に近接した２個のバ
ンドをえた（以下、バンドＩおよびバンド■という）。

えられたバンドＩからＲＦ−１０２３−Ａを１９０■え
、加えてＲＦ−１０２３−ＡとＲＰ−１０２３−Ｂとの
混合バンドであるバンド■から５５　ｍｇえた。バント
■からのＲＰ−１０２３−への分１）ｉｌｌはパンｌ’
　ＩＩよりえたＲ　Ｐ　−１０２３−八とＲＦ−１０２
３−＋３との合計昆１７３■を酢酸エチルに溶解し、こ
の溶液をＴＬＣ（ＴＬＣ用プリプレート０×２０ｃｍメ
ルクプリコーテッドＴＬＣプレートシリカゲル［ｉｏ　
Ｆ２５４　　（メルク杜製）、展開溶剤二ＣＨ２１Ｊ　
２　−メタノール（９／ｌ　：　ｖ／ｖ）、検出方法：
展開後紫外線下で直接検出）で行った。

さら１こ、えられたＲＰ−１０２３−へ２４５■をイソ
プロピルアルコール］、　Ｏｍｌに５５°Ｃで溶解し、
さらに水０２ｍ１を加えて、再結晶させ、目的とする環
状テトラペプチドＲＰ−１０２３−Ａ　　（無色、剣状
）１８４■をえた。以下に本発明の化合物ＲＦ−１０２
３への物理化学的性状を示す。

物理化学的性質 融点：１７３〜１７４℃（プロパノ−ルー水から再奪古
　晶　） 呈色反応＝陰性；ニンヒドリン試薬 陽性；ドラーゲンドルフ試薬 硫酸　−熱 リンモリブデン酸試薬 紫外線吸収スペクトル（第１図参照） Ｈｅ’ｌｌ　　　　　１％ λ　　ｎ　ｍ　（Ｅ　１　ｃ　ｍ　）　’末端吸収、２
３５　（ｓｂ）　（７５）ａｘ 赤外線吸収スベク）・ル（第２図参照）ＩＲ（Ｃｈｒ）
　ｃｍ−’　：　３４１０．３２９６．３０２２．２９
３０．２８５８．１７１０．１６８０、ｌ６２２．１５
２２．１４４０．１３６０．１２７０、１２３＋、１１
７０．１１３３．１０８２．８７４比旋光度 ［ａＦ　　”　　：　　−８３，７±　２．０°　（ｃ
ｍ　　０．５１５．　　Ｈｅ’ｌｌ）質量分析 ＳＩＭＳ；　　６０３［Ｍ＋ｌＩ］”　（Ｃ３ＩＩ　　
ｌｌｌ１２０ｅ　Ｎａ　＋ｌｌの計算（直） 元素分析（Ｃｏｘ　　１１４２０６　Ｎ４　＋　　０．
２８２０として）引　算（直　（％）　　＋　　Ｃ：０
７．３５　　、　ｌｌ：７．０５、　Ｎ：９．２４実験
値（％）　　：　Ｃ：６７．４０　、Ｈ：７．１３、Ｎ
：９．４２アミノ酸分析 Ｉ、−フェニルアラニン２個、Ｄ−ピペコリン酸１個（
光学活性カラム（フェニルアラニン：クラウンハック・
シーアール（ＣＲＯｗＮＰＡＫＣＲ）（ダイセル化学工
業■）、溶媒：１％ＩＩＣ（０４、流速＝０．８ｎ＋１
　／ｍｉｎ、ピペコリン酸：ティーエスケケル・エナン
チオ・エルアイ（ＴＳＫＧＥＬＥＮＡＮＴＩＯＬ＋）（
東ソ　−■）、溶媒：　　０．２５ｍｍｏ＋、流速：　
　１．Ｏｍｌ／ｍ１ｎｌ　でアミノ酸のＤまたはＬを決
定） 核磁気共鳴スペクトル ’Ｈ−ＮＭＲ［２００Ｍ１ｌｚ　、　ＣＤ（１’　３　
　（内部標準ＴＭＳ）コ、ｐｐｍ（Ｊ−Ｈｚ）（第３図
参照） ７．４６（１１１，ｄ、Ｊ−１，０）、　７．２７（１
０１１，Ｓ）、ｃａ。

７．１１（ＩＨ，ｍ）　、ｃａ、　６．４６（２旧…）
、　５．３６（１，Ｈ，Ｑ、Ｊ”９）、５．０２（１，
Ｈ，ｄ、Ｊ−５）、４．１７（ＩＩＩ　、　ｑ　、Ｊ−
９）、　　３．９６（ＩＩＩ、ｄ、Ｊ−９）　　、　　
３，４３（ＩＨ，ｄ　ｏｆ　ｄ、Ｊ−６，１，４）、３
．００（ＬＨ，ｔ。

Ｊ−６）、２．８０（ＩＩＩ、ｄ　ｏｆ　ｄ、Ｊ−０，
１，４）、４．２０　〜２．８０（ｍ）、　　２．５０
　−　１．７０（ｍ）、１．５（ｉ（２＋１．ｔ）　　
、　］、　、　４［ｉ　（２］（、ｂｒ）１３Ｃ−ＮＭ
Ｒ［５０Ｍｌｌｚ、ＣＤ（ｌ１３（内部標準ＴＭＳ）］
　、　ｐｐｍ（第４図参照） １９．４３（ｔ）、２２．９２（ｔ）、２４．１７（ｔ
）、２５．２９（ｔ）　、２５．４０（ｔ）、２８．１
１１２（ｔ）、２９．１８（ｔ）、３５．４５（ｔ）、
３［ｉ、４９（ｔ）、３Ｇ、８０（ｔ）、４４．２０（
ｔ）　、４１１ｉ、３ｇ（ｔ）、５０．２３（ｄ）、５
１．２０（ｄ）、５３．６９（ｄ）、５３．８２（ｄ）
、６３．０７（ｄ）、１２７．１８（ｄ）、１２７．４
３（ｄ）、１２９．０４（ｄ　ｘ４）、１２９．３５（
ｄ　Ｘ２＞、１２９．５６（ｄ　ｘ　２）、１３７．４
４（ｄ　Ｘ２）、１２７．０５（ｓ）、１．７３　、９
５（ｓ）、１７４．２２（ｓ）、１．７［ｉ、３５（Ｓ
）、２０８．２４（ｓ） 以下に本発明の化合物ＲＰ−↓０２３Ａの立体構造を示
す。

［以下余白］ ＲＦ　　−１０２３Ａ 実施例２ 実施例１と同様に操作を行い、ＲＦ−１０２３−８７２
ｍｇをＲＰ−１０２３−Ａとの混合バンド■からえた。

えられたＲＰ−１０２３−Ｂ　７２ｍｇをメタノール１
　ｍｌに加え、再結晶させ、目的とする環状テトラペプ
チドＲＰｉ０２３−＋３　　（無色、針状）　７２Ｉｎ
ｇをえた。

以下に本発明の化合物ＲＦ−１０２３−＋１の物Ｐ１！
化学的性状を示す。

物理化学的性質 融点：１８８〜１９０°Ｃ（メタノール−水から再結晶
） 呈色反応、陰性；ニンヒドリン試薬 陽性；ドラーゲンドルフ試薬 硫酸−熱 リンモリブデン酸試薬 紫外線吸収スペクトル（第５図参照） Ｈｅ’ｌｌ　　　　１％ λ　　ｎｍ（ｌＥ１６Ｉ１１）　　：末端吸収、２３５
（ｓｈ）（９０）ａｘ 赤外線吸収スペクトル（第６図参照） ＩＲ（Ｃｈｆ）　ｃｍ−’　：　３４０２．３２９２．
３００８．２９３４．２８５６．１７０６．１６７８．
１６２２．１５２Ｌ　１４３７．１３５８．１３１２．
１２６７．１０７７．８７２比旋光度 ［α］　　２４：　　−７５，３±　２．２°　（ｃｍ
　　０．５１７、Ｈｅ’ｌｌ）質量分析 ＳＩＭＳ：　　５８９［Ｍ＋Ｉ＋］”　（Ｃ３３１１４
００６Ｎ４　＋ｌＩの計算イ直） 元素分析（Ｃ３３ｔ（４００６Ｎ４　＋０．５）１２０
として）４ 計算値（％）　　：　Ｃ：６Ｂ、３１　、Ｈ：６．９１
、Ｎ：９．３７実験値（％）　　：　Ｃ：Ｂ６．００　
、Ｉｌ：６．７８、Ｎ・９．４０アミノ酸分析 と−フェニルアラニン２個、ニープロリン１個（光学活
性カラム（フェニルアラニン：クラウンバック◆シーア
ール（ＣＲＯνＮＰＡＫ　ＣＲ）（ダイセル化学工業■
）、溶媒：１％１ＩｃＮＯ４、流速、０．８ｍｌ／分、
プロリン：ティーエスケーゲル・エナンチオ・ニルアイ
（ＴＳＫＧＥＬ　ＥＮＡＮＴＩＯＬｌ）（東ソー■）、
溶媒：　　（１，２５ｍｆｆ１ｏｌ、流速：１、Ｏｍｌ
／ｍ１ｎ）でアミノ酸のＤまたはＬを決定）核磁気共鳴
スペクトル ’Ｈ−ＮＭＲ［２００ＭＨｚ、ＣＤＣ＃　３（内部標準
ＴＭＳ）］　、ｐｐｍ（Ｊ−ｔｌｚ）　（第７図参照） ７．８５（１１１，ｄｉ−１０）、７．１３（２Ｈ，＋
１１）　、ｃａ。

６．４０（ＩＨ，ｂｒ）、７．２９〜７．２３（ｌＯＨ
，ｍ）、５．１８（ＩＨ，Ｉｎ）、４．１３８（ＬＨ，
ｄ、Ｊ−５）、４．１５（１１１，ｍ）、３．８５（Ｌ
Ｈ，ｍ）　、ｃａ。

７２　（Ｉ　Ｈ、Ｉｎ）、３．４２（ＩＨ，ｄ　ｏｆ　
ｄ、Ｊ−６，１，４）、３．００　（１，Ｌｔ、Ｊ−６
）、　２．８６（ｉｌｌ、ｄ　ｏｒｄ。

Ｊ−６，１，４）、　　２．５０〜１．２０（ｍ）１３
Ｃ−ＮＭＲ［５０ＭＩ（ｚ、ＣＤＣｇ３（内部標準ＴＭ
Ｓ）］、ｐｐｒｆｌ（第８図参照） ２２．９９（ｔ）、２５．０２（ｔ）、２５．１４（ｔ
）、２５．４１（ｔ）　、２８．８８（ｔ）、２９．０
０（ｔ）、３５．２９　（ｔ）、３５．９９（ｔ）、３
６．５１（ｔ）、４６゜３７（ｔ）、４７．２０（１）
　、５３．７０（ｄ）、３５．８１（ｄ）、５４．２２
　（ｄ）、５８．１５（ｄ）、６３．４９（ｄ）、１２
７．２７（ｄ）、１２７．４２（ｄ）、１２９．０３（
ｄ　Ｘ２）、１２９．１５（ｄＸ２）、１２９．３８（
ｄ　Ｘ２）、１２９．５５（ｄ　Ｘ２）、１３７．３４
（ｄ）、１３７．４７（ｄ）、１７２．１５（Ｓ）、１
７３Ｊ３（ｓ）、１７４．３４（ｓ）、１７５．７４（
ｓ）、２０８．２５（ｓ）以下に本発明の化合物ＲＩ’
−１０２３Ｂの立体構造を示す ［以下余白］ つぎに本発明の化合物の抗肚瘍活性について説明する。

試験例１ （試験方法） 使用した培養液；ダルベツコ・イーグルＭＥＭ培地（白
水製薬■製）　　９．５ｇと７％重曹２０ｍ１を１ρの
蒸溜水に加えついで終濃度１０容量％となる量の牛胎児
血清（フロー・ラボラトリーズ社（Ｐｌｏｗ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）製、米国）を添加して
調整した。

フロー・ラボラトリーズ社製の１２穴のプラスチックデ
イツシュに−に記培養液２　［１１１、ｓｉｓオンコジ
ーンでトランスフオームしたＮｌｌｌ３７３細胞（米国
癌研究所より供与：サイエンス （Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　２１８．１１３１頁（１９８２
）参照）を２×１０４細胞／　ｍｌおよび第１表、第２
表で示す各濃度（５〜４００ｎｇ／　ｍｌ　）の各被験
化合物（ＲＰ−１，０２３ＡまたはＩ？Ｉ’−１０２３
−Ｂ）を添加し、３７°Ｃて５％炭酸ガスインキュベー
ター内で培養した。２４時間目に細胞の形態を観察し、
脱トランスフォーメション活性（オンコジーンで形質転
換させたＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ　３細胞の形質転換を阻害し、
フラットな形態の細胞に復帰させる活性）を求めた。そ
して、２日日にＲＰ−１０２３−Ａを用いたデイツシュ
において０．０５％トリプシンで細胞を分散し、血球計
算板を用い、細胞数をＡｌ１１定した。

（試験結果） ８ 第１表から明らかなように、本発明の化合物は、５　ｎ
ｇ／　ｕ＋１の濃度で脱トランスフォーメーション活性
を示す。分化誘導剤として報告されているヘキサメチレ
ンビスアセタミド（ＩＩＭｌｌＡ）の同じ系での脱トラ
ンスフォーメーション活性は３Ｂ／ｍｌであることから
、本発明の化合物の活性の方が著しく高いことがわかる
。なお、ＲＦ１０２３−ＡおよびＲＦ−１０２３−Ｂと
も同じ結果を与えた。

第２表から、本発明の化合物は５　ｎｇ／　ｍｌの濃度
から細胞ｊ曽殖阻害効果を示し、１．００ｎｇ／　ｍ１
以上の濃度では、完全に阻害することかわかる。

［以下余白］ 第 表 ［注］ ＊１　： ２４侍間目の判定で７５％以上の細胞 がフラゾ トになっていたら十とし た。

ヌ３ ２ 表 試験例２ （試験方（Ｊｌ） ヒト赤血球はヘパリンを含む注射筒（テルモ■製）て採
取したあと、１５００回転／回転速５分の遠心で沈澱せ
しめ、終濃度１０容量％となる量の牛脂児血？ｉ１１を
含むＭＥＭｔＦ：地で３ＸＩ０Ｂ細胞／　＋ｎｌの濃度
に調整した。このヒト赤１（１１球溶液と、本波膜化合
物（ＲＦ−１，０２３−ＡまたはＲＦ−１０２３−Ｂ）
の希釈液（１〜５０μｇ／ｍｌ）を等量ずつ混合し、３
７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間培養した。

１５００回転／回転速心後、」−清のヘモグロビン量を
オートリーダー（米国ダイナチック社製）で５３８１の
吸光度を測定することにより定量した。

（試験結果） 本発明の化合物は、２５μｇ／ｍｌの濃度においても全
くヒト赤血球に対し溶血作用を示さなかった。

前記試験より本発明の化合物は、オンコジーンで形質転
換させたＮｌｌ１３Ｔ３細胞の形質変換を阻害し、フラ
ットな形態の細胞に復帰させる活性（脱トランスフォー
メーション活性）をもち、また同じ細胞に対し、細胞増
殖阻害作用をもっていることがわかる。

［発叩の効果］ 本発明のＲＦ−１０２３−ＡおよびＲＰ−１０２３−Ｂ
は癌遺伝子による細胞の形質転換を阻害し、正常細胞に
復帰せしめる活性および同細胞に対し、細胞２ 増殖阻害を有するための、抗癌剤の有効成分として有用
なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はＲＦ−１０２３−Ａの紫外線吸収スペクトルを
示すチャート、第２図はＩ？Ｆ−１，０２３−Ａの赤外
線吸収スペクトルを示すチャート、第３図はＲＰ−１０
２３−Ａの核磁気共鳴スペクトル（Ｉ）（−ＮＭＲ）を
示すチャート、第４図はＲＰ−１０２３−Ａの核磁気ノ
（鳴スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲ）を示すチャー１・、
第５図はＩ？Ｆ−１０２３−Ｈの紫外線吸収スペクトル
を示すチャート、第６図はＲ１’−１０２３−Ｂの赤外
線吸収スペクトルを示すチャート、第７図はＲＦ−１０
２３Ｂの核磁気共鳴スペクトル（ＩＨ−ＮＭＲ）を示す
チャートおよび第８図はＲＦ−１０２３−Ｂの核磁気共
鳴スペクトル　（’　３Ｃ−ＮＭＲ）を示すチャー１・
である。 符開平 ３ ３４９９１（１０） 特開平３ ３４９９１（１２） 松 寸 牙５図 特開平３ ３４９９１（１４） 咽 ■ 手続補正書 〔自発） 平成２年６月８日 １事件の表示 平成１年特許願第１７０９３０号 ２発明の名称 環状テトラペプチドおよびその製造法 ３補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　大阪市中央区道修町３丁目１番８号名　称　
　［１９２１塩野義製薬株式会社代表者　吉　利　−雄 ４代理人〒５４０ 住　所　　大阪市中央区谷町２丁目２番２２号ばか２名 ５補正の対象 （１）明細書の「発明の詳細な説明」の欄６補正の内容 ｆｉｌ明細書１２頁６行の「大豆粉」を「大豆粉」と補
正する。 （２１同２１頁９行のｒＬＩＪを「Ｌｌ」と補正する。 （３）同２５頁１９行の「７２］をｒ３．７２Ｊと補正
する。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、ｎは４または３を表わす）で示されるＲＦ−１
   ０２３−Ａ（ｎ＝４）またはＲＦ−１０２３−Ｂ（ｎ＝
   ３）である環状テトラペプチド。 ２　ヘリコーマ属に属する請求項１記載の環状テトラペ
   プチド産生菌を培地に培養し、産生された該環状テトラ
   ペプチドを採取することを特徴とする該環状テトラペプ
   チドの製造法。 ３　ヘリコーマ属に属するヘリコーマ・アンビエンスＲ
   Ｆ−１０２３菌株（ＦＥＲＭＰ−１０６８０）を用いる
   請求項２記載の製造法。