DE69007356T2

DE69007356T2 - Zyklisches Tetrapeptid und Verfahren zu dessen Herstellung.

Info

Publication number: DE69007356T2
Application number: DE69007356T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Itazaki; Yoshimi Kawamura; Koichi Matsumoto; Kenji Sugita
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1989-06-30
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1994-10-13
Anticipated expiration: 2010-06-30
Also published as: DE69007356D1; DK0406725T3; KR910000790A; US5112944A; JPH0334991A; EP0406725A1; ATE102955T1; ES2053018T3; EP0406725B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues cyclisches Tetrapeptid und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Das erfindungsgemäße cyclische Tetrapeptid ist eine neue Verbindung, die nicht in der Literatur beschrieben ist.
In "The Journal of Antibiotics", 36, 478-483 (1983) werden Verbindungen, die ähnliche Strukturen haben wie die erfindungsgemäße Verbindung, aufgelistet. Solche Verbindungen unterscheiden sich jedoch von der erfindungsgemäßen Verbindung durch Aminosäurekomponenten. Auch gibt es keinen Bericht, der beschreibt, daß solche Verbindungen die Transformation von Zellen hemmen.
Hinsichtlich einer Substanz, die die durch die Transformation veränderte Morphologie der Zellen normalisieren kann, gibt es folgende Berichte:
Genistein (Hiroshi Ogawara et al., The Journal of Antibiotics 39, 606-608 (1986)).
Erbstatin (Hamao Umezawa et al., The Journal of Antibiotics, 39, 170-173 (1986)).
Oxanosin (Itoh, S. et al., Cancer Research, 49 (4). 996-1000 (1989)).
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Stoff bereitzustellen, der die Gestalt von Carcinomzellen durch Hemmung der Wirkung von onkogenen Produkten reversibel in jene von normalen Zellen umwandeln kann, und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Stoffes bereitzustellen.
Diese Aufgabe wurde durch die Feststellung erfüllt, daß cyclische Tetrapeptide, die aus Kulturen von Helicoma ambiens RF-1023 erhalten wurden, die durch Onkogene induzierte Transformation von Zellen hemmen und exzellente pharmakologische Eigenschaften besitzen, zu denen Antitumor-Eigenschaften zählen, einschließlich einer Eigenschaft, transformierte Zellen in normale Zellen umzuwandeln, und einer Eigenschaft, die Zellproliferation der Carcinomzellen zu hemmen.
Erfindungsgemäß wird ein cyclisches Tetrapeptid der Formel (I) bereitgestellt:
wobei n den Wert 4 oder 3 hat.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines cyclischen Tetrapeptids der Formel (I) bereit:
wobei n den gleichen Wert, wie vorstehend definiert, hat, umfassend die Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Helicoma, der das cyclische Tetrapeptid der Formel (I) produzieren kann , in einem Medium und das Sammeln des produzierten cyclischen Tetrapeptids der Formel (I).
Fig. 1 stellt ein Diagramm dar, das das UV-Absorptionsspektrum von RF-1023-A zeigt.
Fig. 2 stellt ein Diagramm dar, das das IR-Absorptionsspektrum von RF-1023-A zeigt.
Fig. 3 stellt ein Diagramm dar, das das NMR-Spektrum (¹H-NMR) von RF-1023-A zeigt.
Fig. 4 stellt ein Diagramm dar, das das NMR-Spektrum (¹³C-NMR) von RF-1023-A zeigt.
Fig. 5 stellt ein Diagramm dar, das das UV-Absorptionsspektrum von RF-1023-B zeigt.
Fig. 6 stellt ein Diagramm dar, das das IR-Absorptionsspektrum von RF-1023-B zeigt.
Fig. 7 stellt ein Diagramm dar, das das NMR-Spektrum (¹H-NMR) von RF-1023-B zeigt.
Fig. 8 stellt ein Diagramm dar, das das NMR-Spektrum (¹³C-NMR) von RF-1023-B zeigt.
Mikroorganismen, die das cyclische Tetrapeptid der Formel (I) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellen können, können unter jenen der Gattung Helicoma gefunden werden. Unter ihnen ist Helicoma ambiens RF-1023 ein Beispiel eines typischen Stamms.
Taxonomische Studien des Stamms RF-1023 werden im folgenden zusammengefaßt.
Die Kolonien wachsen langsam auf "V8-juice"-Agar.
Die Konidienträger sind einfach oder wenig verzweigt. Der untere sterile Teil der Konidienträger ist gerade und der obere fruchtbare Teil ist häufig hakenförmig und gebogen, mittelbraun und sehr hell braun auf die Spitze zu, 65 bis 270 um lang und 3 bis 4,5 um breit. Die Konidien haben im Knäuel ("coil") einen Durchmesser von 14 bis 22 um; das Konidienfilament ist 5,5 bis 9,0 um an der breitesten Stelle, mit 7-9 Septen. Die basale Zelle ist U-förmig mit einer undeutlichen Narbe, schwach olive- bis olivefarbig. Ein sexuelles Stadium wird bei dem Stamm nicht beobachtet. Aufgrund der vorstehend beschriebenen taxonomischen Eigenschaften wurde der Stamm RF-1023 als Helicoma ambiens Morgan (1892) identifiziert, der von Pirozynsky, K. A. in Mycological papers, 129, 29-30 (1972) beschrieben wurde. Der Stamm RF-1023, der das erfindungsgemäße cyclische Tetrapeptid (I) erzeugt, ist im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2751 hinterlegt worden. Der Tag der Hinterlegung ist der 21. April 1989.
Die mykologischen Eigenschaften der das vorstehend erwähnte cyclische Tetrapeptid (I) erzeugenden Mikroorganismen können variieren. Alle das cyclische Tetrapeptid der Formel (I) produzierenden Mikroorganismen der Gattung Helicoma, einschließlich natürlicher Varianten sowie künstlicher Varianten, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Im Falle der Herstellung des erfindungsgemäßen cyclischen Tetrapeptids der Formel (I) werden zuerst die das cyclische Tetrapeptid der Formel (I) produzierenden Mikroorganismen der Gattung Helicoma in ein Nährmedium zur Induktion des cyclischen Tetrapeptids (I) inokuliert, aerob gezüchtet und das gewünschte cyclische Tetrapeptid der Formel (I) wird erhalten.
Als Züchtungsverfahren sind die folgenden Verfahren beispielhaft.
Zuerst werden die das cyclische Tetrapeptid (I) produzierenden Zellen in ein Medium inokuliert und gezüchtet.
Als Nährmedium für eine solche Züchtung wird gewöhnlich ein Medium verwendet, dem eine organische Stickstoffquelle, wie Polypepton (hergestellt von Nippon Seiyaku Co., Ltd.), Rindfleischextrakt - ( hergestellt von Difco), Hefeextrakt (hergestellt von Difco), Malzextrakt (hergestellt von Difco) oder Bactopepton (hergestellt von Difco), eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, lösliche Stärke oder Kartoffelstärke, anorganisches Salz wie NaCl zugesetzt werden. Zur Züchtung wird eine Schüttelkultur bevorzugt.
Bei solch einer Schüttelkultur beträgt die Geschwindigkeit vorzugsweise 180 Upm, stärker bevorzugt 120 Upm.
Die Züchtungstemperatur beträgt vorzugsweise 25º bis 30ºC, stärker bevorzugt 27º bis 28ºC. Die Züchtungszeit beträgt vorzugsweise 48 bis 96 Stunden, stärker bevorzugt 72 Stunden.
Dann wird die durch die vorstehend erwähnte Kultur erhaltene Kulturlösung in ein frisches Medium inokuliert und gezüchtet.
Bei der vorliegenden Erfindung werden eine Mediumzusammensetzung und Mediumbedingungen verwendet, die gewöhnlich bei der Produktion von Antibiotika verwendet werden. Im Prinzip enthält das Medium eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze.
Falls erforderlich können Vitamine, Vorstufen, zum Beispiel Phenylessigsäure, oder Aminosäuren wie Phenylalanin und andere Zusätze zugesetzt werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kartoffelablauge, Kartoffelstärke, Saccharose, lösliche Stärke, Glucose, Maisstärke, Dextrin, Glycerin, Melasse und organische Säuren. Sie können alleine oder als Gemisch verwendet werden. Beispiele für Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt (hergestellt von Difco), Baumwollsamenmehl, Pepton, Polypepton ( hergestellt von Nippon Seiyaku Co., Ltd), Weizenkeime, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Malzextrakt (hergestellt von Difco). Sie können allein oder als Gemisch verwendet werden. Beispiele für anorganische Salze sind Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kupfersulfat, Manganchlorid, Zinksulfat, Kobaltchlorid und verschiedene Phosphate. Sie werden dem Medium, falls erforderlich, zugesetzt.
Die Züchtung kann gemäß einem normalerweise bei der Produktion von Antibiotika verwendeten Verfahren durchgeführt werden. Eine Flüssigkeitskultur ist bevorzugt. Im Falle einer Massenproduktion ist eine Submerskultur bevorzugt. Wenn es möglich ist, daß der pH-Wert eines Mediums variiert, kann ein Puffer wie Calciumcarbonat dem Medium zugesetzt werden. Falls es während der Züchtung zu heftiger Schäumung kommt, wird vorzugsweise ein Entschäumer, wie Pflanzenöl, Schweineschmalz oder Polypropylenglykol, in geeigneter Weise dem Medium zugesetzt. Zur Kultivierung ist eine Schüttelkultur bevorzugt.
Bei solch einer Schüttelkultur wird vorzugsweise bei 120 bis 180 Upm, stärker bevorzugt bei 180 Upm (7 cm Hub) geschüttelt. Die Züchtungstemperatur beträgt vorzugsweise 25º bis 30ºC, stärker bevorzugt 27º bis 28ºC. Die Züchtungszeit beträgt vorzugsweise 10 bis 14 Tage, stärker bevorzugt 12 bis 14 Tage.
Das erfindungsgemäße cyclische Tetrapeptid der Formel (I) kann zum Beispiel gemäß dem folgenden Verfahren erhalten werden.
Die gewonnene Kulturlösung wird nach dem üblichen Verfahren zur Abtrennung von Zellen und Filtrat filtriert. Die gewonnenen Mikroorganismen werden mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Aceton oder Ethanol, extrahiert. Dann wird der Extrakt konzentriert. Nachdem der pH-Wert auf 1,0 bis 5,0 eingestellt ist, wird das Konzentrat mit einem organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Butanol oder Methylenchlorid, extrahiert. Danach wird der Rohextrakt (1) mittels eines üblichen Reinigungsverfahren gewonnen.
Mittlerweile wird das vorstehend erwähnte Filtrat, nachdem sein pH- Wert auf 1,0 bis 5,0 eingestellt worden ist, mit einem organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Butanol oder Methylenchlorid, extrahiert. Danach wird der Rohextrakt (2) mittels eines üblichen Verfahrens gewonnen.
Die vorstehend erwähnten Rohextrakte (1) und (2) werden gemischt. Die gemischte Probe wird isoliert und mittels einer präparativen Dünnschichtchromatographie (nachstehend als "DC" bezeichnet) gereinigt und dann umkristallisiert. Das gewünschte cyclische Tetrapeptid mit der Formel (I) kann gewonnen werden.
Bei der vorstehend erwähnten DC sind eine "Pre-Coated TLC plate silica gel 60 F-254" von Merck als DC-Platte und das Lösungsmittelgemisch Toluol: Ethylacetat (1:1) als Fließmittel bevorzugt.
Außerdem kann als Nachweis verfahren das cyclische Tetrapeptid der Formel (I) nach der Entwicklung der DC direkt ohne Zerstörung unter Ultraviolettlicht nachgewiesen werden, wenn eine Platte verwendet wird, auf der die Fluoreszenzfarbe beigemischt ist.
Auf der DC-Platte werden zwei benachbarte Banden (nachstehend als "Bande I" und "Bande II" bezeichnet) beobachtet.
RF-1023-A der Formel (I), wobei n den Wert 4 hat, wird aus der Bande I gewonnen und ein Gemisch aus RF-1023-A und RF-1023-B der Formel (I), wobei n den Wert 3 hat, wird aus der Bande II gewonnen. Abgetrennt wird RF-1023-B aus der Bande II mittels DC.
Die vorstehend erwähnte beschichtete "Pre-Coated TLC plate" von Merck als Platte für die DC und das Lösungsmittelgemisch Methylenchlorid: Methanol (9:1) als Fließmittel sind bevorzugt. Außerdem kann als Nachweisverfahren das cyclische Tetrapeptid der Formel (I) direkt ohne Zerstörung unter ultraviolettem Licht nach der Entwicklung der DC nachgewiesen werden, wenn eine Platte verwendet wird, auf der die Fluoreszenzfarbe beigemischt ist. Auch kann RF-1023-B der Formel (I), wobei n den Wert 3 hat, durch die vorstehend erwähnte DC erhalten werden. Die gewonnenen RF-1023-A und RF-1023-B können weiter durch Umkristallisation und dergleichen, gemäß üblicher Verfahren, gereinigt werden.
Antitumormittel, die das erfindungsgemäße cyclische Tetrapeptid der Formel (I) als wirksamen Bestandteil enthalten, können in jeder Zubereitungsform zur oralen oder parenteralen Anwendung vorliegen. Beispiele für die Zubereitungsformen sind Präparate zur oralen Anwendung, wie Tabletten, Kapseln, Granula und Sirups, und Präparate zur parenteralen Anwendung, wie Suppositorien, Salben und Injektionen.
Für die Herstellung der erfindungsgemäßen Antitumormittel verwendete Träger sind zur oralen oder parenteralen Anwendung geeignete organische oder anorganische pharmazeutische Träger entweder im festen oder flüssigen Zustand, die unter üblichen Bedingungen inaktiv sind. Beispiele für Träger zur oralen Anwendung sind Stärke, Mannit, kristalline Cellulose, Wasser und Ethanol.
Beispiele für Träger zur parenteralen Anwendung sind Wasser, normale Kochsalzlösung und eine Glucoselösung. Das Verhältnis des erfindungsgemäßen Antitumormittels zum Träger im Präparat kann von 1 bis 99 Gewichsprozent variieren. Auch können die erfindungsgemäßen Antitumormittel einen weiteren pharmazeutischen Bestandteil, wie ein weiteres Antitumormittel, das mit dem erfindungsgemäßen cyclischen Tetrapeptid verträglich ist, enthalten. In diesem Falle ist das erfindungsgemäße Antitumormittel nicht notwendigerweise ein Hauptbestandteil des Präparats.
Die erfindungsgemäße Verbindung und das erfindungsgemäße Verfahren zu deren Herstellung werden ausführlicher beschrieben und erläutert in den folgenden Beispielen und Testbeispielen, bei denen alle Prozente und Teile Gewichtsprozente und Gewichtsteile sind, es sei denn, es ist anderweitig angemerkt. Selbstverständlich ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Beispiele beschränkt, die Testbeispiele und verschiedenen Abänderungen und Modifikationen können gemacht werden, ohne vom Erfindungsgedanken und Schutzbereich der Erfindung abzuweichen.

Beispiel 1

Eine Schrägagarkultur des Stammes RF-1023 (FERM BP-2751) wurde in 100 ml eines Ausgangsmediums ("seed medium"), enthaltend 1,0% Polypepton, 2,0% Glucose, 0,3% Rindfleischextrakt, 0,2% Hefeextrakt, 0,1% NaCl und Leitungswasser (pH 7,0), in einem 500-ml Sakaguchi-Kolben inokuliert und bei 28ºC 72 Stunden auf einem Rundschüttler bei 120 Upm (7 cm Hub) gezüchtet. Die Stammkultur wurde dann in einer Rate von 4 ml zu 80 ml Produktionsmedium zugegeben, das 2,0% Kartoffelstärke, 2,0% Saccharose und 0,5% Hefeextrakt (pH 7,0) enthielt, und in je einen von vierundzwanzig 500-ml-Erlenmeyerkolben gebracht und 12 Tage bei 28ºC unter Schütteln bei 180 Upm gezüchtet.
Zwei Liter der erhaltenen Kulturlösung wurden mittels einer"Hyfro Super-Cell" (hergestellt von JOHNS-Manville Sales. Corp.) zur Trennung von Zellen und Filtrat filtriert.
Die erhaltenen Zellen wurden in den 2 l-Kolben gegeben und dann wurden 500 ml Methanol zugesetzt. Auf einem Magnetrührer wurde 10 Minuten homogenisiert. Im folgenden wurde die so erhaltene Lösung abfiltriert. Nach der Konzentrierung des Filtrats bei 30º bis 40º mittels eines Rotations verdampfers auf einem Wasserbad, wurde 2 N Salzsäurelösung zur Einstellung des pH -Wertes auf 2,0 zugefügt. Die so erhaltene Lösung wurde mit 100 ml Ethylacetat zweimal extrahiert und dann mit Wasser gewaschen. Die gewaschene Lösung wurde mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, wobei 240 mg des Rohextrakts erhalten wurden (1).
Andererseits wurde das aus der Filtration der Kulturlösung erhaltene Filtrat (pH 6,7) in ein 4-l-Gefäß gebracht. Zur Einstellung des pH-Wertes auf 2,0 wurde eine 2 N Salzsäurelösung zugesetzt. Die so erhaltene Lösung wurde mit 600 ml Ethylacetat zweimal extrahiert und dann mit 20% wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Die gewaschene Lösung wurde mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, wobei 317 mg des Rohextrakts (2) erhalten wurden.
Die erhaltenen Rohextrakte (1) und (2) (insgesamt 557 mg) wurden in Ethylacetat gelöst. Die so erhaltene Lösung wurde mittels DC (DC- Platte: 20 x 20 cm "Pre-Coated TLC plate silica gel 60 F-254" (hergestellt von Merck & CO. INC.), Fließmittel Toluol-Ethylacetat (1/1: v/v) und Nachweisverfahren: direkter Nachweis unter Ultraviolettlicht nach der Entwicklung) aufgetrennt, wobei zwei nebeneinanderliegende Banden auf der DC-Platte (nachstehend als "Bande I" und "Bande II" bezeichnet) erhalten wurden.
Aus der so erhaltenen Bande I wurden 190 mg RF-1023-A gewonnen. Zusätzlich wurden aus der Bande II, die die Mischbande aus RF-1023-A und RF-1023-B darstellt, 55 mg RF-1023-A gewonnen. Die Abtrennung von RF-1023-A aus Bande II erfolgte durch Lösen der gesamten 173 mg RF-1023A und RF-1023-B in Ethylacetat und Durchführung einer DC mit der Lösung (DC-Platte: 20 x 20 cm, "Pre-Coated TLC plate silica gel 60 F-254" von Merck (hergestellt von Merck & CO. INC.), Fließmittel: CH&sub2;Cl&sub2;-Methanol (9/1: v/v) und Nachweisverfahren: nach der Entwicklung direkter Nachweis unter Ultraviolettlicht).
Weitere 245 mg der erhaltenen RF-1023-A wurden bei 55ºC in 10 ml Isopropylalkohol gelöst und dann wurden 0,2 ml Wasser zugegeben. Die Lösung wurde umkristallisiert, wobei 184 mg des gewünschten cyclischen Tetrapeptids RF-1023-A (farblose Nadeln) erhalten wurden. Nachstehend werden die physikalisch-chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindung RF-1023-A gezeigt.

Physikalisch- chemische Eigenschaften;

Schmelzpunkt: 173º-174ºC (Umkristallisation aus Propanol-Wasser)
Farbreaktion: negativ; Ninhydrin-Reagenz
positiv; Dragendolff-Reagenz
H&sub2;SO&sub4;-Hitze
Phosphomolybdänsäure-Reagenz

UV-Absorptionsspektrum (Fig. 1)

MeOH
λmaxnm(E[1%/i]cm ): Endmaximum, 235 (Sch.) (75)

IR-Absorptionsspektrum (Fig. 2)

IR (Chf) cm&supmin;¹: 3410, 3296, 3022, 2930, 2858, 1710, 1680, 1622, 1522, 1440, 1360, 1270, 1231, 1170, 1133, 1082, 874

Spezifische Drehung

[α ] 24/D: -63,7 ± 2,0º (c= 0,515, MeOH)

Massenspektrometrie

SIMS; 603[M+H]&spplus;(berechneter Wert von C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub2;O&sub6;N&sub4; + H)

Elementaranalyse (für C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub2;O&sub6;N&sub4; + 0,2 H&sub2;O)

berechnet (%): C: 67,35, H: 7,05, N: 9,24
gefunden (%): C: 67,40, H: 7,13, N: 9,42

Aminosäureanalyse

L-Phenylalanin (2), D-Pipecolinsäure (1)
(Die Konfiguration der Aminosäure (d.h. D-Form oder L-Form) wurde durch eine optisch aktive Säule bestimmt (Phenylalanin: CROWNPAK CR (DAICEL CHEMICAL lNDUSTRIES, LTD.),, Lösungsmittel: 1% HClO&sub4;. Fließgeschwindigkeit: 0.8 ml/min. Pipecolinsäure: TSKGEL ENANTIO L1 (TOSOH CORPORATION), Lösungsmittel: 0,25 mmol, Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.)

NMR-Spektrum

¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3; (innerer Standard TMS)),
ppm (J= Hz) (Fig. 3)
7.46 (1H, d, J=10), 7,27 (10 H, s), ca. 7,11 (1H,m),
ca. 6,46(2H, m), 5,36(1H, q, J=9), 5,02(1H, d, J=5), 4,17 (1H, q, J=9), 3,96(1H, d, J=9), 3,43 (1H, d von d, 1=6, 1,4), 3,00(1H, t, J=6), 2,86(1H, d von d, J=6, 1,4), 4,20-2,80(m), 2,50-1,70(m), 1,56(2H, t), 1,46 (2H, br)
¹³C-NMR(50 MHz, CDCl&sub3; (innerer Standard TMS)), ppm (Fig. 4) 19,43(t), 22,92(t), 24,17(t), 25,29(t), 25,40(t), 28,82(t), 29,18(t), 35,45(t), 36,49(t), 36,80(t), 44,20(t), 46,38(t), 50,23(d), 51,20 (d), 53,69(d), 53,82(d), 63,07(d), 127,18(d), 127,43(d), 129,04(d X 4), 129,35(d X 2), 129,56(d X 2), 137,44(d X 2), 127,05(s), 173,95(s), 174,22(s), 176,35(s), 208,24(s)
Die stereochemische Struktur der erfindungsgemäßen Verbindung RF-1023-A ist nachstehend gezeigt.

Beispiel 2

Auf die gleiche Art wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde das Verfahren durchgeführt, wobei 72 mg RF-1023-B aus der Bande II, die die Mischbande aus RF-1023-A und RF-1023-B darstellt, erhalten wurden.
1 ml Methanol wurden 72 mg der erhaltenen RF-1023-B zugefügt. RF-1023-B wurde umkristallisiert, wobei 72 mg des gewünschten cyclischen Tetrapeptids RF-1023-B (farblose Nadeln) erhalten wurden.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindung RF-1023-B werden wie folgt gezeigt.

Physikalisch- chemische Eigenschaften:

Schmelzpunkt 188º-190ºC (Umkristallisation aus Methanol-Wasser)
Farbreaktion: negativ; Ninhydrin-Reagenz
positiv: Dragendolff-Reagenz
H&sub2;SO&sub4;-Hitze
Phosphomolybdänsäurereagenz

UV-Absorptionsspektrum (Fig. 5)

MeOH λ nm(E&sub1;1%cm): Endmaximum 235(Sch.) (90)

IR-Absorptionsspektrum (Fig. 6)

IR(Chf)cm&supmin;¹: 3402, 3292, 3008, 2934, 2856
1706, 1678, 1622, 1521, 1437,
1358, 1312, 1267, 1077, 872 Spezifische Drehung

Massenspektrometrie

SIMS: 589 [M+H]&spplus; (berechneter Wert von C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub0;O&sub6;N&sub4; + H)

Elementaranalyse (für C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub0;O&sub6;N&sub4; + O,5 H&sub2;O)

berechnet (%): C:66,31, H: 6,91, N:9,37
gefunden (%): C: 66,00, H: 6,78, N:9,40

Aminosäureanalyse

L -Phenylalanin (2), D- Prolin (1)
(Die Konfiguration der Aminosäure (d.h. D-Form oder L-Form) wurde durch eine optisch aktive Säule bestimmt (Phenylalanin: CROWNPAK CR (DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.), Lösungsmittel: 1% HClO&sub4;, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min., Prolin: TSKGEL ENANTIO L1 (TOSOH CORPORATION), Lösungsmittel: 0,25 mmol, Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min.).)

NMR-Spektrum

¹H-NMR (200MHz, CDCl&sub3; (innerer Standard TMS),ppm (J=Hz) (Fig. 7)
7,65(1H, d, J=10), 7,13(2H,m), ca. 6,40(1H, br),
7,29-7,23(10H, m), 5,18(1H, m), 4,68(H, d, J=5),
4,15(1H, m), 3,85(1H, m), ca. 3,72(1H,m)
3,42(1H, d von d, J=6, 1,4), 3,00(1H, t, J=6),
2,86(1H, d von d,j=6, 1,4), 2,50-1,20(m) ¹³C-NMR(50 MHz, CDCl&sub3; (innerer Standard TMS), ppm (Fig. 8) 22,99(t), 25,02(t), 25,14(t), 25,41(t), 28,88(t),
29,00(t), 35,29(t), 35,99(t9, 36,51(t), 46,37(t),
47,20(t), 53,70(d), 35,81(d), 54,22(d), 58,15(d),
63,49(d), 127,27(d), 127,42(d), 129,03(d X 2),
129,15(d X 2), 129,36(d X 2), 129,55(d X 2),
137,34(d), 137,47(s), 172,15(s), 173,33(s),
174,34(s), 175,74(s), 208,25(s)
Die stereochemische Struktur der erfindungsgemäßen Verbindung RF-1023-B ist nachstehend gezeigt.

Testbeispiel 1

(Durchführung des Verfahrens)

Die verwendete Kulturlösung wurde durch Versetzen von 1 l destilliertem Wasser mit 9,5 g Dulbecco-Eagle-MEM-Medium (hergestellt von NISSUI SElYAKU CO., LTD) und 20 ml 7% Natriumbicarbonat und Zugabe von fetalem Rinderserum (hergestellt von Flow Laboratories, Inc., USA) hergestellt, wobei eine Endkonzentration von 10 Volumenprozent erhalten wurde.
Jeder Vertiefung einer Plastikplatte mit 12 Vertiefungen von Flow Laboratories, Inc., wurden 2 ml der vorstehend erwähnten Kulturlösung, 2 X 10&sup4; Zellen/ml der mit dem sis-Onkogen (vom National Cancer Institute of the United States; Science 218, 1131 (1982)) transformierten NIH3T3- Zellen zugesetzt und jede Testverbindung (RF-1023-A oder RF-1023-B) wurde in jeder Konzentration (5 bis 400 ng/ml) zugegben und bei 37ºC in einem Inkubator (5% CO&sub2;) gezüchtet. Vierundzwanzig Stunden später wurde die Zellmorphologie beobachtet und die Fähigkeit zur Rückbildung der Transformation (Eigenschaft, die Transformation der mit dem Onkogen transformierten NIH3T3-Zellen zu hemmen und sie zur normalen flachen Zellmorphologie zurückzuführen) wurde bestimmt. Zwei Tage nach der Inkubation wurden die Zellen, die dem RF-1023-A enthaltenden Medium ausgesetzt waren, mit 0,05% Trypsin dispergiert und die Zellzahl wurde mittels eines Hämocytometers gemessen.

(Ergebnisse des Tests)

Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, zeigt die erfindungsgemäße Verbindung in der Konzentration von 5 ng/ml Fähigkeit zur Rückbildung der Transformation. Im gleichen Versuchssystem zeigt das als Mittel zur Induktion der Differenzierung bekannte Hexamethylenbisacetamid (HMBA) in der Konzentration von 3 mg/ml Fähigkeit zur Rückbildung der Transformation. Deshalb ist die Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindung bemerkenswert hoch im Vergleich zu HMBA. Darüberhinaus ergaben sowohl RF-1023-A und RF-1023-B das gleiche Ergebnis.
Aus Tabelle 2 geht hervor, daß die erfindungsgemäße Verbindung in der Konzentration von nicht weniger als 5 ng/ml einen cytostatischen Effekt zeigt und in einer Konzentration von nicht weniger als 100 ng/ml die Zellproliferation hemmt. Tabelle 1 Tabelle 2 Konzentration der Testverbindung (ng/ml) Fähigkeit zur Rückbildung der Transformation *1 (Anmerkung) *1: "+" bedeutet, daß die Morphologie von nicht weniger als 75% der Zellen 24 Stunden nach der Inkubation flach war. Zellzahl *2 Zunahme in Prozent (%) (Anmerkung ) *2: Die Zellzahlen wurden 2 Tage nach der Inkubation gemessen.

Testbeispiel 2

(Durchführung des Verfahrens)

Menschliche rote Blutkörperchen wurden mittels einer Spritze (von TERUMO CORPORATION) aufgezogen und dann mittels fünfzehnminütiger Zentrifugation bei 1500 upm präzipitiert, und eine Suspension roter Blutkörperchen aus 3 X 10&sup8; Zellen/ml wurde mit MEM-Medium, enthaltend fetales Rinderserum, hergestellt, wobei die Endkonzentration 10 Volumenprozent war.
Ein Äquivalent der erhaltenen Suspension aus den menschlichen roten Blutkörperchen und eine verdünnte Lösung (1 bis 50 ug/ml) der erfindungsgemäßen Testverbindung (RF-1023-A oder RF-1023-B) wurden gemischt und bei 37º C in einem Inkubator (5% CO&sub2;) 2 Tage gezüchtet. Nach der Zentrifugation bei 1500 Upm wurde die Menge des Hämoglobins im Überstand durch Messen der Absorption bei 538 nm mittels eines "Auto reader" (hergestellt von Dynatech Co. & Ltd, USA) gemessen.

(Ergebnisse des Experiments)

Die erfindungsgemäße Verbindung zeigte überhaupt keinen Hämolyseeffekt gegenüber menschlichen roten Blutkörperchen bei einer Konzentration von 25 ug/ml.
Gemäß den vorstehend erwähnten Experimenten hemmt die erfindungsgemäße Verbindung die Transformation der mit dem Onkogen transformierten NIH3T3-Zellen und bewirkt die Rückkehr der Zellen zur flachen Zellmorphologie (Fähigkeit zur Rückbildung der Transformation) und hat auch einen cytostatischen Effekt gegenüber den transformierten NIH3T3-Zellen.
Zusätzlich zu den in den Beispielen verwendeten Bestandteilen können andere Bestandteile in den Beispielen verwendet werden, wie in der Beschreibung angegeben, wobei im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten werden.

Claims

1. Cyclisches Tetrapeptid der Formel (I)

wobei n den Wert 4 oder 3 hat.

2. Cyclisches Tetrapeptid nach Anspruch 1, wobei n den Wert 4 hat.

3. Cyclisches Tetrapeptid nach Anspruch 1, wobei n den Wert 3 hat.

4. Verfahren zur Herstellung eines cyclischen Tetrapeptids der Formel (I):

wobei n den Wert 4 oder 3 hat, umfassend die Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Helicoma, der das cyclische Tetrapeptid (I) produzieren kann, in einem Medium und das Sammeln des produzierten cyclischen Tetrapeptids (I).

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der zur Gattung Helicoma gehörende Mikroorganismus Helicoma ambiens RF-1023 (FERM BP-2751) ist.

6. Arzneimittel, umfassend ein cyclisches Tetrapeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

7. Arzneimittel nach Anspruch 6 zur Verwendung als Antitumormittel.

8. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach den Ansprüchen 6 oder 7, umfassend das Kombinieren eines cyclischen Tetrapeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

9. Verwendung eines cyclischen Tetrapeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Antitumormittels.