JPH0323160B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法による5′−イノシン酸の製造方
法に関し、更に詳細にはプロトプラスト融合方法
で育種したバチルス属のリフアンピシン耐性株を
用いて5′−イノシン酸を製造する方法に関する。 従来、糖質等の炭素源から発酵法によつて直接
培養液中に5′−イノシン酸を生成・蓄積せしめる
いわゆる直接発酵法としては、コリネバクテリウ
ム属に属するアデニン要求性あるいはキサンチン
要求性の変異株を使用する方法（特公昭43−
2895、特公昭41−16118）、アデニン要求性でかつ
デコイニン又はサルフア剤耐性株を使用する方法
（特開昭55−150899）等が知られている。一方、
バチルス属の微生物については、アデニン及びキ
サンチン要求性で、かつデコイニン又はサイコフ
ニン耐性の変異株を使用する方法（特公昭56−
32918号公報）等が知られている。 本発明者等はバチルス属に属し、より5′−イノ
シン酸生産能の高い微生物を育種することを目的
として種々研究を重ねた結果、バチルス属に属
し、アデニン及びキサンチン要求性、デコイニン
耐性の5′−イノシン酸生産菌にリフアンピシン耐
性を付与した変異株の中に、5′−イノシン酸をよ
り大量蓄積するものが有ることを発見した。本発
明はこの発見に基づいて完成されたものである。 本発明で使用する微生物はバチルス属に属し、
アデニン要求性、キサンチン要求性、デコイニン
耐性及びリフフアンピシン耐性を有しかつ5′−イ
ノシン酸生産能を有する微生物であり、具体的に
はバチルス・ズブチリスAJ11820 FERM−
P6441（Ade^-、Xan^-、Dec^r、Rif^r）が挙げられ
る。Ade^-、Xan^-：アデニン要求性、キサンチン
要求性、Dec^r、Rif^r：デコイニン耐性、リフアン
ピシン耐性、 本発明の微生物は、デンプン資化能を有するこ
とからバチルス属に属するものである。 本発明で使用するリフアンピシン耐性の5′−イ
ノシン酸生産菌はバチルス属に属し、アデニン要
求性、キサンチン要求性かつデコイニン耐性の
5′−イノシン酸生産菌、例えばバチルス・ズブチ
リスAJ11156 FERM−P4118（特公昭56−32918
号公報記載）等を親株とし、これに通常の人工変
異法あるいはプロトプラスト融合法等によつて育
種できる。 次の実験例１、２にて、リフアンピシン耐性変
異株AJ11820のプロトプラスト融合法による育種
方法及びリフアンピシンに対する耐性度を示す。 実験例 １ ペプトン1.0ｇ／dl、酵母エキス1.0ｇ／dl、塩
化ナトリウム0.5ｇ／dl、アデニン10mg／dl及び
グルコース0.5ｇ／dlを含むPH7.0の完全栄養培地
10mlを大型試験管に分注し、120℃で10分間加熱
滅菌した。 この培地に5′−イノシン酸生産菌であるバチル
ス・ズブチリスAJ11156（Ade^-、Xan^-、Dec^r）
を接種し31.5℃で振盪培養した。 対数増殖中期（10⁸個／ml）にペニシリンＧを
3.0単位／ml添加し、更に90分培養を続けた。 培養液から細胞を回収し、該細胞を、0.5Mシ
ユークローズ、0.02Mマレイン酸と0.02M塩化マ
グネシウムを含むSMM希釈液で洗浄した。次い
で細胞を第１表の最少培地に懸濁して、リゾチー
ム1000μｇ／mlを添加し、31.5℃に放置してプロ
トプラスト化をおこなつた。プロトプラスト化は
約30分間で完了した。 一方、コリネバクテリウム・エキイ
AJ11551FERM−P5396（Ade^-、Rif^r）（特開昭56
−160999号公報参照）を上記の方法に従つて完全
栄養培地で培養した。培養液から細胞を分離し、
SSM希釈液で洗滌後、第１表の最少培地に懸濁
し、これにリゾチームを5000μｇ／ml添加し、
31.5℃に20時間放置してプロトプラスト化を行つ
た。

【表】 上記の方法で得られたプロトプラストを含んだ
最少培地を夫々遠心分離して、プロトプラストを
分離し、それぞれ等量のプロトプラストをPH
10.5、100ｍＭの塩化カルシウムを含むSMM希釈
液0.5mlに懸濁し、33％のポリエチレングリコー
ル6000溶液を５ml添加して36℃で30分間放置し
た。反応時間につれてプロトプラストの凝集が生
じ、融合が進行した。 この融合したプロトプラストを遠心分離後PH
10.5、100ｍＭ CaCl₂を含むSMM高張液で洗浄
し、これをデコイニン1000μｇ／ml及びリフアン
ピシン5.0μｇ／mlを含んだAJ11156の最少寒天培
地（プレート）に接種し、同培地（0.8％軟寒天
培地）を、その上層に重層した後、これを31.5℃
で培養した。約10〜14日後、プレート上に出現し
たコロニーを分離した。 これらのコロニーの内から5′−イノシン酸生産
能の最も高い融合株AJ11820を選んだ。 第１表に示されたAJ11156の最小培地において
グルコースだけをデンプンにおきかえた培地に試
験管に4.0ml宛分注し、これに、AJ11820、
AJ11156、AJ11551の各菌を接種し、31.5℃で24
時間振盪培養を行い、デンプン資化率を調べた。
この結果、バチルス属のAJ11156は98％、コリネ
バクテリウム属のAJ11551は０％、融合株の
AJ11820は95％のデンプン資化率であつた。これ
より、融合株はバチルス属に分類されることが判
明した。 実験例 ２ 第２表及び第３表に示す濃度のリフアンピシン
又はデコイニンを含む第１表の最少培地を試験管
に4.0ml宛分注し、これに試験菌を接種し、31.5
℃で24時間振盪培養を行つた。生育値を562nｍ
に於る吸光度を測定して求め、第２表、第３表に
は相対生育値を示した。

【表】

【表】 尚、接種量は、試験菌を上記液体培地に562n
ｍにおける吸光度が0.1になるように懸濁し、そ
の0.1mlを各試験管に接種して接種量を均一にし
た。 本発明において「リフアンピシンに耐性を有す
る変異株」とは、アデニン又はリフアンピシンを
含有する培地中にて、親株の相対生育値よりも高
い相対生育値を有するような変異株をいう。 このような変異株を培養する培地は、炭素源、
窒素源、無機塩類、アデニンおよび必要ならば更
にその他の微量栄養素を含有する通常の液体培地
である。炭素源としては、グルコース、糖蜜、デ
ンプン加水分解度などの炭水化物、酢酸、グルコ
ン酸などの有機酸、エタノールなどのアルコール
などが使用できる。窒素源としては硫安、硝安、
塩安、リン安等のアンモニウム塩、硝安等の硝酸
塩、尿素、アンモニアガス等が使用できる。また
栄養要求物質としてのアデニンはアデニン、アデ
ニン鉱酸塩、アデノシン、アデニル酸、リボ核酸
等のいずれも使用可能である。また必要に応じて
ビタミン類、アミノ酸、アデニン以外の核酸塩基
などの微量栄養素を添加すれば5′−イノシン酸の
蓄積量を増す場合が多い。 培養方法は好気的条件がよく、また、培養温度
は24ないし40℃の範囲がよい。場合によつては発
酵途中にて発酵温度を若干変更させてもよい。培
養開始時および培養中に培養液のPHを5.0ないし
9.0に調節するのが望ましい。PH調整には無機酸、
有機酸あるいはアルカリ、さらに尿素、炭酸カル
シウム、アンモニア水、アンモニアガスなどを使
用することが出来る。かくして２ないし７日間培
養すれば著量の5′−イノシン酸が培地中に蓄積さ
れる。 発酵液より5′−イノシン酸を採取するには、例
えば菌体を分離除去し、その瀘液を脱色樹脂とア
ニオン交換樹脂とを併用し、あるいはアニオン交
換樹脂とカチオン交換樹脂とを併用して処理すれ
ば比較的純粋な5′−イノシン酸含有水溶液が得ら
れる。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 第６表に示すシード培地及び主発酵培地を調製
し、夫々、500ml容のフラスコに50ml宛分注し120
℃にて10分間加熱滅菌した。

【表】 バチルス・ズブチリスの融合株AJ11820及び親
株のAJ11156をシード培地に接種し34℃にて16時
間振盪培養した。 このシード培養液1.0mlを主発酵培地に接種し、
34℃にて72時間振盪培養した。 培養液中に蓄積した5′−イノシン酸の量を高速
液体クロマトグラフイーで定量した。その結果を
第７表に示した。

【表】 AJ11820の培養液10より菌体を濾過分離し瀘
液を塩酸でPH1.2にし、「ダイヤイオンSK＃１」
（H⁺型）の樹脂塔を通した。蒸溜水を流し、瀘液
に続いて流出される初期の流出液の5′−IMPを含
む分画を集め、水酸化ナトリウムでPH7.2に調節
した。これを減圧濃縮後、冷却し、５−IMP・
2Na・7.5H₂Oの結果10.5ｇを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バチルス属に属し、アデニン要求性、キサン
   チン要求性、デコイニン耐性及びリフアンピシン
   耐性の各性質を有し、かつ5′−イノシン酸生産能
   を有する微生物を培養して培養液中に5′−イノシ
   ン酸を生成、蓄積せしめ、これを採取することを
   特徴とする発酵法による5′−イノシン酸の製造
   法。