JPS58158196A - 発酵法による５′−イノシン酸の製造法 - Google Patents
発酵法による５′−イノシン酸の製造法Info
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- JPS58158196A JPS58158196A JP4156582A JP4156582A JPS58158196A JP S58158196 A JPS58158196 A JP S58158196A JP 4156582 A JP4156582 A JP 4156582A JP 4156582 A JP4156582 A JP 4156582A JP S58158196 A JPS58158196 A JP S58158196A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法１こよる５′−イノシン酸の製造方法に
関し、更に詳細ｔこはプロトプラスト融合方法で育種し
たバチルス属のリファンピシン耐性株を用いて５”−イ
ノシン酸７を製造する方法１こ関する。
関し、更に詳細ｔこはプロトプラスト融合方法で育種し
たバチルス属のリファンピシン耐性株を用いて５”−イ
ノシン酸７を製造する方法１こ関する。
従来、糖質等の炭素源から発酵法會こよって直接培養液
中管こ５°−イノシン酸を生成・蓄積せしめるいわゆる
直接発酵法としては、フリネバクテリウム属に属するア
デニン要求性あるいはキサンチン要求性の変異株を使用
する方法（特公昭４３−２８９５、特公昭４ｌ−１６１
１８）、アデニン要求性でかつデフィニン又はサルファ
剤耐性株を使用する方法（特開昭５５−１５０８８９）
等が知られている。一方、バチルス属の微生物について
は、アデニン及びキサンチン要求性で、かつデコイニン
又はサイコフニン耐性の変異株を使用する方法（特公昭
５６−３２９１８号公報）等が知られている。
中管こ５°−イノシン酸を生成・蓄積せしめるいわゆる
直接発酵法としては、フリネバクテリウム属に属するア
デニン要求性あるいはキサンチン要求性の変異株を使用
する方法（特公昭４３−２８９５、特公昭４ｌ−１６１
１８）、アデニン要求性でかつデフィニン又はサルファ
剤耐性株を使用する方法（特開昭５５−１５０８８９）
等が知られている。一方、バチルス属の微生物について
は、アデニン及びキサンチン要求性で、かつデコイニン
又はサイコフニン耐性の変異株を使用する方法（特公昭
５６−３２９１８号公報）等が知られている。
本発明者等はバチルス属１こ属しより５′−イノシン酸
生産能の高い微生物を育種することを目的として種々研
究を重ねた結果、バチルス属に属し、アデニン及びキサ
ンチン要求性、デコイニン耐性＼ ０５＋−イノシン酸生産ｔＭｔこリファンピシン耐性を
付饗した変異株の中に、５１−イノシン酸をより大量蓄
積するものが有ることを発見した。本発明はこの発見？
こ基づいて完成されたものである。
生産能の高い微生物を育種することを目的として種々研
究を重ねた結果、バチルス属に属し、アデニン及びキサ
ンチン要求性、デコイニン耐性＼ ０５＋−イノシン酸生産ｔＭｔこリファンピシン耐性を
付饗した変異株の中に、５１−イノシン酸をより大量蓄
積するものが有ることを発見した。本発明はこの発見？
こ基づいて完成されたものである。
本発明で使用する微生物はバチルス属に属し、アデニン
要求性、キサンチン要求性、デコイニン耐性及びリファ
ンピシン耐性を有しかつ５′−イノシン酸生産能を有す
る微生物であり、具体的にはバチルス・ズブチリスＡＪ
Ｉ＋８２０ ＰＥＲＭ−Ｐ６４４１ （Ａｄｅ−＋
Ｘａｎ−、Ｄｅｃｒ、 Ｒｉｆ” ）”？””５Ａｄ
ｅ−＋Ｘａｎ−：アデニン要求性、キサンチン要求性、
Ｄｅｃｒ＋Ｒｉ ｆｒ：デコイニン耐性、リフアンビア
耐性。
要求性、キサンチン要求性、デコイニン耐性及びリファ
ンピシン耐性を有しかつ５′−イノシン酸生産能を有す
る微生物であり、具体的にはバチルス・ズブチリスＡＪ
Ｉ＋８２０ ＰＥＲＭ−Ｐ６４４１ （Ａｄｅ−＋
Ｘａｎ−、Ｄｅｃｒ、 Ｒｉｆ” ）”？””５Ａｄ
ｅ−＋Ｘａｎ−：アデニン要求性、キサンチン要求性、
Ｄｅｃｒ＋Ｒｉ ｆｒ：デコイニン耐性、リフアンビア
耐性。
本発明で使用するりファンビシン耐性の５°−イノシン
酸生産菌はバチルス属Ｖこ属し、アデニン要求性、キサ
ンチン要求性かつデコイニ／耐性の５１−イノシン酸生
産菌、例えばバチルス・ズブチリスＡＪ１＋１５６
ＦＥＲＭ−Ｐ４’１１８（特公昭５６−３２９１８・号
公報記載）等を親株とし、これに通常の人工変異法ある
いはプロトプラスト融合法等ｔこよって育種できる。
酸生産菌はバチルス属Ｖこ属し、アデニン要求性、キサ
ンチン要求性かつデコイニ／耐性の５１−イノシン酸生
産菌、例えばバチルス・ズブチリスＡＪ１＋１５６
ＦＥＲＭ−Ｐ４’１１８（特公昭５６−３２９１８・号
公報記載）等を親株とし、これに通常の人工変異法ある
いはプロトプラスト融合法等ｔこよって育種できる。
次の実験例１．２にて、リファンピシン耐性変異株ＡＪ
１１８２０のプロトプラスト融合法による育種方法及び
リファンピシンに対する耐性度を示す。
１１８２０のプロトプラスト融合法による育種方法及び
リファンピシンに対する耐性度を示す。
ペプトン１．０９ｌｄ７！、酵母エキス１．ｏｙ／ｄｉ
、塩化ナトリウムｏ、５ｔ／ｄｉ、アデニン１０冨ｇ／
ｄｉ及びグルコース０．５ｔ／ｄｌを含むｐＨ７，０
の完全栄養培地１０ｍ／を大型試験管に分注し、＋２０
Ｃで１０分間加熱滅菌した。
、塩化ナトリウムｏ、５ｔ／ｄｉ、アデニン１０冨ｇ／
ｄｉ及びグルコース０．５ｔ／ｄｌを含むｐＨ７，０
の完全栄養培地１０ｍ／を大型試験管に分注し、＋２０
Ｃで１０分間加熱滅菌した。
この培地にグーイノシン酸生産菌であるバチルス・ズブ
チリスＡ Ｊ １ ＋ １５６ （Ａｄｅ 、 Ｘａ
ｎ−。
チリスＡ Ｊ １ ＋ １５６ （Ａｄｅ 、 Ｘａ
ｎ−。
Ｄｅｃｒ）を接種し３１．５’ｒで振盪培養した。
対数増殖中期（１０８個／ ｍｌ ）にペニシリンＧを
３．０単位／−添加し、更に９０分培養を続けた。
３．０単位／−添加し、更に９０分培養を続けた。
培養液から細胞を回収し、該細胞を、０．５Ｍシュータ
−−ズ、０．０２ Ｍヤレイン酸と０．０２ Ｍ塩化マ
グネシウムを含む５ＭＭ希釈液で洗浄した。
−−ズ、０．０２ Ｍヤレイン酸と０．０２ Ｍ塩化マ
グネシウムを含む５ＭＭ希釈液で洗浄した。
次いで細胞を第１表の最少培地に懸濁して、リゾチーム
！０００μｆ／−を添加し、３１．５ ｒに放置してプ
ロトプラスト化をおこなった。プロトプラスト化は約３
０分間で完了した。
！０００μｆ／−を添加し、３１．５ ｒに放置してプ
ロトプラスト化をおこなった。プロトプラスト化は約３
０分間で完了した。
一方、コリネバクテリウムΦエキイＡＪ１１５５１ＦＥ
ＲＭ−Ｐ５３９６ （Ａｄｅ−、Ｒｉｆｒ） （特開昭
５６−１６０９９９号公報参照）を上記の方法ｔこ従っ
て完全栄養培地で培養した。培養液から細胞を分離し、
５８Ｍ希釈液で洗滌後、第１表の最少培地に懸濁し、こ
れにリゾチームを５ｏｏｏμｆ／ｗｅ添加ｊ、３ ｔ、
ｓ Ｃに２０時間放置してプロトプラストイレを行った
。
ＲＭ−Ｐ５３９６ （Ａｄｅ−、Ｒｉｆｒ） （特開昭
５６−１６０９９９号公報参照）を上記の方法ｔこ従っ
て完全栄養培地で培養した。培養液から細胞を分離し、
５８Ｍ希釈液で洗滌後、第１表の最少培地に懸濁し、こ
れにリゾチームを５ｏｏｏμｆ／ｗｅ添加ｊ、３ ｔ、
ｓ Ｃに２０時間放置してプロトプラストイレを行った
。
第１表 最少培地の組成
（ＮＨ４）、１Ｓｏ４０．２ ０
ＫＨ２Ｐ０． ０．４ ｆ／ｄｅ
Ｏ，１＃Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，０４ｆ／ｄｉ
Ｑ、２９〃ビオチン
２００ μｙ／ｌパントテン酸カル・ンウ
ム − １．０ ｍｇ／ｌアデ
ニン １０ ｍ９／ｄ７！５．
０ ８９／ｄｉカザミノ酸
０．５ ｆ／ｄｉＦｅイオン
２ ｐｐｍ ２ｐｐ１１１Ｍ
ｎイオン ２ ｐｐｍ ２
〃ＮＨ４Ｃｌ Ｏ，５ｆ／
ｄｉ −クエン酸ナトリウム ｏ、
ｏ ｓ ｖ／ｄｅ −キサンチン
１０ ｍｙ／ｄ７！−ｐ Ｈ７，３７，３ 上記の方法で得られたプロトプラストを含んだ最少培地
を夫々遠心分離して、プロトプラストを分離し、それぞ
れ等量のプロトプラストをｐＨ１Ｏ０５，１００ｍＭの
塩化カルシウムを含む５ＭＭ希釈液０．５１１Ｉｌｔこ
懸濁し、３３−のポリエチレングリコール６０００溶液
を５４添加して３６Ｃで３０分間放置した。反応時間ｔ
こつれてプロトプラストの凝集が生じ、融合が進行した
。
Ｏ，１＃Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，０４ｆ／ｄｉ
Ｑ、２９〃ビオチン
２００ μｙ／ｌパントテン酸カル・ンウ
ム − １．０ ｍｇ／ｌアデ
ニン １０ ｍ９／ｄ７！５．
０ ８９／ｄｉカザミノ酸
０．５ ｆ／ｄｉＦｅイオン
２ ｐｐｍ ２ｐｐ１１１Ｍ
ｎイオン ２ ｐｐｍ ２
〃ＮＨ４Ｃｌ Ｏ，５ｆ／
ｄｉ −クエン酸ナトリウム ｏ、
ｏ ｓ ｖ／ｄｅ −キサンチン
１０ ｍｙ／ｄ７！−ｐ Ｈ７，３７，３ 上記の方法で得られたプロトプラストを含んだ最少培地
を夫々遠心分離して、プロトプラストを分離し、それぞ
れ等量のプロトプラストをｐＨ１Ｏ０５，１００ｍＭの
塩化カルシウムを含む５ＭＭ希釈液０．５１１Ｉｌｔこ
懸濁し、３３−のポリエチレングリコール６０００溶液
を５４添加して３６Ｃで３０分間放置した。反応時間ｔ
こつれてプロトプラストの凝集が生じ、融合が進行した
。
この融合したプロトプラストを遠心分離後ｐＨ１Ｏ８５
，１００ｍＭ ＣａＣ１ｇを含む５ＭＭ高張液で洗浄し
、これをデフイニン１０００μｆ／ｍ及びリファンピシ
ン５，０μｔ／醒ｌを含んだＡＪ１１１５６の最少寒天
培地（プレート）に接種し、同培地（０，８％軟寒天培
地）を、その上層に重層した殊。
，１００ｍＭ ＣａＣ１ｇを含む５ＭＭ高張液で洗浄し
、これをデフイニン１０００μｆ／ｍ及びリファンピシ
ン５，０μｔ／醒ｌを含んだＡＪ１１１５６の最少寒天
培地（プレート）に接種し、同培地（０，８％軟寒天培
地）を、その上層に重層した殊。
これを３１．５Ｃで培養した。約ｌθ〜１４田後、プレ
ート上１こ出現したコロニーを分離した。
ート上１こ出現したコロニーを分離した。
これらのコロニーの内から５“−イノシン酸生産能の最
も高い融合株ＡＪ＋１８２０ を選んだ。
も高い融合株ＡＪ＋１８２０ を選んだ。
実験例２
第２表及び第３表音こ示す濃度のりファンビシン又はデ
コイニンを含む第１表の最少培地を試験管に４．ＣＪｑ
ｌ宛分注充分これ１こ試験菌を接種し、３１．５ｔ：’
で２４時間振盪培養を行った。生育値を５６２ ｎｍ
ｔこ於る吸光度を測定して求め、第２表、第３表ｔこけ
相対生育値を示した。
コイニンを含む第１表の最少培地を試験管に４．ＣＪｑ
ｌ宛分注充分これ１こ試験菌を接種し、３１．５ｔ：’
で２４時間振盪培養を行った。生育値を５６２ ｎｍ
ｔこ於る吸光度を測定して求め、第２表、第３表ｔこけ
相対生育値を示した。
第２表 Ｒｉｆ（リフアンプシン）ｔこ対する耐性度第
３表 Ｄｅｃ （デコイニン）會こ対する耐性変向、接
種量は、試験菌を上記液体培地ｔこ５６２ｎｍにおける
吸光度が０．１になるように懸濁し、そのＯ，Ｉ−’ｆ
各試験管ｔこ接種して接種量を均−ｔこした。
３表 Ｄｅｃ （デコイニン）會こ対する耐性変向、接
種量は、試験菌を上記液体培地ｔこ５６２ｎｍにおける
吸光度が０．１になるように懸濁し、そのＯ，Ｉ−’ｆ
各試験管ｔこ接種して接種量を均−ｔこした。
本発明において「トリファンビシンケこ耐性を有する変
異株」とは、アデニン又はリファンピシンを含有する培
地中にて、親株の相対生育値よりも高い相対生育値を有
するような変異株をいう。
異株」とは、アデニン又はリファンピシンを含有する培
地中にて、親株の相対生育値よりも高い相対生育値を有
するような変異株をいう。
このよう、な変異株を培養する培地は、炭素源、窒素源
、無機塩類、アデニンおよび必要ならば更にその他の微
量栄養素を含有する通常の液体培地である。炭素源とし
ては、グルコース、糖蜜、デンプン加水分解液などの炭
水化物、酢酸、グルフン酸などの有機酸、エタノールな
どのアルコ−、ルなどが使用できる。窒素源としては硫
安、硝安、塩安、リン安等のアンモニウム塩、硝安等の
硝酸塩、尿素、アンモニアガス等が使用できる。また栄
養要求物質としてのアデニンはアデニン、アデニン鉱酸
塩、アデノシン、アデニル酸、リポ核酸等のいずれも使
用可能である。また必要に応じてビタミン類、アミノ酸
、アデニン以外の核ｍ 塩基などの微量栄養素を添加す
れば５′−イノシン酸の蓄積量を増す場合が多い。
、無機塩類、アデニンおよび必要ならば更にその他の微
量栄養素を含有する通常の液体培地である。炭素源とし
ては、グルコース、糖蜜、デンプン加水分解液などの炭
水化物、酢酸、グルフン酸などの有機酸、エタノールな
どのアルコ−、ルなどが使用できる。窒素源としては硫
安、硝安、塩安、リン安等のアンモニウム塩、硝安等の
硝酸塩、尿素、アンモニアガス等が使用できる。また栄
養要求物質としてのアデニンはアデニン、アデニン鉱酸
塩、アデノシン、アデニル酸、リポ核酸等のいずれも使
用可能である。また必要に応じてビタミン類、アミノ酸
、アデニン以外の核ｍ 塩基などの微量栄養素を添加す
れば５′−イノシン酸の蓄積量を増す場合が多い。
培養方法は好気的条件がよく、また、培養温度は２４な
いし４０ｒの範囲がよい。場合１こよっては発酵途中に
て発酵温度を若干変更させてもよい。
いし４０ｒの範囲がよい。場合１こよっては発酵途中に
て発酵温度を若干変更させてもよい。
培養開始時および培養中１こ培養液のｐＨを５．０ない
し９．０に調節するのが望ましい。ｐＨ調整ｔこけ無機
酸、有機酸あるいはアルカリ、さらｔこ尿素、炭酸カル
シウム、アンモニア水、アンモニアガスなどを使用する
ことが出来る。かくして２ないし７日間培養すれば著量
の５１−イノシン酸が培地中ｔこ蓄積される。
し９．０に調節するのが望ましい。ｐＨ調整ｔこけ無機
酸、有機酸あるいはアルカリ、さらｔこ尿素、炭酸カル
シウム、アンモニア水、アンモニアガスなどを使用する
ことが出来る。かくして２ないし７日間培養すれば著量
の５１−イノシン酸が培地中ｔこ蓄積される。
発酵液より５°−イノシン酸を採取する１こは、例えば
菌体な分離除去し、その濾液を脱色樹脂と７ニオン交換
樹脂とを併用し、あるいはアニオン交換樹脂とカチオン
交換樹脂とを併用して処理すれば比較的純粋な５゛−イ
ノシン酸含有水溶液が得られる。
菌体な分離除去し、その濾液を脱色樹脂と７ニオン交換
樹脂とを併用し、あるいはアニオン交換樹脂とカチオン
交換樹脂とを併用して処理すれば比較的純粋な５゛−イ
ノシン酸含有水溶液が得られる。
以下、実施例ｔごて説明する。
実施例！
第６表に示すシード培地及び主発酵培地を調製し、夫々
、５００＊／容のフラスコｔこ５０ｍ１宛分注し＋２０
ｒｔこて１０分間加熱滅菌した。
、５００＊／容のフラスコｔこ５０ｍ１宛分注し＋２０
ｒｔこて１０分間加熱滅菌した。
第 ６ 表
バチルス・ズブチリスの融合株ＡＪ１１８２０及び親株
のＡＪ１＋１５６をシード培地に接種し３４Ｃｔごて１
６時間振盪培養した。
のＡＪ１＋１５６をシード培地に接種し３４Ｃｔごて１
６時間振盪培養した。
このシード培養液１．０コな主発酵培地に接種し、３４
ｔｌ’にて７２時間振盪培養した。
ｔｌ’にて７２時間振盪培養した。
培養液中に蓄−した５°−イノシン酸の量を高速液体ク
ロマトグラフィーで定量した。その結果を第７表に示し
た。
ロマトグラフィーで定量した。その結果を第７表に示し
た。
第７表 ５１−イノシン酸の蓄積量
Ａ Ｊ １１１５６ １．５Ａ Ｊ １１
８２０ ２．２ＡＪ１１８２０の培養液１
０ｔより菌体な濾過分離し濾液を塩酸でｐＨ１，２ｔこ
し、［ダイヤイオンｓＫ＄ＩＪ（Ｈ型）の樹脂塔を通し
た。蒸留水を流し、濾液ケこ続いて流出される初期の流
出液のｓ’−ＩＭＰを含む分画を集め、水酸化ナトリウ
ムでｐＨ７，２に調節した。これを減圧濃縮後、冷却し
、５”−ＩＭＰ・２Ｎａ・７．５Ｈ，Ｏの結果１０．５
ｆを得た。
８２０ ２．２ＡＪ１１８２０の培養液１
０ｔより菌体な濾過分離し濾液を塩酸でｐＨ１，２ｔこ
し、［ダイヤイオンｓＫ＄ＩＪ（Ｈ型）の樹脂塔を通し
た。蒸留水を流し、濾液ケこ続いて流出される初期の流
出液のｓ’−ＩＭＰを含む分画を集め、水酸化ナトリウ
ムでｐＨ７，２に調節した。これを減圧濃縮後、冷却し
、５”−ＩＭＰ・２Ｎａ・７．５Ｈ，Ｏの結果１０．５
ｆを得た。
特許出願人 味の素株式会社
Claims (1)
- バチルス属ｔこ属しアデニン要求性、キサンチン要求性
を有し、さら？こデコイニン及びリファンピシンに耐性
を有し、かつ５１−イノシン酸生産能を有する微生物を
培養して培養液中−こ５°−イノシン酸を生成・蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする発酵法による５
°−イノシン酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4156582A JPS58158196A (ja) | 1982-03-16 | 1982-03-16 | 発酵法による５′−イノシン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4156582A JPS58158196A (ja) | 1982-03-16 | 1982-03-16 | 発酵法による５′−イノシン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58158196A true JPS58158196A (ja) | 1983-09-20 |
| JPH0323160B2 JPH0323160B2 (ja) | 1991-03-28 |
Family
ID=12611960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4156582A Granted JPS58158196A (ja) | 1982-03-16 | 1982-03-16 | 発酵法による５′−イノシン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58158196A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63185372A (ja) * | 1987-01-28 | 1988-07-30 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 微生物の育種方法 |
-
1982
- 1982-03-16 JP JP4156582A patent/JPS58158196A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63185372A (ja) * | 1987-01-28 | 1988-07-30 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 微生物の育種方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0323160B2 (ja) | 1991-03-28 |
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