JP7002414B2 - 温度応答性細胞培養基材 - Google Patents
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Description
温度応答性層(A)を有する温度応答性細胞培養基材であって、
前記温度応答性層(A)が温度応答性ポリマーを含み、
前記温度応答性層(A)に含まれる、分子量Mの常用対数(logM)が4.0以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、logMが5.5以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、60%以上である、
温度応答性細胞培養基材。
項2.
前記温度応答性層(A)に含まれる、分子量Mの常用対数(logM)が4.0以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、logMが6.0以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、15%以上である、
項1記載の温度応答性細胞培養基材。
項3.
前記温度応答性ポリマーが、デンドリティックポリマーの末端に温度応答性のブロックが結合したブロックポリマーを含む、項1又は2に記載の温度応答性細胞培養基材。
項4.
前記デンドリティックポリマーが、スチレン骨格又はシロキサン骨格のデンドリティックポリマーである、項3に記載の温度応答性細胞培養基材。
項5.
前記温度応答性ポリマーの少なくとも一種が、
(メタ)アクリルアミド、N-(若しくはN,N-ジ)置換(メタ)アクリルアミド及びビニルエーテルからなる群より選択される少なくとも一種を含むモノマーを重合することにより得られうる温度応答性ポリマー、又は
ポリビニルアルコール部分酢化物
を少なくとも一部に含む、項1~4のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
項6.
前記N-(若しくはN,N-ジ)置換(メタ)アクリルアミドが、ポリ-N-イソプロピル(メタ)アクリルアミド、ポリ-N、N-ジエチル(メタ)アクリルアミド、及びポリ-N、N-ジメチル(メタ)アクリルアミドからなる群より選択される少なくとも一種である、項5に記載の温度応答性細胞培養基材。
項7.
さらに基材層(B)を有し、前記温度応答性層(A)は、前記基材層(B)の少なくとも一方の面に配置されている、項1~6のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
項8.
前記基材層(B)がポリスチレンを含む、項7に記載の温度応答性細胞培養基材。
項9.
温度応答性ポリマーを含む組成物であって、分子量Mの常用対数(logM)が4.0以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、logMが5.5以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、60%以上である、組成物。
項10.
項1~8のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材を製造するために用いられる、項9に記載の組成物。
本開示の温度応答性細胞培養基材は、
温度応答性層(A)を有する温度応答性細胞培養基材であって、
前記温度応答性層(A)が温度応答性ポリマーを含み、
前記温度応答性層(A)に含まれる、分子量Mの常用対数(logM)が4.0以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、logMが5.5以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、60%以上である、
温度応答性細胞培養基材である。
1.1 温度応答層(A)
P[NIPAM/B(M)A]-b-P(Styrene)
P[NIPAM/F(M)A]-b-P(Styrene)
NIPAM:N-イソプロピルアクリルアミド
B(M)A:ブチル(メタ)アクリレート
F(M)A:フルオロアルキル(メタ)アクリレート
なお、上記において、P[NIPAM/B(M)A]等とあるのは、NIPAMとB(M)Aとの共重合体を意味し、-b-は、その記号の両端のポリマーのブロックをそれぞれ有するブロックポリマーを意味する。上記において、P[NIPAM/B(M)A]とP[NIPAM/F(M)A]とがいずれも温度応答性領域に相当し、P(Styrene)(ポリスチレン)が非温度応答性領域に相当する。
B/(A+B)×100(%) ・・・(1)
(5) 吸収強度比率=I1650/I1600
温度応答性領域を構成するポリマーは、特に限定されず、幅広く選択することができる。温度応答性領域を構成するポリマーは、具体的には、下限臨界溶解温度(LCST)を有するポリマー、又は上限臨界溶解温度[Upper Critical Solution emperature(UCST)]を有するポリマーが挙げられ、ブロックポリマーであってもよい。ブロックポリマーは、一種の温度応答性ブロックを含んでいてもよいし、複数種の温度応答性ブロックを含んでいてもよい。
CH2=C(-X)-C(=O)-Y-Z-Rf (1)
Yは、-O-又は-NH-であり;
Zは、炭素数1~10の脂肪族基、炭素数6~10の芳香族基若しくは環状脂肪族基、
-CH2CH2N(R1)SO2-基(但し、R1は炭素数1~4のアルキル基である。
)、-CH2CH(OZ)1)CH2-基(但し、Z1は水素原子又はアセチル基である。)、-(CH2)m-SO2-(CH2)n-基、-(CH2)m-S-(CH2)n-基(但し、mは1~10、nは0~10である。)又は-(CH2)m-COO-基(mは1~10である。)であり;
Rfは、ヘテロ原子を有していてもよい、炭素数1~20の直鎖状又は分岐状のフルオロアルキル基である。]で表されるアクリル酸エステル及びアクリルアミドを例示できる。
CH2=C(-H)-C(=O)-O-C6H4-Rf
CH2=C(-Cl)-C(=O)-O-(CH2)2-Rf
CH2=C(-H)-C(=O)-O-(CH2)2N(-CH3)SO2-Rf
CH2=C(-H)-C(=O)-O-(CH2)2N(-C2H5)SO2-Rf
CH2=C(-H)-C(=O)-O-CH2CH(-OH)CH2-Rf
CH2=C(-H)-C(=O)-O-CH2CH(-OCOCH3)CH2-Rf
CH2=C(-H)-C(=O)-O-(CH2)2-S-Rf
CH2=C(-H)-C(=O)-O-(CH2)2-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-H)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-Rf
CH2=C(-H)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-H)-C(=O)-NH-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CH3)-C(=O)-O-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CH3)-C(=O)-O-C6H4-Rf
CH2=C(-CH3)-C(=O)-O-(CH2)2N(-CH3)SO2-Rf
CH2=C(-CH3)-C(=O)-O-(CH2)2N(-C2H5)SO2-Rf
CH2=C(-CH3)-C(=O)-O-CH2CH(-OH)CH2-Rf
CH2=C(-CH3)-C(=O)-O-CH2CH(-OCOCH3)CH2-Rf
CH2=C(-CH3)-C(=O)-O-(CH2)2-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CH3)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-Rf
CH2=C(-CH3)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CH3)-C(=O)-NH-(CH2)2-Rf
CH2=C(-F)-C(=O)-O-(CH2)2-S-Rf
CH2=C(-F)-C(=O)-O-(CH2)2-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-F)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-Rf
CH2=C(-F)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-F)-C(=O)-NH-(CH2)2-Rf
CH2=C(-Cl)-C(=O)-O-(CH2)2-S-Rf
CH2=C(-Cl)-C(=O)-O-(CH2)2-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-Cl)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-Rf
CH2=C(-Cl)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF3)-C(=O)-O-(CH2)2-S-Rf
CH2=C(-CF3)-C(=O)-O-(CH2)2-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF3)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-Rf
CH2=C(-CF3)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF3)-C(=O)-NH-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF2H)-C(=O)-O-(CH2)2-S-Rf
CH2=C(-CF2H)-C(=O)-O-(CH2)2-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF2H)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-Rf
CH2=C(-CF2H)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF2H)-C(=O)-NH-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CN)-C(=O)-O-(CH2)2-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CN)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-Rf
CH2=C(-CN)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CN)-C(=O)-NH-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF2CF3)-C(=O)-O-(CH2)2-S-Rf
CH2=C(-CF2CF3)-C(=O)-O-(CH2)2-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF2CF3)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-Rf
CH2=C(-CF2CF3)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF2CF3)-C(=O)-NH-(CH2)2-Rf
CH2=C(-F)-C(=O)-O-(CH2)3-S-Rf
CH2=C(-F)-C(=O)-O-(CH2)3-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-F)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-Rf
CH2=C(-F)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-F)-C(=O)-NH-(CH2)3-Rf
CH2=C(-Cl)-C(=O)-O-(CH2)3-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-Cl)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-Rf
CH2=C(-Cl)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF3)-C(=O)-O-(CH2)3-S-Rf
CH2=C(-CF3)-C(=O)-O-(CH2)3-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF3)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-Rf
CH2=C(-CF3)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF2H)-C(=O)-O-(CH2)3-S-Rf
CH2=C(-CF2H)-C(=O)-O-(CH2)3-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF2H)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-Rf
CH2=C(-CF2H)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CN)-C(=O)-O-(CH2)3-S-Rf
CH2=C(-CN)-C(=O)-O-(CH2)3-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CN)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-Rf
CH2=C(-CN)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF2CF3)-C(=O)-O-(CH2)3-S-Rf
CH2=C(-CF2CF3)-C(=O)-O-(CH2)3-S-(CH2)2-Rf
CH2=C(-CF2CF3)-C(=O)-O-(CH2)3-SO2-Rf
CH2=C(-CF2CF3)-C(=O)-O-(CH2)2-SO2-(CH2)2-Rf
[上記式中、Rfは、炭素数1~6、好ましくは、1~3のフルオロアルキル基である。]
C3F7OCF(CF3)CF2O-CF(CF3)CH2-Ac
(CF3)2CH-Ac
C2F5CH2-MAc
C2F5CH2-Ac
[上記式中において、Acはアクリレート、MAcはメタクリレートを、それぞれ表す。
]
本開示においては、温度応答層(A)が、デンドリティックポリマーの末端に、前記温度応答性領域を構成するポリマーが結合したブロックポリマー(本明細書において、「デンドリティックブロックコポリマー」という)を含有することが好ましい。これにより、より優れた細胞剥離性を有し、及び/又は使用中の温度応答性ポリマーの溶出が抑制された温度応答性細胞培養基材が得られやすくなる。
なお、以下に挙げる装置及び試薬等に換えて、それらと同等のものを使用してもよい。
装置 :特に限定されない。
検出器 :示差屈折率検出器RI
カラム:Styragel HR-4E+HR-5E
溶媒 :50mMのLiBrを含むDMF
流速 :1.0ml/min
カラム温度 :28℃
注入量 :100μl
標準試料:ポリスチレン
RAFT重合の開始剤は特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、2,2’-アゾビス(イソブチロニトリル)、2,2’-アゾビス(4-メトキシ‐2,4-ジメチルバレロニトリル)(V-70)及び2,2’-アゾビス[(2-カルボキシエチル)-2-(メチルプロピオンアミジン)(V-057)等が挙げられる。
チオカルボニルチオ基としては、ジチオエステル基、ジチオカルバメート基、トリチオカーボネート基、キサンタート基及びジチオベンゾエート基等が挙げられる。
ジオキサンとノルマルプロパノールとの混合溶媒の場合、例えば、ジオキサン:ノルマルプロパノール=0.5~2:4とすることができる。トルエンとノルマルブタノールとの混合溶媒の場合、例えば、トルエン:ノルマルブタノール=0.5~2:4とすることができる。アセトニトリルとN、N-ジメチルホルムアミドとの混合溶媒の場合、例えば、アセトニトリル:N、N-ジメチルホルムアミド=4:1~6:1とすることができる。
基材層(B)の材質は、窒素原子を有さないものであればよく、特に限定されない。通常、細胞培養に用いられるものであればよく特に制限されない。例えば、ガラス、改質ガラス、各種樹脂等が挙げられる。また、これらの他にもさらに、一般に形態付与が可能とされる材質からなるものであってもよい。そのような材質は、特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、樹脂、セラミックス及び金属類等が挙げられる。
本開示の組成物は、温度応答性ポリマーを含む組成物であって、該組成物に含まれる、分子量Mの常用対数(logM)が4.0以上である、温度応答性ポリマーの合計のうち、logMが5.5以上である、温度応答性ポリマーの合計が、60%以上である、組成物である。かかる組成物は、上記の温度応答性細胞培養基材を製造するために好ましく用いられる。
[S-(4-ビニル)ベンジル S’-アルキルトリチオカーボネートの合成]
窒素置換下の100ml三ッ口フラスコ中へ、ナトリウムメトキシド(5.6ml, 0.028mol)、メタノール(MeOH,28ml)を入れ、2分間撹拌させた。そこへ、2-エチル-1-ヘキサンチオール(4.10g,0.028mol)をMeOH(22ml)に溶解させたものを添加し、室温にて2時間撹拌した。そこへCS2(2.1ml, 0.035mol)を添加し、室温にて5時間撹拌した。さらに、4-ビニルベンジルクロリド(4.3ml, 0.028mol)を添加し、そのまま20時間室温にて撹拌した。反応後、水を添加し、ジクロロメタンにて抽出、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、硫化マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。精製は、ヘキサンを展開溶媒にカラムクロマトグラフィーにて行った。オレンジ色液体の目的物が、5.6gの収率にて得られた(参考文献:Macromolecules 2011,44,2034-2049)
窒素置換下の10ml枝管付フラスコ中へ、S-(4-ビニル)ベンジル S’-(2-エチル-1-ヘキシル)トリチオカーボネート(1.20g, 3.61×10-3mol)、脱水トルエン(1ml)を入れ、撹拌して溶解させた。さらに2,2’ -アゾジイソブチロニトリル(AIBN,0.0745g, 4.50×10-4mol)を添加し、80℃にて10時間撹拌した。反応後、トルエンを2ml追加し希釈した後、氷浴中で冷却したヘキサン中へ滴下・再沈させ、オレンジ色のオイル状のポリマーを0.58g回収した。
窒素置換下の10ml枝管付フラスコ中へ、上述したデンドリティックポリマー1(0.028g)、N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM,1g, 8.85×10-3mol)、脱水テトラヒドロフラン(THF,3ml)を入れ、撹拌して溶解させた。さらに、AIBN (4.0×10-3g, 4.6×10-6mol)を添加し、70℃にて10時間撹拌した。反応後、THFを3ml添加し希釈した後、ヘキサン中へ滴下・再沈させ、卵色固体を回収した。再度THF5mlに溶解させ、ヘキサン中へ再沈を行い、白色の粉末状固体HBP-0を0.706g得た。
前項で得られたブロックポリマーHBP-0をGPCの溶出時間の差により分画し、異なる分子量分布を有するポリマーHBP-1~5を得た。これらのポリマーは、GPC測定(カラム:Styragel HR-4E+HR-5E、溶離液:50mM LiBr in DMF、標準:ポリスチレン)により分子量分布測定を行った。
B/(A+B)×100(%) ・・・(1)
[コーティング溶液の調製]
製造例1にて合成、分画したポリマーHBP-1についてそれぞれ10mgを、THF/MeOH=1/4(v/v)の混合溶媒(4ml)へ溶解させた。これを、母液と称する。この母液を、培養面積9.6cm2のセルカルチャーディッシュに50μl塗布した時の、PNIPAM塗布量が3.5μg/cm2となるよう、THF/MeOH=1/4(v/v)の混合溶媒でさらに希釈した。
上記方法で得られたコーティング溶液(50μl)を、ポリスチレン製セルカルチャーディッシュ(コーニング製Falcon3001、培養面積9.6cm2)に塗布し、蓋をした。そのまま2.5時間静置・乾燥させ、温度応答性細胞培養基材を得た。
コーティング溶液の調製に使用するポリマーをHBP-2~5とした他は、実施例1と同様にして温度応答性細胞培養基材をそれぞれ得た(表2)。
コーティング溶液の調製に使用するポリマーを分画前のHBP-0とした他は、実施例1と同様にして温度応答性細胞培養基材を得た。
未処理のφ3.5cmのポリスチレン製の細胞培養ディッシュ(Falcon3001)を用意した。
PNIPAMのホモポリマーを表面に有する、市販されているφ3.5cmの温度応答性細胞培養容器(セルシード製UpCell、培養面積9.6cm2)を用意した。
(1)培養条件
培地:10%FBS(fetal bovine serum)、および1%ペニシリン(Penicillin-Streptomycin)含有DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)-high glucose (ナカライテスク) 2ml
予め、細胞培養容器内で3T3マウス線維芽細胞を培養し、細胞を回収後に細胞数を数え、培地に対し5×104cells/mLになるように細胞懸濁液を用意した。
培養終了後、培養細胞の付着状態、並びに培養細胞がシャーレ内で満杯(コンフルエント)になるまで増殖しているかどうかを、倒立顕微鏡を用いて観察した。その後、そのまま室温で静置し10分後よりゆっくりと振動を与えた。観察は、インキュベーターより取り出し後50分間行った。細胞シートが自発的に剥離するまでの時間を測定した。
製造例1で分画したNo.HBP-1,-2について、実施例1と同様に塗布溶液を調整し、塗布したサンプルを作製した。塗布乾燥後、室温水中で1時間静置後に乾燥させた。比較例として、市販されている温度応答性細胞培養容器に対しても、同様に室温水中で1時間静置後に乾燥させた。これらのサンプルについて、ポリマー溶出試験前後のPNIPAM存在量を、IR-ATR法により測定し、HBPの溶出の有無を確認した。
Claims (8)
- 温度応答性層(A)を有する温度応答性細胞培養基材であって、
前記温度応答性層(A)が、分子量Mの常用対数(logM)が3.5を超える温度応答性ポリマーを分画した温度応答性ポリマーを含み、
前記温度応答性層(A)に含まれる、logMが4.0以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、logMが5.5以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、60%以上であり、logMが6.0以上である温度応答性ポリマーの含有量が15%以上であり、かつ、
前記温度応答性ポリマーが、スチレン骨格のデンドリティックポリマーの末端に温度応答性のブロックが結合したブロックポリマーを含む、
温度応答性細胞培養基材。 - 前記温度応答性層(A)に含まれる、分子量Mの常用対数(logM)が4.0以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、logMが6.0以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、17%以上である、
請求項1記載の温度応答性細胞培養基材。 - 前記温度応答性ポリマーの少なくとも一種が、
(メタ)アクリルアミド、N-(若しくはN,N-ジ)置換(メタ)アクリルアミド及びビニルエーテルからなる群より選択される少なくとも一種を含むモノマーを重合することにより得られうる温度応答性ポリマー、又は
ポリビニルアルコール部分酢化物
を少なくとも一部に含む、請求項1又は2に記載の温度応答性細胞培養基材。 - 前記N-(若しくはN,N-ジ)置換(メタ)アクリルアミドが、ポリ-N-イソプロピル(メタ)アクリルアミド、ポリ-N、N-ジエチル(メタ)アクリルアミド、及びポリ-N、N-ジメチル(メタ)アクリルアミドからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項3に記載の温度応答性細胞培養基材。
- さらに基材層(B)を有し、前記温度応答性層(A)は、前記基材層(B)の少なくとも一方の面に配置されている、請求項1~4のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
- 前記基材層(B)がポリスチレンを含む、請求項5に記載の温度応答性細胞培養基材。
- 分子量Mの常用対数(logM)が3.5を超える温度応答性ポリマーを分画した温度応答性ポリマーを含む組成物であって、logMが4.0以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、logMが5.5以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、60%以上であり、logMが6.0以上である温度応答性ポリマーの含有量が15%以上であり、かつ、
前記温度応答性ポリマーが、スチレン骨格のデンドリティックポリマーの末端に温度応答性のブロックが結合したブロックポリマーを含む、
組成物。 - 請求項1~6のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材を製造するために用いられる、請求項7に記載の組成物。
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