JP5349728B2

JP5349728B2 - 細胞培養基材及び細胞培養方法

Info

Publication number: JP5349728B2
Application number: JP2003350680A
Authority: JP
Inventors: 敢武久; 和敏原口
Original assignee: Kawamura Institute of Chemical Research; DIC Corp
Current assignee: Kawamura Institute of Chemical Research; DIC Corp
Priority date: 2003-10-09
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2023-10-09
Also published as: JP2005110604A

Description

本発明は、水溶性有機モノマーの重合体と水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルからなる細胞培養基材、及び該高分子ヒドロゲルからなる細胞培養基材を利用した細胞培養方法と細胞培養分離方法に関する。

従来、動物組織等の細胞培養基材としては、プラスチックやガラスの容器が使用されていた。これら容器は、培養細胞の接着性を制御するために、その表面にプラズマ処理や、シリコンや細胞接着因子等のコーティングなどの表面処理が施されている。これら細胞培養容器を培養基材として用いた場合には、細胞培養容器上で培養・増殖した細胞が表面処理された容器表面に接着しており、トリプシン等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品を用いて、容器表面から剥離する操作を行い、回収されるため、酵素や化学薬品により細胞を剥離する際に、雑菌やＤＮＡあるいはＲＮＡ等の不純物が混入する恐れがあった。また、細胞と基材の結合部分が切断されるだけではなく、細胞同士の結合も切断され、細胞が増殖している形状のまま回収できないだけではなく、細胞の性質が変化してしまう問題があった。つまり、細胞を回収する際にバラバラになり、シート状に取り出すことは困難であった。また、酵素や化学薬品による細胞の剥離は行程が煩雑であった。また、複数種の細胞培養を行う際には、培養液等の種類を交換する必要があるが、容器の交換が出来ないために、容器内部に各種薬品等が残留してしまい、これらが細胞培養に混入するおそれがあった。

また、細胞培養容器の表面に温度応答性ポリマーをコーティングした基材を使用して、細胞培養温度ではポリマーを疎水性状態に保持して細胞を接着させ、培養後にポリマーを低温処理してポリマーを親水性状態にすることにより、細胞とポリマーとの接着性を低下させ、細胞を加水分解酵素や化学薬品を使用することなしに基材から細胞をシート状に剥離するという技術が用いられている（例えば特許文献１及び２参照）。しかしながら、上記基材はポリマーの架橋度によって性能が大きく変化し、架橋が不十分な場合は、細胞を剥離する際に、細胞と共にポリマーも基材から一部剥離してしまい、細胞と基材との分離が困難であった。また架橋が十分な場合には、温度応答性の応答速度が非常に悪くなり、ポリマーを親水性にするために長時間を要する問題があり、その間、細胞も低温状態にさらされる問題があった。さらに、該基材を使用した場合には、培養した細胞を次の実験に用いる場合、例えば動物の体内に移植する場合や、他の細胞と共培養を行う場合など、シート状となった細胞を支持体なしで移動させる必要があり、細胞シート自体をポリマーコーティングされた容器から剥離して、細胞シートのみを移動させる必要があり、剥離された、非常に強度の弱い細胞シートを強引に掴んで次の実験位置等に移動させなければならず、細胞シートが傷つきやすかったり、操作性が非常に悪いという問題を有していた。これらのことから、細胞を培養した後、汚染や傷つくことなく完全に分離され、且つ短時間で、且つ任意の場所で細胞シートを取り出し、さらに次の工程に移動させ用いることが必要であった。

一方、水溶性有機高分子と層状粘土鉱物とが複合化して形成された三次元網目を有する高分子ヒドロゲルが開示されている（特許文献３参照）。該高分子化合物は優れた吸水性や極めて高い伸張性などの特徴を有し、各種分野において有用な材料であるが、細胞培養基材としての有用性は知られていなかった。

特公平６−１０４０６１公報特開平５−１９２１３８公報特開２００２−５３６２９号公報

本発明が解決しようとする課題は、柔軟かつ強靱な細胞培養基材、さらには培養した細胞を分離回収する際に細胞の破損や基材の混入がなく、迅速に培養した細胞を回収できる細胞培養基材、及び培養した細胞の回収が容易な細胞培養方法を提供することにある。

本発明において使用する、水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルは、その表面上で好適に細胞を培養でき、また柔軟かつ強靱な材料であることから、細胞をその表面上でシート状に培養して、その形状を保った状態で次の実験に用いることを実現できる。さらに温度条件をはじめとする各種条件設定により親水性と疎水性とを示す高分子ヒドロゲルを使用することにより、該高分子ヒドロゲルからなる細胞培養基材は、疎水性を示す条件下では好適に細胞を培養、増殖させることができ、また親水性を示す条件下では、細胞との接着性を低下させることができるため、培養、増殖させた細胞の破損や、基材の剥離混入を生じることなく、容易かつ迅速に剥離回収することができる。

即ち本発明は、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−シクロプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン及びＮ−アクリロイルピロリディンからなる群から選ばれる少なくとも一種の水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルからなる細胞培養基材、該細胞培養基材上で細胞を培養する細胞培養方法、および該細胞培養基材上で細胞を培養した後、該基材を親水性を示す温度とすることで培養した細胞を該細胞培養基材から分離する細胞分離方法を提供する。

本発明の細胞培養基材は、水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルからなるため、優れた柔軟性と強靱さを有することから、培養した細胞を基材ごと移送する際にも形状を保持したまま、安定に培養した細胞を移送できる。さらに最初の細胞培養後に共培養を行う場合等には、培養液や薬品による汚染がなく、再度の培養を行うことが可能である。

親水性と疎水性とが外部環境により可逆的に変化する高分子ヒドロゲルからなる細胞培養基材は、疎水性条件下では細胞と優れた接着性を示すため、細胞を好適に培養、増殖させることができ、また親水性条件下では、細胞との接着性を低下させることができるため、トリプシン等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品を使用せずに細胞を剥離できるため、細胞の破損や、基材の剥離混入を生じることなく、容易に細胞の回収が可能である。さらに、疎水性から親水性、あるいは親水性から疎水性への変化が迅速であるため、温度をはじめとする外部環境を変化させる際に細胞に与える影響が少ない。

本発明の細胞培養基材は、水溶性有機モノマーの重合体と水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルからなる。

本発明の高分子ヒドロゲルに用いる水溶性有機モノマーは、水に溶解する性質を有し、水に均一分散可能な水膨潤性の粘土鉱物と相互作用を有するものであればよく、例えば、粘土鉱物と水素結合、イオン結合、配位結合、共有結合等を形成できる官能基を有するものが好ましい。これらの官能基を有する水溶性有機モノマーとしては、具体的には、アミド基、アミノ基、エステル基、水酸基、テトラメチルアンモニウム基、シラノール基、エポキシ基などを有する水溶性有機モノマーが挙げられ、なかでもアミド基を有する水溶性有機モノマーが好ましい。また、本発明で言う水には、水と混和する有機溶媒との混合溶媒で水を主成分とするものを含む。

本発明における水溶性有機モノマーの重合体は、水膨潤性粘土鉱物と三次元網目構造を形成して形状が安定な高分子ヒドロゲルを形成できるものであればよく、アクリル系化合物や、ビニル系化合物などを使用できる。なかでも、得られる細胞培養基材から容易に培養した細胞を分離できることから、水溶性または水を吸湿する親水性と共に、疎水性を併せ持つものであることが有効である。特に水溶液中でのポリマーの親水性と疎水性が温度、ｐＨ、溶質濃度、溶媒組成で変化するものが好んで用いられる。具体的には、例えば温度の場合、臨界温度（Ｔｃ）以上では疎水性となる下限臨界共溶温度（Lower Critical Solution Temperature：以下ＬＣＳＴと略記する。）を持つポリマーや、Ｔｃ以上で親水性となる、上限臨界共溶温度（Upper Critical Solution Temperature：以下ＵＣＳＴと略記する。）を持つポリマーがより好んで用いられる。また、溶質濃度の場合は、例えばある温度において、溶媒中の塩化ナトリウムの濃度が一定濃度以上では疎水性となり、一定濃度以下では親水性となるポリマーも好んで用いられる。さらに、溶媒組成の場合は、例えばある温度において、溶媒中の水に対するメタノール濃度が一定以上の濃度の場合は疎水性となり、一定濃度以下では親水性となるポリマーも好んで用いられる。

このような重合体を与える水溶性有機モノマーの例としては、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換アクリルアミド誘導体、Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換メタクリルアミド誘導体などを好ましく使用することができ、具体的にはＮ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン、Ｎ−アクリロイルピロリディンがあげられる。

かかる有機モノマーの重合体としては、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−テトラフルフリルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピペリディン）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピロリディン）が例示される。

また水溶性有機モノマーの重合体としては、以上のような単一水溶性有機モノマーからの重合体の他、これらから選ばれる複数の異なる水溶性有機モノマーを重合して得られる共重合体を用いることも有効である。また上記水溶性有機モノマーからなる重合体が好ましいが、上記水溶性有機モノマーとそれ以外の水溶性有機モノマーまたは有機溶媒可溶性有機モノマーとの共重合体も、得られた重合体が親水性及び疎水性の両方を示すものであれば使用することが出来る。共重合に用いられる有機モノマーとしては、具体的にはＮ−アルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、アクリルアミド等のアクリルアミド類、または、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメタクリルアミド、メタクリルアミド等のメタクリルアミド類が挙げられる。なお、より好ましくは、Ｎ−アルキルアクリルアミドまたはＮ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドが用いられる。アルキル基としては、炭素数が１〜４のものが好ましく選択される。その他には、アクリロイルモルフォリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルメチルホモピペラディン、Ｎ−アクリロイルメチルピペラディン等も用いることが出来る。

本発明の細胞培養基材に用いられる粘土鉱物は、水又は水溶液中で層間が膨潤する性質を有することが必要である。より好ましくは少なくとも一部が水中で層状に剥離して分散できるものであり、更に好ましくは水中で１ないし１０層以内の厚みに、特に好ましくは水中で１ないし３層以内の厚みに層状に剥離して均一分散できる層状粘土鉱物である。例えば、水膨潤性スメクタイトや水膨潤性雲母などを用いることができ、具体的には、ナトリウムを層間イオンとして含む水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリロナイト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性合成雲母が挙げられる。

本発明の細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルは、上記水膨潤性粘土鉱物と水溶性有機モノマーの重合体が三次元網目構造を有することから、該高分子ヒドロゲルからなる細胞培養基材は、細胞を培養した後、高分子ヒドロゲルから細胞を剥離する際に破壊することがなく、形状を維持できる特徴を有する。また本発明の細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルは、細胞を培養後、次の実験位置まで移動させる必要がある場合に、培養した細胞のシートを破壊することなく移動できる。該高分子ヒドロゲルは、１ｋＰａ以上の引っ張り弾性率、２０ｋＰａ以上の引っ張り強度、および５０％以上の破断伸びのものを実現でき、これら特性を有するものは好ましく使用できる。また引っ張り弾性率が５ｋＰａ以上、引っ張り強度が５０ｋＰａ以上、破断伸びが５０％以上であればより好ましく、引っ張り弾性率が１０ｋＰａ以上、引っ張り強度が８０ｋＰａ以上、破断伸びが１００％以上であればさらに好ましい。

該高分子ヒドロゲルは、三次元網目構造を形成する上記水溶性有機モノマーの重合体により、外部環境条件に応じて親水性と疎水性とを有する。このため、該高分子ヒドロゲルからなる細胞培養基材は細胞を好適に培養でき、かつ培養した細胞の破壊や基材の剥離混入を生じることなく、培養した細胞を容易かつ迅速に剥離回収することができる。

高分子ヒドロゲルの親水性と疎水性とが変化する臨界温度は、細胞を好適に培養・剥離できることから、該臨界温度は０〜５０℃程度の温度範囲にあることが好ましい。該臨界温度は、使用するモノマーの重合体が有するＵＣＳＴ、ＬＣＳＴに影響されるため、ＵＣＳＴ、ＬＣＳＴが概ね該温度範囲内にあるものを選択し、使用する水膨潤性粘土鉱物の種類や、水溶性有機モノマーと水膨潤性粘土鉱物との比率などを適宜調整することで実現できる。

本発明の細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルは、単独で用いられる他、金属、セラミック、プラスチック等の平滑表面または凹凸表面を有する支持体に被覆して用いられる。また、各種形状に形成が可能であり、シート状、繊維状、中空繊維状、球状で用いることができる。

本発明の細胞培養基材に使用する高分子ヒドロゲルは、水、水と混和する有機溶剤、あるいは塩などを含む水溶液を構造中に含有する。なお、高分子ヒドロゲル調製後に水と混和する有機溶剤に全体を置換することも可能である。水と混和する有機溶剤としては、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド及びそれらの混合溶媒が挙げられる。

本発明の細胞培養基材の製造方法としては、例えば、水溶性有機モノマーと水膨潤性粘土鉱物と水を含む均一分散液を調製した後、水膨潤性粘土鉱物共存下で水溶性有機モノマーを重合させることにより、高分子ヒドロゲルを調製する。ここで層状に剥離した粘土鉱物が架橋剤の働きをすることにより水溶性有機モノマー重合体と粘土鉱物との三次元網目が形成される。得られた高分子ヒドロゲルはそのままでも細胞培養基材として使用できるが、必要に応じて支持体上への被覆や、形状を調節することで、より好ましく細胞培養基材として使用できる。

水膨潤性粘土鉱物共存下での水溶性有機モノマーの重合反応は例えば、過酸化物を重合開始剤として使用して重合させる方法、加熱または放射線照射などの慣用の方法を用いたラジカル重合により行わせることが出来る。ラジカル重合開始剤及び触媒としては、慣用のラジカル重合開始剤及び触媒のうちから適宜選択して用いることが出来、好ましくは水に分散性を有し、系全体に均一に含まれるものを用いることができる。特に好ましくは層状に剥離した粘土鉱物と強い相互作用を有するラジカル重合開始剤である。重合開始剤としては水溶性の過酸化物、例えばペルオキソ二硫酸カリウムやペルオキソ二硫酸アンモニウム、水溶性のアゾ化合物などを好ましく使用でき、具体的には、和光純薬工業株式会社製のＶＡ−０４４、Ｖ−５０、Ｖ−５０１などが好ましく使用できる。その他、ポリエチレンオキシド鎖を有する水溶性ラジカル開始剤なども使用できる。また触媒としては、３級アミン化合物であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンやβ−ジメチルアミノプロピオニトリルなどを好適に使用できる。

上記重合反応時の温度は、用いる水溶性有機モノマー、重合触媒及び開始剤の種類などに合わせて適宜選択すればよく、例えば０℃〜１００℃の範囲に設定出来る。また、重合温度を得られる高分子ヒドロゲルのＬＣＳＴ以下（またはＵＣＳＴ以上）の温度とする場合、重合後の高分子ヒドロゲルは親水性となるが、ＬＣＳＴ以上（またはＵＣＳＴ以下）の温度にて保持することにより、親水性から疎水性の状態に変化させることが出来、細胞培養に適した状態となる。また、ＬＣＳＴ以上（またはＵＣＳＴ以下）の温度で重合を行った場合は、高分子ヒドロゲルは疎水性の状態となって得られるので、そのまま細胞培養を行うことが出来る。即ち、どちらの重合方法を用いても、細胞培養基材として用いられる高分子ゲルを得ることは可能である。但し、ＬＣＳＴ以下（またはＵＳＣＴ以上）の温度にて重合を行うと、重合により得られる高分子ヒドロゲルを疎水性の状態に変化させた時に収縮が起こるが、ＬＣＳＴ以上（またはＵＣＳＴ以下）の温度で重合を行うと、重合により得られる高分子ヒドロゲルは疎水性状態のまま保たれるため、そのまま収縮せずに細胞培養を行うことが出来るので好適である。以上のことは、その他の外部環境（溶液のｐＨ、重合時の親水性または疎水性を制御するために加える塩や、添加物等の溶質濃度、水と混和する有機溶剤等の溶媒組成）を変えても行うことも、有機モノマーの重合に差し支えない限り可能である。

重合時間は触媒、開始剤、重合温度、重合溶液量（厚み）などの重合条件によって異なり、一概に規定できないが、一般に数十秒〜十数時間の間で行える。

本発明の細胞培養基材の製造においては、重合時に重合容器の形状を変化させたり、重合後のゲルを切削加工したりすることにより種々の大きさや形状をもった細胞培養基材を調製できる。例えば、繊維状、棒状、平板状、円柱状、中空状、らせん状、あるいは球状など任意の形状を有する細胞培養基材を調製することが可能である。また重合反応時に慣用の界面活性剤を共存させる等の方法で、得られる細胞培養基材を微粒子形態で製造することも可能である。また、本発明の細胞培養基材は、一般に細胞培養に用いられているプラスチック製やガラス製のシャーレ等の非親水性の支持体の上に積層して用いることが好ましい。このような積層部材は、支持体上部で重合を行い、そのまま細胞培養に使用してもよいし、他の容器で重合後、基材表面に充填して細胞培養に使用しても良い。

本発明の細胞培養基材を構成する水溶性有機モノマーと粘土鉱物との比率は、用いる水溶性有機モノマーや粘土鉱物の種類により適宜選択すればよいが、ゲルの合成が容易であることや、力学物性及び均一性に優れることなどから、水溶性有機モノマー重合体に対する粘土鉱物の質量比が０．０１〜１０であることが好ましく、より好ましくは０．０３〜２、特に好ましくは０．１〜１である。かかる質量比の範囲であれば、高分子ヒドロゲルの特性が十分に発揮され、調製が容易であり、また得られる細胞培養基材がより高い強度を示す。

本発明において細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルに含まれる溶媒の量は、目的に応じて設定され一概には規定されないが、高分子ヒドロゲルが上記の力学物性を発揮するためには、好ましくは疎水性状態となっている高分子ヒドロゲル中の固形分に対する溶媒の質量比が０．１〜５０のものが用いられ、さらに好ましくは０．１〜１０のものが用いられる。これらの溶媒量は、重合時の溶媒量、または重合後に高分子ヒドロゲルを疎水性の状態に変化させる時の保持状態等により、任意に制御することが可能である。

本発明の細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルには、その特性を改良する目的で、重合時に公知慣用の有機架橋剤を使用してもよい。使用する有機架橋剤濃度は特に限定されず、目的に応じて選択できる。使用できる有機架橋剤としては、従来から公知のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−プロピレンビスアクリルアミド、ジ（アクリルアミドメチル）エーテル、１，２−ジアクリルアミドエチレングリコール、１，３−ジアクリロイルエチレンウレア、エチレンジアクリレート、Ｎ，Ｎ’−ジアリルタータルジアミド、Ｎ，Ｎ’−ビスアクリリルシスタミンなどの二官能性化合物や、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレートなどの三官能性化合物が例示できる。

本発明の細胞培養基材には、得られた高分子ヒドロゲル材料を慣用の方法で乾燥し、溶媒の一部もしくは全部を除去して乾燥物とすることもできる。かかる乾燥物は、水または水と混和する有機溶媒などの溶媒を再び含ませることにより、可逆的に細胞培養基材としての高分子ヒドロゲル材料を再生することが出来る。

また、本発明の細胞培養基材に用いられる高分子ヒドロゲルには、本発明の効果を損なわない範囲で添加剤として、水溶性有機モノマーの重合体以外に、高分子化合物または低分子化合物を含有させたものが含まれる。例えばコラーゲンやヒアルロン酸等の細胞接着性因子、細胞増殖因子、ヒドロキシアパタイト粒子などを添加することができる。

（作製例１）
粘土鉱物には、［Ｍｇ_５．３４Ｌｉ_０．６６Ｓｉ_８Ｏ_２０（ＯＨ）_４］Ｎａ^＋ _０．６６の組成を有する水膨潤性合成ヘクトライト（ＲｏｃｋｗｏｏｄＬｔｄ．製「ラポナイトＸＬＧ」）を真空乾燥して用いた。有機モノマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（興人株式会社製：以下、ＮＩＰＡと略記。）を既知の方法により精製して、重合禁止剤を取り除いてから使用した。重合開始剤は、ペルオキソ二硫酸カリウム（関東化学株式会社製：以下、ＫＰＳと略記。）をＫＰＳ／水＝０．４０／２０（ｇ／ｇ）の割合で脱酸素した超純水中に溶解し、水溶液にして使用した。触媒は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（和光純薬工業株式会社製：以下、ＴＥＭＥＤと略記。）を使用した。超純水は、全て微粒子除去用フィルターを通した高純度窒素をあらかじめ充分にバブリングさせ、含有酸素を除去してから使用した。

２０℃の恒温室において、内部を窒素置換した平底ガラス容器に、超純水５７．０６ｇとテフロン（登録商標）製攪拌子を入れ、攪拌しながら１．４４ｇのラポナイトＸＬＧを加え、無色透明の溶液を調製した。これにＮＩＰＡ６．７８ｇを加え、窒素雰囲気内で攪拌して無色透明溶液を得た。次に、ＫＰＳ水溶液３ｇとＴＥＭＥＤ４８μｌを攪拌しながら無色透明溶液に加えた。この溶液をあらかじめ窒素雰囲気中に静置して容器内の酸素を除去しておいた蓋付きのポリスチレン製容器（９ｃｍ×１５ｃｍ）３枚にそれぞれ酸素にふれないようにして移した後、密栓をし、２０℃の恒温水槽中で２０時間静置して重合を行った。なお、これらの溶液調製から重合までの操作は、全てクリーンベンチ内にて行い、さらに酸素を遮断した窒素雰囲気下で行った。重合開始から２０時間後に、ポリスチレン製容器内に無色透明で均一なシート状のヒドロゲル（Ａ）が得られた。

このシート状のヒドロゲル（Ａ）を、１ｃｍ×５ｃｍの大きさに切り取り、チャック部での滑りの無いようにして引っ張り試験装置（株式会社島津製作所製「卓上型万能試験機ＡＧＳ−Ｈ」）に装着し、評点間距離＝３０ｍｍ、引っ張り速度＝１００ｍｍ／分にて引っ張り試験を行った結果、引っ張り破断強度が８５ｋＰａ、破断伸びが１２００％、弾性率が１１．２ｋＰａであった。
次に、シート状のヒドロゲル（Ａ）を、２０℃で２Ｌの超純水に２日間浸漬して、ヒドロゲルを膨潤させてから取り出し、次いで５０℃の超純水１Ｌに１２時間浸漬して、ヒドロゲルを収縮させてから取り出した。該洗浄による精製操作を３回繰り返した後、精製したシート状のヒドロゲル（Ａ）を、直径８ｃｍの大きさに切断し、ヒドロゲル（Ａ）からなる細胞培養基材（Ａ）とした。それを細胞培養用ディッシュ（ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア社製「ファルコン３００３」）の中に移し替えてから蓋をして３７℃で静置した。この時細胞培養基材（Ａ）は、疎水化されたため、完全に白色化していた。なお、これらの精製から細胞培養ディッシュ内に細胞培養基材（Ａ）を移し替えるまでの操作は、すべてクリーンベンチ内で行った。

これらの操作で得られた細胞培養基材（Ａ）の表面に付着した水分をていねいに取り除いてから、該細胞培養基材（Ａ）表面の２０℃および５０℃における水の接触角を接触角測定装置（協和界面科学株式会社製「ＣＡ−Ｘ２００」）を用いて測定した。各々の温度における水の接触角は２０℃では２５°、５０℃保持状態では６２°であり、得られた細胞培養基材（Ａ）は、温度条件により親水性と疎水性の両特性を示すことが確認された。

（実施例１）
上記作製例１で得られた細胞培養基材（Ａ）含有細胞培養ディッシュを用いて、細胞の培養を行った。培養する細胞は、ヒト肝上皮細胞由来のガン細胞ＨｅｐＧ２細胞株（大日本製薬株式会社製）を使用した。培養は、ウシ胎児血清（ＩＣＮ製）を１０％含有するミニマム・エッセンシャル・イーグル培地（ＳＩＧＭＡ製）（ピルビン酸（ＩＣＮ製）及び非必須アミノ酸（ＩＣＮ製）を添加剤として含有）を使用して、５％二酸化炭素含有３７℃恒温器内で行った。播種してから１週間後、このディッシュ内の細胞培養基材（Ａ）の端を一部切り取り、２０℃恒温槽内に５分間静置してから、表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が細胞培養基材（Ａ）上に接着して、また十分に増殖していたことが確認された。この培養を行った細胞培養基材（Ａ）含有ディッシュから細胞培養基材（Ａ）を培養した細胞ごと取り出して、あらかじめ２０℃に保持しておいたウシ胎児血清を１０％含有するミニマム・エッセンシャル・イーグル培地を含む組織培養ディッシュに移し替えた。蓋をしてから２０℃で１０分間静置後、細胞培養基材（Ａ）上に増殖した細胞をピンセットで摘むことにより、細胞をシート状に細胞培養基材（Ａ）から分離できた。この時、細胞培養基材（Ａ）に何ら損傷はなく、またシート状の細胞にも何ら付着物は見られなかった。この取り出したシート状細胞についてトリプシン−ＥＤＴＡ処理を行い、各細胞を個々の状態に分離した後、トリパンブルー染色を行うことによって、生細胞数を計測したところ、培養開始時には２．５×１０^６個であった細胞数が、培養後は３．１×１０^７個に増加したことが確認された。

（作製例２）
重合を５０℃の恒温水槽中で行うこと以外は作製例１と同様にして、シート状のヒドロゲル（Ｂ）を得た。シート状のヒドロゲル（Ｂ）の引っ張り試験を参考例１と同様の方法で行ったところ、引っ張り破断強度が７１ｋＰａ、破断伸びが３００％、弾性率が１１．２ｋＰａであった。このシート状のヒドロゲル（Ｂ）を、作製例１と同様にして、精製を行った後、直径８ｃｍの大きさに切断して細胞培養基材（Ｂ）とした。得られた細胞培養基材（Ｂ）の表面に置ける接触角は、５０℃保持状態で５５°であった。

（実施例２）
作製例２で得られた細胞培養基材（Ｂ）含有細胞培養ディッシュを用いて、実施例１と同様の方法でＨｅｐＧ２細胞の培養を行った。細胞を播種してから１週間後、このディッシュ内のヒドロゲルシートの端を一部切り取り、２０℃恒温槽内に５分間静置してから、表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が細胞培養基材（Ｂ）上に接着して、また十分に増殖していたことが確認された。この培養を行った細胞培養基材（Ｂ）含有ディッシュから細胞培養基材（Ｂ）を培養された細胞ごと取り出して、あらかじめ２０℃に保持しておいたウシ胎児血清を１０％含有するミニマム・エッセンシャル・イーグル培地を含む組織培養ディッシュに移し替えた。蓋をしてから２０℃で１０分間静置後、細胞培養基材（Ｂ）上に増殖した細胞をピンセットで摘むことにより、細胞をシート状に細胞培養基材（Ｂ）から分離できた。この時、細胞培養基材（Ｂ）に何ら損傷はなく、またシート状の細胞にも何ら付着物は見られなかった。この取り出したシート状細胞について実施例２と同様の方法で生細胞数を計測したところ、培養開始時には２．５×１０^６個であった細胞数が、培養後には３．３×１０^７個に増加したことが確認された。

（作製例３）
２０℃の恒温室において、内部を窒素置換した平底ガラス容器に、超純水５７．０６ｇとテフロン（登録商標）製攪拌子を入れ、攪拌しながら１．４４ｇのラポナイトＸＬＧを加え、無色透明の溶液を調製した。これにＮＩＰＡ６．７８ｇ、及びブタ皮由来ペプシン可溶化コラーゲン（新田ゼラチン株式会社製、「タイプＩ」）の３．０ｍｇ／ｍｌ溶液１．０ｇを加え、窒素雰囲気内で攪拌して無色透明溶液を得た。次に、ＫＰＳ水溶液３．０ｇとＴＥＭＥＤ４８μｌを攪拌しながら無色透明溶液に加えた。この溶液を参考例１と同様に、２０℃の恒温水槽中で２０時間静置することによって重合を行った。なお、これらの溶液調製から重合までの操作は、全てクリーンベンチ内にて行い、さらに酸素を遮断した窒素雰囲気下で行った。重合開始から２０時間後に、ポリスチレン製容器内に無色透明で均一なシート状のヒドロゲル（Ｃ）が生成しており、このポリスチレン製容器から注意深く取り出した。このシート状のヒドロゲル（Ｃ）を用いて、実施例１と同様の方法で引っ張り試験を行ったところ、引っ張り破断強度が８１ｋＰａ、破断伸びが１０８０％、弾性率が８．８ｋＰａであった。

このシート状のヒドロゲル（Ｃ）を作製例１と同様の方法で、精製操作を３回行った後、直径８ｃｍの大きさに切断して細胞培養基材（Ｃ）とした。得られた細胞培養基材（Ｃ）を実施例１と同様の方法で、細胞培養用ディッシュに移し替えて、３７℃で保持した。この細胞培養基材（Ｃ）表面における水の接触角は、２０℃では２３°であり、５０℃保持状態では４９°であった。

（実施例３）
参考例３で得られた細胞培養基材（Ｃ）含有細胞培養ディッシュを用いて、実施例１と同様の方法でＨｅｐＧ２細胞の培養を行った。細胞を播種してから１週間後、このディッシュ内の細胞培養基材（Ｃ）の端を一部切り取り、２０℃恒温槽内に５分間静置してから、表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が細胞培養基材（Ｃ）上に接着して、また十分に増殖していたことが確認された。この培養を行った細胞培養基材（Ｃ）含有ディッシュから細胞培養基材（Ｃ）を培養された細胞ごと取り出して、あらかじめ２０℃に保持しておいたウシ胎児血清を１０％含有するミニマム・エッセンシャル・イーグル培地を含む組織培養ディッシュに移し替えた。蓋をしてから２０℃で１０分間静置後、細胞培養基材（Ｃ）上に増殖した細胞をピンセットで摘むことにより、細胞をシート状に細胞培養基材（Ｃ）から分離できた。この時、細胞培養基材（Ｃ）に何ら損傷はなく、またシート状の細胞にも何ら付着物は見られなかった。この取り出したシート状細胞について実施例１と同様の方法で生細胞数を計測したところ、培養開始時には２．０×１０^６個であった細胞数が、培養後は３．９×１０^７個に増加したことが確認された。

（比較例１）
細胞培養用ディッシュ「ファルコン３００３」を何も表面処理を行わずに使用して、細胞培養を行った。細胞及び培地、培養条件は実施例２と同様にして行った。培養開始から１週間後にディッシュ表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が接着して増殖していることが確認された。この培養を行ったディッシュを２０℃の恒温槽に入れて，１０分間静置後、ディッシュ上の細胞を取り出そうとしたが、全く剥離しなかった。また、公知の方法により、トリプシンを用いて培養細胞の分離を行ったところ、細胞が個々の細胞に分かれてしまい、細胞をシート状に取り出すことは不可能であった。

（比較例２）
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをイソプロピルアルコールに溶解させて、５０ｗｔ％の溶液を調製した。この溶液を細胞培養用ディッシュ「ファルコン３００３」表面に、０．２ｍｌ添加して、電子線を照射することにより、ディッシュ表面にポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の被膜を形成した。照射量は３０Ｍｒａｄとした。照射後、超純水を使用して、ディッシュ表面を洗浄した。このディッシュを用いて、実施例１と同様の細胞培養を行ったところ、ディッシュの表面に細胞が接着して増殖していることが確認された。このディッシュを２０℃の恒温槽に１０分間静置後、細胞を取り出そうとしたが、ディッシュ表面と細胞との分離が不十分であり、シート状に細胞を剥離することは不可能であった。

Claims

Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−シクロプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン及びＮ−アクリロイルピロリディンからなる群から選ばれる少なくとも一種の水溶性有機モノマーの重合体と、水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルからなる細胞培養基材。
前記高分子ヒドロゲルが、含水率９０％の条件において、１ｋＰａ以上の引っ張り弾性率、２０ｋＰａ以上の引っ張り強度、および５０％以上の破断伸びを有する高分子ヒドロゲルである請求項１記載の細胞培養基材。
前記高分子ヒドロゲルが、水に均一に分散した水膨潤性粘土鉱物の存在下で、前記水溶性有機モノマーを重合させてなる高分子ヒドロゲルである請求項１又は２記載の細胞培養基材。
前記水溶性有機モノマーの重合体が、疎水性を示す条件で重合されてなる重合体である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養基材。
請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養基材を使用して、該細胞培養基材が疎水性を示す温度下で細胞を培養した後、該細胞培養基材の温度を下げ、該細胞培養基材が親水性を示す温度とすることにより培養した細胞を該細胞培養基材から分離する細胞培養方法。