JP6879365B2 - 温度応答性細胞培養基材及びその製造方法 - Google Patents
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Description
温度応答性細胞培養基材から回収した細胞(シート状に限定されない)は、化学的、物理的に損傷を受けていない特徴がある。また、温度応答性細胞培養基材から回収した細胞シートは、接着性タンパク質をそのまま保持しており、生体組織にも速やかに付着することができる。また、細胞シート同士を積層化すれば組織化することもでき、今後の再生医療技術の展開のためのプラットホーム技術と位置付けられる。
(A)温度応答層;及び
(B)基材層
を含有する温度応答性細胞培養基材であって、
前記温度応答層(A)は、窒素原子を有する温度応答性ポリマーを含有し、
前記温度応答層(A)は、前記基材層(B)の少なくとも一方の面に配置されており、
前記基材層(B)は、窒素原子を有さず、かつ
前記温度応答層(A)側の表面は、放出角45°におけるX線光電子分光法で測定される窒素元素濃度N1s及び炭素元素濃度C1sが、以下の数式(1):
(1)100×(N1s/C1s)/(N/C)≧80
(数式中、N/Cは、前記温度応答性ポリマーにおける各元素比の理論値を表わす)
を満たす、温度応答性細胞培養基材。
項2.
前記温度応答層(A)側の表面は、アルゴンガスクラスターイオンビームにより表面側からエッチングしながら、X線光電子分光法により測定されるN1sとC1sとが、以下の条件(A)を満たす、項1に記載の温度応答性細胞培養基材:
(A)エッチング深さ2nmにおける測定値が、以下の数式(2)を満たす:
(2)100×(N1s/C1s)/(N/C)≧50
(数式中、N/Cは、前記と同じ意味を表わす)。
項3.
前記温度応答層(A)側の表面に、前記温度応答性ポリマーが、1〜10μg/cm2固定化されている、項1又は2に記載の温度応答性細胞培養基材。
項4.
前記温度応答層(A)が、デンドリティックポリマーの末端に前記温度応答性ポリマーが結合したブロックポリマーを含有する、項1〜3のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
項5.
前記デンドリティックポリマーが、スチレン骨格又はシロキサン骨格のデンドリティックポリマーである、項4に記載の温度応答性細胞培養基材。
項6.
前記温度応答性ポリマーの少なくとも一種が、
(メタ)アクリルアミド、N−(若しくはN,N−ジ)置換(メタ)アクリルアミド及びビニルエーテルからなる群より選択される少なくとも一種を含むモノマー組成物を重合することにより得られうる温度応答性ポリマー、又は
ポリビニルアルコール部分酢化物
である、項1〜5のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
項7.
前記N−(若しくはN,N−ジ)置換(メタ)アクリルアミドが、ポリ−N−イソプロピル(メタ)アクリルアミド、ポリ−N、N−ジエチル(メタ)アクリルアミド、及びポリ−N、N−ジメチル(メタ)アクリルアミドからなる群より選択される少なくとも一種である、項6に記載の温度応答性細胞培養基材。
項8.
前記基材層(B)がポリスチレンを含む、項1〜7のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
項9.
リユース用である、項1〜8のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
項10.
(a)ブロックポリマーであって、スチレン骨格又はシロキサン骨格のデンドリティックポリマーの末端に、温度応答性ポリマーが結合したブロックポリマーが溶解してなる、ポリスチレンの良溶媒と貧溶媒とを含む溶液を、ポリスチレン基材表面に滴下し、展開させる工程;
(b)前記工程(a)で得られた表面を、2時間以上、前記溶媒の蒸気下に置く工程;及び
(c)前記工程(b)で得られた表面を、乾燥させる工程
を含む、温度応答性細胞培養基材の製造方法。
1.1 温度応答性ポリマーの分布に関するパラメーター
本発明の温度応答性細胞培養基材は、
(A)温度応答層;及び
(B)基材層
を含有する温度応答性細胞培養基材であって、
前記温度応答層(A)は、窒素原子を有する温度応答性ポリマーを含有し、
前記温度応答層(A)は、前記基材層(B)の少なくとも一方の面に配置されており、 前記基材層(B)は、窒素原子を有さず、かつ
前記温度応答層(A)側の表面は、放出角45°におけるXPS法で測定される窒素元素濃度N1s及び炭素元素濃度C1sが、以下の数式(1):
(1)100×(N1s/C1s)/(N/C)≧80
(数式中、N/Cは、前記温度応答性ポリマーにおける各元素比の理論値を表わす)
を満たす、温度応答性細胞培養基材である。
アルバック・ファイ社製 表面分析装置 PHI5000 VersaProbe II又はその同等品を用いて、単色化されたX線 AlKαを照射し、放出角45°で測定する。
(A)エッチング深さ2nmにおける測定値が、以下の数式(2)を満たす:
(2)100×(N1s/C1s)/(N/C)≧50
(数式中、N/Cは、前記と同じ意味を表わす)
(B)以下の数式(3)が満たされるエッチング深さが5nm以上である:
(3)100×(N1s/C1s)/(N/C)≦5
(数式中、N/Cは、前記と同じ意味を表わす)。
アルバック・ファイ社製 表面分析装置 PHI5000 VersaProbe II又はその同等品を用いて、2.5kV、10nA(Area 2mm□)の条件で、アルゴンガスクラスターイオンでエッチングしながら深さ方向の元素を測定する。エッチングレートは、膜厚61nmのPNIPAM薄膜(基板:シリコンウエハ)に、Siが検出されるまでアルゴンガスクラスターイオンでエッチングすることにより、2.0nm/minを算出する。
前記温度応答層(A)側の表面の中心点、及び
該中心点から各端点までの距離の合計が最大となるように設定された、該中心点を交点とする十字線における、各端点と中心点とを結ぶ線の中心点
からなる5点における、前記温度応答性ポリマー固定化量の各測定値から算出された変動係数[(標準偏差/平均値)×100]が、以下の数式(4):
(4)変動係数≦10
を満たすことが好ましい。
(5) 吸収強度比率=I1650/I1600
温度応答性ポリマーは、窒素原子を有する温度応答性ポリマーであれば特に限定されず、幅広く選択することができる。温度応答性ポリマーは、具体的には、下限臨界溶解温度(LCST)を有するポリマー、又は上限臨界溶解温度[Upper Critical Solution emperature(UCST)]を有するポリマーが挙げられ、特定構造のブロックポリマーを用いることが好ましい。ブロックポリマーは、一種の温度応答性ポリマーをブロックとして含んでいてもよいし、複数種の温度応答性ポリマーをブロックとして含んでいてもよい。
CH2=C(−X)−C(=O)−Y−Z−Rf (1)
Yは、−O−又は−NH−であり;
Zは、炭素数1〜10の脂肪族基、炭素数6〜10の芳香族基若しくは環状脂肪族基、
−CH2CH2N(R1)SO2−基(但し、R1は炭素数1〜4のアルキル基である。
)、−CH2CH(OZ)1)CH2−基(但し、Z1は水素原子又はアセチル基である。)、−(CH2)m−SO2−(CH2)n−基、−(CH2)m−S−(CH2)n−基(但し、mは1〜10、nは0〜10である。)又は−(CH2)m−COO−基(mは1〜10である。)であり;
Rfは、ヘテロ原子を有していてもよい、炭素数1〜20の直鎖状又は分岐状のフルオロアルキル基である。]で表されるアクリル酸エステル及びアクリルアミドを例示できる。
CH2=C(−H)−C(=O)−O−C6H4−Rf
CH2=C(−Cl)−C(=O)−O−(CH2)2−Rf
CH2=C(−H)−C(=O)−O−(CH2)2N(−CH3)SO2−Rf
CH2=C(−H)−C(=O)−O−(CH2)2N(−C2H5)SO2−Rf CH2=C(−H)−C(=O)−O−CH2CH(−OH)CH2−Rf
CH2=C(−H)−C(=O)−O−CH2CH(−OCOCH3)CH2−Rf CH2=C(−H)−C(=O)−O−(CH2)2−S−Rf
CH2=C(−H)−C(=O)−O−(CH2)2−S−(CH2)2−Rf
CH2=C(−H)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−Rf
CH2=C(−H)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−(CH2)2−Rf CH2=C(−H)−C(=O)−NH−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CH3)−C(=O)−O−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CH3)−C(=O)−O−C6H4−Rf
CH2=C(−CH3)−C(=O)−O−(CH2)2N(−CH3)SO2−Rf
CH2=C(−CH3)−C(=O)−O−(CH2)2N(−C2H5)SO2−Rf
CH2=C(−CH3)−C(=O)−O−CH2CH(−OH)CH2−Rf
CH2=C(−CH3)−C(=O)−O−CH2CH(−OCOCH3)CH2−Rf
CH2=C(−CH3)−C(=O)−O−(CH2)2−S−(CH2)2−Rf CH2=C(−CH3)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−Rf
CH2=C(−CH3)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CH3)−C(=O)−NH−(CH2)2−Rf
CH2=C(−F)−C(=O)−O−(CH2)2−S−Rf
CH2=C(−F)−C(=O)−O−(CH2)2−S−(CH2)2−Rf
CH2=C(−F)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−Rf
CH2=C(−F)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−(CH2)2−Rf CH2=C(−F)−C(=O)−NH−(CH2)2−Rf
CH2=C(−Cl)−C(=O)−O−(CH2)2−S−Rf
CH2=C(−Cl)−C(=O)−O−(CH2)2−S−(CH2)2−Rf
CH2=C(−Cl)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−Rf
CH2=C(−Cl)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF3)−C(=O)−O−(CH2)2−S−Rf
CH2=C(−CF3)−C(=O)−O−(CH2)2−S−(CH2)2−Rf CH2=C(−CF3)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−Rf
CH2=C(−CF3)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF3)−C(=O)−NH−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF2H)−C(=O)−O−(CH2)2−S−Rf
CH2=C(−CF2H)−C(=O)−O−(CH2)2−S−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF2H)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−Rf
CH2=C(−CF2H)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF2H)−C(=O)−NH−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CN)−C(=O)−O−(CH2)2−S−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CN)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−Rf
CH2=C(−CN)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CN)−C(=O)−NH−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF2CF3)−C(=O)−O−(CH2)2−S−Rf
CH2=C(−CF2CF3)−C(=O)−O−(CH2)2−S−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF2CF3)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−Rf
CH2=C(−CF2CF3)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF2CF3)−C(=O)−NH−(CH2)2−Rf
CH2=C(−F)−C(=O)−O−(CH2)3−S−Rf
CH2=C(−F)−C(=O)−O−(CH2)3−S−(CH2)2−Rf
CH2=C(−F)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−Rf
CH2=C(−F)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−(CH2)2−Rf CH2=C(−F)−C(=O)−NH−(CH2)3−Rf
CH2=C(−Cl)−C(=O)−O−(CH2)3−S−(CH2)2−Rf
CH2=C(−Cl)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−Rf
CH2=C(−Cl)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF3)−C(=O)−O−(CH2)3−S−Rf
CH2=C(−CF3)−C(=O)−O−(CH2)3−S−(CH2)2−Rf CH2=C(−CF3)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−Rf
CH2=C(−CF3)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF2H)−C(=O)−O−(CH2)3−S−Rf
CH2=C(−CF2H)−C(=O)−O−(CH2)3−S−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF2H)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−Rf
CH2=C(−CF2H)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CN)−C(=O)−O−(CH2)3−S−Rf
CH2=C(−CN)−C(=O)−O−(CH2)3−S−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CN)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−Rf
CH2=C(−CN)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF2CF3)−C(=O)−O−(CH2)3−S−Rf
CH2=C(−CF2CF3)−C(=O)−O−(CH2)3−S−(CH2)2−Rf
CH2=C(−CF2CF3)−C(=O)−O−(CH2)3−SO2−Rf
CH2=C(−CF2CF3)−C(=O)−O−(CH2)2−SO2−(CH2)2−Rf
[上記式中、Rfは、炭素数1〜6、好ましくは、1〜3のフルオロアルキル基である。]
C3F7OCF(CF3)CF2O−CF(CF3)CH2−Ac
(CF3)2CH−Ac
C2F5CH2−MAc
C2F5CH2−Ac
[上記式中において、Acはアクリレート、MAcはメタクリレートを、それぞれ表す。]
本発明においては、温度応答層(A)が、デンドリティックポリマーの末端に、前記温度応答性ポリマーが結合したブロックポリマー(本明細書において、「デンドリティックブロックコポリマー」という)を含有することが好ましい。これにより、上記の好ましい温度応答性ポリマーの分布に関するパラメーターを達成しやすくなる。
かかる態様の温度応答性細胞培養基材は、好ましくは、温度応答層(A)が、20℃の蒸留水中に浸漬して24時間静置した後の温度応答性ポリマー残存量が1μg/cm2以上である。特に限定されないが、上記において、温度応答性ポリマー残存量の上限は、通常、10μg/cm2であり、好ましくは5μg/cm2であり、より好ましくは4μg/cm2である。温度応答性ポリマーの残存量は、温度応答性ポリマーの固定化量の測定方法として上述したものと同じ方法により測定できる。
なお、以下に挙げる装置及び試薬等に換えて、それらと同等のものを使用してもよい。
装置 :特に限定されない。
検出器 :示差屈折率検出器RIカラム:LF−604(2本)、KF−601(2本)(Shodex)
溶媒 :テトラヒドロフラン
流速 :0.6ml/min
カラム温度 :40℃
試料調製 :試料をテトラヒドロフランに溶解させ、0.5質量%に調製した。溶解後、0.45μmフィルターを用いてろ過した。
注入量 :0.2ml
標準試料:shodex製標準ポリスチレン
装置:特に限定されない。
検出器:示差屈折率検出器RI
カラム:TSKgel−M(1本)、TSKgel−3000(1本)(東ソー)
溶媒:ジメチルホルムアミド(50mM LiBr 添加)
流速:0.8mL/min
カラム温度 :23℃
試料調製 :試料10mgにDMF溶媒5mLを加え、室温で緩やかに攪拌して溶解させた後、0.45μmフィルターを用いてろ過する。
注入量:0.2mL
標準試料:東ソー製単分散ポリスチレン
RAFT重合の開始剤は特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、2,2’−アゾビス(イソブチロニトリル)、2,2’−アゾビス(4−メトキシ‐2,4−ジメチルバレロニトリル)(V−70)及び2,2’−アゾビス[(2−カルボキシエチル)−2−(メチルプロピオンアミジン)(V−057)等が挙げられる。
チオカルボニルチオ基としては、ジチオエステル基、ジチオカルバメート基、トリチオカーボネート基、キサンタート基及びジチオベンゾエート基等が挙げられる。
ジオキサンとノルマルプロパノールとの混合溶媒の場合、例えば、ジオキサン:ノルマルプロパノール=0.5〜2:4とすることができる。トルエンとノルマルブタノールとの混合溶媒の場合、例えば、トルエン:ノルマルブタノール=0.5〜2:4とすることができる。アセトニトリルとN、N−ジメチルホルムアミドとの混合溶媒の場合、例えば、アセトニトリル:N、N−ジメチルホルムアミド=4:1〜6:1とすることができる。
基材層(B)の材質は、窒素原子を有さないものであればよく、特に限定されない。通常、細胞培養に用いられるものであればよく特に制限されない。例えば、ガラス、改質ガラス、各種樹脂等が挙げられる。また、これらの他にもさらに、一般に形態付与が可能とされる材質からなるものであってもよい。そのような材質は、特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、グラフトポリマー、セラミックス及び金属類等が挙げられる。
[S−(4−ビニル)ベンジル S’−アルキルトリチオカーボネートの合成]
窒素置換下の100ml三ツ口フラスコ中へ、ナトリウムメトキシド(5.6ml, 0.028mol)、メタノール(MeOH、28ml)を入れ、2分間撹拌させた。そこへ、2−エチル−1−ヘキサンチオール(4.10g、0.028mol)をMeOH(22ml)に溶解させたものを添加し、室温にて2時間撹拌した。そこへ二硫化炭素(CS2)(2.1ml、0.035mol)を添加し、室温にて5時間撹拌した。さらに、4−ビニルベンジルクロリド(4.3ml、0.028mol)を添加し、そのまま20時間室温にて撹拌した。反応後、水を添加し、ジクロロメタンにて抽出、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、硫化マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。精製は、ヘキサンを展開溶媒にカラムクロマトグラフィーにて行った。オレンジ色液体の目的物が、5.6gの収率にて得られた。
参考文献:Macromolecules 2011,44,2034−2049
窒素置換下の10ml枝管付フラスコ中へ、S−(4−ビニル)ベンジル S’−(2−エチル−1−ヘキシル)トリチオカーボネート(1.20g、3.61×10−3mol)、脱水トルエン(1ml)を入れ、撹拌して溶解させた。さらに2、2’−アゾジイソブチロニトリル(AIBN、0.0745g、4.50×10−4mol)を添加し、80℃にて10時間撹拌した。反応後、トルエンを2ml追加し希釈した後、氷浴中で冷却したヘキサン中へ滴下及び再沈させ、オレンジ色のオイル状のポリマーを0.58g回収した。
窒素置換下の10ml枝管付フラスコ中へ、上述したデンドリティックポリマー1(0.028g)、N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM、1g、8.85×10−3mol)、脱水テトラヒドロフラン(THF、3ml)を入れ、撹拌して溶解させた。
さらに、AIBN(4.0×10−3g、4.6×10−6mol)を添加し、70℃にて10時間撹拌した。反応後、THFを3ml添加し希釈した後、ジエチルエーテル中へ滴下及び再沈させ、卵色固体を回収した。再度THF5mlに溶解させ、ジエチルエーテル中へ再沈を行い、白色の粉末状固体を0.706g得た。
[デンドリティックポリマー2の合成]
窒素置換下の10ml枝管付フラスコ中へ、S−(4−ビニル)ベンジル S’−(2−エチル−1−ヘキシル)トリチオカーボネート(1.20g、3.61×10−3mol)、脱水トルエン(1ml)を入れ、撹拌して溶解させた。さらに、AIBN(0.0745g、4.50×10−4mol)を添加し、80℃にて24時間撹拌した。反応後、トルエンを2ml追加し希釈した後、氷浴中で冷却したヘキサン中へ滴下・再沈させ、オレンジ色のオイル状のポリマーを回収した。収量は0.58gであった。
窒素置換下の10ml枝管付フラスコ中へ、上述したデンドリティックポリマー2(0.028g)、NIPAM(1g、8.85×10−3mol)、脱水THF(3ml)を入れ、撹拌して溶解させた。さらに、AIBN(4.0×10−3g、4.6×10−6mol)を添加し、70℃にて24時間撹拌した。反応後、THFを3ml添加し希釈した後、ジエチルエーテル中へ滴下及び再沈させ、卵色固体を回収した。再度THF5mlに溶解させ、ジエチルエーテル中へ再沈を行い、白色の粉末状固体を0.730g得た。
[ポリ−N−イソプロピルアクリルアミド(PNIPAM)の合成]
窒素置換下の50ml三ツ口フラスコ中へ、NIPAM(5g,0.044mol)、2−プロパノール(25ml)を添加し、撹拌して溶解させた。さらにそこへ、AIBN(0.0726g、4.4×10−4mol)を添加し、80℃にて6時間撹拌した。反応後、溶媒を減圧留去し、白色固体を4.95g得た。
[コーティング溶液の調製]
製造例1にて合成したデンドリティックブロックコポリマー10mgを、THF/MeOH=1/4(v/v)の混合溶媒(4ml)へ溶解させた。これを、母液と称する。この母液を、培養面積9.6cm2のセルカルチャーディッシュに50μl塗布した時の、PNIPAM換算での塗布量が3.5μg/cm2となるよう、THF/MeOH=1/4(v/v)の混合溶媒でさらに希釈した。これを、コーティング溶液と称する。
上記方法で得られたコーティング溶液(50μl)を、ポリスチレン製セルカルチャーディッシュ(コーニング製Falcon3001、培養面積9.6cm2)に塗布し、蓋をした。そのまま2.5時間静置させた後に乾燥させ、温度応答性細胞培養基材を得た。
コーティング溶液(50μl)を、ポリスチレン製セルカルチャーディッシュ(コーニング製Falcon3001、培養面積9.6cm2)に塗布し、蓋をした。そのまま4時間静置させた後に乾燥させた。乾燥後、純水にて1時間洗浄した。洗浄後は、水切り後一晩自然乾燥させ、温度応答性細胞培養基材を得た。
[コーティング溶液の調製]
コーティング溶媒の調製に使用する混合溶媒をTHF/MeOH=2/5(v/v)とした。その他の操作については、実施例1と同様に実施した。
ポリスチレン製基材に対するポリマーの固定化、並びに細胞評価の方法については、実施例1と同様に実施した。
[コーティング溶液の調製]
デンドリティックブロックコポリマーを製造例2で合成したものに置き換える以外は、実施例1と同じ方法で調製した。
ポリスチレン製基材に対するポリマーの固定化、並びに細胞評価の方法については、実施例1と同様に実施した。
[コーティング溶液の調製]
コーティング溶液の調製に使用する混合溶媒をTHF/MeOH=2/5(v/v)とした。その他、コーティング溶液の調製方法については実施例3と同様にした。
ポリスチレン製基材に対するポリマーの固定化、並びに細胞評価の方法については、実施例1と同様に実施した。
コーニング製Falcon3001(培養面積9.6cm2)を比較例1として用いた。
[コーティング溶液の調製]
デンドリティックブロックコポリマーを比較製造例1で合成したPNIPAMに置き換える以外は、実施例1と同じ方法で調製した。
ポリスチレン製基材に対するポリマーの固定化、並びに細胞評価の方法については、実施例1と同様に実施した。ポリマー塗布後、水洗なしの場合を比較例2、水洗ありの場合を比較例3とした。
電子線照射によりポリスチレン基材表面にPNIPAMをグラフト重合により化学的に付与した、市販品温度応答性細胞培養基材Aを比較例4として用いた。
アルバック・ファイ社製 表面分析装置 PHI5000 VersaProbe IIを用いて、単色化されたX線 AlKαを照射し、放出角45°で測定した。
アルバック・ファイ社製 表面分析装置 PHI5000 VersaProbe IIを用いて、2.5kV、10nA(Area 2mm)の条件で、アルゴンガスクラスターイオンでエッチングしながら深さ方向の元素を測定した。エッチングレートは、膜厚61nmのPNIPAM薄膜(基板:シリコンウエハ)に、Siが検出されるまでアルゴンガスクラスターイオンでエッチングすることにより、2.0nm/minを算出した。
表面、又は特定のエッチング深さにおける温度応答性ポリマーによる被覆率は、以下のようにして評価した。
放出角45°におけるXPS法で測定される窒素元素濃度N1s及び炭素元素濃度C1sに関する、以下の数式(1)の値(%)を、被覆率とした。
(1)100×(N1s/C1s)/(N/C)(%)
(数式中、N/Cは、温度応答性ポリマーにおける各元素比の理論値を表わす)
ポリスチレン製セルカルチャーディッシュを基材とし、温度応答性ポリマーとしてPNIPAMを固定化させた、温度応答性細胞培養基材を用意した。同基材をFT−IR−ATR測定することにより、次式(5)にて表される、ポリスチレンに由来するベンゼン環伸縮(1600cm−1)の吸収強度に対する、PNIPAMに由来するアミド伸縮(1650cm−1)の吸収強度の比率を得た。
(5) 吸収強度比率=I1650/I1600
既知量のPNIPAM(1〜10μg/cm2)をポリスチレン基材に固定化させ、式(5)により得られる吸収強度比率から検量線を予め作成しておくことにより、ポリスチレン基材上に固定化された未知のPNIPAMの量を求めた。なお、ポリスチレン基材上のポリマー固定化層は、試料に対するIR光の侵入深さに対し十分に薄いと仮定した(参考文献:Langmuir 2004,20,5506−5511)。
3.5cmφ温度応答性細胞培養基材へ培地[ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、10%仔ウシ血清、1%抗生物質含]1mlを加え、さらに3T3マウス線維芽細胞が1×105個分散した培地1mlを加え、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)中で4日間培養を行った。
1.剥離しない
2.一部剥離
3.培養細胞全体が剥がれるが、剥離に15分程度かかる
4.15分以内に良好に剥離する
5.さらに短い時間で極めて良好に剥離する
結果を表1に示す。実施例1(水洗なし)の基材は、エッチング深さ0nmにおける最表面のPNIPAM被覆率が99%以上であった。一方、比較例4(市販品A)で得た基材は、最表面のPNIPAM被覆率が80%に満たないことから、基材が露出していることが示唆された。さらに、エッチング深さに対するPNIPAM被覆率を測定したところ、比較例4で得た基材と比べ、実施例1で得た基材の方が2倍以上深くPNIPAMが存在していることが示唆された。以上より、本発明品は、基材に対し効果的にポリマーを埋め込むことができており、且つ基材表面をPNIPAMによりほぼ被覆できていることが確認された。
[実施例1(水洗あり)の評価、及び比較例4との比較]
実施例1(水洗なし)の基材では、基材に固定化しきれなかったポリマーが、細胞シート剥離性を阻害する可能性があった。そこで、実施例1において得られた温度応答性細胞培養基材を水洗し、水洗前後において、PNIPAM被覆率が5%以下となるエッチング深さ(=PNIPAM存在深さ)を比較したところ、水洗後はPNIPAM存在深さが約3nm浅いことが確認された。FT−IR−ATR測定においては、水洗によりPNIPMA被覆量が約半分にまで減少していること、さらに、変動係数が5%以下に軽減していることが確認された。従って、余分なポリマーを除去することによって、非常に均一なPNIPAM層を得られることが確認された。比較例4と同じく、基材表面の露出が懸念されたが、エッチング深さ0nmにおけるPNIPAM被覆率を確認したところ、表面は水洗前と同様に被覆されていることが判った。
実施例2においては、コーティング溶媒中のTHF含量を20体積%から29体積%に増加させた。その効果についてPNIPAM被覆量と被覆率の両面から評価した。その結果、FT−IR−ATR測定により、実施例1と比べ水洗後のPNIPAM被覆量が約20%増加したことが確認され、それに伴いエッチング深さ2nmに対するPNIPAM被覆率、及びPNIPAM被覆率が5nm以下となるエッチング深さもやや増加した。
さらに優れた剥離性を目指し、実施例3、4においては、ポリマー中のPNIPAM含量が95重量%のデンドリティックブロックコポリマーを用いた温度応答性細胞培養基材を作製した。ポリマー中のPNIPAM含量が85%である実施例1、2の結果と比較したところ、特に「THF含量29%、水洗あり」の基材において、PNIPAM被覆量、各エッチング深さにおける被覆率、PNIPAM存在深さに増加傾向が見られた。デンドリティックブロックコポリマー中のPNIPAM鎖が長鎖化した効果と考えられる。
比較例1の基材においては、温度応答性ポリマーで表面を被覆していないため、上述したような細胞剥離性は発現しなかった。
比較例2では、比較製造例1にて得られたPNIPAMを塗布した基材について評価したが、細胞剥離性は発現しなかった。このPNIPAMは、基材に対する結合手段を有していないことから、培地(水)を添加した際に溶解し、除去されたためと考えられる。比較例3は、比較例2の基材を水洗したものであり、PNIPAMによる表面の被覆が確認できなかった。PNIPAMが基材と結合していないため、塗布したすべてのPNIPAMが水洗の時点で既に除去されたためと考えられる。そのため、比較例3においては細胞剥離性が発現しなかった。
実施例1の水洗あり基材について、室温水に対するポリマー溶出試験を行った。具体的には、試料を室温水に浸漬後、表面のPNIPAM被覆率がどの程度変化するかについて、先述のXPS(分析深さ約10nm)、及びFT−IR−ATR(分析深さ1〜数μm)を利用した方法により分析した。比較例4として、電子線照射を用いたグラフト重合法により、PNIPAMをポリスチレン基材に化学的に付与した市販品温度応答性細胞培養基材についても、同様に測定した。
1.各基材を適当な大きさにカットし、試料とした。
2.各試料の裏側に、マジックペンで目印をつけた。この時、n=2で測定を行うため、二箇所に目印をつけた。
3.上記2.の目印部分について、XPS分析を行った。
4.測定後の試料を装置から取り出し、蒸留水を充填した50mlのスクリュー管瓶に浸漬させた。この時、水温は20℃であった。
5.24時間後に4.の試料を取り出し、乾燥させたのち、再度目印部分についてXPS分析を行った。
6.浸漬前後の測定値から、先述したとおりPNIPAM被覆率を計算した。また、それぞれの値から計算した変化率を、溶出試験後のPNIPAM残存率として示した。
1.各基材を適当な大きさにカットし、試料とした(約1.5cm四方のものを2枚ずつ用意した)。
2.50mlスクリュー管瓶に蒸留水を充填した。この時、水温は20℃であった。
3.上記2.の蒸留水に上記1.の試料を1枚浸漬させ、24時間後に取り出した。
4.浸漬あり、なしの各試料についてFT−IR−ATR分析を行い、検量線法により各表面のPNIPAM量を分析した(各試料につき5点ずつ測定した)。
5.PNIPAM残存率を次式に従って計算した。
(浸漬ありの際のPNIPAM量/浸漬なしの際のPNIPAM量)×100(%)
Claims (10)
- (A)温度応答層;及び
(B)基材層
を含有する温度応答性細胞培養基材であって、
前記温度応答層(A)は、窒素原子を有する温度応答性ポリマーがデンドリティックポリマーの末端に結合したブロックポリマーを含有し、
前記温度応答層(A)は、前記基材層(B)の少なくとも一方の面に配置されており、 前記基材層(B)は、窒素原子を有さず、かつ
前記温度応答層(A)側の表面は、放出角45°におけるX線光電子分光法で測定される窒素元素濃度N1s及び炭素元素濃度C1sが、以下の数式(1):
(1)100×(N1s/C1s)/(N/C)≧80
(数式中、N/Cは、前記温度応答性ポリマーにおける各元素比の理論値を表わす)
を満たし、かつ
前記温度応答層(A)側の表面の中心点、及び
該中心点から各端点までの距離の合計が最大となるように設定された、該中心点を交点とする十字線における、各端点と中心点とを結ぶ線の中心点
からなる5点における、前記温度応答性ポリマー固定化量の測定値から算出された変動係数[(標準偏差/平均値)×100]が、以下の数式(4):
(4)変動係数≦10
を満たす、温度応答性細胞培養基材。 - 前記温度応答層(A)側の表面は、アルゴンガスクラスターイオンビームにより表面側からエッチングしながら、X線光電子分光法により測定されるN1sとC1sとが、以下の条件(A)を満たす、請求項1に記載の温度応答性細胞培養基材:
(A)前記窒素原子について、エッチング深さ2nmにおける測定値が、以下の数式(2)を満たす:
(2)100×(N1s/C1s)/(N/C)≧50
(数式中、N/Cは、前記と同じ意味を表わす)。 - 前記温度応答層(A)側の表面に、前記温度応答性ポリマーが、1〜10μg/cm2固定化されている、請求項1又は2に記載の温度応答性細胞培養基材。
- 前記デンドリティックポリマーが、スチレン骨格又はシロキサン骨格のデンドリティックポリマーである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
- 前記温度応答性ポリマー固定化量の測定値が、フーリエ変換赤外分光全反射減衰法(FT-IR-ATR法)によるものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
- 前記温度応答性ポリマーの少なくとも一種が、
(メタ)アクリルアミド、N−(若しくはN,N−ジ)置換(メタ)アクリルアミド及びビニルエーテルからなる群より選択される少なくとも一種を含むモノマー組成物を重合することにより得られうる温度応答性ポリマー、又は
ポリビニルアルコール部分酢化物
である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。 - 前記N−(若しくはN,N−ジ)置換(メタ)アクリルアミドが、ポリ−N−イソプロピル(メタ)アクリルアミド、ポリ−N、N−ジエチル(メタ)アクリルアミド、及びポリ−N、N−ジメチル(メタ)アクリルアミドからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項6に記載の温度応答性細胞培養基材。
- 前記基材層(B)がポリスチレンを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
- リユース用である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
- (a)ブロックポリマーであって、スチレン骨格又はシロキサン骨格のデンドリティックポリマーの末端に、温度応答性ポリマーが結合したブロックポリマーが溶解してなる、ポリスチレンの良溶媒と貧溶媒とを含む溶液を、ポリスチレン基材表面に滴下し、展開させる工程;
(b)前記工程(a)で得られた表面を、2時間以上、前記溶媒の蒸気下に置く工程;及び
(c)前記工程(b)で得られた表面を、水洗し、さらに乾燥させる工程を含む、温度応答性細胞培養基材の製造方法。
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