JP6816885B2 - リパーゼ活性測定用基質溶液並びに試料中のリパーゼ活性の測定方法及び測定試薬 - Google Patents
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Description
また、本発明は、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための試薬であって、その保存安定性が優れたリパーゼ活性の測定試薬に関するものである。
また、本発明は、試料中のリパーゼ活性の測定のための方法であって、長期間正確な測定値を得ることができる試料中のリパーゼ活性の測定方法に関するものである。
また、本発明は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、その保存安定性が優れた当該ミセル粒子からなるエマルジョン溶液に関するものである。
また、本発明は、リパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法であって、リパーゼ活性測定用基質溶液の保存安定性を改善する方法に関するものである。
また、本発明は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液の安定化方法であって、当該ミセル粒子からなるエマルジョン溶液の保存安定性を改善する方法に関するものである。
このリパーゼは、長鎖脂肪酸の3分子がそれぞれグリセロールにエステル結合したトリグリセライド(TG)のα位(1位、3位)のエステル結合を加水分解して、2分子の脂肪酸及び1分子のβ−モノグリセライドを生成する反応を触媒する酵素である。
この1分子のβ−モノグリセライドは、α型に異性化され、これがリパーゼの作用を受けて加水分解されてグリセロールと脂肪酸とになる。
例えば、オリーブ油のエマルジョンをリパーゼの基質として用い、このオリーブ油のエマルジョンを血清試料等と接触させ、37℃で24時間反応させた後、リパーゼによる加水分解反応により生成した脂肪酸をアルカリで滴定するCherry−Crandallの方法が知られていた。
しかし、この方法は反応時間が長く、測定しようとするリパーゼの不活性化や反応阻害が著しい方法であった。
しかし、これらの方法は、血清蛋白による阻害やリウマチ因子による凝集塊の干渉を受け、均一かつ安定なエマルジョンを作るのが難しく、再現性に乏しいという短所を有する方法であった。
しかし、この方法は、高濃度の肝エステラーゼの存在下でその干渉を受けてしまうため、他の測定項目の測定試薬から反応セル又はノズル(プローブ)を介して混入する肝エステラーゼの影響を受けて測定値に誤差が生じるという短所を有する方法であった。
しかし、この方法も、高濃度の肝エステラーゼの存在下でその干渉を受けてしまうため、他の測定項目の測定試薬から反応セル又はノズル(プローブ)を介して混入する肝エステラーゼの影響を受けて測定値に誤差が生じるという短所を有する方法であった。
この方法では、この1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]を血清試料等と接触させ、反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロール及びグルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルが生成する。
このグルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて6’−メチルレゾルフィン(λmax:580nm)を生成する。
この生成する6’−メチルレゾルフィンの増加を580nm又はその近辺の波長の吸光度を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めることができる。
このDGGMRをリパーゼの基質として用いるリパーゼ活性の測定方法は、測定が一連の反応で進むシンプルなものであり、かつ他の測定試薬から反応セル又はノズル(プローブ)を介して混入するエステラーゼの影響を受けにくいという長所を有する方法である。
このため、従来、リパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液(リパーゼ活性測定用基質溶液)を製造するに当っては、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化(乳化)した基質溶液となるよう、種々の方法が考えられてきたが、基質を界面活性剤を含む水溶液に混合したり、基質をアルコールなどの有機溶媒を含む溶液に混合したり、基質含有液を滴々と滴下して溶液に混合したり、基質含有液を溶液に噴射注入したり、基質溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又は基質溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理が必要であったり、又は特別な装置若しくは器具などの物等が必要であった。
このため、リパーゼ活性測定用基質を含有する溶液の保存安定性の改善を目的として種々の試みが行われた。
また、本発明の課題は、DGGMRをリパーゼ活性測定用基質として含有するリパーゼ活性測定用基質溶液を含むリパーゼ活性の測定試薬であって、その保存安定性が優れたリパーゼ活性の測定試薬を提供することである。
また、本発明の課題は、DGGMRをリパーゼ活性測定用基質として含有するリパーゼ活性測定用基質溶液を用いる試料中のリパーゼ活性の測定方法であって、長期間正確な測定値を得ることができる試料中のリパーゼ活性の測定方法を提供することである。
また、本発明の課題は、DGGMR等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、その保存安定性が優れた当該ミセル粒子からなるエマルジョン溶液を提供することである。
また、本発明の課題は、リパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法であって、リパーゼ活性測定用基質溶液の保存安定性を改善する方法を提供することである。
また、本発明の課題は、DGGMR等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液の安定化方法であって、当該ミセル粒子からなるエマルジョン溶液の保存安定性を改善する方法を提供することである。
[1] 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなることを特徴とする、リパーゼ活性測定用基質溶液。
[2] 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなるリパーゼ活性測定用基質溶液を含むことを特徴とする、リパーゼ活性測定試薬。
[3] 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなるリパーゼ活性測定用基質溶液を使用して、試料中のリパーゼ活性を測定することを特徴とする、試料中のリパーゼ活性の測定方法。
[4] 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液。
[5] 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることを特徴とする、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルをリパーゼ活性測定用基質として用いるリパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法。
[6] 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることを特徴とする、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液の安定化方法。
また、本発明のリパーゼ活性の測定試薬は、その保存安定性が優れたリパーゼ活性の測定試薬である。
また、本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法は、長期間正確な測定値を得ることができる方法である。
また、本発明のDGGMR等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液は、その保存安定性が優れたエマルジョン溶液である。
また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法は、リパーゼ活性測定用基質溶液の保存安定性を改善することができる方法である。
また、本発明のDGGMR等よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液の安定化方法は、当該エマルジョン溶液の保存安定性を改善することができる方法である。
I.総論
1.リパーゼ活性測定用基質溶液
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなることを特徴とするものである。
本発明において、リパーゼは、リパーゼとしての活性、すなわちリパーゼ活性を有するものであればよく、このリパーゼ活性を有するものであれば特に限定はない。
本発明において、リパーゼの活性を測定する試料は、前記のリパーゼを含む可能性がある試料であればよく、前記のリパーゼを含む可能性があるものであれば特に限定されない。
この試料としては、例えば、ヒト若しくは動物又は植物に由来する試料等を挙げることができる。
また、試料は、必要に応じて、希釈又は濃縮処理等を行ってもよい。
1.総論
前記の通り、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなることを特徴とするものである。
(1)総論
本発明において、試料中に含まれるリパーゼの活性の測定に使用するためのリパーゼの基質、すなわちリパーゼ活性測定用基質は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]である。
このグルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて6’−メチルレゾルフィン(λmax:580nm)を生成する。
本発明においては、この生成する6’−メチルレゾルフィンの増加を580nm又はその近辺の波長の吸光度を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めることができる。
本発明のエマルジョン溶液におけるDGGMRの濃度であるが、この本発明のエマルジョン溶液におけるDGGMRの濃度が0.05mM以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液とする上で好ましい。
(1)総論
前記の通り、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、リパーゼ活性測定用基質としてのDGGMR、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなることを特徴とするものである。
本発明において用いる、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル[以下、「本変性シリコーンオイル」ということがある]について、以下説明する。
そして、直鎖状のシリコーン化合物がシリコーンオイルである。
この変性シリコーンオイルとしては、ポリシロキサンの側鎖の一部、ポリシロキサンのどちらか片方の末端、ポリシロキサンの両方の末端、又はポリシロキサンの側鎖の一部と両方の末端に、各種の有機基を導入したシリコーンオイルが存在する。
本発明のエマルジョン溶液における本変性シリコーンオイルの濃度であるが、この本発明のエマルジョン溶液における本変性シリコーンオイルの濃度が0.01%(w/v)以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液とする上で好ましい。
(1)リパーゼ賦活化剤
本発明のエマルジョン溶液には、リパーゼ賦活化剤を含有させてもよい。
このアルカリ金属としては、例えば、カリウム、ナトリウム又はリチウム等を挙げることができ、また、このアルカリ土類金属としては、例えば、マグネシウム又はカルシウム等を挙げることができる。
この胆汁酸としては、タウロデオキシコール酸が特に好ましい。
本発明のエマルジョン溶液において、リパーゼ賦活化剤は、その濃度が0.2%(w/v)以上の濃度であることが好ましい。
(1)リパーゼ活性化剤
本発明のエマルジョン溶液には、リパーゼ活性化剤を含有させてもよい。
(i) リパーゼの活性化能。
(ii) リパーゼの触媒作用を受けることによりリパーゼ活性測定用基質から遊離した脂肪酸は、リパーゼ活性測定用基質よりなる界面を壊すが、カルシウムイオン又はカルシウム塩はこの遊離した脂肪酸を捕捉し、当該界面が壊れるのを抑制することができる。
本発明のエマルジョン溶液において、リパーゼ活性化剤は、その濃度が0.1mM以上の濃度であることが好ましい。
(1)コリパーゼ
本発明のエマルジョン溶液には、コリパーゼを含有させてもよい。
本発明のエマルジョン溶液において、コリパーゼは、その活性値が15K単位/L(15K Unit/L)以上であることが好ましい。
本発明のエマルジョン溶液には、水を含有させてもよい。
すなわち、本発明のエマルジョン溶液は、水溶液であってよい。
本発明におけるリパーゼ活性測定用基質としてのDGGMRは、pH4又はその付近のpHにおいて安定である。
よって、本発明のエマルジョン溶液において、そのpHはpH4を中心とする一定の範囲内のものであることが好ましい。
(1)緩衝剤
本発明のエマルジョン溶液には、緩衝剤を含有させてもよい。
本発明において、緩衝剤を本発明のエマルジョン溶液に含有させる場合の濃度は、特に限定はなく、設定するpHの範囲において緩衝能を発揮することができる濃度であればよい。
先に記載した通り、リパーゼは、エマルジョン化したトリグリセライド基質の水と油との界面で最も効率よく作用し、このリパーゼの反応速度は分散した基質の表面積に関係するので、このリパーゼの活性測定には安定で均一なミセル粒子からなる基質の調製が重要であるとされている(非特許文献2参照。)。
1.総論
本発明のエマルジョン溶液を製造する方法であるが、上記の「DGGMR、及び本変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなる」という構成の本発明のエマルジョン溶液を製造することができる方法であればよく、特に限定はない。
この(a)及び(b)の工程よりなる方法は、煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理、又は特別な装置若しくは器具などの物等を必要とせずに、本発明のエマルジョン溶液を製造することができるので、好ましい。
前記1における(a)の工程、すなわち、「DGGMRと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程」について、以下、詳細に説明する。
前記1の(a)の工程、すなわち、「DGGMRと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程」においては、リパーゼ活性測定用基質であるDGGMRと本変性シリコーンオイルを混合する。
すなわち、DGGMRと本変性シリコーンオイルとを直接混合する。
リパーゼ活性測定用基質としてのDGGMRと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程において、このDGGMRを混合する量は、特に限定されない。
なお、前記1の(a)の「DGGMRと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程」における当該DGGMRと当該本変性シリコーンオイルとの混合(以下、「第1混合」ということがある)の時の当該DGGMR及び当該本変性シリコーンオイルそれぞれの混合量を、第2混合後にDGGMRの濃度が上記の通りになるように、考慮の上決めてもよく、このようにすることが、その製造手順の上から好ましい。
第1混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をWs[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とし、そしてリパーゼ活性測定用基質の分子量をMWsとした場合、第2混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Cs[単位:mM]は次の式で表すことができる。
第1混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をWs[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とし、リパーゼ活性測定用基質の分子量をMWsとし、そして第1混合時の混合物のA%(重量又は容量)を第2混合時に水又は水溶液と混合した場合、第2混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Cs[単位:mM]は次の式で表すことができる。
リパーゼ活性測定用基質としてのDGGMRと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程において、この本変性シリコーンオイルを混合する量は、特に限定されない。
なお、第1混合時の当該DGGMR及び当該本変性シリコーンオイルそれぞれの混合量を、第2混合後に本変性シリコーンオイルの濃度が上記の通りになるように、考慮の上決めてもよく、このようにすることが、その製造手順の上から好ましい。
第1混合時に混合させる本変性シリコーンオイルの混合量をWp[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とした場合、第2混合後の本変性シリコーンオイルの濃度Cp[単位:%(w/v)]は次の式で表すことができる。
第1混合時に混合させる本変性シリコーンオイルの混合量をWp[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とし、そして第1混合時の混合物のA%(重量又は容量)を第2混合時に水又は水溶液と混合した場合、第2混合後の本変性シリコーンオイルの濃度Cp[単位:%(w/v)]は次の式で表すことができる。
DGGMRと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程において、このDGGMRと本変性シリコーンオイルとを混合する方法は、このDGGMRと本変性シリコーンオイルが混合するのであればいずれの方法でもよく、特に限定はない。
DGGMRと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程において、このDGGMRと本変性シリコーンオイルとを混合する時の温度は、特に限定されないが、用いる本変性シリコーンオイルの曇点付近の温度又はこの曇点付近の温度以下の温度においてこの工程を行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
この本変性シリコーンオイルの曇点付近の温度としては、その本変性シリコーンオイルの曇点の温度のプラスマイナス(±)15℃の範囲が好ましく、プラスマイナス(±)10℃の範囲がより好ましく、プラスマイナス(±)5℃の範囲が特に好ましい。
なお、KF−354Lは、曇点の測定に使用した恒温水槽の設定温度の上限の77℃においても曇点に至らなかったので、これの曇点は77℃超である。
DGGMRと本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程において、このDGGMRと本変性シリコーンオイルとを混合する時間であるが、このDGGMRと本変性シリコーンオイルとが均質に混合されればよく、特に限定されない。
通常は、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から、この混合を5分間又はそれ以上行うことが好ましい。なお、一般的には、5分間で十分である。
前記1における(b)の工程、すなわち、『「DGGMRと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程」において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程』について、以下、詳細に説明する。
前記1の(b)の工程、すなわち、「前記1の(a)の工程において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程」において、この水又は水溶液については、特に限定はない。
本発明において、前記の水溶液に含有させることができるリパーゼ賦活化剤としては、リパーゼを賦活化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、胆汁酸又はその塩等を挙げることができる。
第2混合後のリパーゼ賦活化剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の「DGGMR及び本変性シリコーンオイルの混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にリパーゼ賦活化剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
本発明において、前記の水溶液に含有させることができるリパーゼ活性化剤としては、リパーゼを活性化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、アルカリ土類金属イオン又はその塩等を挙げることができる。
第2混合後のリパーゼ活性化剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の「DGGMR及び本変性シリコーンオイルの混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にリパーゼ活性化剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
本発明において、水溶液に含有させることができるコリパーゼとしては、コリパーゼの作用、機能又は活性を有しているものであればよく、特に限定はない。
第2混合後のコリパーゼの活性値が上記の活性値となるよう、前記の「DGGMR及び本変性シリコーンオイルの混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にコリパーゼを適当な活性値で含有させることが好ましい。
本発明においてリパーゼ活性測定用基質として用いるDGGMRは、pH4又はその付近のpHにおいて安定である。
よって、第2混合後、そのpHはpH4を中心とする一定の範囲内のものであることが好ましい。
第2混合後のpHが上記のpHとなるよう、前記水溶液のpHを適当なpHにすることが好ましい。
本発明においては、第2混合後のpHを、前記(d)に記載のpH範囲に保つため、前記のpH範囲に緩衝能を有する緩衝剤を前記水溶液に適宜含有させてもよい。
第2混合後の緩衝剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の水溶液に緩衝剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
前記1における(b)の工程、すなわち、『「DGGMRと、本変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程」において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程』においては、当該「DGGMRと本変性シリコーンオイルの混合物」の全部又は一部を、当該「水又は水溶液」と混合する。
前記2の「(2)DGGMRの混合量」の項に詳述した通り、第2混合後、DGGMRの好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは0.05mM以上であり、より好ましくは0.1mM以上であり、そして、特に好ましくは0.2mM以上である。
また、これも前記2の「(2)DGGMRの混合量」の項に詳述した通り、第2混合後、DGGMRの好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは2mM以下であり、より好ましくは1mM以下であり、そして、特に好ましくは0.8mM以下である。
第1混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をWs[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とし、そしてリパーゼ活性測定用基質の分子量をMWsとした場合、第2混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Cs[単位:mM]は次の式で表すことができる。
第1混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をWs[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とし、リパーゼ活性測定用基質の分子量をMWsとし、そして第1混合時の混合物のA%(重量又は容量)を第2混合時に水又は水溶液と混合した場合、第2混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Cs[単位:mM]は次の式で表すことができる。
前記2の「(3)本変性シリコーンオイルの混合量」の項に詳述した通り、第2混合後、本変性シリコーンオイルの好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは0.01%(w/v)以上であり、より好ましくは0.05%(w/v)以上であり、そして、特に好ましくは0.1%(w/v)以上である。
第1混合時に混合させる本変性シリコーンオイルの混合量をWp[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とした場合、第2混合後の本変性シリコーンオイルの濃度Cp[単位:%(w/v)]は次の式で表すことができる。
第1混合時に混合させる本変性シリコーンオイルの混合量をWp[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とし、そして第1混合時の混合物のA%(重量又は容量)を第2混合時に水又は水溶液と混合した場合、第2混合後の本変性シリコーンオイルの濃度Cp[単位:%(w/v)]は次の式で表すことができる。
なお、このように、この工程を複数の段階(ステップ)によって行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
[B] 前記[A]の段階における当該混合物(DGGMRと本変性シリコーンオイルとの混合物)と水又は水溶液との混合後の混合液に、更に一定量の水又は水溶液を混合する段階
リパーゼ活性測定用基質としてのDGGMRと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する方法は、当該混合物と、当該水又は水溶液が混合するのであればいずれの方法でもよく、特に限定はない。
リパーゼ活性測定用基質としてのDGGMRと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する時の温度は、特に限定されないが、用いる本変性シリコーンオイルの曇点以下の温度においてこの工程を行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
リパーゼ活性測定用基質としてのDGGMRと本変性シリコーンオイルを混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する時間であるが、このDGGMRと本変性シリコーンオイルの混合物と、この水又は水溶液とが、均質に混合されればよく、特に限定されない。
I.総論
本発明のリパーゼ活性測定試薬は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなるリパーゼ活性測定用基質溶液を含むことを特徴とするものである。(なお、エマルジョン溶液及びリパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔1〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。)
1.リパーゼ活性測定試薬の構成等
本発明のリパーゼ活性測定試薬は、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のみからなるものであってもよく、又は本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液と他の構成試薬からなるもの(試薬キット)であってもよい。
(a) 本発明におけるリパーゼ活性測定用基質[DGGMR]はpH4又はその付近のpHにおいて安定であるのに対して、リパーゼはpH8又はその付近のpHにおいてその活性は至適であり、それぞれ適するpH域が異なっている。
(b) 本発明におけるリパーゼ活性測定用基質[DGGMR]、コリパーゼ、及びリパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩を、一つの試薬に共存させると、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質[DGGMR]の安定性が良くなくなる。
前記の他の構成試薬、又はそれ以外の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、校正(キャリブレーション)を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
本発明のリパーゼ活性測定試薬の具体例を以下挙げる。
(a)第1試薬 [下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液;pH8.3(20℃)]
デオキシコール酸ナトリウム [リパーゼ賦活化剤] 2%(w/v)
塩化カルシウム [リパーゼ活性化剤] 5mM
コリパーゼ (ブタ膵臓由来;ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国]) 375K単位/L(5mg/L)
Bicine [緩衝剤] 40mM
1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル 〔DGGMR〕 (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国]) [リパーゼ活性測定用基質] 0.3mM
側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル 0.3%(w/v)
L−酒石酸 [緩衝剤] 40mM
(a)第1試薬 [下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液;pH8.4(20℃)]
タウロデオキシコール酸ナトリウム [リパーゼ賦活化剤] 2%(w/v)
デオキシコール酸ナトリウム [リパーゼ賦活化剤] 0.2%(w/v)
塩化カルシウム [リパーゼ活性化剤] 5mM
コリパーゼ (ブタ膵臓由来;ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国]) 150K単位/L(2mg/L)
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 〔Tris〕 [緩衝剤] 40mM
1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル 〔DGGMR〕 (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国]) [リパーゼ活性測定用基質] 0.6mM
側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル 0.3%(w/v)
タウロデオキシコール酸ナトリウム [リパーゼ賦活化剤] 2%(w/v)
I.総論
本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなるリパーゼ活性測定用基質溶液を使用して、試料中のリパーゼ活性を測定することを特徴とするものである。(なお、エマルジョン溶液及びリパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔1〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定試薬の詳細については、前記の「〔2〕本発明のリパーゼ活性測定試薬」の項に記載した通りである。)
1.試料中のリパーゼ活性の測定の方法
本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法により、試料中のリパーゼ活性の測定を行う場合、その測定は終点法(エンドポイント法)により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法(レート法)により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよいが、反応速度法(レート法)によるものが好ましい。
本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法の具体例を以下挙げる。
(a)第1試薬
前記の〔2〕のIIの2の(1)の(a)の第1試薬を、この測定方法の具体例における第1試薬として用いた。
前記の〔2〕のIIの2の(1)の(b)の第2試薬を、この測定方法の具体例における第2試薬として用いた。
ヒトの血清を試料として用いた。
(a)第1段階
前記(2)の試料と前記(1)の(a)の第1試薬を混合して、混合液を調製する。
なお、一般的には、例えば、試料の量は0.5〜100μL、第1試薬の量は20〜1,000μLの範囲のもの等とすることが好ましい。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は20分以内であることが好ましく、10分以内であることがより好ましく、5分以内であることが特に好ましい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は2〜70℃であるが、20〜37℃が好ましく、30〜37℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる酵素等の成分が耐熱性酵素など耐熱性の成分であれば更に高温でもよい。
前記の第1段階で調製した「試料と第1試薬の混合液」に、前記(1)の(b)の第2試薬を混合する。これを最終反応液とする。
なお、一般的には、例えば、第2試薬の量は10〜1,000μLの範囲のもの等とすることが好ましい。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は20分以内であることが好ましく、10分以内であることがより好ましく、5分以内であることが特に好ましい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は2〜70℃であるが、20〜37℃が好ましく、30〜37℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる酵素等の成分が耐熱性酵素など耐熱性の成分であれば更に高温でもよい。
そして、このグルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルは不安定であるので、容易に自然に加水分解されて、6’−メチルレゾルフィン(λmax:580nm)を生成する。
本発明のエマルジョン溶液は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるものである。(なお、このエマルジョン溶液及びリパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔1〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定試薬の詳細については、前記の「〔2〕本発明のリパーゼ活性測定試薬」の項に記載した通りである。また、試料中のリパーゼ活性の測定方法の詳細については、前記の「〔3〕本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法」の項に記載した通りである。)
本発明の1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]をリパーゼ活性測定用基質として用いるリパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることを特徴とするものである。(なお、エマルジョン溶液及びリパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔1〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定試薬の詳細については、前記の「〔2〕本発明のリパーゼ活性測定試薬」の項に記載した通りである。また、試料中のリパーゼ活性の測定方法の詳細については、前記の「〔3〕本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法」の項に記載した通りである。)
本発明の1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液の安定化方法は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることを特徴とするものである。(なお、エマルジョン溶液及びリパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔1〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定試薬の詳細については、前記の「〔2〕本発明のリパーゼ活性測定試薬」の項に記載した通りである。また、試料中のリパーゼ活性の測定方法の詳細については、前記の「〔3〕本発明の試料中のリパーゼ活性の測定方法」の項に記載した通りである。)
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における保存安定性の効果を確認した。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液(本発明のエマルジョン溶液よりなることを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液)を調製した。
また、対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液を調製した。
更に、緩衝液を調製した。
(1) 本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル 〔DGGMR〕(販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国])の0.09グラム[g]を、ビーカー(容量:10mL)に量り取った。
なお、このリパーゼ活性測定用基質溶液において、リパーゼ活性測定用基質〔DGGMR〕の濃度は0.6mMであり、本変性シリコーンオイル(KF−351A)の濃度は2.0%(w/v)である。
また、このリパーゼ活性測定用基質溶液に、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
(1) リパーゼ活性測定用基質である、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル 〔DGGMR〕(販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国])の0.09グラム[g]を、ビーカー(容量:10mL)に量り取った。
調製した混合物」(全部)と、前記の「一定量(4.0mL)の2%(w/v)のタウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液」との混合を行った。
なお、この対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液において、リパーゼ活性測定用基質〔DGGMR〕の濃度は0.6mMであり、界面活性剤の濃度は0.5%(w/v)である。
また、このリパーゼ活性測定用基質溶液に、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.4(20℃)に調整して、緩衝液を調製した。
(1) 前記1の〔1〕において調製した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を、25℃で暗所に30日間保存した。
(1) 前記1の〔3〕において調製した調製当日の緩衝液を第1試薬とし、前記2の(1)において25℃(暗所)にて30日間保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を第2試薬とした。
この第1試薬の1,600μLに、この第2試薬の960μLを添加し、混合して、混合液とした。
なお、この吸収曲線の測定は、DU7500型分光光度計(販売元:ベックマンコールター株式会社[日本国])を使用して行った。
前記3において測定した第2試薬として前記2の(1)の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を用いた場合の混合液の吸収曲線を図1に示した。
(1) DGGMRよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液、及びDGGMRをリパーゼ活性測定用基質として用いるリパーゼ活性測定用基質溶液においては、その保存中DGGMRは徐々に加水分解される。
そして、このDGGMRの分解により、6’−メチルレゾルフィンが最終的に生成する。
そこで、図1及び図2それぞれの吸収曲線において、6’−メチルレゾルフィンの生成を示す580nmのピークの高さ(増加度)より、6’−メチルレゾルフィンの生成量、すなわちDGGMRの分解量(加水分解量)を求めた。
これに対して、図2、すなわち対照例のリパーゼ活性測定用基質溶液を25℃(暗所)にて30日間保存した場合のDGGMRの分解量は8.9%であった。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における保存安定性の効果を再度確認した。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液(本発明のエマルジョン溶液よりなることを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液)を調製した。
そして、対照として、市販試薬の基質液を用いた。
また、緩衝液を調製した。
(1) 本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル 〔DGGMR〕(販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国])の0.045グラム[g]を、ビーカー(容量:10mL)に量り取った。
なお、このリパーゼ活性測定用基質溶液において、リパーゼ活性測定用基質〔DGGMR〕の濃度は0.3mMであり、本変性シリコーンオイル(KF−355A)の濃度は0.3%(w/v)である。
また、このリパーゼ活性測定用基質溶液に、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
市販のリパーゼ活性測定試薬(リパーゼ活性測定試薬キット)である「リキテック リパーゼ カラー II」(販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国])を、対照として用いた。
なお、この「リキテック リパーゼ カラー II」[以下、「対照市販試薬」ということがある]は、第1試薬である「緩衝液」、及び第2試薬である「基質液」(DGGMRをリパーゼ活性測定用基質として0.27mMの濃度で含む)よりなるものである。
この「対照市販試薬」の「基質液」を本実施例における検討に用いた。
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.4(20℃)に調整して、緩衝液を調製した。
(1) 前記1の〔1〕において調製した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を、30℃で暗所に35日間保存した。
(1) 前記1の〔3〕において調製した調製当日の緩衝液を第1試薬とし、前記2の(1)において30℃(暗所)にて保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を第2試薬として、以下の測定を行った。
なお、この測定は、この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の保存開始日(0日目)、保存7日後、保存15日後、保存21日後、及び保存35日後の各々の日に、当該期間保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液をそれぞれ使用して行った。
まず、この第1試薬の1,600μLに、この第2試薬の960μLを添加し、混合して、混合液とした。
すなわち、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を算出した。
すなわち、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を算出した。
前記3において測定した、第2試薬として前記2の(1)の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を用いた場合の、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を表1及び図3に示した。
(1) 30℃で15日間保存した場合、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「DGGMRの分解率」の値が0.2%であるのに対して、対照市販試薬の基質液における「DGGMRの分解率」の値は1.4%であることが、表1及び図3より分かる。
すなわち、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「DGGMRの分解率」は、対照市販試薬の基質液における「DGGMRの分解率」の14%にしかすぎないことが分かる。
(2) また、30℃で35日間保存した場合、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「DGGMRの分解率」の値が0.4%であるのに対して、対照市販試薬の基質液における「DGGMRの分解率」の値は3.3%であることが、表1及び図3より分かる。
すなわち、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「DGGMRの分解率」は、対照市販試薬の基質液における「DGGMRの分解率」の12%にしかすぎないことが分かる。
(3) 従って、本実施例の検討結果からも、本発明は、DGGMRの分解を効果的に抑制することができ、保存安定性が優れ、そして長期間正確な測定値を得ることができるものであることが確かめられた。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における保存安定性の効果を再度確認した。
計4種類の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液(本発明のエマルジョン溶液よりなることを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液)を調製した。
そして、対照として、市販試薬の基質液を用いた。
また、緩衝液を調製した。
(1) 本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル 〔DGGMR〕(販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国])を、4個のビーカー(容量:10mL)のそれぞれに、0.09グラム[g]ずつ量り取った。
(b) KF−354A (販売元:信越化学工業株式会社[日本国])
(c) KF−355A (販売元:信越化学工業株式会社[日本国])
(d) KF−6011 (販売元:信越化学工業株式会社[日本国])
なお、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液(計4種類)において、いずれも、リパーゼ活性測定用基質〔DGGMR〕の濃度は0.6mMであり、本変性シリコーンオイルの濃度は2.0%(w/v)である。
また、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液(計4種類)のいずれにも、濃度勾配や強い濁り等は見られず、それぞれ均質に混合されていることを目視にて確認した。
(B) リパーゼ活性測定用基質溶液−B(リパーゼ活性測定用基質:DGGMR、本変性シリコーンオイル:KF−354A)
(C) リパーゼ活性測定用基質溶液−C(リパーゼ活性測定用基質:DGGMR、本変性シリコーンオイル:KF−355A)
(D) リパーゼ活性測定用基質溶液−D(リパーゼ活性測定用基質:DGGMR、本変性シリコーンオイル:KF−6011)
市販のリパーゼ活性測定試薬(リパーゼ活性測定試薬キット)である「リキテック リパーゼ カラー II」(販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国])を、対照として用いた。
なお、この「リキテック リパーゼ カラー II」[以下、「対照市販試薬」ということがある]は、第1試薬である「緩衝液」、及び第2試薬である「基質液」(DGGMRをリパーゼ活性測定用基質として0.27mMの濃度で含む)よりなるものである。
この「対照市販試薬」の「基質液」を本実施例における検討に用いた。
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.4(20℃)に調整して、緩衝液を調製した。
(1) 前記1の〔1〕の(6)の(A)〜(D)の4種類の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のそれぞれを、25℃で暗所に31日間保存した。
(1) 前記1の〔3〕において調製した調製当日の緩衝液を第1試薬とし、前記2の(1)において25℃(暗所)にて保存した「(A) リパーゼ活性測定用基質溶液−A」を第2試薬として、以下の測定を行った。
なお、この測定は、この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の保存開始日(0日目)、保存5日後、保存23日後、及び保存31日後の各々の日に、当該期間保存した「(A) リパーゼ活性測定用基質溶液−A」をそれぞれ使用して行った。
まず、この第1試薬の1,600μLに、この第2試薬の960μLを添加し、混合して、混合液とした。
すなわち、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を算出した。
すなわち、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を算出した。
すなわち、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を算出した。
すなわち、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を算出した。
すなわち、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を算出した。
前記3において測定した、第2試薬として前記2の(1)の4種類の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液[(A)〜(D)]を用いた場合の、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を表2及び図4に示した。
「(D) リパーゼ活性測定用基質溶液−D」における「DGGMRの分解率」の値を「●」で示し、そして、対照市販試薬の基質液における「DGGMRの分解率」の値を「▲」で示す。
(1) 表2及び図4より、25℃で31日間保存した場合、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「(A) リパーゼ活性測定用基質溶液−A」における「DGGMRの分解率」の値は0.3%であり、「(B) リパーゼ活性測定用基質溶液−B」における「DGGMRの分解率」の値は0.4%であり、「(C) リパーゼ活性測定用基質溶液−C」における「DGGMRの分解率」の値は0.8%であり、そして「(D) リパーゼ活性測定用基質溶液−D」における「DGGMRの分解率」の値は0.5%であることが分かる。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における保存安定性の効果を再度確認した。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液(本発明のエマルジョン溶液よりなることを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液)を調製した。
そして、対照として、市販試薬の基質液を用いた。
また、緩衝液を調製した。
(1) 本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル 〔DGGMR〕(販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国])の0.045グラム[g]を、ビーカー(容量:10mL)に量り取った。
なお、このリパーゼ活性測定用基質溶液において、リパーゼ活性測定用基質〔DGGMR〕の濃度は0.3mMであり、本変性シリコーンオイル(KF−355A)の濃度は0.3%(w/v)である。
また、このリパーゼ活性測定用基質溶液に、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
市販のリパーゼ活性測定試薬(リパーゼ活性測定試薬キット)である「リキテック リパーゼ カラー II」(販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国])を、対照として用いた。
なお、この「リキテック リパーゼ カラー II」[以下、「対照市販試薬」ということがある]は、第1試薬である「緩衝液」、及び第2試薬である「基質液」(DGGMRをリパーゼ活性測定用基質として0.27mMの濃度で含む)よりなるものである。
この「対照市販試薬」の「基質液」を本実施例における検討に用いた。
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.4(20℃)に調整して、緩衝液を調製した。
(1) 前記1の〔1〕において調製した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を、30℃で暗所に35日間保存した。
(1) 前記1の〔3〕において調製した調製当日の緩衝液を第1試薬とし、前記2の(1)において30℃(暗所)にて保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を第2試薬として、以下の測定を行った。
なお、この測定は、この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の保存開始日(0日目)、保存7日後、保存15日後、保存21日後、及び保存35日後の各々の日に、当該期間保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液をそれぞれ使用して行った。
まず、この第1試薬の1,600μLに、この第2試薬の960μLを添加し、混合して、混合液とした。
すなわち、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を算出した。
すなわち、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を算出した。
前記3において測定した、第2試薬として前記2の(1)の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を用いた場合の、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を表3及び図5に示した。
(1) 表3及び図5より、30℃で35日間保存した場合、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「DGGMRの分解率」の値は0.4%であることが分かる。
(2) よって、本実施例の検討結果からも、本発明は、DGGMRの分解を効果的に抑制することができ、保存安定性が優れ、そして長期間正確な測定値を得ることができるものであることが確かめられた。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における保存安定性の効果を再度確認した。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液(本発明のエマルジョン溶液よりなることを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液)を調製した。
そして、対照として、市販試薬の基質液を用いた。
また、緩衝液を調製した。
(1) 本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル 〔DGGMR〕(販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国])の0.045グラム[g]を、ビーカー(容量:10mL)に量り取った。
なお、このリパーゼ活性測定用基質溶液において、リパーゼ活性測定用基質〔DGGMR〕の濃度は0.3mMであり、本変性シリコーンオイル(KF−355A)の濃度は0.3%(w/v)である。
また、このリパーゼ活性測定用基質溶液に、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
市販のリパーゼ活性測定試薬(リパーゼ活性測定試薬キット)である「リキテック リパーゼ カラー II」(販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国])を、対照として用いた。
なお、この「リキテック リパーゼ カラー II」[以下、「対照市販試薬」ということがある]は、第1試薬である「緩衝液」、及び第2試薬である「基質液」(DGGMRをリパーゼ活性測定用基質として0.27mMの濃度で含む)よりなるものである。
この「対照市販試薬」の「基質液」を本実施例における検討に用いた。
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.4(20℃)に調整して、緩衝液を調製した。
(1) 前記1の〔1〕において調製した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を、10℃で暗所に390日間保存した。
(1) 前記1の〔3〕において調製した調製当日の緩衝液を第1試薬とし、前記2の(1)において10℃(暗所)にて保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を第2試薬として、以下の測定を行った。
なお、この測定は、この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の保存開始日(0日目)、保存90日後、保存180日後、保存270日後、保存360日後、及び保存390日後の各々の日に、当該期間保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液をそれぞれ使用して行った。
まず、この第1試薬の1,600μLに、この第2試薬の960μLを添加し、混合して、混合液とした。
すなわち、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を算出した。
すなわち、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を算出した。
前記3において測定した、第2試薬として前記2の(1)の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を用いた場合の、「試薬中のDGGMR濃度1mM当りの、試薬保存時に分解したDGGMRの比率」(DGGMRの分解率)[単位:%]を表4及び図6に示した。
(1) 表4及び図6より、10℃で390日間保存した場合、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における「DGGMRの分解率」の値は0.6%であることが分かる。
(2) よって、本実施例における冷蔵保存時の検討結果からも、本発明は、DGGMRの分解を効果的に抑制することができ、保存安定性が優れ、そして長期間正確な測定値を得ることができるものであることが確かめられた。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における保存安定性の効果を再度確認した。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液(本発明のエマルジョン溶液よりなることを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液)を計3ロット調製した。
これを第1ロットとした。
これらを第2ロット及び第3ロットとした。
また、これらのいずれのリパーゼ活性測定用基質溶液においても、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
前記1において調製した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第1ロット、第2ロット、及び第3ロットのそれぞれを、10℃で暗所に16ヶ月間保存した。
前記2において保存した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第1ロット、第2ロット、及び第3ロットについて、それぞれのエマルジョンのミセル径を測定した。
前記3において測定した本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第1ロットのエマルジョンのミセル径(粒子径)の分布を図7に示し、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第2ロットのエマルジョンのミセル径(粒子径)の分布を図8に示し、そして、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第3ロットのエマルジョンのミセル径(粒子径)の分布を図9に示した。
これらの図7、図8及び図9より、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の第1ロット、第2ロット、及び第3ロットのいずれにおいても、保存開始時(0日目)の測定結果及び16ヶ月間保存時の測定結果の両方において、そのエマルジョンのミセル径(粒子径)の分布が100nm〜200nm(0.1μm〜0.2μm)の範囲及びその近辺にあることが分かる。
本発明のリパーゼ活性測定試薬(本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を含むことを特徴とする)における保存安定性の効果を確認した。
本発明のリパーゼ活性測定試薬の第1試薬及び第2試薬をそれぞれ調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.4(20℃)に調整して、本発明のリパーゼ活性測定試薬の第1試薬を調製した。
塩化カルシウム [リパーゼ活性化剤] 20mM
コリパーゼ (ブタ膵臓由来、販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国]) 750K単位/L(10mg/L)
Bicine [緩衝剤] 80mM
本発明のリパーゼ活性測定試薬の第2試薬を計3ロット調製した。
これを本発明のリパーゼ活性測定試薬の第2試薬の第1ロットとした。
これらをそれぞれ本発明のリパーゼ活性測定試薬の第2試薬の第2ロット及び第3ロットとした。
また、これらのいずれのリパーゼ活性測定用基質溶液においても、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
(1) 前記1の〔1〕において調製した本発明のリパーゼ活性測定試薬の第1試薬の第1ロット、第2ロット、及び第3ロットのそれぞれを、10℃で暗所に13ヶ月間保存した。
下の「(1)管理血清−1」、「(2)管理血清−2」、及び「(3)管理血清−3」をそれぞれ試料として用いた。
市販の精度管理用管理血清である「Aalto Control IM」(販売元:株式会社シノテスト[日本国])と精度管理用管理血清である「Aalto Control II」の「試作品」(株式会社シノテスト[日本国])を等量ずつ混合したものを、「管理血清−1」として用いた。
精度管理用管理血清である「Aalto Control II」の「試作品」(株式会社シノテスト[日本国])を、「管理血清−2」として用いた。
市販の精度管理用管理血清である「QAPトロール 2X」〔製造番号:QL−215〕(販売元:シスメックス株式会社[日本国])を、「管理血清−3」として用いた。
前記2において10℃(暗所)にて13ヶ月間保存した本発明のリパーゼ活性測定試薬の第1試薬及び第2試薬を使用して、7180形汎用自動分析装置(販売元:株式会社日立ハイテクノロジーズ[日本国])により、前記3の各試料のリパーゼ活性の測定を行った。
なお、この測定は、この本発明のリパーゼ活性測定試薬の第1試薬及び第2試薬の保存開始時(0日目)、保存3ヶ月後、保存6ヶ月後、保存9ヶ月後、保存12ヶ月後、及び保存13ヶ月後の各々の時に、当該期間保存した本発明のリパーゼ活性測定試薬の第1試薬及び第2試薬をそれぞれ使用して行った。
この「自動分析用キャリブレーターII(C.f.a.s.II)」を試料とすること以外は、前記(1)〜(3)の記載の通りに操作を行い、較正物質である「自動分析用キャリブレーターII(C.f.a.s.II)」を測定したときの吸光度変化量を測定した。(当該較正物質に含まれているリパーゼの活性値[既知値]に応じて生成する6’−メチルレゾルフィンの濃度増加に基づく吸光度変化量の測定)
この生理食塩水を試料とすること以外は、前記(1)〜(3)の記載の通りに操作を行い、生理食塩水を測定したときの吸光度変化量を測定した。(試薬盲検の吸光度変化量の測定)
前記4において測定し、求めた前記3の各試料のリパーゼ活性値を表5に示した。
(1) これらの表5及び図10より、本発明のリパーゼ活性測定試薬の第1試薬及び第2試薬としてそれぞれの第1ロットを使用したとき、保存開始時(0日目)の測定値(リパーゼ活性値)に対する試薬保存中の測定値は、「(1)管理血清−1」においては98%〜100%であり、「(2)管理血清−2」においては100%〜101%であり、そして、「(3)管理血清−3」においては98%〜101%であることが分かる。
Claims (6)
- 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなることを特徴とする、リパーゼ活性測定用基質溶液。
- 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなるリパーゼ活性測定用基質溶液を含むことを特徴とする、リパーゼ活性測定試薬。
- 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液よりなるリパーゼ活性測定用基質溶液を使用して、試料中のリパーゼ活性を測定することを特徴とする、試料中のリパーゼ活性の測定方法。
- 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル、及び側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液。
- 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることを特徴とする、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルをリパーゼ活性測定用基質として用いるリパーゼ活性測定用基質溶液の安定化方法。
- 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルと共に、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを含有させることを特徴とする、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルよりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液の安定化方法。
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