JPH03139278A - グルコースオキシダーゼ酵素調剤の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グルコース（ＣＯＤ）は、下記の反応に触媒作用を与え
る酵素である。

ｒ−Ｄ−グルコノラクトン十Ｈ，Ｏ□ この酵素は、最近はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｇ
ｒｇｉｌｌｓａ　Ｎｉｇｇｒ　）から主として得られ、
酸素の除去（例えば食品からの酸素除去）のような種々
の応用において、及びグルコース（生物液体、食品等の
中のグルコース）を分析する方法において使用される。

ＣＯＤのその他の有用な採取源としてはペニシリウム・
ツタツム（Ｐａｎｓｃｉｌｌ−４ｎｍ％６ｔａｔｓｍ）
のようなペニシリウム菌がある。

すべての酵素がそうであるように、ＧＯＤは安定性が悪
く、従って商業的目的のためには、意図されろ用途に応
じて固体また液体の形の処方物が一般に使用される。

液体の形の処方物は、固体処方物よりも製造するのが容
易であるが、酵素はより不安定であり、従ってそのよう
な調剤は、より短い貯蔵寿命である。

従って、液体状の酵素の非常な不安定性の欠点を克服す
るために、過去に多様な努力がなされてきた。かかる課
題に関する文献としては、例えば、Ｊ、フイーシュル（
Ｆｉｇｓｃｈｌ　）等［Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ−Ｊ６６
４１６０　　Ａ５及び「Ｂｏｅｈｒｉｎｇｇｒ　Ｍａｎ
ｎｈｓ団テクニカル・プルティン」ＥＣ，１，１，３，
４、等があり、液状のＣＯＤ調剤に対して種々の安定化
用物質、例えばノニオン界面活性剤、塩化ナトリウム等
を添加して使用することが提案されている。

さらには、最近の液状ＣＯＤ調剤は一般に、溶液のｐＨ
を安定化するのに適切な濃度で緩衝剤を含んでいる。リ
ン酸塩緩衝剤は、生物液体中のグルコース分析（測定）
に通常使用される試薬処方物中において最も普通に用い
られるものである。

本発明の目的は、液状のグルコースオキシダーゼ調剤を
安定化させて、それを製造するのが経済的であり、そし
て従前提案の調剤と比較して使用するのが簡単であり、
長期にわたり安定であるようにする方法を提供すること
である。

この点に関して、本発明は、直ちに使用できかつ長時間
安定である調剤を製造しうろ仮状のグルコースオキシダ
ーゼの調製に関する。本発明による液状のグルコースオ
キシダーゼ調剤の安定化方法は、その調剤に対してリン
酸塩緩衝剤を４００〜３５００　ｍ　Ｍ　／　ｌの濃度
で導入することを特徴とするものである。換言すれば、
本発明は６．０〜８０の、Ｈを有し、リン酸塩を４００
〜３５００ｍ　Ｍ　／　Ａ！の濃度で含む、グリコ−オ
キシダーゼ含有水性液体組成物を提供する。

本発明の、即使用可能な液状グルコースオキシダーゼ調
剤は、リン酸塩緩衝剤を４００〜３５００ｍ　Ｍ　／　
ｌの濃度で含有することを特徴とする。

リン酸カリウムは、その高い水溶性の故に好ましいが、
その他のリン酸塩類やそれらの混合物も使用することが
できる。リン酸塩の好ましい濃度は、１ノ当り７００〜
２５００ｍＡｆ、特に１１当り約１５００ｍＭである。

種々の採取源からの、種々の濃度のＣＯＤを使用できる
。アスペルギルス・ニガーからのＧＯＤは好ましく、５
〜５０１Ｕ／ゴ、％に１５〜２０ＩＵ／αの組成物濃度
が好ましい。

この点に関して、す／酸塩緩衝剤が、Ｈ緩衝剤として機
能するのに必要とされるよりも異常に高いリン酸塩緩衝
剤濃度、殊にその必要濃度よりも２倍以上高し・リン酸
塩緩衝剤濃度は、液状調剤中の酵素の安定化について付
加的かつ予想できない効果をもたらすことが意外にも発
見された。

安定化効果は、リン酸塩緩衝剤以外の塩を添加すること
によって増大されつる溶液のイオン力の単なる増加に相
関しないものであるのでなおさらに驚くべきことである
。

本発明の創作性は、ＧＯＤ溶液を緩衝するのに通常使用
されるものとは異なる特定の濃度範囲で使用される場合
にリン酸塩緩衝剤は、ＣＯＤ酵素に対して強調された安
定化効果を生じるとい５事実を確認したことに依拠する
。

その効果が、イオン力の単純な増加やいずれかの緩衝剤
の濃度ではなくリン酸塩の使用に依存するものであると
い５事実は、下記の観察事項によって証される。

ｌ）リン、酸塩以外の塩を添加することによってリン酸
塩緩衝剤含有溶液のイオン力（イオン濃度）を増加させ
ろ場合には、達成される安定化は、同じイオン濃度（力
）を得るまでリン酸塩緩衝剤を添加することによって得
られる安定化と比較できない程低い。

２）その他の緩衝剤類を用℃・る調剤における酵累安定
化は、最良の効果がリン酸塩緩衝剤で得られることを示
す。

酵素安定化のためにリン酸塩緩衝剤を用いての本発明に
よる調剤のかかる重要な性質を明かにするため、以下に
例示説明を行なう。実験結果は添付図に示されている。

第１〜５図は、本発明による実験結果のグラフである。

実験には下記の組成の基本液状処方物を用いた。

Ｇ　ＯＤ　　　　　　　　　　　　２０，０００　Ｕナ
トリウムアジド（抗微生物剤）１１ 水を加えて　・　　　　　　　　　　　１１緩衝剤活性
を有する物質をこの処方物に加えて、ｐＨ７，２となる
ようにした。一般的には、本発明のＧＯＤ試薬組成物は
６．０〜８．０のｐＨを有しつるが、７．１〜７．３の
、Ｈが好まし〜・。

一連の試験での使用緩衝剤は下記の通りであつた。

リン酸カリウム：それぞれ１００，２２５．４５０、５
５０、　ｌ　５００、２０００゜３０００及び５０００
　ｍ　Ｍの量で添加した。

リン酸カリウム１１００ｆｒＬに、５００ｍＭ及び１０
００　ｍ　Ｊ！のリン酸塩緩衝剤に等量の全イオン濃度
を得るような量でＫＣＩを添加した。

トリス：５５０．１５００．２０００惧Ｍで使用した。

すべての処方物は、３７°Ｃ及び４５℃での促進安定性
試験により試験した。

上記のタイプの緩衝剤を含む組成物を用いて本発明の主
要原理を一層明かにするために、上記の条件下で実施し
た試験の結果を、以下、添付図を参照して説明する。

第１図のグラフは、リン酸塩緩衝剤の種々の濃度につい
ての４５℃におけろＣＯＤの促進安定性試験の結果を示
すものである。グラフの横軸は安定性測定の時間（日数
）を表わし、そして縦軸は、酵素を溶液に入れたときの
初期活性の百分率として計算された残留活性を示す。活
性の測定は常法により実施した。

簡明のために５０００　ｍ　Ｍの濃度に対応する曲線は
省略した。この理由はその曲線の形が１００ｍＭの濃度
についての曲線と一致しているからである。

このグラフは、酵素活性が緩衝剤濃度が増大するにつれ
て増大し、１５００ｍ、Ｖの緩衝剤濃度でその最大効果
に達し、次いで緩衝剤濃度がその最大効果濃度を越えて
増大するにつれて減少することを示しており従って本発
明の組成物での酵素の実際の安定化の度合を示している
。第２図（横軸及び縦軸は第１図と同じ）は、第１図と
同じ濃度において、但し３７°ＣにおいてのＣＯＤの促
進安定性試験の結果を示している。このグラフは、この
試験温度における酵素安定性に対するり／酸塩緩衝剤の
作用の選択性は、４５℃におけるものよりも低いことを
示している。

第３図のグラフは、本発明の特徴を明かにするのに特に
重要なものである。このグラフは、４５℃での１３日間
の貯蔵後のＣＯＤ残留活性をリン酸塩緩衝剤濃度に対し
てプロットしたものであり、第１図のグラフの結果を用
いて構成されたものである。このグラフは、最大酵素安
定性が顕著に認められる緩衝剤濃度範囲が存在すること
を明瞭に示している。

第４図のグラフ（横軸、縦軸は第１及び２図と同じ）は
、１００ｍＭのリン酸塩緩衝剤に対してイオン力＜１）
を１，４及び４の二つの値にするに足りる量の塩化カリ
ウムを添加したものを用いて得られた結果を示す。これ
らの緩衝剤はそれぞれ５５０ｍ、Ｍ及び１５００　ｍ　
、Ｍのリン酸塩緩衝剤と同じイオン力を有する（第１図
の５５０ｍＡｆ及び１５００ｍＭのリン酸塩についての
二つの曲線を第４図に再現しである）。ＣＯＤ活性の維
持における上記二つの濃度での「リン酸塩緩衝剤十ＫＣ
Ｉ　Ｊの影響は、同じイオン強度を与える濃度のリン酸
塩緩衝剤単独の場合のものと容易に対比できる。

この対比から、酵素に対する安定化効果はリン酸塩緩衝
剤の存在に大きく左右されること、そして同一のイオン
力であるがより低いリン酸塩緩衝剤濃度である緩衝剤溶
液は可成り低い安定化効果を示すこと、が明かである。

最後に第５図のグラフ（＠及び縦軸は第４図と同じ）は
、４５°ＣＫおし・てのリン酸塩緩衝剤中のＣＯＤ及び
トリス緩衝剤中のＣＯＤの促進安定性試験（三つの同じ
濃度値での）の結果を示す。

同一の濃度について、リン酸塩緩衝剤はトリス緩衝剤よ
りもはるかに大きい安定化効果を示すことが明かである
。

上記の方法によるグルコースオキシダーゼ（ｃｏＤ）の
安定化は、生物液中のグルコース測定、殊にいわゆるト
リングー（Ｔｒｉ／Ｉｄｅｒ　）法によるグリコースｇ
！ＩＩ定で即座に使用しつる状態の液状調剤を製造する
のに特に有用である。

そのような使用の一例は下記の通りである。

第１組成物を、アス〆ルギルス・ニガーからの１５Ｕ、
７ｍｌのＣＯＤ、及び５００−１０００ｍＭ／Ｅのリン
酸二水素カリウム及びリン酸−水累二カリウム（７２の
最終ｐＥを与える比率）ならびに残部の水で作った。こ
の溶液に対して、トリンダー試薬（４！５ｍ＆フェノー
ル、７．５　ｍ　ｒｓｆ　４−アミノアンチピリン、４
２Ｕ　／ｍｉペルオキシダーゼ及び抗微生物剤としての
９２　ｍ　Ａｆナトリウムアジド、残部水）を添加した
。この場合トリンダー試薬：溶液の容積比は５：１であ
った。この混合物１００μｌに対して、グルコース濃度
測定用試料（典型的には血清または尿）３μ及び水１４
０μｌを（遠心分析器で混合することにより）添加した
。５００〜５２０ｎｍでのこの反応混合物の吸光度を、
その分析器の分光分析装置によって連続的に測定し、そ
１−で、終点または一定の時点を基準にして、既知グル
コース濃度を有するキャリブレーク−の同様分析器の値
と比較した。

使用トリンダー試薬は、凍結固体の形で、あるいは液状
安定組成物の形で（好ましくはイタリヤ特許出願第２１
５９１，４．、／８９号明細書に記載のようにして安定
化されて）供給されうる。試料の全希釈度は種々のＣＯ
Ｄ試薬ニドリンダ−試薬の比率によって、１：８０から
１：２００の間で変えることができる。好ましくは、反
応は約３７°Ｃで行なわせるが、その他の反応条件も適
当に使用できる。

さらには、本発明の安定化ＣＯＤ組成物は、トリンダー
試薬以外の公知の発色試薬と共に、また分光分析法以外
の公知の過酸化水素検出試験法について使用できる。

【図面の簡単な説明】

第１〜５図は本発明によるグルコースオキシダーゼ酵素
安定化効果を示すグラフである。 （外４名） 日 畝 日 数

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液状のグルコースオキシダーゼ酵素調剤にリン酸塩
   緩衝剤を４００〜３５００ｍＭ／ｌの濃度で添加するこ
   とを特徴とする液状のグルコースオキシダーゼ酵素調剤
   の安定化方法。 ２、濃度が７００〜２５００ｍＭ／ｌである請求項１記
   載の方法。 ３、濃度が約１５００ｍＭ／ｌである請求項２記載の方
   法。 ４、リン酸塩緩衝剤がリン酸カリウムである請求項１記
   載の方法。 ５、６．０〜８．０のｐＨを有しそして４００〜３５０
   ０ｍＭ／ｌの濃度でリン酸塩濃度を含む、グルコースオ
   キシダーゼからなる水性液体組成物。 ６、リン酸塩濃度が７００〜２５００ｍＭ／ｌである請
   求項５記載の水性液体組成物。 ７、リン酸塩濃度が約１５００ｍＭ／ｌである請求項５
   記載の水性液体組成物。 ８、グルコースオキシダーゼがアスペルギルス・ニガー
   から誘導されたものであり、かつｐＨが７．１〜７．３
   である請求項５記載の水性液体組成物。 ９、ｐＨが７．１〜７．３である請求項５記載の水性液
   体組成物。 １０、グルコースオキシダーゼが５〜５０ＩＵ／ｍｌの
   濃度である請求項５記載の水性液体組成物。