JP6808489B2 - 酸可溶性銅−アンモニウム錯体および銅−亜鉛−アンモニウム錯体、組成物、調製、方法、ならびに使用 - Google Patents

酸可溶性銅−アンモニウム錯体および銅−亜鉛−アンモニウム錯体、組成物、調製、方法、ならびに使用 Download PDF

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Description

本発明は、概して、抗菌活性を有する組成物に関し、より具体的には、酸可溶性銅−アンモニウム錯体または酸可溶性銅−亜鉛−アンモニウム錯体を活性成分として含有する組成物に関する。
銅金属および銅塩の抗菌効果は古代より知られている。抗菌剤としての銅の役割は、紀元前約２，６００年に著述されたエジプトの医学文書であるスミス・パピルス（Ｓｍｉｔｈ Ｐａｐｙｒｕｓ）に最初に記載されており、この文書には、胸部創傷および飲料水の滅菌に銅を適用することが記載されている。
ギリシャ人、ローマ人、およびアステカ人は、慢性感染症の処置および一般の衛生のために銅金属またはその化合物を使用した。例えば、ヒポクラテス全集では、銅は、拡張蛇行静脈に関連した下腿潰瘍の処置に推奨されている。新鮮創の感染を予防するために、ギリシャ人は、酸化銅および硫酸銅で構成される乾燥粉末を創傷に振りかけた。その時代の別の消毒創傷処置は、ハチミツと赤色酸化銅の煮沸混合物であった。銅は、銅のラテン名ｃｕｐｒｕｍが由来するキプロス（Ｋｙｐｒｏｓ（Ｃｙｐｒｕｓ））島で容易に入手できたので、ギリシャ人は簡単に銅を利用できた。
古代インドのアーユルヴェーダ文書であるチャラカ・サンヒター（Ｃｈａｒａｋａ Ｓａｍｈｉｔａ）（紀元前３００年）も、飲料水の精製における銅の役割も含めて、銅が致死的な微生物をどのように死滅させるかについて記述している。Ｐｌｉｎｙ（紀元２３年〜７９年）は、銅を含むいくつかの治療薬について記載しており、例えば、黒酸化銅は腸内寄生虫を除去するためにハチミツと共に投与された。
現代に近づくと、免疫系における銅の役割についての最初の観察が１８６７年に発表され、そのときに、１８３２年、１８４９年、および１８５２年のパリにおけるコレラの流行期間中、銅労働者がその疾患に対して免疫であったことが報告された。さらに、銅が不足した動物は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）などの病原菌に対する易罹患性が増大していることが示された。
硫酸銅は、１９世紀に発明された殺真菌性の「ボルドー液」の重要な活性成分であり、数多くの他の銅ベースの農薬と同様に、今日でも、農業で使用されている。
細菌、真菌、およびウイルスなどの病原性微生物は、以下の非限定例により示されるように、多細胞生物における多くの疾患の原因となっている。
医薬品分野では、細菌感染は、座瘡（プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ））および湿疹（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））などの皮膚疾患に関係する。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種、クレブシエラ肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（その中にＮＤＭ−１酵素遺伝子が最初に同定された）、およびレジオネラ症の原因であるレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）により引き起こされる医療関連感染症（ＨＡＩ）。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））は、尿路感染症の通常の原因である。これらのＨＡＩおよび他のＨＡＩのために、米国で毎年ほぼ１００，０００人が死亡していると推定されている。病原性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７は、汚染食物を通して摂取されると、胃腸炎の原因となる。足白癬（トリコフィトン（Ｔｒｉｃｏｐｈｙｔｏｎ）種）、頭部秕糠疹（マラセチア・グロボーサ（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｇｌｏｂｏｓａ））、および口腔カンジダ症（カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））などの真菌を原因とする疾患は、比較的軽度であり得るが、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ））などの真菌、ならびにクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）などの酵母は、免疫無防備状態の患者に生命を脅かす感染症を引き起こすことがある。さらに、ウイルスは、感冒（ライノウイルス）およびインフルエンザ（インフルエンザウイルスＡ、Ｂ、およびＣ）などの通常の疾患、ならびに口唇ヘルペス（単純ヘルペスウイルス）、狂犬病およびエボラなどの一層重篤なウイルス疾患の原因である。
褥瘡および糖尿病性下腿潰瘍などの皮膚創傷の細菌感染は、症状を悪化させることがあり、銅塩および銅ベースの組成物は、その抗菌効果と増殖因子産生の増強により創傷治癒を刺激するその能力の両方によって、これらの疾患に有効であることが示されている。
美容分野では、銅または銅−亜鉛組成物は、例えば、軽度から中程度の日焼けおよび軽度熱傷の影響の緩和、さらに昆虫刺傷を原因とするそう痒および炎症の軽減、ならびにしわの出現の低減に有効であることが示されている。
農業分野では、真菌病害が、現在、合衆国西部でマテバシイを死滅させており（ファイトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｒａｍｏｒｕｍ））、欧州ではトリネコの木を死滅させている（チャララ・フラキシネア（Ｃｈａｌａｒａ ｆｒａｘｉｎｅａ））。ブドウ蔓茎、果物および野菜が実る植物ならびに禾穀類の真菌性および細菌性疾患が、世界食糧生産にとって脅威となっている。
病院および一般的な環境において数が増大する、病原性微生物の薬剤耐性菌株の存在が、以下の例で示されるように、大きな関心事となりつつある。ＭＲＳＡ、バイコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＶＲＳＡ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）など、抗生物質耐性および多剤耐性の病原菌株が現在普通になっている。ケトコナゾール耐性のＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）およびＡ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）など、病原性真菌の耐性株が、特に免疫無防備状態の患者でますます問題となっている。殺真菌剤耐性の植物病原性真菌は絶えず進化し、その処置のために新しい抗真菌剤が必要とされている。例えば、ジャガイモ胴枯れ病の原因であるフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）は、２０世紀後半にはメタラキシルに対して高度に耐性になった。病原性ウイルスも同様に、抗ウイルス薬に対する耐性を発生させ、過去５年間における、オセルタミビルリン酸塩（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡの登録商標）に対するＨ１Ｎ１「ブタかぜ」インフルエンザＡ型の耐性の発生が最近の例である。
本発明によれば、銅塩を含む水溶液と不溶性銅−アンモニウム錯体を生成させるために銅塩溶液に加える塩基性アンモニウム塩と、銅−アンモニウム錯体を可溶化し、それにより形成される透明な青色酸可溶性銅−アンモニウム溶液のｐＨを調節するために銅塩溶液に加える少なくとも１種の水溶性酸とを含む抗菌性組成物が提供される。
前述の段落は、導入として提示されたものであり、本明細書、特許請求の範囲、および添付図面に記載される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本発明は、以下の図面を参照して説明することになるが、同様な参照番号は同様な要素を指す。
菌株Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖に対する硫酸銅および組成物Ｃｕ＃１の効果を示すグラフである。 菌株Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖に対する硫酸亜鉛単独および組成物Ｃｕ＃１と併用した硫酸亜鉛の効果を示すグラフである。 菌株Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖に対するゲル、硫酸亜鉛（１００μｇ／ｍｌ）単独、ならびに組成物Ｃｕ＃９またはＣｕ＃１０（２００μｇ／ｍｌ）単独および硫酸亜鉛と併用した組成物Ｃｕ＃９またはＣｕ＃１０（２００μｇ／ｍｌ）の効果を示す棒グラフである。 硫酸銅ならびに組成物Ｃｕ＃９、Ｃｕ＃１０、およびＣｕ−Ｚｎ＃１：ゲル＋Ｃｕ＃９、ゲル＋Ｃｕ−Ｚｎ＃１と共に２４時間培養した後のヒト皮膚細胞生存率のグラフである。 ゲル＋Ｃｕ＃９、ゲル＋Ｃｕ−Ｚｎ＃１、および活性化合物のサリチル酸および過酸化ベンゾイルを含有する２つのＣＬＥＡＲＡＳＩＬ（登録商標）（Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ ＬＬＣ ｏｆ Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄの商標）抗座瘡クリーム製品と共に２４時間培養した後のヒト皮膚細胞生存率のグラフである。
本発明について、好ましい実施形態に関連して説明することになるが、記載の実施形態に本発明を限定する意図はないことを理解されよう。これに対して、意図することは、本明細書、特許請求の範囲、および添付図面により定義される本発明の趣旨および範囲の中に包含され得る、すべての代替形態、修正形態、および均等形態を包含することである。
本発明について、例として説明するものであり、限定するものではない。本明細書に記載の本発明に対する修正形態、改良形態、および追加形態は、本明細書を読み、添付図面を見た後に判定することができ；そのような修正形態、改良形態、および追加形態は、本発明の趣旨および幅広い範囲に含まれ、かつ本明細書に記載または想定されるその種々の実施形態に含まれると見なされる。
本発明者は、驚くべきことに、本明細書に記載の酸可溶性銅−アンモニウムおよび銅−亜鉛−アンモニウム錯体が、特定の細菌株の場合に抗生物質耐性であるか、またはそうでなければ特定の細菌株および真菌株の場合に処置または管理するのが困難である特定の病原性微生物と戦うのに有用であることを見出した。さらに、本発明者は、驚くべきことに、これらの酸可溶性銅−アンモニウム錯体が、処置するのが困難な細菌、例えばＭＲＳＡおよびアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）に対して極めて有効であり得ること、それと同時に同様な濃度で培養中のヒト皮膚細胞に毒性がないことを見出した。
安全に摂取することができる銅（成人で１日当たり６ミリグラム以下）または環境中、特に水性環境中の植物および動物が耐容性を示す銅が比較的低量のために、本明細書に記載の酸可溶性銅−アンモニウムまたは銅−亜鉛−アンモニウム組成物の用途は、主として、例えば、動物およびヒトの皮膚または粘膜の上、植物の葉の上、あるいは例えば、家または病院などの環境中の表面上など局所使用向けである。
局所使用の例外としては、例えば、（ｉ）微生物を除去または死滅させるための酸可溶性銅−アンモニウムまたは酸可溶性銅−亜鉛−アンモニウム組成物の使用により飲用にすることができる、１種または複数の微生物により汚染された水を処理すること、あるいは（ｉｉ）本明細書に記載の酸可溶性銅または銅−亜鉛組成物の１種または複数の添加により、水泳プールまたはホットタブなどの構造物中の水を汚染する微細藻類または細菌を除去または死滅させることより、使用に適した水にすることが挙げられる。
本明細書に記載の酸可溶性銅−アンモニウム錯体組成物は、例えばＭＲＳＡ感染症またはＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）などの真菌感染症を予防または処置するために、患者の皮膚に局所的に塗布することができる。それらはまた、例えばウドンコ病などの真菌感染症の植物の葉に噴霧することにより局所的に塗布することができる。いったん表面上に塗布されると、銅イオン錯体の殺菌特性は、相当な期間有効性を持続することができる。
酸可溶性銅−アンモニウム錯体はまた、例えば噴霧することにより、または布地へのアプリケーションにより表面に塗布することができ、予想外にも、複数の異なる病原性微生物に対して同時に有効になる場合があり、そのような微生物による感染および再感染に対して防護することができる。いったん表面上に塗布されると、銅イオン錯体の殺菌特性は、相当な時間有効性を持続することができる。
本酸可溶性銅−アンモニウム錯体およびそれを含浸した基材は、通常の薬物および／または通常の殺菌剤レジームで処置するのがこれまで困難であった病原性微生物の増殖を極めて有効に阻害することができる。病原性微生物の増殖のこの阻害は、驚くべきことに、ヒト皮膚細胞に有毒でない濃度で起こり得る。
酸可溶性銅−アンモニウム組成物は、クリーム剤、ゲル剤、噴霧溶液、灌水溶液、ならびに皮膚および粘膜表面、植物の葉、および家、病院、工場、乗り物等の作業表面への塗布用になり得る含浸ドレッシング材などの局所製剤にすることができる。
酸可溶性銅−アンモニウムおよび銅−亜鉛−アンモニウム組成物は、以下に概説される基本手順に従って好都合に調製される。本発明のこれらの開示実施形態は、特定の好ましい組成物を例示するが、これらの例は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者にとって明白であるように、本発明の趣旨および幅広い範囲から逸脱することなく、複数の変形および修正がなされ得る。
以下の例では、酸可溶性銅−アンモニウム錯体製剤Ｃｕ＃３を作製するための基本プロトコールを記載する。化学物質はすべて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ．，Ｔｈｅ ｏｌｄ Ｂｒｉｃｋｙａｒｄ，Ｎｅｗ Ｒｏａｄ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｄｏｒｓｅｔ ＳＰ８ ４ＸＴ，ＵＫ，またはＯｘｏｉｄ Ｌｔｄ．，Ｗａｄｅ Ｒｏａｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ ＲＧ２４ ８ＰＷ，ＵＫから入手した。
１６．０グラムの硫酸銅５水和物を、ガラスビーカー中の８０ミリリットルの蒸留水に、マグネティックスターラーおよび撹拌バーを使用して激しく混合しながら加えて、透明な青色溶液を形成させた。二酸化炭素が活発に放出されるため、４．０グラムの炭酸アンモニウムを０．５〜１グラム量の硫酸銅溶液に加えて、炭酸アンモニウムの分割量を加える間に二酸化炭素の活発な放出が静まるようにした。硫酸銅溶液に炭酸アンモニウムを加えながら、淡青色の不溶性銅−アンモニウム錯体を形成させ、これを激しく撹拌して懸濁状態に保った。二酸化炭素を放出させ、銅−アンモニウム錯体を可溶化させながら、１０．０ミリリットルのリン酸（８５％溶液）を徐々に加えた。銅−アンモニウム錯体を完全に可溶化し、かつ溶液のｐＨを調節するように十分な酸を加えなければならない。得られた透明で鮮やかな青色溶液を、さらに５分間激しく撹拌し、次いで蒸留水で１００ミリリットルの最終容積にした。
組成物中の銅の元素濃度は、概略１〜１０グラム／デシリットル、好ましくは３〜７グラム／デシリットル、より好ましくは３．５〜５グラム／デシリットルであって、溶媒相は蒸留水または脱イオン水であることが好ましい。
このプロトコールに基づく他の酸可溶性銅−アンモニウム錯体製剤の例については、下記の表１を参照されたい。表では、グラムを、文字ｇで略し、ミリリットルを、文字ｍｌで略す。
Figure 0006808489
以下の例では、酸可溶性銅−亜鉛−アンモニウム製剤Ｃｕ−Ｚｎ＃１０の製造のための基本プロトコールについて記載する。
６．０グラムの硫酸銅５水和物を、ガラスビーカー中の８０ミリリットルの蒸留水に、マグネティックスターラーおよび撹拌バーを使用して激しく混合しながら加えて、透明な青色溶液を形成させた。６．６グラムの硫酸亜鉛７水和物を硫酸銅溶液に加え、撹拌して溶解させた。２．０ミリリットルの水酸化アンモニウム（１０％溶液）を硫酸銅／硫酸亜鉛溶液に滴下して加えた。硫酸銅／硫酸亜鉛液に水酸化アンモニウム溶液を加えながら、淡青色の不溶性銅−亜鉛−アンモニウム錯体を形成させ、これを激しく撹拌しながら懸濁状態に保った。銅−亜鉛−アンモニウム錯体を可溶化するために、４．０グラムの亜リン酸を約０．５ｇの分割量で徐々に加えた。銅−亜鉛−アンモニウム錯体を完全に可溶化し、かつ溶液のｐＨを調節するように十分な酸を加えなければならない。得られた透明な淡青色溶液を、さらに５分間激しく撹拌し、次いで蒸留水で１００ミリリットルの最終容積にした。
組成物中の銅および亜鉛の元素濃度は、概略１：１であって、溶媒相は、蒸留水または脱イオン水であることが好ましい。
このプロトコールに基づく他の酸可溶性銅−亜鉛−アンモニウム製剤については、表２を参照されたい。表では、グラムを、文字ｇで略し、ミリリットルを、ｍｌで略す。
Figure 0006808489
本発明のアロエベラベースのゲルを製造する方法を、実施例の提供と共に本明細書に記載する。
実施例１．３００ミリリットルのホウケイ酸ガラスビーカー中で約６０℃にて、１５０ミリリットルの蒸留水に１．０グラムのキサンタンガムを振りかけ、泡立て器で３０秒間激しく混合して、滑らかな泡立ち溶液を形成させる。キサンタンガム溶液に１．０グラムのアロエベラ粉末を振りかけ、再度３０秒間、またはアロエベラ粉末が溶液に完全に溶解するまで激しく泡立てる。室温の蒸留水を加えて２００ミリリットルの最終容積にする。４℃でゲルを保存し、１か月以内に使用する。このゲルは、寒天プレート抗菌性試験において、銅および銅／亜鉛組成物を希釈するために使用した。美容目的および／または室温での保存のためにこのゲルを使用することになる場合には、抗菌防腐剤を加えなければならない。これらの防腐剤としては、例えば、マンデル酸、グリセロール、ソルビン酸カリウム、フェノキシエタノール、安息香酸ナトリウムを挙げることができる。有効な組合せは、ソルビン酸カリウム（ＫＳ）と安息香酸ナトリウム（ＮａＢ）である。１０．０％重量／容積のＫＳおよびＮａＢの別々の保存溶液を調製し、２．０ミリリットルの各生成物を、激しく混合しながら上記のキサンタンガム−アロエベラ溶液に加え、次いで室温の蒸留水を加えて２００ミリリットルの最終容積にした。酸可溶性銅−アンモニウムまたは銅−亜鉛−アンモニウム錯体組成物を、例えば、このゲル中に１：１００容量／容量に希釈した。
実施例２．秤量したビーカー中で室温（約２０℃）にて、３グラムのグリセロールに３．０グラムのキサンタンガムを約１グラムの分割量で徐々に混合して、滑らかな均一なペーストを形成させる。ビーカーおよびその内容物を再秤量する。８００ミリリットルのホウケイ酸ガラスビーカー中で約６０℃にて、５グラムのグリセロール−キサンタンガム混合物（１グラムの混合物はビーカー中に残すべきである）を４００ミリリットルの蒸留水に、激しく泡立てながら徐々に加えて、透明な泡立ち溶液を形成させる。この溶液に２．５グラムのアロエベラ粉末を振りかけて、アロエベラ粉末が溶液に完全に溶解するまで泡立て続ける。抗菌防腐剤（例えば、上記のＫＳおよびＮａＢの１０％保存溶液の５．０ミリリットル）をこの段階で泡立てながら加えることができ、その後室温の蒸留水を加えて、５００ミリリットルの最終容積にする。
本発明が示され、一層容易に理解され、かつ当業者により容易に実行され得るように、その実施形態が、もっぱら非限定実施例として提示され、添付図面の参照と共に記載される。
実施例１．細菌に対する、選択した組成物の抗菌効果についての寒天プレート試験。
湿疹患者の皮膚から単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株（Ｓ１）を、トリプトン−大豆寒天（ＴＳＡ）上で培養し、単一コロニーをＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃にて一晩培養した。Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））培養物を、新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地で１：１０に希釈し、０．２ミリリットルを、ＴＳＡを含有する９センチメートルのペトリ皿上に広げ、乾燥させた。プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）株ＡＴＣＣ １１８２８（Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ））を、１％グルコース含有脳心臓浸出物（ＢＨＩ）ブロス中で、ＡｎａｅｒｏＧｅｎサッシェを使用する嫌気性条件下にて、３７℃で７２時間培養した。Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）培養物の０．２ミリリットルのサンプルを、ＢＨＩ寒天を含有する９センチメートルのペトリ皿上に広げ、乾燥させた。
試験する組成物を蒸留水で希釈し、５マイクロリットルを５ミリメートルの濾紙ディスク上に置くか、または種々の濃度で上記のアロエベラベースのゲル（防腐剤不含）に加え、５マイクロリットルの液滴を寒天表面上に置いた。次いで、プレートを３７℃で２４時間インキュベートし（Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）のために嫌気性条件下で）、そのとき、定規を使用して９０°角で２回、阻止帯（ＺｏＩ）を測定（ミリメートル単位）し、平均直径（Ｄ）を算出した。ｍｍ２での阻止面積（ＡｏＩ）を式：ＡｏＩ＝πｘ（Ｄ／２）２使用して算出した。
結果：
１．図１の結果では、ＴＳＡ上の菌株Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖に対する、硫酸銅の効果とゲルに溶解した組成物Ｃｕ＃１の効果を比較する。８００マイクログラム／ミリリットルの硫酸銅と２００マイクログラム／ミリリットルの組成物Ｃｕ＃１が同じＡｏＩ（２８ｍｍ２）を有するので、Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖阻害において、組成物Ｃｕ＃１が硫酸銅よりも約４倍効力が高いことが明らかである。この結果から、酸可溶性銅−アンモニウム錯体の組成物は、驚くべきことに、硫酸銅単独よりも抗菌性が高いことがわかる。
２．図２の結果では、ＴＳＡ上の菌株Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖に対する、硫酸亜鉛単独の効果とゲルに溶解した組成物Ｃｕ＃１と併用した硫酸亜鉛の効果を比較する。硫酸亜鉛単独は、試験したいずれの濃度（５０〜２００マイクログラム／ミリリットル）でも、Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖に対して効果を示さなかった。これに対して、組成物Ｃｕ＃１（１００マイクログラム／ミリリットル）を濃度漸増の硫酸亜鉛と併用した場合は、Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖に対して、明確な相乗的阻害効果があった。このように、組成物Ｃｕ＃１単独は、３ｍｍ２のＡｏＩを示したが、５０、１００、および２００マイクログラム／ミリリットルの濃度で硫酸亜鉛と併用した場合にはそれぞれ、ＡｏＩが１３、２０、および２８ｍｍ２に増加した。これらの結果から、驚くべきことに、抗菌性の酸可溶性銅−アンモニウム錯体は、単独ではＳ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））に対して抗菌活性を示さない硫酸亜鉛と相乗的に作用することができることがわかる。これらの結果から、酸可溶性銅−亜鉛−アンモニウム錯体が特定の生物に対して有利な抗菌活性を有し得ることが示唆される。
３．図３では、Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖に対する、単独および硫酸亜鉛（１００マイクログラム／ミリリットル）と併用したゲル中の２種の組成物Ｃｕ＃９およびＣｕ＃１０（２００マイクログラム／ミリリットル）の効果を示す。この結果から、ゲル単独およびゲル中の硫酸亜鉛がＳ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖に対して効果を示さないことがわかる。ゲル中の組成物Ｃｕ＃９およびＣｕ＃１０は両方とも単独で、Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖をそれぞれ２０および３３ｍｍ２のＡｏＩで阻害した。これに対して、ゲル中で硫酸亜鉛と併用すると、組成物Ｃｕ＃９およびＣｕ＃１０により、Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖阻害が増大し、それぞれ３８および５７ｍｍ２のＡｏＩを示した。これらの結果は、図２に示す結果を確認および拡張し、酸可溶性銅−アンモニウム錯体と硫酸亜鉛の間に、Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖に対する明確な相乗的阻害効果あることが示される。
４．表３では、上記の方法の部に記載のように、ＢＨＩ寒天上のＰ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の増殖に対する、硫酸銅、５種の異なる酸可溶性銅−アンモニウム錯体、および１種の酸可溶性銅−亜鉛−アンモニウム錯体の効果を示す。酸可溶性銅−アンモニウム錯体の保存溶液はすべて、１：２００（容量／容量）に希釈し、また同濃度の銅元素（２００マイクログラム／ミリリットル）の硫酸銅溶液も調製した。組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃１（表２を参照のこと）の保存溶液も試験用に１：２００に希釈した。すべての稀釈液は蒸留水とした。
Figure 0006808489
表３の結果から、酸可溶性銅−アンモニウム錯体はすべて、硫酸銅形態の等価濃度の銅元素よりもＰ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の増殖に対して阻害的であることがわかる。試験した５種のＣｕ＃組成物のＺｏＩは同様であったが、組成物の配合は、表１に示すようにかなり異なっていた。Ｃｕ＃３、Ｃｕ＃９、およびＣｕ＃１３は同じＺｏＩを示したが、銅−アンモニウム錯体を可溶化するために使用した酸は異なっており（それぞれリン酸、塩酸、および硫酸）、またＣｕ＃１３は、硫酸銅ではなく塩化銅を含む。Ｃｕ＃１２（硫酸銅および硫酸）は、Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）に対して最も大きなＺｏＩを示したが、Ｃｕ＃１３とは、組成物に使用した銅塩が異なるのみである（表１を参照のこと）。
銅−アンモニウムおよび銅−亜鉛−アンモニウムの組成物は、酸で可溶化されるので、これらの組成物の酸性度が、硫酸銅と比較した場合における、それらの大きな抗菌活性の原因であることが示唆され得るであろう。しかしながら、表３に示すように、Ｃｕ＃１０の保存溶液は、硫酸銅の等価溶液よりも高いｐＨを示すが、それにもかかわらず、Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の増殖に対して大きな阻害効果を示す。さらに、表３に示す化合物／組成物のＺｏＩとｐＨの間のノンパラメトリックなスピアマン相関検定により、相関係数＝−０．０５６およびｐ＝０．８１が得られ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｉｎ Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＰｒｉｓｍ ６統計パッケージを使用する）、この実験で試験した組成物のｐＨと抗菌活性の間に有意な相関がないことが示された。
興味深いことに、組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃１は、Ｃｕ＃組成物の銅元素のわずか３７．５％しか有していないにもかかわらず、最も阻害的な組成物の１つであり、等モル濃度の亜鉛元素を併せもつ（保存溶液中で１．５グラム／デシリットル）。Ｃｕ−Ｚｎ＃１の印象的な活性は、銅イオンと亜鉛イオンの間に相乗作用があるという、図２および３に提示する結果による結論を支持し、この酸可溶性銅−亜鉛−アンモニウム錯体が、Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）に対して予想を超える阻害効果を示すことを表す。これらの結果から、Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）に強く関連した疾患である座瘡の処置において、組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃１が治療価値を有し得ることも示唆される。さらに、Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）が、「正常な」皮膚のｐＨ範囲であるｐＨ４．５〜５であまり増殖しないことが知られており、また酸可溶性銅−亜鉛−アンモニウム錯体Ｃｕ−Ｚｎ＃１がＰ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の増殖を強力に阻害し、防腐剤を含むゲル中のＣｕ−Ｚｎ＃１の１％（容量／容量）製剤のｐＨ値が約ｐＨ４．６であるので、Ｃｕ−Ｚｎ＃１は、座瘡の処置に治療価値がある可能性がある。
実施例２．細菌のマイクロプレート培養
好気性菌株アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ））、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、およびクレブシエラ肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））を、病棟で採取したスワブから単離した。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＮＣＴＣ ９００１；Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））は、患者の膀胱由来の臨床分離株であり；すべての株は、ＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。マイクロプレートアッセイでの２倍希釈が１％容量／容量濃度から開始するように、試験する化合物／組成物の保存溶液を希釈した。試験する組成物の２倍稀釈液を、９６ウェル組織培養プレートにおいてＲＰＭＩ−１６４０中で調製した。細菌培養物を新鮮なＲＰＭＩで１：４０に希釈し、組成物に加えた。Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）を実施例１（寒天プレート試験法）に記載するように培養し、サンプルを新鮮なＢＨＩで１：１００に希釈した。９６ウェル組織培養プレート（１００マイクロリットル）において、試験する組成物の２倍希釈液を蒸留水で上記のように調製し、希釈したＰ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）培養物の１００マイクロリットルを加えた。次いで、プレートを３７℃で２４時間（Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）のために嫌気性条件下で）インキュベートした。組成物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、細菌増殖が視覚的に観察されない最低濃度として定義された。
結果
１．表４に、表１および２に記載の硫酸銅、硫酸亜鉛、および種々の組成物に対するＭＩＣの結果を示す。実験＃１では、試験した２種の銅ベース組成物（Ｃｕ＃３およびＣｕ＃９）は、硫酸銅の２倍の活性であった。驚くべきことに、硫酸亜鉛は、銅ベース生成物のいずれよりも低いＰ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）に対するＭＩＣを示し、酸可溶性銅−亜鉛−アンモニウム製剤Ｃｕ−Ｚｎ＃１は、試験した最も活性な組成物であった。Ｃｕ−Ｚｎ＃１と同量の銅元素を有するが亜鉛元素が１／６であるＣｕ−Ｚｎ＃３（表２を参照のこと）の活性は、Ｃｕ−Ｚｎ＃１の１／４であった。
Figure 0006808489
実験＃２では、Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）に対する硫酸銅およびＣｕ＃３のＭＩＣは、第１の実験で観察の２倍であったが、Ｃｕ＃３は依然として２倍の活性であった。Ｃｕ＃１２およびＣｕ＃１３は、Ｃｕ＃３中のリン酸ではなく硫酸を含むにもかかわらず、Ｃｕ＃３と同じＭＩＣを示し；Ｃｕ＃１３は、Ｃｕ＃３およびＣｕ＃１２における硫酸銅ではなく塩化銅を含んだ。これらの結果から、酸可溶性銅−アンモニウム錯体が硫酸銅単独よりも概ね有効であることが示される。実験＃１におけるように、Ｃｕ−Ｚｎ＃１はＰ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の増殖に対して最も活性な組成物であり、再びＣｕ−Ｚｎ＃３よりも４倍活性であった。
全体として、これらの実験から、上記および表３に示す寒天プレート試験結果が確認および拡張される。これらの結果から、酸可溶性銅−アンモニウム組成物が硫酸銅単独よりも活性であることが確認される。これらの結果は、驚くべきことに、硫酸亜鉛がＰ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の増殖を阻害すること、およびＣｕ−Ｚｎ＃１が、銅元素をわずか３７．５％しか含有していないにもかかわらず、Ｃｕ＃組成物のいずれよりも相当高い活性であることを示した。これらの結果から、組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃１における等モルの亜鉛元素と銅元素の組合せは、硫酸亜鉛よりも活性があり、かつ銅に比較して１／６の亜鉛元素を含有するＣｕ−Ｚｎ＃３よりもなお一層活性であることがわかる。全体として、これらの実験結果から、Ｃｕ−Ｚｎ＃１が座瘡に治療効果を有し得ることが確認される。
２．表５に、Ｃｕ−Ｚｎ錯体を作製するのに使用した炭酸アンモニウムの量およびＣｕ−Ｚｎ錯体を安定化するのに使用した塩酸の量を一定に保持しながら、銅元素と亜鉛元素の比が様々であるＣｕ−Ｚｎ組成物＃１〜＃５（表２を参照のこと）のＭＩＣの結果を示す。この実験では、組成物Ｃｕ＃３（実験間の参照として使用）は、硫酸亜鉛と同じように、ＭＩＣ＝５０マイクログラム／ミリリットルを示した。以前の実験のように、組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃１は、Ｃｕ−Ｚｎ＃３およびこの実験ではＣｕ−Ｚｎ＃２よりも、Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の増殖に対する活性が４倍であった。Ｃｕ−Ｚｎ＃４および＃５は両方とも同等に、活性がＣｕ−Ｚｎ＃２および＃３の半分であり、Ｃｕ−Ｚｎ＃１の１／８であった。これらの結果から、等モルの銅元素および亜鉛元素を含む組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃１が、試験したすべての中でＰ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の増殖に対して最も活性があることがわかる。Ｃｕ−Ｚｎ＃２および＃３に関する結果から、Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の増殖に対する銅の役割は、亜鉛よりもいくぶん大きいが、等モル等価（Ｃｕ−Ｚｎ＃１）の場合、一緒になった２種の金属の驚くべき相乗作用により、Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の増殖に対して、断然最も有効な組成物が生成する。
Figure 0006808489
３．表６に、マイクロプレート培養における、ＭＲＳＡ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、およびＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の増殖に対する硫酸銅ならびに種々のＣｕ＃およびＣｕ−Ｚｎ＃組成物のＭＩＣの結果を示す。ＭＲＳＡおよびＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）は両方とも、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）よりも、硫酸銅、Ｃｕ＃組成物、およびＣｕ−Ｚｎ＃組成物の作用に対して明確に感受性があり、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）は、Ｃｕ−Ｚｎ＃組成物の阻害作用に驚くべき感受性がある。Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）が、医療関連感染症（ＨＡＩ）の原因となる特に執拗な細菌であるので、組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃１による清浄および／または噴霧は、この流行性で処置が困難な微生物の増加から病院および他のヘルスケア施設を解放することに特に有用である可能性がある。
Figure 0006808489
ＭＲＳＡおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は両方とも、Ｃｕ−Ｚｎ＃組成物および硫酸銅よりもＣｕ＃組成物の増殖阻害作用に感受性であり、一方Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）およびＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対してはその反対が成立する。しかしながら、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、試験した組成物のすべてに対して、概ね感受性がＭＲＳＡの約１／８であった。
炭酸アンモニウムまたは炭酸水素アンモニウムを用い、かつ酢酸（Ｃｕ＃１０）およびクエン酸（Ｃｕ＃１１；表１に示さず、すなわち沈殿が２４時間後に顕著であったので試験していない）を使用して作製した特定の組成物が、調製の数日以内に沈殿し始めることに気づいた。極めて類似した組成物を水酸化アンモニウムを使用して作製したところ、これらの組成物（Ｃｕ＃１０ａおよびＣｕ＃１１ａ）は、驚くべきことに安定であり、調製の数か月後でも沈殿の兆候を示さなかった。水酸化アンモニウムを使用して３種の組成物を作製し（詳細については表１を参照のこと）、表６の下部に示すように、ＭＲＳＡ、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して試験した。Ｃｕ＃３は安定な組成物であり、Ｃｕ＃３ａは同等に安定であり、試験した３種の菌株に対して活性であった。Ｃｕ１０ａはＣｕ＃１０と同様の活性を示し、クエン酸を含むＣｕ＃１１ａは他のＣｕ＃組成物と同様に活性であった。これら（および水酸化アンモニウムで調製した他の組成物−下記を参照のこと）の組成物は安定性が増しているだけでなく、二酸化炭素が放出されないので作製するのが迅速かつ容易であり、また水酸化アンモニウムで形成させたＣｕ−／Ｃｕ−Ｚｎ−アンモニウム錯体は、可溶化に必要な酸が少なく、そのため、組成物のｐＨをより高くすることができ、その製剤において利点がある。
ＭＲＳＡはおそらく、ＨＡＩをもたらす最もよく知られかつ最も問題のある病原菌であるが、ＵＳＡ３００ ＭＲＳＡ株も、特に皮膚のコミュニティー関連感染症において懸念が高まっている。カルバペネム耐性Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が過去１０年にわたって出現し、ほとんど完全に薬剤耐性の世界中に広がった院内病原体になっている。しかしながら、Ｃｕ＃組成物およびＣｕ−Ｚｎ＃組成物に対する、試験した菌株の感受性から（表６）、これらの組成物が、病院、家、および他の建物での清浄、噴霧等により、これらの生物を除去するのに有用である可能性が示唆される。全体として、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）もＣｕ＃組成物にかなり感受性があるので、Ｃｕ＃３は、清浄および殺菌を行ってこれらの病原性微生物を建物から除去するのに特に有効な組成物になり得る。
実施例３．ヒト扁平上皮性皮膚細胞株（Ａ−４３１）に関する細胞傷害性アッセイ
Ａ−４３１（ＡＴＣＣ）を、３７℃で空気雰囲気中５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中にて、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（完全培地）で培養した。細胞傷害性実験のために、細胞をトリプシン処理し、洗浄してカウントし、２×１０４細胞を、完全培地中にて平底９６ウェルプレートのウェルに播種し、３日間培養してコンフルエントな単層を形成させた。試験した生成物は次のとおりであった：（ｉ）図４に示す硫酸銅、Ｃｕ＃９、Ｃｕ＃１０、およびＣｕ−Ｚｎ＃１、ならびに（ｉｉ）図５に示す、防腐剤を含むアロエベラゲルで希釈した組成物Ｃｕ＃９およびＣｕ−Ｚｎ＃１、および以下の２種の座瘡クリーム剤：２％サリチル酸を含むＣＬＥＡＲＡＳＩＬ（登録商標）（Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ ＬＬＣ ｏｆ Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ Ｅｎｇｌａｎｄの登録商標）超速効作用処置ゲルおよび１０％過酸化ベンゾイルを含むＣＬＥＡＲＡＳＩＬ（登録商標）（Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ ＬＬＣ ｏｆ Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ Ｅｎｇｌａｎｄの登録商標）毎日用透明座瘡処置クリーム。試験生成物はすべて、完全培地で希釈した後、コンフルエントなＡ−４３１細胞に三つ組で加え、次いでさらに２４時間培養し、そこで下記のように、スルホロダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを使用して、細胞傷害性／細胞生存率を定量的に評価した。
細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄した後、１０％トリクロロ酢酸で、４℃にて１時間固定した。水道水で２回洗浄した後、細胞をＳＲＢ（１％酢酸中に０．４％ｗ／ｖのＳＲＢ）で室温にて３０分間染色した。水道水で２回洗浄した後、残存する染色剤を１０ｍＭトリス塩基に溶解し、ウェルの吸光度をＤｙｎａｔｅｃｈ Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ ＥＬＩＳＡリーダー上で５４０ｎｍにて測定した。試験生成物の吸光度を対照の吸光度で除して１００を乗じることによりパーセント細胞生存率を算出した。
結果
図４から、硫酸銅ならびに組成物Ｃｕ＃９および＃１０が、ヒト皮膚細胞についてほとんど同一の細胞傷害性プロファイルを示し、５０マイクログラム／ミリリットルの５０％細胞傷害性濃度（ＣＣ５０）を有することがわかり、銅イオンが３種の生成物の細胞傷害性効果の原因であることが示唆される。組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃１は、銅元素濃度が他の３種の生成物のわずか３７．５％であるにもかかわらず、おそらく銅イオンおよび亜鉛イオンの両方が存在することにより、他の３種の生成物よりもわずかに細胞傷害性が強く（ＣＣ５０＝３０マイクログラム／ミリリットル）、亜鉛イオンがヒト皮膚細胞に対して銅イオンよりもさらに一層細胞傷害性があること、および／または亜鉛イオンが銅イオンの細胞傷害性を増強することが示唆される。
重要なことには、これらの結果から、Ｃｕ＃３、＃３ａ、＃９、＃１０、＃１０ａ、＃１１ａ、＃１２、＃１３、ならびにＣｕ−Ｚｎ＃１および＃３など、本明細書に記載の組成物は、培養中のヒト皮膚細胞に細胞傷害性をもたらす濃度（約３０マイクログラム／ミリリットル）より十分低い濃度（ＭＩＣ １．６〜６．３マイクログラム／ミリリットル−表６を参照のこと）で、ＭＲＳＡおよびＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）などの細菌の増殖を阻害することがわかる。Ｃｕ−Ｚｎ＃１はまた、ヒト皮膚細胞に対して細胞傷害性でない濃度であるＭＩＣ＝１２．５マイクログラム／ミリリットル（表４）で、Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の増殖を阻害する。
図５に、組織培養中のヒト皮膚細胞の生存率に対する、１％容量／容量の組成物Ｃｕ＃９（４００マイクログラム／ミリリットルの銅元素）およびＣｕ−Ｚｎ＃１（１５０マイクログラム／リットルの銅元素および亜鉛元素）を含有するゲル、ならびに２種の市販ＣＬＥＡＲＡＳＩＬ（登録商標）（Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ ＬＬＣ ｏｆ Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ Ｅｎｇｌａｎｄの登録商標）座瘡クリーム剤の効果を示す。一方は活性成分として１０％過酸化ベンゾイルを含有し、他方は２％サリチル酸を含有する、両方のＣＬＥＡＲＡＳＩＬ（登録商標）（Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ ＬＬＣ ｏｆ Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ Ｅｎｇｌａｎｄの登録商標）製品は、それぞれ０．０２％および０．０５％のＣＣ５０値を有し、約０．５％以上の濃度で１００％細胞傷害性（０％の細胞生存率）を示す同様の細胞傷害性プロファイルを生成した。座瘡の処置に好ましい組成物と考えられる組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃１を１％含有するゲルは、４％のＣＣ５０を示すが、組成物Ｃｕ＃９を１％含有するゲルは、このアッセイでは１０％容量／容量においてもＣＣ５０に達しなかった。これらのゲル製剤のＣＣ５０値は、組成物単独で得られたＣＣ５０値と適合する（図４を参照のこと）。したがって、ＣＬＥＡＲＡＳＩＬ（登録商標）（Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ ＬＬＣ ｏｆ Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ Ｅｎｇｌａｎｄの登録商標）製品は、ゲル製剤のいずれよりもヒト皮膚細胞に対して約２００倍を超える毒性があることが明らかである。
皮膚の複雑な構造に比較して、皮膚細胞培養物が相対的に単純であるため、医療との関係は注意して解釈する必要があり、これらのインビトロの結果を臨床的な差に変換することはできないことに留意することは重要である。しかしながら、ＣＬＥＡＲＡＳＩＬ（登録商標）（Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ ＬＬＣ ｏｆ Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ Ｅｎｇｌａｎｄの登録商標）製品中の活性成分であり、座瘡処置製品中に幅広く使用されているサリチル酸および過酸化ベンゾイルは、座瘡に罹患する人々の皮膚上で多く曝露され得る皮膚細胞に特に有毒であるように見える。こうして、Ｃｕ−Ｚｎ＃１製剤を含むゲルは、座瘡罹患者の皮膚への損傷が少ない可能性がある一方、座瘡に関連した細菌であるＰ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）に対して極めて活性である（実施例１および２を参照のこと）。
実施例４．植物病原真菌に対する抗真菌アッセイ。
チャララ・フラキシネア（Ｃｈａｌａｒａ ｆｒａｘｉｎｅａ）分離株１９６／２８（Ｃ．フラキシネア（Ｃ．ｆｒａｘｉｎｅａ））、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、およびウドンコ病から分離した株（Ｐｍ；リンゴの葉から分離）を、ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）上で室温（約２２℃）にて培養した。真菌増殖に対する組成物の効果を評価するために、滅菌蒸留水で希釈した試験組成物１０マイクロリットルを、１２ウェル組織培養プレートのウェルに入れ、各ウェルに１ミリリットルのＰＤＡをピペットで加えた。寒天の全体にわたって均一に試験組成物が分散するようにプレートを撹拌し（蒸留水単独を対照として使用した）、次いで、寒天を凝固させた。確立した真菌培養物から真菌の菌糸を含有する寒天プラグ（３ｍｍ２）を、メスを使用して注意深く切り取り、１２ウェルプレートの各ウェルの寒天の中心にある穴に挿入し、次いで室温（約２２℃）で培養した。真菌の増殖速度は株に応じて異なるので、実験は、Ｐｍについては３日後、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）については３〜４日の適切な間隔で、またＣ．フラキシネア（Ｃ．ｆｒａｘｉｎｅａ）については約７日に評価した。真菌増殖に対する組成物の効果を評価するために、真菌の菌糸の直径を、定規を使用して９０°の角度で２回測定し、平均直径をミリメートル単位で算出した。真菌増殖を視覚的に検出できない場合には、培養物を位相差顕微鏡（４０倍）で観察して、視覚試験で判断されるように増殖がない（ＮＧ）ことを確認する。
結果
１．表７に、Ｃ．フラキシネア（Ｃ．ｆｒａｘｉｎｅａ）の増殖に対する硫酸銅および組成物Ｃｕ＃１６の効果を示す。おそらく抗真菌活性を有することが知られている亜リン酸による、Ｃｕ＃１６中の銅−アンモニウム錯体の可溶化のために（表１を参照のこと）、組成物Ｃｕ＃１６は、両方の時点で１２５マイクログラム／ミリリットルの濃度で真菌増殖を強力に阻害し、硫酸銅よりも真菌の増殖に対して約３０倍阻害的であった（３．７５マイクログラム／ミリリットルのＣｕ＃１６による結果は、１２５マイクログラム／ミリリットルの硫酸銅による結果に極めて類似していた）。
Figure 0006808489
２．表８に、Ｃ．フラキシネア（Ｃ．ｆｒａｘｉｎｅａ）の増殖に対する組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃１およびＣｕ−Ｚｎ＃７の効果を示す。組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃１は、Ｃ．フラキシネア（Ｃ．ｆｒａｘｉｎｅａ）の増殖阻害において組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃７ほど有効ではなく、２種の組成物の製剤は極めて類似しているが（表２）、組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃７は、銅−亜鉛を可溶化する酸として亜リン酸を含有し、Ｃｕ−Ｚｎ＃１は塩酸を含有する。亜リン酸は、抗真菌活性を有することが知られており、組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃７中にそれを使用すると、アッセイの７日目および１４日目にそれぞれ、Ｃｕ−Ｚｎ＃１よりも３倍から１０倍の活性がある抗真菌組成物が得られる。
１％濃度のＣｕ−Ｚｎ＃７が１５０マイクログラム／ミリリットルの銅元素を含有するため、Ｃｕ−Ｚｎ＃７の効果を表７の硫酸銅およびＣｕ＃１６の効果と比較すると、Ｃｕ−Ｚｎ＃７は、Ｃｕ＃１６よりもＣ．フラキシネア（Ｃ．ｆｒａｘｉｎｅａ）増殖の阻害剤としてはわずかに有効性が低いが、硫酸銅よりもかなり有効であることが示される。
Figure 0006808489
３．表９に、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の増殖に対する硫酸銅および組成物Ｃｕ＃１６の効果を示す。組成物Ｃｕ＃１６は、１２５マイクログラム／ミリリットルの濃度で真菌増殖を完全に阻害し、Ｃ．フラキシネア（Ｃ．ｆｒａｘｉｎｅａ）で見られたように（表７）、３時点すべてで硫酸銅よりも３〜１０倍阻害的であった。
Figure 0006808489
４．表１０に、いずれも亜リン酸を含有するＣｕ＃組成物は両方とも、Ｐｍの増殖阻害において硫酸銅よりも有効であったことを示す。組成物Ｃｕ＃１６は炭酸水素アンモニウムを含んで作製され、一方Ｃｕ＃２７は水酸化アンモニウムを含有するが、前に示すように（表６）、これは、組成物の抗真菌活性にあまり差を与えない。しかしながら、組成物Ｃｕ＃１６については、室温で数日後に沈殿が認められるが、Ｃｕ＃２７に関してはこれは見られず、組成物を可溶化するために亜リン酸を使用する場合、水酸化アンモニウムは銅−アンモニウム錯体の調製において驚くほど有利になり得ることが示唆される。Ｐｍ増殖の同等に有効な阻害剤である組成物Ｃｕ−Ｚｎ＃７およびＣｕ−Ｚｎ＃１０は、それぞれの場合に亜リン酸で可溶化されるＣｕ−Ｚｎ−アンモニウム錯体を生成させるために、それぞれ炭酸アンモニウムおよび水酸化アンモニウムを使用する点で異なっていた（表２）。しかしながら、亜リン酸で可溶化されるＣｕ−Ｚｎ−アンモニウム錯体を調製するために炭酸アンモニウムを使用する場合には、沈殿は認められなかった。驚くべきことに、銅元素含量の点からすると、Ｃｕ−Ｚｎ＃組成物は、Ｃｕ＃組成物よりもＰｍ増殖の有効な阻害剤であった。したがって、１パーセント稀釈（１５０マイクログラム／ミリリットルの銅）では、Ｃｕ＃組成物−ただし３７５マイクログラム／ミリリットルの銅元素−と同様に、Ｃｕ−Ｚｎ＃組成物は増殖を完全に阻害した。０．３パーセント稀釈（４５マイクログラム／ミリリットルの銅）でも、Ｃｕ−Ｚｎ＃組成物は依然としてＰｍ増殖を強力に阻害するが、Ｃｕ＃組成物は、３７．５マイクログラム／ミリリットルではＰｍ増殖に対してわずかに阻害的であるのみであった。計算によると、Ｐｍの増殖を５０％阻害するのに必要とされる濃度は、Ｃｕ−Ｚｎ＃組成物については約４０マイクログラム／ミリリットルであり、Ｃｕ＃組成物については約１７０マイクログラム／ミリリットルであった。したがって、これらの結果から、亜リン酸で可溶化したＣｕ−Ｚｎ＃組成物は、組成物を形成させるために使用したアンモニウム塩にかかわらず、亜リン酸で可溶化したＣｕ＃組成物よりもＰｍの増殖阻害において驚くほど有効であることがわかる。
Figure 0006808489
Ｃ．フラキシネア（Ｃ．ｆｒａｘｉｎｅａ）は、欧州で重大な林業問題になっているトリネコの木の枝枯れ病の原因である。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）は、ブドウ、タマネギ、およびピーナッツなどの特定の果物および野菜のクロカビの原因であり、食物の通常の汚染菌である。ブルメリア（Ｂｌｕｍｅｒｉａ）属の真菌は、ブドウの木、ウリ科植物（Ｃｕｒｃｕｂｉｔｓ）、タマネギ、リンゴおよびセイヨウナシの木を含む多くの植物の葉のウドンコ病の原因となる広汎な植物病原菌である。上記の結果から、亜リン酸で可溶化した銅−アンモニウムおよび銅−亜鉛−アンモニウムの錯体は、試験した種々の植物病原真菌の増殖阻害において極めて有効であり、したがって、作物、植物、木、花、および観賞用低木を保護する農業分野で実用的な用途を有し得ることがわかる。驚くべきことに、Ｃｕ−Ｚｎ＃７および＃１０は、Ｃｕ＃１６および＃２７よりもウドンコ病の増殖阻害において顕著に有効であり、これらの組成物が特定の植物病原菌に対して有利な抗真菌活性を有し得ることが示唆される。
実施例５．ヒト病原菌カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）に関する抗真菌／酵母アッセイ。
カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ））の３種の株を使用した：１−１、３−１、および４−１をそれぞれ、ヒトの血液、膣、および中咽頭から単離した。クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）（Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））株ＣＣＴＰ１３を使用した。すべての株は、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃にて培養した。硫酸銅およびＣｕ＃組成物は、２００マイクログラム／ミリリットルの高濃度で開始し、一方、Ｃｕ−Ｚｎ＃組成物は、保存溶液（表２）の１％となる高濃度で開始し、また硫酸亜鉛および亜リン酸は、Ｃｕ−Ｚｎ＃７および＃１０中のものと等価な高濃度で開始して（詳細については表１１の説明文を参照のこと）、組成物の２倍希釈液（１００マイクロリットル）を９６ウェル組織培養プレート中にてＲＰＭＩ−１６４０で調製した。Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）およびＣ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）の一晩培養物をそれぞれ、４０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝剤を含有する新鮮なＲＰＭＩで希釈し、９０マイクロリットルをプレート中の組成物に加えた。レサズリンＡ（蒸留水中の０．０６７５％重量／容量溶液の１０マイクロリットル）を、増殖の指示薬として加え、培養物を３７℃で２４時間インキュベートした。化合物／組成物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、レサズリンＡ指示薬が青色のままである最低濃度として定義した（生細胞は青色色素をピンク色に変換する）。
結果
表１１に、試験した株がすべて、硫酸銅の形態であっても酸可溶性銅−アンモニウム組成物（Ｃｕ＃）の形態であっても、銅に驚くほど感受性であり、ＭＲＳＡおよびＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）で見られたものと同様のＭＩＣ（約６マイクログラム／ミリリットル；表６）を有することを示す。
塩酸および亜リン酸をそれぞれ含む、等モル量の銅元素および亜鉛元素を含有する酸可溶性Ｃｕ−Ｚｎ−アンモニウム錯体組成物＃１および＃７は、銅イオン濃度の点からすると、硫酸銅およびＣｕ＃組成物よりもわずかに有効性に勝る、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）増殖の阻害剤であった（ＭＩＣ＝４．７マイクログラム／ミリリットルのＣｕ２＋元素）。さらに、酵母Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）は、銅に対してその形態にかかわらず極めて感受性であったが、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）株に比べるとＣｕ−Ｚｎ＃１に対する感受性は低かった。Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）株の増殖は、硫酸亜鉛にも亜リン酸にも影響を受けなかった（それぞれＭＩＣ＞１５０および＞５００マイクログラム／ミリリットル）。Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）の増殖も硫酸亜鉛に影響を受けなかった。
Figure 0006808489
これらの結果から、多種多様な解剖学的部位から単離したＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）株がすべて、ＲＰＭＩ培地で増殖させると、銅の存在に極めて感受性であることがわかる。したがって、Ｃｕ＃またはＣｕ−Ｚｎ＃組成物のいずれかが、膣および口腔の鵞口瘡などのＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）関連疾患の局所処置に有用であり得ると結論することができる。
Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）も硫酸銅およびＣｕ＃組成物には極めて感受性であったが、Ｃｕ−Ｚｎ＃１および硫酸亜鉛に対しては感受性がかなり低かった。Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの人々には重篤な脳膜炎をもたらすため、銅含有錯体の脳への選択的な送達は、この致死的疾患の有望な療法になる可能性がある。
実施例６．安定性試験
組成物Ｃｕ＃１、および１％容量／容量の組成物Ｃｕ＃１を含む防腐剤含有アロエベラゲルのサンプル（３ミリリットル）を、７ミリリットルの滅菌プラスチックチューブに入れ、反復サンプルを以下の４つの条件下で保存した；加湿インキュベーター中で３７℃、戸棚中で室温（約２２℃）、低温室中で４℃、および冷凍庫中で−２０℃。保存５か月後、Ｃｕ＃１および１％Ｃｕ＃１を含有するゲルの一連のサンプルを放置して室温にした。ゲルサンプル（５マイクロリットル）およびＣｕ＃１のサンプル（蒸留水で１：１または１：１０容量／容量に希釈し、５マイクロリットルをペーパーディスク上に置いた）を、寒天プレート試験で菌株Ｓ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））に対して試験し、３７℃で２４時間の培養後、実施例１に記載のように、阻止帯の直径を測定した。
結果
組成物Ｃｕ＃１を１％含有するゲルのサンプルはすべて、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して６ミリメートルの阻止帯を与え、広範囲の温度での保存がゲルの抗菌活性に影響を与えないことが示された。
表１２に、種々の温度で５か月間保存した組成物Ｃｕ＃１のサンプルについての阻止帯を示す。３７℃で保存したサンプルは、試験した両方の濃度で極めて類似した阻止帯を与えた他のサンプルよりもＳ１（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の増殖に対する阻害がわずかに大きかった。これらの結果から、組成物Ｃｕ＃１は、広範囲の温度で５か月間保存した後でも、その抗菌活性を保持することがわかる。
Figure 0006808489
本発明の種々の目的をその好ましい実施形態に関連して説明してきたが、多くの代替形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることは明白である。したがって、本明細書、特許請求の範囲、添付図面の趣旨および幅広い範囲の中に入る、そのようなすべての代替形態、修正形態、および変形形態を包含することを意図するものである。

Claims (9)

  1. 抗菌性組成物を製造する方法であって、
    銅塩を水と併せる工程と、
    前記銅塩と前記水の混合物に亜鉛塩を加える工程と、
    前記銅塩と前記亜鉛塩と前記水の混合物を激しく撹拌する工程と、
    不溶性銅−亜鉛−アンモニウム錯体を生成させるために、前記得られた混合物に塩基性アンモニウム塩を加える工程と、
    前記銅−亜鉛−アンモニウム錯体を可溶化し、それにより形成される透明な青色抗菌性組成物のｐＨを調節するために、前記銅−亜鉛−アンモニウム錯体に水溶性酸を加える工程と
    を含み、
    前記水溶性酸が、硫酸、塩酸、リン酸、および亜リン酸からなる群から選択される無機酸である、
    方法。
  2. 前記銅塩が硫酸銅および塩化銅からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記水が、蒸留水、脱イオン水、精製水、濾過水、医薬品グレード水、医療グレード水、および逆浸透水からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記銅塩が無水である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記銅塩が水和されている、請求項１に記載の方法。
  6. 前記塩基性アンモニウム塩が、水酸化アンモニウム、炭酸アンモニウム、および炭酸水素アンモニウムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記亜鉛塩が、無水硫酸亜鉛、無水塩化亜鉛、水和硫酸亜鉛、および水和亜鉛塩化物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記塩基性アンモニウム塩が、前記銅塩と前記亜鉛塩と前記水の混合物に併せられる前に水に溶解している、請求項１に記載の方法。
  9. 前記抗菌性組成物が、ゲル、軟膏、油、ペースト、薬物、噴霧可能溶液、ドレッシング溶液、灌水溶液、クリーム、石鹸、界面活性剤、洗剤、および泡からなる群から選択される担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
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